Determinação de baixas concentrações de lítio em águas de abastecimento público por cromatografia de íons: validação de método / Determination of low concentrations of lithium in public water supply by the ion chromatography: method validation

Esta nota apresenta a validação de um método para realizar a determinação de lítio em concentrações menores do que 40 μg L-1 em amostras de águas de abastecimento público, utilizandose cromatografia de íons e calibração externa, com a curva analítica obtida por regressão linear (mínimos quadrados ordinários). O método é seletivo, e apresenta limite de detecção igual a 1,0 μg L-1 e limite de quantificação igual a 2,0 μg L-1 . Os ensaios de recuperação em três níveis de concentração apresentaram resultados entre 99,4 e 101,9%. Na avaliação da precisão nos mesmos três níveis de concentração, os coeficientes de variação exibiram valores entre 1,1 e 4,0%.

This note presents the validation of a method for determining the lithium at concentrations less than 40 μg L-1 in the public water supply, by using the ion chromatography and external calibration, and the analytical curve was obtained by the linear regression (ordinary least squares). The employed method is selective, showing the detection limit equal to 1.0 μg L-1 and the quantification limit equal to 2.0 μg L-1 . Recovery tests in three concentration levels presented results from 99.4 to 101.9%. On the precision evaluation in the same three concentration levels, the coefficients of variation exhibited values between 1.1 and 4.0%.

Determinação de baixas concentrações de lítio em águas de abastecimento público por cromatografia de íons: validação de método / Determination of low concentrations of lithium in public water supply by the ion chromatography: method validation

Esta nota apresenta a validação de um método para realizar a determinação de lítio em concentrações menores do que 40 μg L-1 em amostras de águas de abastecimento público, utilizandose cromatografia de íons e calibração externa, com a curva analítica obtida por regressão linear (mínimos quadrados ordinários). O método é seletivo, e apresenta limite de detecção igual a 1,0 μg L-1 e limite de quantificação igual a 2,0 μg L-1 . Os ensaios de recuperação em três níveis de concentração apresentaram resultados entre 99,4 e 101,9%. Na avaliação da precisão nos mesmos três níveis de concentração, os coeficientes de variação exibiram valores entre 1,1 e 4,0%.(AU)

This note presents the validation of a method for determining the lithium at concentrations less than 40 μg L-1 in the public water supply, by using the ion chromatography and external calibration, and the analytical curve was obtained by the linear regression (ordinary least squares). The employed method is selective, showing the detection limit equal to 1.0 μg L-1 and the quantification limit equal to 2.0 μg L-1 . Recovery tests in three concentration levels presented results from 99.4 to 101.9%. On the precision evaluation in the same three concentration levels, the coefficients of variation exhibited values between 1.1 and 4.0%.(AU)

Changes in energetic metabolism of Biomphalaria glabrata (Mollusca, Planorbidae) in response to exogenous calcium / Alterações no metabolismo energético de Biomphalaria glabrata em resposta ao cálcio exógeno

Calcium is considered an essential element for the metabolism of aquatic snail Biomphalaria glabrata (Say, 1818), intermediate host of Schistosoma mansoni Sambon, 1907 in Brazil, and represents a limiting factor to its distribution and adaptation to the environment. This study investigated the effect of different concentrations of exogenous CaCO3 on the energetic metabolism of B. glabrata for better understanding the physiological interference of chemical elements dissolved in the environment with the physiology of this species. Sixty-day-old snails were distributed into six groups, five exposed to different concentrations of CaCO3 (20, 40, 60, 80 and 100 mg/L) and a control group. The exposure to CaCO3 was assessed over time, with analysis of 15 snails of each group in the following intervals: 1, 14, 21 or 30 days for hemolymph extraction. Concentrations of calcium and glucose in the hemolymph were determined by commercial kits, and organic acids were extracted using an ion exchange column and analyzed by high-performance liquid chromatography. Concentration of calcium in the hemolymph showed no significant difference (p>0.05) from the control group and between the concentrations tested...(AU)

