Resumo

Feline leishmaniosis is infrequent worldwide, and cats have been suggested as secondary reservoirs for the parasite. However, specific diagnostic techniques for feline samples are scarce. In this study, we standardized an in-house indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using crude Leishmaniainfantum antigen to detect antibodies in feline samples from an endemic canine visceral leishmaniosis (CVL) area in the western border of Brazil. The results were compared with those of an indirect immunofluorescence assay (IFA). We tested semi-domiciled felines residing in Uruguaiana and Barra do Quaraí, Rio Grande do Sul. Among the 41 samples, 25 (61%) were positive using ELISA and 24 (58%) were positive using IFA (1:40). Our findings demonstrated a high seropositivity of feline samples from the endemic CVL area in the western border of Brazil, and we proposed the use of an in-house ELISA with crude antigen for population screening. This is the first serological survey on felines in a region where CVL is well established.

A leishmaniose felina é relatada esporadicamente em todo o mundo e, a espécie foi sugerida como um reservatório secundário para o parasita. Apesar disso, há carência de técnicas diagnósticas específicas para amostras de felinos. O presente estudo teve como objetivo padronizar um Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA) indireto interno, utilizando o antígeno cru de L. infantum para detectar anticorpos em amostras felinas em uma área endêmica de CVL na fronteira oeste do Brasil e, comparar os resultados com o ensaio de imunofluorescência indireta (IFA). Foram testados felinos residentes em Uruguaiana e Barra do Quaraí - RS, semi-domiciliados. Entre as 41 amostras testadas, 25 (61%) foram positivas no ELISA e 24 (58%) no IFA (1:40). O presente estudo elucidou uma alta soropositividade de amostras felinas em uma área endêmica de leishmaniose visceral canina na fronteira Oeste do Brasil e demonstrou a possibilidade de aplicar um ELISA com antígeno bruto para diagnóstico de triagem populacional. Além disso, este é o primeiro inquérito sorológico em felinos na região onde a leishmaniose visceral canina está bem estabelecida.

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A cinomose é uma enfermidade causada pelo vírus Canine Distemper Virus (CDV). Essa doença afeta principalmente cães, mas também acomete outras espécies domésticas e selvagens. A imunidade do animal está relacionada ao grau que a esse patógeno vai atingir o organismo do indivíduo. Ela afeta a respiração do animal, pode causar vômito, diarreia, convulsões, podendo levar o animal à óbito. O objetivo do presente trabalho foi padronizar um teste ELISA indireto com antígeno de superfície para o diagnostico cinomose utilizando amostras de soro canino. Para padronização da técnica, fez-se necessário o estudo da diluição do antígeno para identificar a melhor concentração para sensibilização da placa. O teste foi aplicado primeiramente com diferentes diluições do antígeno para detecção do melhor desempenho do antígeno. Feito isso, foi testado em um banco de soro de 45 animais comprovadamente positivos no teste ELISA comercial e em soro de 45 animais comprovadamente negativos no teste ELISA comercial, posteriormente foi calculado o ponto de corte, especificidade e sensibilidade do teste. O teste ELISA indireto se mostrou com excelência como um teste de diagnóstico para a cinomose canina, obtendo-se ponto de corte de densidade óptica de 0,229, sensibilidade de 95,5% e especificidade de 84,4%.

Distemper is a disease or the disease by the CDV virus, Distemper Virus. This disease mainly affects dogs, but also affects other domestic and wild species. The animal's immunity is related to the degree to which it will reach the individual's organism. It affects the animal's breathing, can cause vomiting, diarrhea, convulsions, and can lead to death. The aim of the present work test was to standardize an indirect ELISA for distemper diagnosis in experiments using a surface antigen. For the study of technical identification, it was necessary to specify the antigen for the best concentration of plaque sensitization. The test was initially applied with different dilutions of the antigen to detect the best performance of the antigen. This was tested in a serum bank of 45 animals proven positive in the commercial ELISA test and in the serum of 45 animals proven negative in the commercial ELISA test, later it was tested on the cut-off point, specificity and sensitivity of the test. The indirect ELISA test proved to be excellent as a diagnostic test for canine distemper, with an optical density cut-off of 0.229, sensitivity of 95.5% and specificity of 84.4% being obtained.

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The standardization and validation of a multiplex assay requires the combination of important parameters such as sensitivity and specificity, acceptable levels of performance, robustness, and reproducibility. We standardized a multiparametric Dot-blot aimed at the serological screening of paracoccidioidomycosis, histoplasmosis, and aspergillosis. A total of 148 serum were evaluated: 10 from healthy subjects, 36 from patients with paracoccidioidomycosis, 62 from patients with histoplasmosis, and 40 from patients with aspergillosis. It was found that the multiparametric Dot-blot showed a high percentage of cross-reactivity. However, when evaluated individually, in the serological screening of histoplasmosis, a good performance was observed when compared to the double immunodiffusion assay, considered the gold standard test, with 100% co-positivity and 83.3% co-negativity. The performance of serological screening for aspergillosis was not satisfactory when compared to double immunodiffusion, showing 71.4% co-positivity and 100% co-negativity. The evaluation of the stability of nitrocellulose membranes showed that membranes sensitized with H. capsulatum antigen remained stable for 90 days and those sensitized with A. fumigatus antigen for 30 days. We conclude that the use of crude antigens was not suitable for the standardization of the multiparametric Dot-blot assay, due to the high cross-reactivity, and that further tests should be performed with purified proteins (AU).

