Diversidade genética e potencial deteriorante de fungos leveduriformes e filamentosos isolados em queijos tipo Minas Frescal comercializados informalmente na região Norte do Tocantins

O queijo é um produto resultante da coagulação enzimática do leite, complementado ou não com bactérias láticas específicas. A composição comum do queijo favorece a multiplicação de micro-organismos patogênicos. A contaminação fúngica desse produto pode comprometer a qualidade, pois tais agentes tem alto potencial deteriorante, além de trazer riscos para a saúde pública. Objetivou-se nesse estudo verificar a diversidade genética e o potencial deteriorante de fungos leveduriformes e filamentosos isolados em 20 amostras de queijos tipo Minas Frescal comercializados de forma ilegal, em feiras livres na região norte do Tocantins. Foram realizadas contagens de fungos filamentosos e leveduriformes, verificação da atividade proteolítica, lipolítica e sacarolítica em diferentes temperaturas dos isolados obtidos e identificação dos gêneros dos fungos filamentosos e identificação das espécies de leveduras por meio da amplificação das regiões espaçadoras transcritas internas (ITS) do DNA, sequenciamento e identificação por similaridade usando a ferramenta BLAST para comparação com as sequencias depositadas no GenBank do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Foi observado que 45% das amostras de queijo tiveram a presença de fungos filamentosos e 100% a presença de leveduras, apresentando contagem média 7,6 (±2,6) x 105 UFC/g. O gênero de fungo filamentoso predominante foi o Penicillium spp., representando 47,36% (9/19) das morfoespécies, sendo um gênero conhecido por conter espécies produtoras de micotoxinas. A espécie de levedura predominante foi a Kluveromyces lactis seguida da Clavispora lusitaniae. Dos fungos filamentosos isolados 73,68% (14/19) tem potencial proteolítico, sendo que quatro (21,05%) tiveram crescimento tanto em temperatura mesófila como psicrotrófica. A atividade proteolítica de leveduriformes foi de 64% (16/25), das quais 37,50% (6/16) dessas produziram proteases em temperatura psicrotrófica. Dos filamentosos, 89,47% (17/19) tiveram atividade lipolítica, na qual 57,89% produziram lipases nas duas temperaturas submetidas. Com relação às leveduras, 92% (23/25) tiveram atividade lipolítica sendo 86,95% (20/25) psicrotrófica. Em relação à atividade acidificante em diferentes açúcares, a maioria dos isolados teve maior ação sobre a dextrose, tanto filamentosos quanto leveduriformes. Conclui-se que os queijos clandestinos comercializados em feiras livres em Araguaína são inapropriados para o consumo e são necessárias políticas públicas que acentuem a educação sanitária e que a fiscalização seja mais intensiva coibindo a comercialização ilegal de produtos e subprodutos de origem animal que podem oferecer risco ao consumidor.

Cheese is a product resulting from the enzymatic coagulation of milk, complemented or not with specific lactic bacteria. The common cheese composition favors the multiplication of pathogenic microorganisms. The fungal contamination of this product can compromise the quality, as these agents have a high deteriorating potential, in addition to posing risks to public health. The objective of this study was to verify the genetic diversity and the damaging potential of yeast and filamentous fungi isolated in 20 samples of Minas Frescal cheeses sold illegally, in open markets in the northern region of Tocantins. Filamentous and yeast-yeast fungi counts were performed, verification of proteolytic, lipolytic and saccharolytic activity at different temperatures of the obtained isolates. The amplification of the internal transcribed spacer regions (ITS) of the DNA, sequencing and identification by similarity using the BLAST tool for comparison with the sequences deposited in the GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). It was observed that 45% of the cheese samples had the presence of filamentous fungi and 100% the presence of yeasts, with an average count of 7.6 (± 2.6) x 105 CFU / g. The predominant genus of filamentous fungus was Penicillium spp., Representing 47.36% (9/19) of morphospecies, being a genus known for containing mycotoxin-producing species. The predominant yeast species was Kluveromyces lactis followed by Clavispora lusitaniae. Of the isolated filamentous fungi 73.68% (14/19) have proteolytic potential, with four (21.05%) growing in both mesophilic and psychrotrophic temperatures. The proteolytic activity of yeasts was 64% (16/25), of which 37.50% (6/16) of these produced proteases at psychrotrophic temperature. Of the filaments, 89.47% (17/19) had lipolytic activity, in which 57.89% produced lipases at the two temperatures submitted. Regarding yeasts, 92% (23/25) had lipolytic activity and 86.95% (20/25) were psychrotrophic. Regarding the acidifying activity in different sugars, most of the isolates had a greater action on dextrose, both filamentous and yeast. It is concluded that clandestine cheeses marketed in open markets in Araguaína are unsuitable for consumption and public policies are needed that enhance health education and that inspection is more intensive, preventing the illegal commercialization of products and by-products of animal origin that may pose a risk. to the consumer.