O cálcio é considerado um elemento essencial no metabolismo do molusco aquático Biomphalaria glabrata (Say, 1818), principal hospedeiro intermediário de Schistosoma mansoni Sambon, 1907 no Brasil e, tem sido descrito como um fator limitante na distribuição e adaptação desse molusco no ambiente. O presente trabalho avaliou o efeito de diferentes concentrações de carbonato de cálcio (CaCO3) exógeno ao metabolismo energético de B. glabrata, a fim de subsidiar uma melhor compreensão da interferência de elementos químicos dissolvidos no meio aquático na fisiologia destes moluscos. Foram utilizados moluscos com sessenta dias de vida, distribuídos em seis grupos, cinco expostos a diferentes concentrações de CaCO3 (20, 40, 60, 80 e 100mg/L) e um controle. A exposição ao CaCO3 foi avaliada em função do tempo, sendo retirados 15 moluscos de cada grupo nos seguintes intervalos: 1, 14, 21 ou 30 dias para extração da hemolinfa. As concentrações de cálcio e glicose na hemolinfa foram determinadas usando-se kits comercial e os ácidos orgânicos foram extraídos por meio da coluna de troca iônica e analisados através cromatografia líquida de alta eficiência. Os resultados demonstraram que a concentração de cálcio na hemolinfa não apresentou diferença significativa (p>0,05) em relação ao controle e nas concentrações testadas...(AU)

New insights into the structural characteristics of irradiated crotamine

Background:Since ionizing radiation has the potential to alter the molecular structure and affect the biologica properties of biomolecules, it has been successfully employed to attenuate animal toxins. The present study aimed to characterize the structural modifications on irradiated crotamine, a toxin from Crotalus durissus terrificus venom, using circular dichroism (CD), fluorescence, Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR), atomic force microscopy (AFM) and differential scanning calorimetry (DSC).Methods:A combination of size exclusion and ion-exchange chromatography was used to purify the peptide using crude venom. The pure toxin was then submitted to 2 kGy gamma irradiation doses from a cobalt-60 source. Native and irradiated crotamine were analyzed using a fluorescence spectrophotometer. Wavelength was fixed at 295 nm and fluorescence emission scans were collected from 300 to 400 nm. CD and FTIR techniques were used to identify the secondary structure of both samples. DSC analyses were performed at a starting temperature of 20 °C up to a final temperature of 90 °C. AFM provided a 3D profile of the surfaces of both crotamine forms adsorbed on mica.Results:Fluorescence spectroscopy showed that the quantum yield of the irradiated form decreased. CD spectra of native and irradiated crotamine solutions showed differences between the samples in wavelength, indicating that irradiation induced a transition of a small portion of the random coil regions towards an a-helical conformation. FTIR and CD showed that the native and irradiated crotamine spectra were different with regard to secondary structure. The thermodynamic analysis showed that irradiation caused changes in the calorimetric profile and CD showed that temperature-induced changes also occur in the secondary structure. Finally, AFM showed the possible formation of insoluble aggregates.Conclusions:Our results indicate that irradiation leads to progressive changes in the structure of the toxin, which could explain a decrease in myotoxic activity.(AU)

New insights into the structural characteristics of irradiated crotamine

Background: Since ionizing radiation has the potential to alter the molecular structure and affect the biologica properties of biomolecules, it has been successfully employed to attenuate animal toxins. The present study aimed to characterize the structural modifications on irradiated crotamine, a toxin from Crotalus durissus terrificus venom, using circular dichroism (CD), fluorescence, Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR), atomic force microscopy (AFM) and differential scanning calorimetry (DSC). Methods: A combination of size exclusion and ion-exchange chromatography was used to purify the peptide using crude venom. The pure toxin was then submitted to 2 kGy gamma irradiation doses from a cobalt-60 source. Native and irradiated crotamine were analyzed using a fluorescence spectrophotometer. Wavelength was fixed at 295 nm and fluorescence emission scans were collected from 300 to 400 nm. CD and FTIR techniques were used to identify the secondary structure of both samples. DSC analyses were performed at a starting temperature of 20 °C up to a final temperature of 90 °C. AFM provided a 3D profile of the surfaces of both crotamine forms adsorbed on mica. Results: Fluorescence spectroscopy showed that the quantum yield of the irradiated form decreased. CD spectra of native and irradiated crotamine solutions showed differences between the samples in wavelength, indicating that irradiation induced a transition of a small portion of the random coil regions towards an a-helical conformation. FTIR and CD showed that the native and irradiated crotamine spectra were different with regard to secondary structure. The thermodynamic analysis showed that irradiation caused changes in the calorimetric profile and CD showed that temperature-induced changes also occur in the secondary structure. Finally, AFM showed the possible formation of insoluble aggregates. Conclusions: Our results indicate that irradiation leads to progressive changes in the structure of the toxin, which could explain a decrease in myotoxic activity.(AU)