A padronização e validação de um ensaio multiplex requer a combinação de parâmetros importantes, como sensibilidade e especificidade, níveis aceitáveis de desempenho, robustez e reprodutibilidade. Este trabalho padronizou um Dot-blot multiparamétrico visando a triagem sorológica da paracoccidioidomicose, histoplasmose e aspergilose. Foram avaliadas 148 amostras de soro: 10 de indivíduos saudáveis, 36 de pacientes com paracoccidioidomicose, 62 de pacientes com histoplasmose e 40 de pacientes com aspergilose. Verificou-se que o Dot-blot multiparamétrico apresentou elevado percentual de reatividade cruzada. Entretanto, quando avaliado individualmente, na triagem sorológica da histoplasmose observou-se bom desempenho quando comparado ao ensaio de imunodifusão dupla, considerado o teste padrão ouro, com 100% de co-positividade e 83,3% de co-negatividade. O desempenho da triagem sorológica da aspergilose não foi satisfatório quando comparado a imunodifusão dupla, apresentando 71,4% de co-positividade e 100% de co-negatividade. A avaliação da estabilidade das membranas de nitrocelulose mostrou que membranas sensibilizadas com antígeno de H. capsulatum permaneceram estáveis por 90 dias e as sensibilizadas com antígeno de A. fumigatus, por 30 dias. Concluímos que o uso de antígenos brutos não foi adequado para a padronização do ensaio de Dot-blot multiparamétrico, devido ao alto índice de reatividade cruzada, e que novos testes devem ser realizados com proteínas purificadas (AU).

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The protozoan Neospora caninum is known worldwide as one of the main causes of abortion in cattle. During infection, rhoptry proteins present in the apical complex of the parasite play important roles in adhesion and parasitophorous vacuole formation. The use of N. caninum ROP2 in experimental vaccines has shown promising protective results. In our study we performed cloning and expression in Escherichia coli of an antigenic portion of N. caninum ROP2. The recombinant protein (rROP2) was obtained in insoluble form, and the purified protein showed a size of approximately 18kDa. Even being a small truncate NcROP2 region, it was possible to conserve the antigenic epitopes which were recognized by bovine serum naturally infected with N. caninum. Vaccination with rROP2 on aluminum hydroxide adjuvant induced high levels of rROP2-specific IgG antibodies capable of recognizing native protein in tachyzoite lysates. In conclusion, our approaches were effective in obtaining the rROP2 protein, which induced specific mouse immune response and was also recognized by sera from N. caninum naturally infected cattle. These results suggest that it is a promising antigen for the development of neosporosis subunit vaccines as well as a suitable antigen for use in immunodiagnosis.(AU)

O protozoário Neospora caninum é conhecido mundialmente como uma das principais causas de aborto em bovinos. Durante a infecção, as proteínas rhoptry presentes no complexo apical do parasita desempenham papel importante na adesão e formação de vacúolos parasitóforos. O uso de ROP2 de N. caninum em vacinas experimentais tem mostrado resultados de proteção promissores. Em nosso estudo, realizamos a clonagem e expressão em Escherichia coli de uma porção antigênica de N. caninum ROP2. A proteína recombinante (rROP2) foi obtida na forma insolúvel, e a proteína purificada apresentou tamanho aproximado de 18kDa. Mesmo sendo uma pequena região truncada de NcROP2, foi possível conservar os epítopos antigênicos que foram reconhecidos pelo soro de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. A vacinação com rROP2 adsorvida no adjuvante de hidróxido de alumínio induziu altos níveis de anticorpos IgG anti-rROP2, capazes de reconhecer a proteína nativa em lisados de taquizoítos. Em conclusão, nossas abordagens foram eficazes na obtenção da proteína rROP2, que induziu resposta imune específica em camundongos e também foi reconhecida por soros de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. Estes resultados sugerem que rROP2 é um antígeno promissor para o desenvolvimento de vacinas de subunidades de neosporose, bem como um antígeno adequado para uso em imunodiagnóstico.(AU)

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ABSTRACT: The protozoan Neospora caninum is known worldwide as one of the main causes of abortion in cattle. During infection, rhoptry proteins present in the apical complex of the parasite play important roles in adhesion and parasitophorous vacuole formation. The use of N. caninum ROP2 in experimental vaccines has shown promising protective results. In our study we performed cloning and expression in Escherichia coli of an antigenic portion of N. caninum ROP2. The recombinant protein (rROP2) was obtained in insoluble form, and the purified protein showed a size of approximately 18kDa. Even being a small truncate NcROP2 region, it was possible to conserve the antigenic epitopes which were recognized by bovine serum naturally infected with N. caninum. Vaccination with rROP2 on aluminum hydroxide adjuvant induced high levels of rROP2-specific IgG antibodies capable of recognizing native protein in tachyzoite lysates. In conclusion, our approaches were effective in obtaining the rROP2 protein, which induced specific mouse immune response and was also recognized by sera from N. caninum naturally infected cattle. These results suggest that it is a promising antigen for the development of neosporosis subunit vaccines as well as a suitable antigen for use in immunodiagnosis.

RESUMO: O protozoário Neospora caninum é conhecido mundialmente como uma das principais causas de aborto em bovinos. Durante a infecção, as proteínas rhoptry presentes no complexo apical do parasita desempenham papel importante na adesão e formação de vacúolos parasitóforos. O uso de ROP2 de N. caninum em vacinas experimentais tem mostrado resultados de proteção promissores. Em nosso estudo, realizamos a clonagem e expressão em Escherichia coli de uma porção antigênica de N. caninum ROP2. A proteína recombinante (rROP2) foi obtida na forma insolúvel, e a proteína purificada apresentou tamanho aproximado de 18kDa. Mesmo sendo uma pequena região truncada de NcROP2, foi possível conservar os epítopos antigênicos que foram reconhecidos pelo soro de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. A vacinação com rROP2 adsorvida no adjuvante de hidróxido de alumínio induziu altos níveis de anticorpos IgG anti-rROP2, capazes de reconhecer a proteína nativa em lisados de taquizoítos. Em conclusão, nossas abordagens foram eficazes na obtenção da proteína rROP2, que induziu resposta imune específica em camundongos e também foi reconhecida por soros de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. Estes resultados sugerem que rROP2 é um antígeno promissor para o desenvolvimento de vacinas de subunidades de neosporose, bem como um antígeno adequado para uso em imunodiagnóstico.