ANÁLISE GENÉTICA E DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO DE DIAGNÓSTICO, BASEADO EM PCR, PARA DETECÇÃO DE Cyniclomyces guttulatus EM FEZES DE CÃES

O significado das infecções fúngicas dos animais tem sido amplamente ignorado por muitos veterinários. No entanto, problemas recentes de doenças fúngicas de destaque, por exemplo, a esporotricose de felinos e humanos no Brasil e a criptococose zoonótica em todo o mundo, demonstraram a necessidade de reverter essa tendência negativa há muito estabelecida. A levedura ascomicética Cyniclomyces guttulatus é a única espécie atualmente incluída no gênero Cyniclomyces. Tradicionalmente, era vista como um componente comensal da microbiota intestinal de coelhos e outros herbívoros. O aumento do interesse em C. guttulatus se desenvolveu com base em relatos da Europa, Ásia, América do Norte e Brasil, sugerindo que C. guttulatus representava um patógeno emergente e / ou oportunista de cães, onde sua presença em números elevados, estava ligada a sinais clínicos, incluindo diarreia, gastroenterite e colangiohepatite. No entanto, pesquisas recentes conduzidas na Holanda e nos Estados Unidos argumentaram que a presença dessa levedura em cães que sofrem de doença gastrintestinal é provavelmente mais circunstancial e não tem relevância clínica. O diagnóstico de C. guttulatus em fezes e / ou em material clínico é realizado principalmente usando análises microscópicas e microbiológicas baseadas em cultura. Em uma minoria de estudos, a identificação definitiva das colônias da levedura foi feita usando amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento de um fragmento do gene 26S rDNA (codifica a subunidade maior do RNA ribossomal). O presente estudo relata o desenvolvimento de métodos moleculares inovadores para detecção e caracterização de culturas de leveduras e para a detecção e caracterização independente de cultura de C. guttulatus diretamente de fezes de cães. A disponibilidade dos ensaios servirá para reduzir as dúvidas sobre a validade dos diagnósticos morfológicos e pode reduzir o tempo para confirmação do diagnóstico molecular em até 48 horas, ao invés do prazo atual de 7 a 10 dias. A genotipagem de uma coleção de isolados de porquinhos-da-índia (n = 1), coelhos (n = 20) e cães (n = 8) utilizou amplificação por PCR e sequenciamento de fragmentos das sequências que codificam as subunidades maior (26S) e menor (18S) do DNA ribossomal, as subunidades RPB1 e RPB2 do gene que codifica a RNA polimerase II, o citocromo oxidase II e as regiões espaçadoras internas transcritas (ITS). Alinhamentos de sequências e avaliações da similaridade de nucleotídeos para a maioria das sequências serviram para apoiar dados de estudos anteriores que sugeriram a possível existência de duas espécies de Cyniclomyces. Curiosamente, o uso da região ITS indicou que pode haver pelo menos três espécies de Cyniclomyces. Conclui-se que a identificação das novas espécies de Cyniclomyces questiona grande parte dos dados produzidos até o momento em relação à patogenicidade desse organismo. Prevê-se que os resultados deste trabalho sirvam para estimular uma expansão do estudo do gênero Cyniclomyces e, como tal, contribuam significativamente para a compreensão do seu papel na saúde dos cães

