Solid-state fermentation with orange waste: optimization of Laccase production from Pleurotus pulmonarius CCB-20 and decolorization of synthetic dyes

Laccases are oxidoreductase enzymes that have the ability to oxidize phenolic substrates. Its biotechnological potential has been greatly explored in many areas as biotechnology industry, bioremediation of dyes, food industry and environmental microbiology. The aim of this study was maximize the laccase production by Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quélet in solid-state fermentation (SSF) using orange waste as substrate. After optimization the capability of the crude laccase to decolorize dyes was analyzed. The fermentation medium in the solid-state was optimized by applying a factorial design. After statistics optimization, laccase activity increased two times. The laccase activity appears to be correlated with the ability of crude extract to decolorize some industrial dyes. The optimized laccase was characterized with respect to optimum pH, influence of temperature and salts. Our results demonstrate that P. pulmonarius was an efficient producer of an important industrial enzyme, laccase, in a cheap solid-state system using orange waste as substrate.

Solid-state fermentation with orange waste: optimization of Laccase production from Pleurotus pulmonarius CCB-20 and decolorization of synthetic dyes

Laccases are oxidoreductase enzymes that have the ability to oxidize phenolic substrates. Its biotechnological potential has been greatly explored in many areas as biotechnology industry, bioremediation of dyes, food industry and environmental microbiology. The aim of this study was maximize the laccase production by Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quélet in solid-state fermentation (SSF) using orange waste as substrate. After optimization the capability of the crude laccase to decolorize dyes was analyzed. The fermentation medium in the solid-state was optimized by applying a factorial design. After statistics optimization, laccase activity increased two times. The laccase activity appears to be correlated with the ability of crude extract to decolorize some industrial dyes. The optimized laccase was characterized with respect to optimum pH, influence of temperature and salts. Our results demonstrate that P. pulmonarius was an efficient producer of an important industrial enzyme, laccase, in a cheap solid-state system using orange waste as substrate.(AU)

Influence of iron and copper on the activity of laccases in Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

ABSTRACT Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici is a phytopathogenic fungus that causes vascular wilt in tomato plants. In this work we analyze the influence of metal salts such as iron and copper sulphate, as well as that of bathophenanthrolinedisulfonic acid (iron chelator) and bathocuproinedisulfonic acid (copper chelator) on the activity of laccases in the intra (IF) and extracellular fractions (EF) of the wild-type and the non-pathogenic mutant strain (rho1::hyg) of F. oxysporum. The results show that laccase activity in the IF fraction of the wild and mutant strain increased with the addition of iron chelator (53.4 and 114.32%; respectively). With copper, it is observed that there is an inhibition of the activity with the addition of CuSO4 for the EF of the wild and mutant strain (reduction of 82 and 62.6%; respectively) and for the IF of the mutant strain (54.8%). With the copper chelator a less laccase activity in the IF of the mutant strain was observed (reduction of 53.9%). The results obtained suggest a different regulation of intracellular laccases in the mutant strain compared with the wild type in presence of CuSO4 and copper chelator which may be due to the mutation in the rho gene.

Influence of iron and copper on the activity of laccases in Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici is a phytopathogenic fungus that causes vascular wilt in tomato plants. In this work we analyze the influence of metal salts such as iron and copper sulphate, as well as that of bathophenanthrolinedisulfonic acid (iron chelator) and bathocuproinedisulfonic acid (copper chelator) on the activity of laccases in the intra (IF) and extracellular fractions (EF) of the wild-type and the non-pathogenic mutant strain (rho1::hyg) of F. oxysporum. The results show that laccase activity in the IF fraction of the wild and mutant strain increased with the addition of iron chelator (53.4 and 114.32%; respectively). With copper, it is observed that there is an inhibition of the activity with the addition of CuSO4 for the EF of the wild and mutant strain (reduction of 82 and 62.6%; respectively) and for the IF of the mutant strain (54.8%). With the copper chelator a less laccase activity in the IF of the mutant strain was observed (reduction of 53.9%). The results obtained suggest a different regulation of intracellular laccases in the mutant strain compared with the wild type in presence of CuSO4 and copper chelator which may be due to the mutation in the rho gene.(AU)

Outstanding impact of soil tillage on the abundance of soil hydrolases revealed by a metagenomic approach

The soil represents the main source of novel biocatalysts and biomolecules of industrial relevance. We searched for hydrolases in silico in four shotgun metagenomes (4,079,223 sequences) obtained in a 13-year field trial carried out in southern Brazil, under the no-tillage (NT), or conventional tillage (CT) managements, with crop succession (CS, soybean/wheat), or crop rotation (CR, soybean/maize/wheat/lupine/oat). We identified 42,631 hydrolases belonging to five classes by comparing with the KEGG database, and 44,928 sequences by comparing with the NCBI-NR database. The abundance followed the order: lipases > laccases > cellulases > proteases > amylases > pectinases. Statistically significant differences were attributed to the tillage system, with the NT showing about five times more hydrolases than the CT system. The outstanding differences can be attributed to the management of crop residues, left on the soil surface in the NT, and mechanically broken and incorporated into the soil in the CT. Differences between the CS and the CR were slighter, 10% higher for the CS, but not statistically different. Most of the sequences belonged to fungi (Verticillium, and Colletotrichum for lipases and laccases, and Aspergillus for proteases), and to the archaea Sulfolobus acidocaldarius for amylases. Our results indicate that agricultural soils under conservative managements may represent a hotspot for bioprospection of hydrolases.(AU)