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Background: Small ruminant lentivirus (SRLV) belong to genus Lentivirus, family Retroviridae. These viruses causecaprine arthritis encephalitis (CAE) and maedi visna (MV), infectious diseases that cause economic, production, and reproductive losses. There are no effective treatments or vaccines for these diseases. Thus, early detection via serology hasgreat importance for control of SRLV. Therefore, the objective of this review is to demonstrate the potential of the westernblot (WB) test as an immunodiagnostic test for SRLV.Review: In general, immunodiagnosis of SRLV is performed via agar gel immunodiffusion (AGID) and indirect enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), which can detect antibodies in several different biological samples but is used preferably with serum and blood plasma. However, WB has demonstrated efficacy in the early diagnosis of immunoglobulinsagainst SRLV, presenting higher sensitivity and specificity than the serological tests usually used, because this techniquecan detect antibodies at a dilution as much as 256 times greater than that of AGID and 32 times greater than that of ELISA.SRLV infection and consequent immunological activation result in the induction of cellular and humoral responses. Additionally, around the third week, production of antibodies directed mainly toward viral capsid proteins (p25 and p28)occurs. After the fifth week, production of immunoglobulins directed toward other viral proteins occurs. Because of thepersistence of SRLV infection, serology is considered to be the most practical means to diagnosis. Each serological testhas a percentage specificity and distinct sensitivity, as well as advantages and disadvantages in its applicability. It shouldbe noted that there is no gold standard test for diagnosis of SRLV infection. Moreover, SRLV are characterized by escapemechanisms such as genetic diversity, mutagenic potential, viral intermittence...

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Oitenta porcento dos casos de paracoccidioidomicose (PMC) ocorrem no Brasil. As regiões brasileiras com maior número de casos são: sul, sudeste e centro-oeste, sendo emergente no norte e nordeste. A imunodifusão dupla em gel de agarose assume grande importância no diagnóstico, por permitir o monitoramento da doença e por oferecer subsídios para levantamentos soroepidemiológicos. O objetivo deste trabalho foi de avaliar e caracterizar os pacientes atendidos no Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, em 2016. Trata-se de um estudo retrospectivo realizado utilizando-se dados secundários e avaliando-se as seguintes informações: idade, sexo, procedência do pedido médico, resultado e histórico sorológico dos pacientes. Dos 1.408 pacientes, 12,8% apresentaram reatividade sorológica para Paracoccidioides brasiliensis. Destes, 42,5% não possuiam histórico sorológico, sendo considerados como casos novos da doença. A classificação dos pacientes reagentes por gênero demonstrou que 83,4% eram do sexo masculino, com razão de masculinidade de 5:1. A faixa etária variou de um (1) a 92 anos, e aproximadamente 40% dos pacientes eram da faixa etária de 41 a 60 anos. Este estudo demonstra e reforça a importância da implementação dos estudos soroepidemiológicos como ferramenta auxiliar para nortear as ações de vigilância e políticas em saúde na PCM.

Eighty percent of paracoccidioidomycosis (PMC) cases occur in Brazil. The highest numbers occur in south, southeast and center-west region, being emergent in the north and northeast areas. The double immunodiffusion in agarose gel is valuable for its diagnosis, as it allows the monitoring of the disease and offers subsidies for the seroepidemiological surveys. This study evaluated and characterized the patients attended in 2016 at the Mycoses Immunodiagnosis Laboratory of Adolfo Lutz Institute of São Paulo. This retrospective study, based on the secondary data, evaluated the information: age, sex, medical request origin, result and serological history of the patients. Of 1,408 patients, 12.8% presented positive serological reactivity for Paracoccidioides brasiliensis. Of them, 42.5% had no serological history and they were considered as new cases. The classification of reactive patients by gender showed that 83.4% were males, being the masculinity ratio of 5:1. The age range was one (1) to 92 years old, and ±40% of the patients were of age ranging from 41-60 years old. This study reinforces the importance of the implementation of the seroepidemiological studies as to guide the surveillance actions and the public health politics in PCM.

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A dengue é um problema grave para a saúde pública no Brasil e vários fatores agravam a situação, um deles é que a dengue pode ser confundida com outras doenças infecciosas. Este trabalho teve como objetivo a produção de um polipetídeo quimérico do vírus da dengue para a produção de um kit de imunodiagnóstico de baixo custo. Foi usada a proteína E do envelope viral do domínio III, fusionada ao Polipeptídeo Elastina-Like (ELP), a expressão foi feita em N. benthamiana. Os resultados do Western blotting mostraram que a fusão com a cauda de ELP foi melhor expressa do que a não fusionada. O teste de ELISA apresentou diferença significativa nas médias de absorbância entre pacientes positivos e negativos para dengue e de diferenciar pacientes com dengue positivo e de zika positivo, cujo os resultados de absorbâncias se equipararam aos resultados de pacientes negativos.

Dengue is a serious problem for public health in Brazil and several factors aggravate the situation, one of which is that dengue can be mistaken for other infectious diseases. This work aimed at the production of a chimeric dengue virus polypeptide for the production of a low cost immunodiagnostic kit. Domain E viral envelope protein E, fused to the Elastin-Like Polypeptide (ELP), was used in N. benthamiana. Western blotting results showed that fusion with the ELP tail was better expressed than the non-fused. The ELISA test showed a significant difference in the absorbance means between positive and negative patients for dengue and to differentiate patients with dengue positive and positive zika, whose absorbance results were similar to the results of negative patients.