Many veterinary scientists have largely overlooked the significance of fungal infections in animals. However, recent high-profile fungal disease problems e.g. sporotrichosis of felines and humans in Brazil and zoonotic cryptococcosis worldwide, have demonstrated the need to revert this long-established negative trend. The ascomycete yeast Cyniclomyces guttulatusis is the only species currently included in the genus Cyniclomyces. Traditionally, it was viewed as a commensal component of the gut microbiota of rabbits and other herbivores. Increased interest in C. guttulatus developed based on reports from Europe, Asia, North America and Brazil suggesting that C. guttulatus represented an emerging and/or opportunistic pathogen in dogs, where its presence, in large numbers, was linked to clinical signs including diarrhea, gastroenteritis and cholangiohepatitis. However, recent investigations conducted in The Netherlands and the United States have argued that the presence of this yeast in dogs suffering gastrointestinal disease is most likely circumstantial and is not of clinical relevance. Diagnosis of C. guttulatus in feces and/or in clinical material is conducted primarily using microscopic and microbiological, culture-based analyses. In a minority of studies, definitive identification of yeast colonies was made using polymerase chain reaction (PCR) amplification and sequencing of a fragment of the universal yeast gene 26S (encodes for the large subunit of ribosomal RNA). The current study reports the development of innovative, molecular methods for the detection and characterization of yeast cultures and for the culture-independent detection and characterization of C. guttulatus directly from canine feces. The availability of the assays will serve to reduce doubt over the validity of morphological diagnostics and can reduce the time for a confirmed molecular diagnosis to 48 hours, rather than the actual timescale of 7-10 days. Genotyping of a collection of isolates from guinea pigs (n=1), rabbits (n= 20) and dogs (n=8), used PCR-based amplification and sequencing of fragments of the sequences encoding the large (26S) and small (18S) subunits of ribosomal rDNA, the subunits RPB1 and RPB2 of the gene encoding RNA polymerase II, Cytochrome oxidase II and the internal transcribed spacer (ITS) regions of the nuclear ribosomal RNA gene cluster. Sequence alignments and evaluations of nucleotide similarity for most sequences, served to support data from earlier studies, which had suggested the possible existence of two species of Cyniclomyces. Intriguingly, the use of the ITS region indicated that there may exist at least three species of Cyniclomyces. The identification of the new species of Cyniclomyces calls into question much of the data produced until now in relation to the pathogenicity of this organism. It is envisaged that the findings of this research will serve to stimulate an expansion in the study of the genus Cyniclomyces, and as such will make significant contributions to our comprehension of its role in canine health.

Pesquisa de coccídios da família Sarcocystidae em pinguins-de-magalhães (Spheniscus magellanicus) encalhados na costa brasileira