New insights into the structural characteristics of irradiated crotamine

Background: Since ionizing radiation has the potential to alter the molecular structure and affect the biologica properties of biomolecules, it has been successfully employed to attenuate animal toxins. The present study aimed to characterize the structural modifications on irradiated crotamine, a toxin from Crotalus durissus terrificus venom, using circular dichroism (CD), fluorescence, Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR), atomic force microscopy (AFM) and differential scanning calorimetry (DSC). Methods: A combination of size exclusion and ion-exchange chromatography was used to purify the peptide using crude venom. The pure toxin was then submitted to 2 kGy gamma irradiation doses from a cobalt-60 source. Native and irradiated crotamine were analyzed using a fluorescence spectrophotometer. Wavelength was fixed at 295 nm and fluorescence emission scans were collected from 300 to 400 nm. CD and FTIR techniques were used to identify the secondary structure of both samples. DSC analyses were performed at a starting temperature of 20 °C up to a final temperature of 90 °C. AFM provided a 3D profile of the surfaces of both crotamine forms adsorbed on mica. Results: Fluorescence spectroscopy showed that the quantum yield of the irradiated form decreased. CD spectra of native and irradiated crotamine solutions showed differences between the samples in wavelength, indicating that irradiation induced a transition of a small portion of the random coil regions towards an a-helical conformation. FTIR and CD showed that the native and irradiated crotamine spectra were different with regard to secondary structure. The thermodynamic analysis showed that irradiation caused changes in the calorimetric profile and CD showed that temperature-induced changes also occur in the secondary structure. Finally, AFM showed the possible formation of insoluble aggregates. Conclusions: Our results indicate that irradiation leads to progressive changes in the structure of the toxin, which could explain a decrease in myotoxic activity.

PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LECTINAS OBTIDAS DE Scenedesmus sp.

Lectinas são glicoproteínas de origem não-imune que reconhecem carboidratos específicos e, por isso, possuem diversas funções biológicas. Dentre essas fontes, destacam-se as microalgas que são ricas fontes de bioativos. O objetivo deste trabalho foi extrair purificar e caracterizar lectina a partir da microalga Scenedesmus sp. (=Tetradesmus obliquus) A biomassa microalgal foi cultivada em meio padrão BG-11, de modo autotrófico durante 15 dias. A lectina foi extraída da biomassa por agitação magnética durante 9 horas a 4ºC. O homogenizado foi centrifugado e o sobrenadante, denominado de extrato bruto (EB), foi utilizado para a purificação. O EB foi precipitado por sulfato de amônio na saturação de 60-80%, e o precipitado protéico submetido à cromatografia de troca iônica e gel filtração. A lectina foi caracterizada em relação ao reconhecimento dos grupos sanguíneos A, B, AB, O, subgrupos A1 e A2, e eritrócitos de coelho, pH ótimo, temperatura ótima e suas estabilidades durante 90 min, inibição a carboidratos, glicoproteínas e íons. Esta proteína foi purificada utilizando uma etapa cromatográfica e aglutinou os eritrócitos humanos tipos O e eritrócitos de coelho, não aglutinou subgrupos A1 e A2, A, B e AB. A lectina apresentou pH ótimo entre 7,0 - 7,5 estável por 90 min e temperatura ótima entre 20 a 50 °C com boa estabilidade térmica. A lectina foi inibida por carboidratos complexos presentes nas glicoproteínas azoalbumina, azocaseína e albumina, mas não foi inibida pelos mono e dissacarídeos. A proteína tem massa molecular aparente de 78 kDa, determinada por filtração em gel, e sua atividade foi afetada na presença de cátions divalentes, indicando que a lectina de Scenedesmus sp. apresenta características distintas entre as lectinas de microalgas. O presente estudo oferece uma nova alternativa para a obtenção de lectinas de alto valor biológico, bem como traz novos dados acerca do potencial biotecnológico das microalgas, contribuindo para a indústria farmacêutica, agrícola e biomédica.