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O objetivo do estudo foi produzir anticorpos policlonais para vírus bovino e testar a reatividade em imunoensaios como imunofluorescência, imunoperoxidase e slot blot. Como imunógeno utilizou-se cepas e/ou isolados dos herpesvírus bovino tipo 1, 2 e 5 (BoHV-1, BoHV-2 e BoHV-5), vírus da diarreia viral bovina (BVDV), vírus respiratório sincicial bovino (BRSV), vírus da língua azul (BTV) e vírus vaccina (VACV) amplificados em cultivo celular. Os coelhos foram imunizados em intervalos regulares e o soro hiperimune produzido foi utilizado como anticorpo primário nos imunoensaios. A diluição de trabalho para cada antissoro foi determinada por diluição seriada limitante e variaram entre 1:800 e 1:51.200. As maiores diluições foram observadas para imunoperoxidase, quando comparadas com a imunofluorescência e slot blot. Diluições menores que 1:800 foram associadas com aumento de reações inespecíficas. Os antissoros anti-BoHV-1, -BoHV-5, -BVDV e -BRSV reagiram frente a isolados heterólogos em ensaios de imunofluorescência e imunoperoxidase. Conclui-se que os antissoros produzidos possuem elevadas concentrações de anticorpos específicos para os vírus e é uma alternativa para a utilização em imunoensaios.

The objective of the study was to produce polyclonal antibodies to bovine viruses and to test the reactivity in immunoassays such as immunofluorescence, immunoperoxidase and slot blot. Bovine viral diarrhea virus (BVDV), bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bovine herpesvirus type 1, 2 and 5 (BoHV-1, BoHV-2 and BoHV-5) blue tongue virus (BTV) and vaccinia virus (VACV) were amplified in cell culture and used to immunize rabbits. Animals were immunized at regular intervals and the hyper immune serum produced was used as primary antibody in the immunoassays. The working dilution for each antiserum was determined by limiting serial dilution and varied from 1: 800 to 1: 51,200. The highest dilutions were observed for immunoperoxidase, when compared with immunofluorescence and slot blot. Dilutions lower than 1:800 were associated with the presence of nonspecific reactions. Anti-BoHV-1, -BoHV-5, -BVDV and -BRSV antisera reacted against heterologous isolates in immunofluorescence and immunoperoxidase assays. It is concluded that the produced polyclonal antibodies have high concentrations of virus-specific antibodies and are an alternative for use in immunoassays.

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A imuno-histoquímica (IHQ) é considerada uma ferramenta rápida e precisa para a identificação de protozoários, como Toxoplasma gondii, em tecidos fetais e placentários. Neste estudo foi avaliada a imunodetecção de Toxoplasma gondii em tecido placentário de cabras naturalmente infectadas. Foram coletadas e analisadas 80 amostras de placentas de cabras procedentes de único rebanho com sorologia positiva para T. gondii na técnica de ELISA. Na histopatologia, 27/80 amostras apresentaram lesões sugestivas de infecção por protozoários. Após a avaliação histopatológica, procedeu-se à realização da técnica de imuno-histoquímica, obtendo-se 85,2% (23/27) de amostras com marcação positiva. A imunodetecção ocorreu no epitélio de revestimento das vilosidades coriônicas e foi classificada de acordo com o grau de intensidade da imunomarcação. Também foi evidenciada imunomarcação no interior dos vasos sanguíneos fetais em 8,69% (2/23) das amostras. Este estudo demonstrou que a técnica de IHQ se comportou como uma ferramenta valiosa no diagnóstico da infeção por T. gondii em tecido placentário de cabras naturalmente infectadas e complementou, de forma decisiva, o diagnóstico, além de agregar maior valor aos resultados obtidos nas análises histopatológica e sorológica.(AU)

Immunohistochemistry (IHC) is considered to be a rapid and accurate tool for the identification of protozoa such as Toxoplasma gondii in fetal and placental tissues. In this study, we evaluated the immunodetection of Toxoplasma gondii in placental tissue from naturally infected goats. A total of 80 samples of goat placentas from a single herd with positive ELISA serology for T. gondii were collected and analyzed. In the histopathology, 27/80 samples presented lesions suggestive of protozoal infection. After the histopathological evaluation, the immunohistochemistry technique was performed, obtaining 85.2% (23/27) of samples with positive marking. Immunodetection occurred in the lining epithelium of the chorionic villi and was classified according to the degree of intensity of the immunostaining. Immunostaining within the fetal blood vessels was also evidenced in 8.69% (2/23) of the samples. This study demonstrated that the IHQ technique behaved as a valuable tool in the diagnosis of T. gondii infection in placental tissue of naturally infected goats completing the diagnosis in a decisive way and adding greater value to the results obtained in the histopathological and serological analysis.(AU)

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Brucellosis is an infectious disease caused by bacteria of the genus Brucella spp. with diagnosis based on use of serological techniques. The present study aimed to develop and standardize a western blotting (WB) test for detection of antibodies against B. abortus. Samples from two groups of cattle were analyzed: group I: 60 serum samples from true positive and true negative vaccinated animals (30 positive samples from infected animals according to rose bengal test (RBT), 2-mercaptoethanol, serum agglutination test (SAT) and complement fixation test (CFT) and 30 RBT negatives samples); group II: 383 field samples (90 positive and 293 CFT negative sera). The most reactive band in the western blotting, which properly identified and separated infected from non - infected had a molecular weight of ≤ 20kDa. The sensitivity, specificity and accuracy of the WB compared to RBT was 93%, 99%, 98%, respectively and k= 0.938. When compared to CFT, the sensitivity, specificity and accuracy of the WB was 97%, 98% and 97%, respectively and k= 0.929. The WB developed and standardized in the present study is a serological test with potential use as a confirmatory test for the diagnosis of bovine brucellosis.(AU)