O gênero Sarcocystis é constituído por várias espécies que se diferenciam pelas características morfológicas, biológicas e moleculares. Foram relatadas mais de 196 espécies encontradas em mamíferos, aves e répteis e somente 26 dessas espécies possuem o ciclo completo conhecido. Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório, com distribuição geográfica cosmopolita, capaz de infectar uma ampla variedade de mamíferos e aves, inclusive o homem, caracterizando seu potencial zoonótico. Nas últimas décadas, a quantidade de pinguins vindos da Patagônia argentina e chilena, região de nascimento dessas aves, para o litoral brasileiro, onde muitos encalham e são resgatados, tem aumentado significativamente. Pouco se sabe sobre as doenças causadas por protozoários nessas aves. O presente estudo teve como objetivo conhecer aspectos epidemiológicos da infecção por coccídios da família Sarcocystidae em pinguins-de-magalhães (Spheniscus magellanicus), através de análises moleculares e sorológicas. Foram realizadas duas campanhas, uma em 2014 e outra em 2015, com a finalidade de obter amostras de sangue e tecidos dos pinguins que vieram a óbito durante reabilitação no Instituto de Pesquisa e Reabilitação de Animais Marinhos (IPRAM) localizada em Cariacica, Espírito Santo. Foram colhidas 514 amostras de tecidos (músculo=342, coração=86, cérebro=86) de 310 indivíduos. Dos tecidos de 54 pinguins foi realizado o bioensaio em camundongos para o isolamento de T. gondii, mas nenhum isolado foi obtido. Amostras de 310 indivíduos tiveram o DNA extraído para a pesquisa de coccídios da família Sarcocystidae utilizando-se os marcadores 18S rDNA, espaçador interno transcrito 1 (ITS1), codificador de proteínas de superfície (SAG)2, SAG3 e SAG4, subunidade beta da RNA polimerase (RPOB) e citocromo B (CytB). Destas, 16 (3.0%) amostras de músculo peitoral foram positivas para o gênero Sarcocystis spp., quando analisadas pelo marcador 18S, e todas com resultados idênticos. Com o ITS1, RPOB e Ctv. foram confirmadas as espécies de Sarcocystis em 12 amostras, todas idênticas a S. falcatula-like. Com os marcadores SAGs foi possível observar que as sequências não tinham variabilidade genética. Das 145 amostras de soro avaliadas para a presença de anticorpos anti-T. gondii, pelo Teste de Aglutinação Modificado (MAT 20), 18 aves foram positivas com títulos de: 20 (7 aves), 40 (9 aves) e 80 (2 aves). Este é o primeiro relato de S. falcatula-like e de anticorpos anti - T. gondii em pinguins-de-magalhães de vida livre.

The genus Sarcocystis is composed of several species that are differentiated by the morphological, biological and molecular characteristics. More than 196 species found in mammals, birds and reptiles have been reported, and only 26 of these species have the complete known cycle. Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite with cosmopolitan geographic distribution, capable of infecting a wide variety of mammals and birds, including man, characterizing its zoonotic potential. In recent decades, the number of penguins that have come from Argentine and Chilean Patagonia, the region of birth of these birds, to the Brazilian coast, where many of them are stranded and rescued, has increased significantly. Little is known about the diseases caused by protozoa in these birds. The present study had as objective to study epidemiological aspects of coccidia infection of the family Sarcocystidae in Magellanic Penguins (Spheniscus magellanicus), through molecular and serological analyzes. Two campaigns were carried out, one in 2014 and another in 2015, in order to obtain blood and tissue samples from penguins who died during rehabilitation at the Institute of Research and Rehabilitation of Marine Animals (IPRAM) in the municipality of Cariacica, Espírito Santo. Tissue samples (total = 514: muscle = 342, heart = 86, brain = 86) were collected from 310 birds. From the tissues of 54 penguins the mouse bioassay was performed for the isolation of T. gondii, but no isolates were obtained. Samples of 310 individuals had DNA extracted for coccidia from the Sarcocystidae family using the 18S rDNA, Transcribed internal spacer 1(ITS1), surface protein encoder (SAG)2, SAG3, SAG4, beta subunit of RNA polymerase (RPOB) and citocrome B (CytB) markers. Of these, 16 (3.0%) samples, of pectoral muscle, were positive and all were identical to Sarcocystis spp. when analyzed by the 18S marker. With ITS1, RPOB and CytB the Sarcocystis species were confirmed in 12 samples, all identical to S. falcatula-like. With the SAGs it was possible to observe that the sequences had no genetic variability. Of the 145 serum samples evaluated for the presence of anti-T. gondii antibodies by Modified Agglutination Test (MAT 20), 18 were positive with titers of: 20 (7 birds), 40 (9 birds) and 80 (2 birds). This is the first report of S. falcatula-like and the presence of antibodies to T. gondii in free-living magellanic penguins.