Lectins are non-immune glycoproteins with diverse biological in agriculture, medicine, biotechnology research and have become important tools in identifying different blood groups.The search for new sources of these macromolecules has intensified, so the objective of this work was to extract, purify and characterize a new lectin from the biomass of the Scenedesmus sp, a microalgae that produces bioactives with high added value.Biomass wascultivated in BG-11 medium, autotrophically for 15 days. Lectin was extracted of biomass by magnetic stirring for 9 hours at 4 °C. The homogenate was centrifuged and the supernatant (EB) used to purification step. The EB was precipitated by 60-80%ammonium sulfate and the protein precipitate was subjected to ion exchange chromatography on DEAE Sephadex C-25 and gel filtration.The lectin was characterized in relation to the recognition of blood groups A, B, AB, O, subgroups A1 and A2, and rabbit erythrocytes, optimum pH, optimum temperature and its stabilities for 90 minutes, inhibition of carbohydrates, glycoproteins and ions. The lectin was purified using a chromatographic step and agglutinated the human erythrocytes types O and rabbit erythrocytes. The lectin presented optimum pH of 7.0 - 7.5 stable for 90 min and optimum temperature of 20 to 50 °C with good thermal stability. Lectin was inhibited by complex carbohydrates present in glycoproteins azoalbumin, azocasein and albumin, but was not inhibited by most mono- and disaccharides. The lectin has an apparent molecular mass of 78 kDa, determined by gel filtration, and its activity was affected in the presence of divalent cations, indicating the lectin of Scenedesmus sp. characteristics among microalga lectins. The present study offers a new alternative for obtaining lectins of high biological value, as well as brings new data about the biotechnological potential of microalgae, contributing to the pharmaceutical, agricultural and biomedical industry.

Acao de protease do latex de Ficus benjamina L. sobre nematodeo e bacterias de interesse na producao animal.

Helmintoses e infecções bacterianas são um grande desafio para a produção pecuária porque provocam perda de produtividade nos rebanhos. Para reduzir prejuízos, os produtores realizam o controle de parasitos e bactérias principalmente utilizando produtos químicos sintéticos, mas a resistência aos princípios ativos desses produtos insta a busca contínua por moléculas biologicamente ativas. Essa pesquisa foi conduzida com o objetivo de obter frações proteicas e protease a partir do látex de Ficus benjamina, além de avaliar uso potencial dessas amostras proteicas no controle do nematóide parasito de pequenos ruminantes, Haemonchus contortus, bem como sobre as bactérias patogênicas Salmonella enterica, Staphylococcus aureus e Enterobacter aerogenes. O látex foi obtido a partir de uma incisão feita no ápice do galho das plantas e coletado em tampão fosfato de sódio (75 mM, pH 7,0). O látex foi centrifugado (12.000 x g a 4 °C por 15 min), dialisado contra água (cut-off 14 kDa), novamente centrifugado nas mesmas condições anteriores e, então, denominado EPL (Extrato Proteico do Látex). O EPL foi fracionado com sulfato de amônio a 30-60% e 60-90% de saturação para a obtenção das frações denominadas F30-60 e F60-90, respectivamente. A F60-90 foi fracionada por cromatografia de troca iônica em matriz de CM-Cellulose e a fração com maior atividade proteolítica obtida foi denominada FbP (Ficus benjamina Protease). De posse dessas frações, foram conduzidos ensaios de análise de proteínas, atividade proteolítica e identificação da FbP. Adicionalmente foram realizados ensaios de inibição do desenvolvimento larvar do nematódeo H. contortus e inibição do crescimento das bactérias S. enterica, S. aureus e E. aerogenes em meio líquido. Os teores de proteína totais obtidos foram, respectivamente, 121,6, 21,2, 75,7 mg para EPL, F30-60 e F60-90. A atividade proteolítica das amostras proteicas foi de 43.471, 13.245 e 57.857 UA/mL/mgP para EPL, F30-60 e F60-90, respectivamente. A FbP apresentou atividade proteolítica de 36.393,8 UA/mL/mgP. A análise em gel mostrou a FbP com uma banda proteica com massa entre 20 e 30 kDa e por espectrometria de massa identificou-se a FbP como protease cisteínica, com massa molecular de 23,97 kDa. FbP manteve atividade proteolítica estável na faixa de pH entre 6 e 10 e em uma ampla faixa de temperatura, com atividade ótima à 60 °C. Em testes de inibição do desenvolvimento larvar, EPL, F30-60, F60-90 e a FbP apresentaram IC50 de 0,22, 1,38, 0,42 e 0,26 mg/mL, respectivamente. Foi verificado que EPL, F30-60 e F60-90 não exerceram ação inibitória sobre o crescimento das bactérias, mas FbP inibiu o crescimento de S. aureus e S. enterica com mínima concentração inibitória (MIC) de 3,12 g/mL. Conclui-se que a FbP obtida a partir do látex de F. benjamina possui propriedades biológicas promissoras para o desenvolvimento de produtos que possam ser utilizados no controle do nematóide gastrointestinal, H. contortus, e das bactérias patogênicas S. aureus e S. enterica.