A brucelose é uma doença infectocontagiosa, causada por bactérias do gênero Brucella spp., com diagnóstico baseado no emprego de técnicas sorológicas. Objetivou-se neste estudo desenvolver e padronizar um teste Western blotting (WB) para detecção de anticorpos contra B. abortus. Foram analisados dois grupos de amostras bovinas: grupo I, com 60 amostras de animais verdadeiros positivos e verdadeiros negativos vacinados (30 amostras positivas de animais infectados e positivos nos testes de antígeno acidificado tamponado (AAT), 2 - mercaptoetanol (2 - ME), soroaglutinação lenta em tubos (SAT) e fixação do complemento e de 30 amostras negativas no AAT); grupo II, com 383 amostras de campo, sendo 90 soropositivas e 293 soronegativas no TFC. O resultado da análise do WB revelou peso molecular ≤20kDa como sendo a área mais reativa e característica para identificação e separação dos animais infectados dos não infectados. A sensibilidade, a especificidade e a acurácia do WB, quando este foi comparado com o AAT, foram, respectivamente, 93%, 99% e 98%, e k= 0,938. Quando comparadas com a TFC, a sensibilidade, a especificidade e a acurácia foram 97%, 98% e 97%, respectivamente, e k= 0,929. O WB padronizado neste estudo mostrou-se um teste sorológico com potencial uso como teste confirmatório no diagnóstico da brucelose bovina.(AU)

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Background: Passive immunity acquired by colostrum ingestion is essential to prevent neonatal infections. Failure ofpassive transfer (FPT) of maternal immunity occurs in foals that fail to absorb enough immunoglobulins within 24 h afterbirth. Foals with FPT are at increased risk of infections and death. Serum samples from neonatal foals might be examinedfor FPT using the zinc sulphate turbidity (ZST) test. The aim of this study was to investigate the accuracy of the ZST test,performed at two different times after first suckling (12 and 18 h), to detect FPT in newborn foals. The effect of temperatureon the turbidity intensity resulting from the ZST reaction was also investigated.Materials, Methods & Results: Blood samples were collected from 112 newborn foals at 12 h after the first colostrumintake. In 36 foals, additional serum samples were collected at 18 h after first colostrum intake. The serum samples weretested with the ZST test and, later, in the laboratory setting, the ZST test was repeated. The IgG levels were measured bysingle radial immunodiffusion (SRID), which was used as the reference method. The standard solution used for the interpretation of results had a turbidity corresponding to approximately 800 mg/dL of immunoglobulins (IgG). The mean IgG concentration measured at 12 and 18 h after the first colostrum intake was analyzed using the t-test for paired samples.Values of absorbance of ZST test under different temperatures were analyzed using a one-way analysis of variance, andmeans were compared using the Tukey test. The relationship between the temperature of the solution and absorbance wasdetermined using the Pearson’s correlation coefficient. Based on SRID results, 12 foals (10.7%) had serum IgG concentration 0.05) between 12 h (943.9 ± 508.6 mg/dL) and 18 h (975.9 ± 525.6 mg/dL)...

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Os diagnósticos indiretos de afecções helmínticas são muito importantes para o devido combate dessas helmintoses quer na população humana, quer na população animal. Esse diagnóstico, quando da sua suspeita, se realizado de forma prévia, pode contribuir decisivamente para que esses agentes possam ser controlados ou banidos de um grupo animal ou grupo populacional humano em risco. O grande desafio para essas metodologias é assegurar que elas sejam eficazes, ou seja, possam apresentar elevadas sensibilidades e especificidades. Esse presente trabalho tem como objetivo apresentar as metodologias, em especial, as sorológicas, que se apresentam promissoras para o diagnóstico de importantes enfermidades causadas pelos mais importantes helmintos que são responsáveis por importantes e prevalentes enfermidades para o homem e para algumas espécies animais. Neste trabalho, será apresentado um apanhado dessas metodologias que devem se apresentar como práticas, sensíveis, específicas, baratas e disponíveis.

Indirect diagnoses of helminthic conditions are very important for the proper combat of these helminthes both in the human population and in the animal population. This diagnosis, if suspected, if carried out in advance, can contribute decisively to the fact that these agents can be controlled or banned from an animal group or human population group at risk. The great challenge for these methodologies is to ensure that they are effective, that is, they can have high sensitivities and specificities. This present work aims to present the methodologies, especially the serological methods, which are promising for the diagnosis of important diseases caused by the most important helminths that are responsible for important and prevalent diseases for man and for some animal species. In this work, collections of these methodologies are presented as practices, sensible, specific, cheap and available.

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ABSTRACT The study was conducted to compare the specificity of immunological diagnostic methods used for the diagnosis of Cryptosporidium species capable of causing life-threatening infection in both immunosuppressed and immunocompetent patients. For the detection of Cryptosporidium species in 79 animals with diarrhoea, we used three Copro-antigen tests: RIDASCREEN® Cryptosporidium test, Cryptosporidium 2nd Generation (ELISA) and RIDA®QUICK Cryptosporidium. For immunoassays we used positive and negative samples detected by means of polymerase chain reaction and validated by sequencing and nested polymerase chain reaction to confirm the presence six different species of Cryptosporidium species. Prevalence of cryptosporidiosis in the entire group determined by enzyme immunoassay, enzyme linked immunosorbent assay, immuno-chromatographic test and polymerase chain reaction was 34.17%, 27.84%, 6.33% and 27.84%, respectively. Sensitivity of animal samples with enzyme immunoassay, enzyme linked immunosorbent assay, and immuno-chromatographic test was 63.6%, 40.9% and 22.7%, resp., when questionable samples were considered positive, whereas specificity of enzyme immunoassay, enzyme linked immunosorbent assay and immuno-chromatographic test was 75.9%, 78.9% and 100%, respectively. Positive predictive values and negative predictive values were different for all the tests. These differences results are controversial and therefore reliability and reproducibility of immunoassays as the only diagnostic method is questionable. The use of various Cryptosporidium species in diagnosis based on immunological testing and different results obtained by individual tests indicate potential differences in Copro-antigens produced by individual Cryptosporidium species.