Avaliação do potencial de transmissão vetorial do Trypanosoma cruzi no estado do Rio Grande do Norte: aspectos epidemiológicos e taxonômicos de triatomíneos (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae)

A infestação dos ecótopos artificiais por triatomíneos, as ações de controle vetorial, a infecção natural por tripanossomatídeos e a distribuição territorial desses vetores foram avaliadas nos municípios do Rio Grande do Norte, Brasil, a partir dos dados disponibilizados pela Secretaria de Estado de Saúde Pública no período de 2005 a 2015 e no município de Caraúbas no período de 2010 a 2016. A fauna triatomínica silvestre, a infecção natural por tripanossomatídeos e a sua associação com a fonte de alimentação foram avaliadas na Estação Ecológica do Seridó, em Serra Negra do Norte. Além disso, a possibilidade da existência de híbridos naturais entre Triatoma brasiliensis e Triatoma petrocchiae também foi analisada morfologicamente e por sequenciamento do DNA mitocondrial, o citocromo b (Cyt b), e nuclear, o espaçador interno transcrito (ITS-1). Os dados mostraram que 67,7% (113/167) dos municípios realizaram a busca ativa e 110 registraram a ocorrência de triatomíneos nas unidades domiciliares (UDs). Os índices de colonização foram elevados ao logo dos anos pesquisados e, apesar disso, o número de UDs borrifadas foi inferior ao de positivas. Um total de 51.569 triatomíneos foi capturado, sendo T. brasiliensis (47,20%) e Triatoma pseudomaculata (40,22%) as espécies mais capturadas. A colonização intradomiciliar e peridomiciliar foi demonstrada pelas espécies T. brasiliensis, T. pseudomaculata, Panstrongylus lutzi e Rhodnius nasutus. A infecção natural por tripanossomatídeos foi detectada em 2,4% dos espécimes, sendo mais elevada em T. brasiliensis (3,2%). Em Caraúbas, as atividades de controle ocorreram de forma descontínua, e mesmo com a presença de ninfas, as UDs não foram borrifadas em 2013, 2014 e 2016. As espécies mais capturadas nos últimos anos foram T. brasiliensis (n = 244) e T. pseudomaculata (n = 315). Os dados primários revelaram a elevada infestação dos ecótopos peridomiciliares como galinheiro, curral e pilha de telhas, onde T. brasiliensis e T. pseudomaculata apresentaram elevados percentuais de infecção pelo T. cruzi. A espécie T. brasiliensis foi a mais eclética, sendo o Homo sapiens a fonte alimentar frequentemente identificada no intradomicílio e peridomicílio, enquanto para o T. pseudomaculata a fonte mais detectada foi Gallus gallus. No ambiente silvestre, T. brasiliensis foi encontrado em afloramentos de rochas, juntamente com espécimes de Triatoma sp., e T. pseudomaculata em troncos de árvores da espécie Anadenanthera colubrina. As fontes alimentares do T. brasiliensis foram os roedores Thrichomys apereoides (30%) e Galea spixii (30%). Nesse estudo nós registramos o primeiro encontro de Psammolestes tertius no estado, aumentando a área de distribuição geográfica dessa espécie. O P. lutzi apresentou o índice de infecção pelo T. cruzi mais elevado (64,8%), e o genótipo identificado foi TcIII. O Trypanosoma rangeli foi identificado em apenas um espécime dessa espécie. T. cruzi II e III foram detectados na espécie T. brasiliensis. Na análise morfológica, Triatoma sp. apresentou semelhança com o T. petrocchiae. A similaridade genética entre essas duas espécies foi demonstrada utilizando o marcador ITS-1, as quais formaram um único clado. Entretanto, na análise das sequências do Cytb, o Triatoma sp., T. brasiliensis e T. petrocchiae formaram clados distintos, sugerindo a existência de uma nova espécie, porém, é necessário a realização de outras análises para essa comprovação. O aumento dos índices de infestação e colonização dos triatomíneos, a presença desses vetores infectados e alimentados com sangue humano e de vários animais e, a circulação de animais silvestres infectados no ambiente antrópico, alerta para a possibilidade de transmissão do T. cruzi para o homem e animais domésticos. Os dados desse estudo reforçam que a VE e o controle vetorial nos municípios são imprescindíveis para evitar o contato de espécies como, T. brasiliensis, T. pseudomaculata e P. lutzi com a população e animais.