Helminthes and bacterial infections are a major challenge for livestock production because they cause loss of productivity in herds. To reduce losses, producers control parasites and bacteria mainly using synthetic chemicals, but the resistance to the active principles of these products calls for the continuous search for biologically active molecules. This research was conducted with the objective of obtaining protein fractions and protease from the latex of Ficus benjamina, in addition to evaluating the potential use of these protein samples in the control of the parasite nematode of small ruminants, Haemonchus contortus, as well as on the pathogenic bacteria Salmonella enterica, Staphylococcus aureus and Enterobacter aerogenes. Latex was obtained from an incision made at the apex of the plant limb and collected in sodium phosphate buffer (75 mM, pH 7.0). The latex was centrifuged (12,000 x g at 4 ° C for 15 min), dialysed against water (14 kDa cut-off), again centrifuged under the same conditions as before and then referred to as EPL (Latex Protein Extract). The EPL was fractionated with ammonium sulphate at 30-60% and 60-90% saturation to obtain the fractions denominated F30-60 and F60-90, respectively. F60-90 was fractionated by ion exchange chromatography on CM-Cellulose matrix and the fraction with the highest proteolytic activity obtained was denominated FbP (Ficus benjamina Protease). With these fractions, protein analysis, proteolytic activity and FbP identification were carried out. In addition, inhibition of larval development of the nematode H. contortus and inhibition of the growth of S. enterica, S. aureus and E. aerogenes in a liquid medium were carried out. The total protein levels obtained were, respectively, 121.5, 21.2, 75.7 mg for EPL, F30-60 and F60-90. The proteolytic activity of the protein samples was 43,471, 13,245 and 57,857 UA/mL/mgP for EPL, F30-60 and F60-90, respectively. The FbP presented proteolytic activity of 36,393.8 AU/mL/mgP. Gel analysis showed FbP with a protein band with mass between 20 and 30 kDa and by mass spectrometry the FbP was identified as cysteine protease, with a molecular weight of 23.97 kDa. FbP maintained stable proteolytic activity in the pH range between 6 and 10 and over a wide temperature range, with optimum activity at 60 °C. In tests for inhibition of larval development, EPL, F30-60, F60-90 and FbP presented IC50 of 0.22, 1.38, 0.42 and 0.26 mg/mL, respectively. It was verified that EPL, F30-60 and F60-90 did not exert an inhibitory action on the growth of bacteria, but FbP inhibited the growth of S. aureus and S. enterica with minimum inhibitory concentration (MIC) of 3.12 g/mL. It is concluded that FbP obtained from latex of F. benjamina has promising biological properties for the development of products that can be used in the control of the gastrointestinal nematode, H. contortus, and the pathogenic bacteria S. aureus and S. enterica.

ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DA ESTRUTURA PRIMÁRIA DE UMA FICOBILIPROTEÍNA DA ALGA MARINHA VERMELHA Hypnea musciformis (WULFEN) LAMOUROUX

As algas marinhas constituem uma rica reserva de substância de interesse biotecnológico, dentre essas substâncias podemos destacar as ficobiliproteínas. Essas moléculas são proteínas solúveis em água ligadas covalentemente a pigmentos com estrutura tetrapirrólica linear denominado bilina, também conhecido como pigmento acessório. Dessa forma, as ficobiliproteínas formam um complexo denominado ficobilissomos, que constitui uma estrutura primordial de captação de luz, apresentando função fotossintética. Essas estruturas são encontradas nas algas marinhas vermelhas e cianofíceas. Ficobiliproteínas isoladas e purificadas, quando caracterizadas, apresentaram subunidades estruturais, como subunidades alfa, beta e gama. Quanto a suas aplicações, essas proteínas foram utilizadas como corantes e estabilizantes de alimentos, marcadores de biomoléculas, agentes antioxidantes e anti-inflamatórios. Tendo em vista a importância destas moléculas, este trabalho teve como objetivo isolar, purificar e determinar a estrutura primária parcial da cadeia beta de uma ficobiliproteína presente na alga marinha vermelha Hypnea musciformis. A ficobiliproteína (HMp) foi isolada através da precipitação do extrato proteico com sulfato de amônio e purificada por cromatografia de troca iônica. A eletroforese em gel de poliacrilamida revelou que a HMp possui duas bandas proteicas em torno de 20 kDa e 22 kDa. A banda de 22 kDa foi excisada do gel e digerida com a enzima proteolítica tripsina. Os peptídeos oriundos da digestão foram submetidos à fragmentação em espectrômetro de massas. Os fragmentos gerados foram utilizados para sequenciar os peptídeos e estes na identificação de proteínas a partir dos bancos de dados existentes. A partir dessas informações, iniciadores foram desenhados para amplificar o gene da cadeia beta da ficobiliproteína de Hypnea musciformis (bhmp) a partir do DNA genômico da alga. O gene amplificado foi sequenciado e os dados brutos foram processados pela ferramenta Phred/Phrap/Consed. A sequência processada foi traduzida para obtenção da estrutura primária parcial de bhmp. A tradução resultou em uma sequência de 87 resíduos de aminoácidos e HMp apresentou identidade com diversas ficoeritrinas de algas vermelhas.