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In areas where human tuberculosis and bovine tuberculosis coexist, differentiation between M. bovis and M. tuberculosis is important for monitoring the spread of M. bovis among cattle and from cattle to humans. The objective of this study was to isolate and identify M. bovis in bovines with positive diagnosis identified on tuberculin test in the State of Paraíba, Northeastern Brazil. Thirty-two bovines that tested positive in the comparative tuberculin test were used, from which samples of any organ with lesions suggestive of tuberculosis were collected, as well as lymph nodes, when no gross lesions were observed. Samples were submitted to histopathological exam, mycobacterial culture, Ziehl-Neelsen staining and molecular diagnosis. Twenty-one (65.6%) animals presented lesions suggestive of tuberculosis. As to body region 77.7% of lesions were found in the thoracic cavity, 12.4% in the head and 9.9% in the abdominal cavity. Among 55 samples submitted to mycobacterial culture, mycobacteria were isolated in 31 (56.4%), being 13 (41.9%) identified as M. bovis and 18 (58.1%) as Mycobacterium spp. Conclusion is that isolation and identification of M. bovis and Mycobacterium spp. in cattle suggests that humans are exposed to the risk of infection. This reinforces the need for intensification and optimization of prevention and control measures foreseen in the Brazilian National Program for the Control and Eradication of Bovine Brucellosis and Tuberculosis. Mycobacteria isolation and identification surveys are, therefore, encouraged in other Northeastern states.(AU)

Em áreas onde a tuberculose humana e a tuberculose bovina coexistem, a diferenciação entre M. bovis e M. tuberculosis é importante para monitorar a disseminação de M. bovis entre bovinos e destes para os seres humanos. Objetivou-se neste estudo isolar e identificar M. bovis em bovinos com diagnóstico positivo pelo teste de tuberculinização no estado da Paraíba, nordeste do Brasil. Foram submetidos 32 bovinos positivos ao teste de tuberculinização comparativa, dos quais foram colhidas amostras de qualquer órgão com lesões sugestivas de tuberculose, e, nos casos em que não foram observadas lesões sugestivas, foram colhidas amostras de linfonodos. As amostras foram submetidas a exame histopatológico, cultivo micobacteriológico, coloração de Ziehl-Neelsen e diagnóstico molecular. Apresentaram lesões sugestivas de tuberculose 21 animais (65,6%). Com relação à distribuição das lesões de acordo com a região corporal, 77,7% localizavam-se na cavidade torácica, 12,4% na cabeça e 9,9% na cavidade abdominal. De 55 amostras submetidas ao cultivo de micobactérias, em 31 (56,4%) foram isoladas micobactérias, sendo que em 13 (41,9%) foi identificado M. bovis, e nas 18 restantes (58,1%) foi identificado Mycobacterium spp. Conclui-se que o isolamento e a identificação de M. bovis e Mycobacterium spp. em bovinos indicam que os seres humanos estão expostos ao risco de infecção. Isso reforça a necessidade de intensificação e otimização de medidas de prevenção e controle previstas no Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Bovina. Sugere-se a realização de estudos de isolamento e identificação de micobactérias em outros estados do Nordeste.(AU)

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Abstract The aim of this study was to identify possible infection of Toxoplasma gondii among cats in a shelter and a set of condominiums in the city of Rio de Janeiro, through changes to the cats' serological status between two different times in 2014 and 2015. One group was made up of captive cats at the municipal shelter and the other comprised stray cats that circulated in condominiums in the city. On the first occasion, cats were caught and tagged through application of microchips; in this manner, blood samples were obtained from 261 captive cats and 172 stray cats. On the second occasion, blood samples were obtained from 94 captive cats and 56 recaptured stray cats. The serological diagnosis was made by means of the indirect hemagglutination assay (IHA) and indirect immunofluorescence reaction (IFAT) (cutoff ≥ 64). The frequency of T. gondii infection among the captive cats was 24.5% and among the stray cats, 18%. With the second analysis, it was possible to verify modifications to the serological status of anti-T. gondii antibodies, in 18% of both populations of animals. The presence of seroconversion shows that infection was possibly occurring in the region at the time of the study.

Resumo O objetivo deste estudo foi identificar uma possível infecção por Toxoplasma gondii entre gatos de abrigo e de um conjunto de condomínios na cidade do Rio de Janeiro, por meio de mudanças no status sorológico dos gatos em dois momentos diferentes em 2014 e 2015. O grupo foi formado por gatos, denominados cativos, de um abrigo municipal, e o outro por gatos de rua que circulavam em condomínios da cidade. Na primeira ocasião, os gatos foram capturados, microchipados e coletadas amostras de sangue de 261 gatos cativos e de 172 gatos de rua. Na segunda ocasião, as amostras de sangue foram obtidas de 94 gatos cativos e 56 de gatos de rua recapturados. O diagnóstico sorológico foi realizado por meio do ensaio de hemaglutinação indireta (HAI) e pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI) (ponto de corte ≥ 64). A frequência de infecção por T. gondii entre os gatos cativos foi de 24,5% e entre os gatos de rua 18%. Com a segunda análise, foi possível verificar modificações no status sorológico de anticorpos anti-T. gondii, em 18% em ambas populações de animais. A presença de soroconversão mostra que a infecção possivelmente ocorreu na região no momento do estudo.