The infestation of the artificial ecotopes by triatomines, the vector control actions, the natural infection by trypanosomatids and the territorial distribution of these vectors were evaluated in the municipalities of the State of Rio Grande do Norte, Brazil, based on the temporal analysis of the data provided by the State Secretariat of Public Health in the period from 2005 to 2015 and in the municipality of Caraúbas in the period from 2010 to 2016. The wild triatomine fauna, the natural infection by trypanosomatids and their association with the food source were evaluated at the Seridó Ecological Station, in Serra Negra do Norte. In addition, the possibility of natural hybrids between Triatoma brasiliensis and Triatoma petrocchiae, was analyzed morphologically and by sequencing of mitochondrial DNA, cytochrome b (Cyt b), and nuclear, internal transcribed spacer (ITS-1). The data showed that 67,7% (113/167) of the municipalities performed the active search and 110 municipalities registered the occurrence of triatomines in the domiciliary units (DUs). Colonization rates were high during the surveyed years, and despite that, the number of DUs sprayed was lower than the positive ones. A total of 51.569 triatomines were captured, with T. brasiliensis (47,20%) and T. pseudomaculata (40,22%) being the most captured species. The indoor and outdoor colonization was demonstrated by the species T. brasiliensis, T. pseudomaculata, Panstrongylus lutzi and Rhodnius nasutus. The natural infection by trypanosomatids was detected in 2,4% of the specimens, being higher in T. brasiliensis (3,2%). In Caraúbas, the vector control activities occurred discontinuously, and even with the presence of nymphs, the DUs were not sprayed in 2013, 2014 and 2016. The most captured species in the last years were T. brasiliensis (n = 244) and T. pseudomaculata (n = 315). The primary data revealed the high infestation of outdoors ecotopes such as chicken coop, corral and pile of shingles, where T. brasiliensis and T. pseudomaculata presented high percentages of Trypanosoma cruzi infection. T. brasiliensis was the most eclectic species, with Homo sapiens being the food source frequently identified in the intradomicile and peridomicile, while for T. pseudomaculata the food source was Gallus gallus. In the wild environment, T. brasiliensis was found in rock outcrops, along with specimens of Triatoma sp., and T. pseudomaculata on tree trunks of the species Anadenanthera colubrina. The food sources of T. brasiliensis were the rodents Thrichomys apereoides (30%) and Galea spixii (30%). In this study, we recorded the first encounter of Psammolestes tertius in the state, expanding the geographic distribution of this species. P. lutzi presented the highest T. cruzi infection rate (64,8%) and the genotype identified was TcIII. Trypanosoma rangeli was identified in only one specimen of this species. T. cruzi II and III were detected in the species T. brasiliensis. The morphological analysis of Triatoma sp. presented similarity to T. petrocchiae. The genetic similarity between both species was demonstrated using the ITS-1 marker, which formed a single clade. Nevertheless, in the analysis of Cytb sequences, Triatoma sp., T. brasiliensis and T. petrocchiae formed distinct clades, suggesting the existence of a new species, however, further analysis are necessary for this confirmation. The increase of infestation and colonization rates of triatomines, the presence of these infected vectors fed with human blood and of several animals and the circulation of infected wild animals in the anthropic environment, point out the possibility of T. cruzi transmission to humans and domestic animals. The data of this study reinforce that ES and vector control in the municipalities are essential to avoid the contact of species, such as T. brasiliensis, T. pseudomaculata and P. lutzi, with the population and animals.