Seaweeds are a rich reserve of substances with biotechnological interest, among these substances it is possible to highlight the phycobiliproteins. These molecules are water-soluble proteins covalently linked to pigments with linear tetrapyrrole structure called bilin, also known as accessory pigment. Thus, the phycobiliproteins form a complex named phycobilisomes, which is a primary structure of light-gathering, showing photosynthetic function. These structures are found in red and Cyanophyceae seaweed. Phycobiliproteins isolated and purified, when structuraly analised, present subunits characterized as alpha, beta and gamma. These proteins can be used as colorants and stabilizers for food, markers of biomolecules, antioxidants and anti-inflammatory agents. In view of the importance of these molecules, this work aimed to isolate, purify and determine the partial primary structure of the beta chain phycobiliprotein present in the red marine alga Hypnea musciformis. The phycobiliprotein (HMp) was isolated by precipitation of proteins with ammonium sulphate and purified by ion-exchange chromatography. The polyacrylamide gel electrophoresis revealed that the HMp has two chains around 20 kDa and 22 kDa. The 22 kDa chain was excised from the gel and digested with proteolytic enzyme trypsin. The peptides from digestion underwent fragmentation in mass spectrometer. The generated fragments were used for sequencing peptides and have identified in databases. Primers were designed to amplify the beta chain gene bhmp from the genomic DNA of the alga. The amplified gene was sequenced and the tool Phred/Phrap/Consed processed the raw data. The final gene sequence has been translated to obtain the partial primary structure of bHMp. The translation resulted in a sequence with 87 amino acid residues and HMp presented identity with various phycoerythrins of red algae.

Purification and characterization of a new Xylanase from Humicola grisea var. Thermoidea

The thermophilic fungus Humicola grisea var. thermoidea secretes extracellular xylanase when grown on solid and in liquid media containing wheat bran and banana plant residue as substrates, respectively. At 55ºC, xylanase from the culture filtrate of H. grisea var. thermoidea grown on banana stalk retained 50% of its activity after 28 h of incubation. A xylanase (X2) was isolated from solid state cultures with wheat bran as the carbon source. It was purified to apparent homogeneity by ultrafiltration followed by ion-exchange and hydrophobic interaction chromatography on DEAE-Sepharose and Phenyl-Sepharose resins, respectively. The enzyme had an apparent molecular weight of 29 kDa, as determined by SDS-PAGE. The purified enzyme was most active at pH and temperature ranges of 4.5-6.5 and 55-60ºC, respectively. In addition, X2 showed thermostability at 60ºC with a half-life of approx. 5.5 h. The apparent Km values, using soluble and insoluble arabinoxylans as substrates, were 10.87 and 11.20 mg/ml, respectively.

O fungo termofílico Humicola grisea var. secreta xilanase extracelular quando cultivado em meios sólidos e líquidos contendo farelo de trigo e engaço de bananeira como substratos, respectivamente. À temperatura de 55ºC, xilanase do filtrado de meio de cultura de H. grisea var. thermoidea cultivado em engaço de bananeira reteve 50% de sua atividade após 28 de incubação. Uma xilanase (X2) foi isolada de culturas de estado sólido contendo farelo de trigo como fonte de carbono. X2 foi purificada por ultrafiltração, seguido por cromatografias de interação hidrofóbica e troca iônica em resinas de Phenyl-Sepharose e DEAE-Sepharose, respectivamente. A enzima apresentou peso molecular de 29 kDa, como determinado por SDS-PAGE. A enzima purificada foi mais ativa em intervalos de pH e temperatura de 4,5-6,5 and 55-60ºC, respectivamente. Além disso, X2 mostrou termoestabilidade a 60ºC com meia vida de aproximadamente 5,5 h. Os valores de Km aparente, utilizando arabinoxilanas solúveis e insolúveis, foram 10,87 and 11,20 mg/ml, respectivamente.