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Considerando-se que o immunoblotting para o imunodiagnóstico da paracoccidioidomicose (PCM) é uma metodologia in house e laboriosa envolvendo duas etapas iniciais, SDS-PAGE e Western blot, neste estudo foi avaliado o tempo de prateleira das membranas de nitrocelulose sensibilizadas com antígeno de P. brasiliensis, armazenadas a -20 oC durante 7, 15, 30, 45, 60 e 90 dias. Vinte e oito amostras de soro foram analisadas em dois grupos de membranas de nitrocelulose (membranas previamente bloqueadas com PBS-leite 5 % e as não-bloqueadas). Não houve diferença no padrão de reatividade quando os soros foram avaliados frente a ambos os grupos, especialmente para membranas armazenadas por 7, 15, 30, 45 e 60 dias. A boa estabilidade do antígeno utilizado para sensibilizar as membranas fez com que estas pudessem ser armazenadas a -20 °C até 60 dias. Estas características contribuem para efetuar o diagnóstico rápido da PCM, bem como as perspectivas dessas membranas sensibilizadas serem encaminhadas para os laboratórios, que não possuam infraestrutura necessária para executar as etapas que antecedem a realização de immunoblotting, como a produção de antígeno, as técnicas de SDS PAGE e Western blot. Este procedimento contribui substancialmente para melhorar o diagnóstico sorológico da PCM, pois poderá fornecer resultados reprodutíveis nas unidades componentes da Rede de Laboratórios.

The immunoblotting reaction for performing the paracoccidioidomycosis (PCM) immunodiagnosis is an in-house methodology; and being a laborious task involving two previous steps, SDS-PAGE and Western blot, we evaluated the shelf life of nitrocellulose membranes containing the immobilized P. brasiliensis antigens, stored at -20 oC for 7, 15, 30, 45, 60 and 90 days. Twenty-eight serum samples were analyzed on two nitrocellulose membranes groups: (a) membranes previously blocked with PBS-5 % non-fat dry milk and (b) the priory non-blocked membranes. No difference was detected in the reactivity pattern in serum samples evaluated in the both membrane groups, especially for those stored for 7, 15, 30, 45 and 60 days. It might be emphasized that a good stability of P. brasiliensis antigens, immobilized on the nitrocellulose membranes, enable them to be stored up to 60 daysat -20 oC. This finding contributes to the rapid diagnosis of PCM, and for sending them to other laboratories without adequate infrastructure for carrying out the steps that precede the immunodetection as the antigen production, SDS-PAGE and Western blot techniques. This scheme contributes substantially to improve the quality of PCM serodiagnosis, as it provides reproducible results in the units of the Laboratory Network.

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Trypanosoma vivax gera perdas econômicas para a pecuária, como perdas na produção de leite, perda de peso, febre, distúrbios neurológicos, aborto, estro de repetição, infertilidade e morte de animais infectados. Na década de 70, a doença era restrita aos estados do Nordeste. A partir de 2009, surtos da doença passaram a ser notificados em vários estados do Brasil, incluindo o Rio Grande do Sul. O diagnóstico da tripanossomose geralmente é realizado através da avaliação clínico-hematológica dos animais (temperatura retal, frequência cardíaca, frequência respiratória, tempo de enchimento capilar, eritrograma e leucograma) associado ao uso de técnicas de diagnóstico parasitológico (microhematócrito e Buffy coat); sorológico (imunofluorescência indireta, ELISA, técnica de aglutinação direta e teste de tripanólise), além de testes moleculares (PCR). Os testes, no entanto, apresentam limitações. Os testes parasitológicos podem ter baixa sensibilidade na fase crônica da infecção devido à diminuição parasitemia em animais, os testes sorológicos geralmente não distinguem o curso da infecção e os testes de PCR não são satisfatórios quando há baixo ou nenhuma parasitemia. A cromatografia acoplada com espectrometria de massa para identificar proteínas podem, após análise por bioinformática, auxiliar na busca de novos alvos a serem usados como biomarcadores antígenos espécie-específicos. No presente trabalho foram produzidos anticorpos policlonais eficazes para diagnóstico por meio da imunização de ratos com o T. vivax, os quais se apresentaram eficazes para diagnóstico de T. vivax quando utilizados na imuno-histoquímica. Além do mais, através de análises por bioinformática foram identificadas e mapeadas 35 proteínas epítopos específicos para T. vivax. Os resultados deste trabalho oferecem ferramentas para a produção de um novo método diagnóstico para infecções por T. vivax mais eficaz que os utilizados atualmente.

Trypanosoma vivax generates economic losses for livestock, such as losses in milk production, weight loss, fever, neurological disorders, abortion, repeated estrus, infertility and death of infected animals. In the 70s, the disease was restricted to the Northeastern states. As of 2009, outbreaks of the disease began to be reported in several states of Brazil, including Rio Grande do Sul. The capillary refill time, erythrogram and leukogram) associated with the use of parasitological diagnostic techniques (microhematocrit and Buffy coat); serological (indirect immunofluorescence, ELISA, direct agglutination technique and trypanolysis test), in addition to molecular tests (PCR). The tests, however, have limitations. Parasitological tests may have low sensitivity in the chronic phase of infection due to decreased parasitaemia in animals, serological tests generally do not distinguish the course of infection, and PCR tests are not satisfactory when there is low or no parasitaemia. Chromatography coupled with mass spectrometry to identify proteins can, after bioinformatics analysis, help in the search for new targets to be used as species-specific antigen biomarkers. In the present work, effective polyclonal antibodies were produced for diagnosis through the immunization of mice with T. vivax, which were effective for the diagnosis of T. vivax when used in immunohistochemistry. Furthermore, through bioinformatics analysis, 35 protein epitopes specific to T. vivax were identified and mapped. The results of this work offer tools for the production of a new diagnostic method for T. vivax infections that is more effective than those currently used.

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O imunodiagnóstico aplicado à identificação da artrite encefalite caprina (CAE) é considerado a melhor alternativa para a prevenção e controle da infecção, possibilitando a detecção dos animais infectados na fase precoce. O processo de produção dos antígenos é fundamental para a realização desse teste, o que torna de suma importância o desenvolvimento de pesquisas que contribuam com sua produção. Desta forma, objetivou-se com esta pesquisa produzir antígeno viral através do uso de células fibroblásticas de bovinos (CFBov) infectadas com o vírus da artrite encefalite caprina (CAEV), sem tratamento prévio e tratadas com os detergentes Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), Triton X-100 e Tween 20, para utilização em testes de IDGA. Foram utilizadas 270 amostras de soro obtidas no banco de soro do Laboratório de Virologia Animal (LAVIAN) da Universidade Federal Rural de Pernambuco, oruindas de caprinos oriundos de rebanhos do Estado, soronegativos e soropositivos testados para CAEV. Ao analisar os resultados constatou-se que 38 amostras foram positivas (14,07%) e 232 negativas (85,92%) quando testadas com antígeno puro sem nenhum tratamento; 39 amostras foram positivas (14,44%) e 231 negativas (85,55%) quando tratadas com o detergente SDS; 35 amostras foram positivas (12,96%) e 235 negativas (87,03%) quando tratadas com o detergente Triton X-100 e 36 amostras foram positivas (13,33%) e 234 negativas (86,66%) quando tratadas com o detergente Tween 20. A sensibilidade e especificidade para cada teste foi calculada referente ao antígeno comercial e os testes alcançaram 94,7% e 99,6% para o antígeno puro, 97,4% e 98,7% para o SDS, 97,2% e 98,7% para o Triton X-100 e 97,3% e 99,1% para o Tween 20, sendo o SDS o mais eficiente. O coeficiente Kappa foi 1,0. A produção de antígenos a partir de células bovinas e sua purificação utilizando SDS como detergente, mostrou-se como uma alternativa de alta qualidade e eficaz para o diagnóstico da CAE.

The immunodiagnosis applied to the identification of caprine arthritis encephalitis (CAE) is considered the best alternative for the prevention and control of infections, enabling the detection of infected animals at an early stage. The production process of the antigens is fundamental for the performance of this test, which makes the development of research contributing to obtaining it, extremely important. The objective of this research was to produce viral antigen through bovine fibroblastic cells (CFBov) infected with the caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) for use in IDGA tests, without previous treatment and treated with Sodium Duodecyl Sulfate (SDS) detergents, Triton X-100 and Tween 20. 270 serum samples obtained from the serum bank of the Animal Virology Laboratory (LAVIAN) of the Federal Rural University of Pernambuco, from goats from local herds, seronegative and seropositive tested for CAEV, were used. When analyzing the results, it was found that 38 samples were positive (14.07%) and 232 negative (85.92%) when tested with pure antigen without any treatment; 39 samples were positive (14.44%) and 231 negative (85.55%) when treated with the SDS detergent; 35 samples were positive (12.96%) and 235 negative (87.03%) when treated with Triton X-100 detergent; and 36 samples were positive (13.33%) and 234 negative (86.66%) when treated with the Tween 20 detergent. The sensitivity and specificity for each treatment was calculated and the tests reached relating to commercial antigen respectively, 94.7% and 99.6% for pure antigen; 97.4% and 98.7% for SDS; 97.2% and 98.7% for Triton X-100; and, 97.3% and 99.1% for Tween 20, with SDS being the most efficient. The kappa coeficiente was 1.0. The production of antigens from bovine cells and their purification using SDS as a detergent, proved to be a high quality and effective alternative for the diagnosis of CAE.

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Background: Buffaloes are susceptible to viral infections, often associated with pathologies of importance in cattle breeding.Among the numerous infectious diseases, Bovine Viral Diarrhea (BVDV) and Bovine Infectious Rhinotracheitis (IBR) havea negative impact on buffalo creations. This study aimed to detect the occurrence of bovine viral diarrhea virus (BVDV)and infectious bovine rhinotracheitis (IBR) virus infections in buffaloes in Pernambuco state, Brazil.Materials, Methods & Results: For this purpose, serum samples were obtained from 244 buffaloes on eight properties distributedin six municipalities. The search for anti-BVDV and -bovine herpesvirus type-1 (BoHV-1) antibodies was performedusing the virus neutralization technique. To analyze the association between the serological status of BoHV-1 infection andaspects of hygienic-sanitary and reproductive management, an investigative questionnaire with objective questions wasused. In total, 97.9% (239/244) of buffaloes had anti-BVDV antibodies and 56.1% (137/244) had anti-BoHV-1 antibodies.Co-infection was observed in 55.3% (135/244) of buffaloes. The distribution of antibody occurrence in buffaloes byproperties ranged from 90.5% to 100.0% for BVDV and from 4.8% to 100% for BoHV-1. It was not possible to performan association analysis for BVDV infection; however, in that for BoHV-1 infection, the following variables exhibited asignificant association: an extensive breeding system (P < 0.001), open herd (P = 0.029), lack of reproductive rest (P =0.029), natural mating in females with reproductive disorders (P < 0.001), exploration type (P = 0.0014), presence of wildanimals (P < 0.001), and lack of cleaning facilities (P = 0.008).Discussion: The occurrence of anti-BVDV antibodies in this study was 97.9% this was higher than those reported in othercountry’s regions. The results of the present study demonstrate a high occurrence of anti-BVDV antibodies in [...]