Purification and characterization of a new Xylanase from Humicola grisea var. Thermoidea

The thermophilic fungus Humicola grisea var. thermoidea secretes extracellular xylanase when grown on solid and in liquid media containing wheat bran and banana plant residue as substrates, respectively. At 55ºC, xylanase from the culture filtrate of H. grisea var. thermoidea grown on banana stalk retained 50% of its activity after 28 h of incubation. A xylanase (X2) was isolated from solid state cultures with wheat bran as the carbon source. It was purified to apparent homogeneity by ultrafiltration followed by ion-exchange and hydrophobic interaction chromatography on DEAE-Sepharose and Phenyl-Sepharose resins, respectively. The enzyme had an apparent molecular weight of 29 kDa, as determined by SDS-PAGE. The purified enzyme was most active at pH and temperature ranges of 4.5-6.5 and 55-60ºC, respectively. In addition, X2 showed thermostability at 60ºC with a half-life of approx. 5.5 h. The apparent Km values, using soluble and insoluble arabinoxylans as substrates, were 10.87 and 11.20 mg/ml, respectively.

O fungo termofílico Humicola grisea var. secreta xilanase extracelular quando cultivado em meios sólidos e líquidos contendo farelo de trigo e engaço de bananeira como substratos, respectivamente. À temperatura de 55ºC, xilanase do filtrado de meio de cultura de H. grisea var. thermoidea cultivado em engaço de bananeira reteve 50% de sua atividade após 28 de incubação. Uma xilanase (X2) foi isolada de culturas de estado sólido contendo farelo de trigo como fonte de carbono. X2 foi purificada por ultrafiltração, seguido por cromatografias de interação hidrofóbica e troca iônica em resinas de Phenyl-Sepharose e DEAE-Sepharose, respectivamente. A enzima apresentou peso molecular de 29 kDa, como determinado por SDS-PAGE. A enzima purificada foi mais ativa em intervalos de pH e temperatura de 4,5-6,5 and 55-60ºC, respectivamente. Além disso, X2 mostrou termoestabilidade a 60ºC com meia vida de aproximadamente 5,5 h. Os valores de Km aparente, utilizando arabinoxilanas solúveis e insolúveis, foram 10,87 and 11,20 mg/ml, respectivamente.

Testing for the ability to modify antibiotics of Panus tigrinus 8/18 Lentinus strigosus 1566 laccase

Abstract In advanced biotechnology, the utilization of enzymes to achieve new or modified compounds with antibacterial, fungicidal, and anti-cancer specifications is crucial. Mushroom lactases are a hopeful biocatalyst for the synthesis and modification of different compounds. They are an accessible and inexpensive enzyme for the preparation of reaction objects and have recently received attention. Laccase purification was performed from basidiomycete Lentinus strigosus (LS) in several stages: Stage 1. On ion-exchange chromatography on TEAE Servacell 23 (400 ml), two distinctly separated laccase activity peaks were observed, eluted from the carrier at 0.21 and 0.27 M NaCl. In order to reduce the loss of enzymes, all fractions with laccase activity were collected, concentrated, and desalted using an ultrafiltration cell (Amicon, United States) with a UM-10 membrane. Stage 2. The resulting preparation with laccase activity was applied to a Q-Sepharose column (60 ml). Two well-separated peaks with laccase activity were obtained during the elution: laccase I (0.12 M NaCl) and laccase II (0.2 M NaCl). Stage 3. In the course of further purification of both enzymes, carried out on anion-exchange carrier Resource Q (6 ml), a broken gradient was used: 0 - 10%, 10 - 20%, and 20 - 100% with 1M NaCl. Stage 4. Both laccase I and laccase II, obtained after Resource Q, were desalted, concentrated to 1 ml each, and applied to a Superdex 75 gel filtration column. As a result, two laccases were obtained in a homogeneous form.

Resumo Na biotecnologia moderna, o uso de enzimas para obter compostos novos ou modificados com propriedades antibacterianas, antifúngicas e anticancerígenas é crucial. Lactases de cogumelos são biocatalisadores promissores para síntese e modificação de diferentes compostos, por serem enzimas baratas e disponíveis para a preparação de componentes de reação, e vem recebendo a devida atenção recentemente. A purificação da lacase foi realizada a partir do basidiomiceto Lentinus strigosus em vários estágios: Etapa 1 - na cromatografia de troca iônica em TEAE Servacell 23 (400 ml), foram observados dois picos de atividade da lacase distintamente separados, com eluição do transportador a 0,21 e 0,27 M de NaCl. Para reduzir a perda de enzimas, todas as frações com atividade de lacase foram coletadas, concentradas e dessalinizadas em uma célula de ultrafiltração (Amicon, Estados Unidos) com membrana UM-10; Etapa 2 - a preparação resultante com atividade de lacase foi aplicada a uma coluna Q-Sepharose (60 ml). Durante a eluição, foram obtidos dois picos bem separados com atividade de lacase: lacase I (NaCl 0,12 M) e lacase II (NaCl 0,2 M); Etapa 3 - no decurso da purificação adicional de ambas as enzimas, realizada no Recurso Q de transportador de troca aniônica (6 ml), um gradiente quebrado foi usado: 0-10%, 10-20% e 20-100% com NaCl 1M; Etapa 4 - tanto a lacase I como a lacase II, obtidas após o Recurso Q, foram dessalinizadas e concentradas para 1 ml cada e aplicadas a uma coluna de filtração em gel Superdex 75. Como resultado, duas lacases foram obtidas de forma homogênea.

Testing for the ability to modify antibiotics of Panus tigrinus 8/18 Lentinus strigosus 1566 laccase / Teste de capacidade para modificar antibióticos a partir da lacase de Panus tigrinus 8/18 e Lentinus strigosus 1566

In advanced biotechnology, the utilization of enzymes to achieve new or modified compounds with antibacterial, fungicidal, and anti-cancer specifications is crucial. Mushroom lactases are a hopeful biocatalyst for the synthesis and modification of different compounds. They are an accessible and inexpensive enzyme for the preparation of reaction objects and have recently received attention. Laccase purification was performed from basidiomycete Lentinus strigosus (LS) in several stages: Stage 1. On ion-exchange chromatography on TEAE Servacell 23 (400 ml), two distinctly separated laccase activity peaks were observed, eluted from the carrier at 0.21 and 0.27 M NaCl. In order to reduce the loss of enzymes, all fractions with laccase activity were collected, concentrated, and desalted using an ultrafiltration cell (Amicon, United States) with a UM-10 membrane. Stage 2. The resulting preparation with laccase activity was applied to a Q-Sepharose column (60 ml). Two well-separated peaks with laccase activity were obtained during the elution: laccase I (0.12 M NaCl) and laccase II (0.2 M NaCl). Stage 3. In the course of further purification of both enzymes, carried out on anion-exchange carrier Resource Q (6 ml), a broken gradient was used: 0 - 10%, 10 - 20%, and 20 - 100% with 1M NaCl. Stage 4. Both laccase I and laccase II, obtained after Resource Q, were desalted, concentrated to 1 ml each, and applied to a Superdex 75 gel filtration column. As a result, two laccases were obtained in a homogeneous form.

Na biotecnologia moderna, o uso de enzimas para obter compostos novos ou modificados com propriedades antibacterianas, antifúngicas e anticancerígenas é crucial. Lactases de cogumelos são biocatalisadores promissores para síntese e modificação de diferentes compostos, por serem enzimas baratas e disponíveis para a preparação de componentes de reação, e vem recebendo a devida atenção recentemente. A purificação da lacase foi realizada a partir do basidiomiceto Lentinus strigosus em vários estágios: Etapa 1 - na cromatografia de troca iônica em TEAE Servacell 23 (400 ml), foram observados dois picos de atividade da lacase distintamente separados, com eluição do transportador a 0,21 e 0,27 M de NaCl. Para reduzir a perda de enzimas, todas as frações com atividade de lacase foram coletadas, concentradas e dessalinizadas em uma célula de ultrafiltração (Amicon, Estados Unidos) com membrana UM-10; Etapa 2 - a preparação resultante com atividade de lacase foi aplicada a uma coluna Q-Sepharose (60 ml). Durante a eluição, foram obtidos dois picos bem separados com atividade de lacase: lacase I (NaCl 0,12 M) e lacase II (NaCl 0,2 M); Etapa 3 - no decurso da purificação adicional de ambas as enzimas, realizada no Recurso Q de transportador de troca aniônica (6 ml), um gradiente quebrado foi usado: 0-10%, 10-20% e 20-100% com NaCl 1M; Etapa 4 - tanto a lacase I como a lacase II, obtidas após o Recurso Q, foram dessalinizadas e concentradas para 1 ml cada e aplicadas a uma coluna de filtração em gel Superdex 75. Como resultado, duas lacases foram obtidas de forma homogênea.