The influence of Tween 80 on laccase production by Pleurotus sajor-caju and the efficiency of crude enzyme broth in the removal of bisphenol-A / Influência do Tween 80 na produção de lacases de Pleurotus sajor-caju e eficiência do caldo enzimático bruto na remoção de bisfenol-A

Bisphenol-A is currently considered an environmental pollutant, capable of interfering in the endocrine system of organisms and causing alterations in its development and reproductive system. An alternative method to the chemical treatment of this pollutant has been the use of oxidative enzymes, especially laccases produced by fungi. In order to reduce production costs, agro-industrial waste can be used in the culture medium composition. Nonionic surfactants, which are only slightly toxic to biological membranes, can be applied, as well as Tween 80, to facilitate the excretion of these enzymes into the culture medium. The objectives of this work were: a) characterize the immersion water of banana straw used in the formulation of the culture medium; b) evaluate laccase production by Pleurotus sajor-caju in culture medium with and without addition of Tween 80, through shaken flasks; c) evaluate the efficiency of the crude enzyme broth in degrading bisphenol-A. The shaken flasks were incubated at 30°C for 12 days. The immersion water had a C:N ratio of 13.8, ash percentage of 28.6%, and pH close to neutrality. The addition of Tween 80 on the culture medium (7.5%, m/v) yielded laccase activity and productivity values equal to 3,016.47 U L-1 and 502.7 U L-1 day-1, respectively. These values were 50 and 33.5 times higher than those obtained in the culture medium without addition of Tween 80 for laccase activity and productivity, respectively. The crude enzyme broth degraded 100% of bisphenol-A after 48 hours, regardless of concentration (500, 750 and 1,000 mg L-1).(AU)

O bisfenol-A é considerado um poluente ambiental capaz de interferir no sistema endócrino dos organismos, ocasionando alterações em seu desenvolvimento e sistema de reprodução. Um método alternativo ao tratamento químico desse tipo de poluente tem sido a utilização de enzimas oxidativas, especialmente as lacases, produzidas por fungos. A fim de diminuir custos de produção, resíduos agroindustriais podem compor o meio de cultivo. Assim, surfactantes não iônicos e pouco tóxicos para as membranas biológicas, como o Tween 80, podem ser utilizados para facilitar a excreção dessas enzimas para o meio de cultivo. Os objetivos deste trabalho foram: caracterizar quimicamente o resíduo água de imersão de palha de bananeira, usado na formulação do meio de cultivo; avaliar a produção de lacase por Pleurotus sajor-caju em meio de cultivo líquido (frascos Erlenmeyer) com e sem adição de Tween 80; e avaliar a eficiência do caldo enzimático bruto em degradar bisfenol-A. Os frascos foram incubados a 30°C, por 12 dias. A água de imersão apresentou relação C:N 13,8, percentual de cinzas 28,6% e pH próximo da neutralidade. O cultivo adicionado de Tween 80 (7,5%, m/v) propiciou valores de atividade e produtividade em lacase iguais a 3.016,47 U L-1 e 502,7 U L-1 dia-1, respectivamente. Esses valores são 50 e 33,5 vezes maiores que os obtidos no cultivo sem adição de Tween 80, para atividade e produtividade em lacase, respectivamente. O caldo enzimático bruto degradou 100% do bisfenol-A após 48 horas, independentemente da concentração (500, 750 e 1.000 mg L-1).(AU)

The influence of Tween 80 on laccase production by Pleurotus sajor-caju and the efficiency of crude enzyme broth in the removal of bisphenol-A / Influência do Tween 80 na produção de lacases de Pleurotus sajor-caju e eficiência do caldo enzimático bruto na remoção de bisfenol-A

Bisphenol-A is currently considered an environmental pollutant, capable of interfering in the endocrine system of organisms and causing alterations in its development and reproductive system. An alternative method to the chemical treatment of this pollutant has been the use of oxidative enzymes, especially laccases produced by fungi. In order to reduce production costs, agro-industrial waste can be used in the culture medium composition. Nonionic surfactants, which are only slightly toxic to biological membranes, can be applied, as well as Tween 80, to facilitate the excretion of these enzymes into the culture medium. The objectives of this work were: a) characterize the immersion water of banana straw used in the formulation of the culture medium; b) evaluate laccase production by Pleurotus sajor-caju in culture medium with and without addition of Tween 80, through shaken flasks; c) evaluate the efficiency of the crude enzyme broth in degrading bisphenol-A. The shaken flasks were incubated at 30°C for 12 days. The immersion water had a C:N ratio of 13.8, ash percentage of 28.6%, and pH close to neutrality. The addition of Tween 80 on the culture medium (7.5%, m/v) yielded laccase activity and productivity values equal to 3,016.47 U L-1 and 502.7 U L-1 day-1, respectively. These values were 50 and 33.5 times higher than those obtained in the culture medium without addition of Tween 80 for laccase activity and productivity, respectively. The crude enzyme broth degraded 100% of bisphenol-A after 48 hours, regardless of concentration (500, 750 and 1,000 mg L-1).(AU)

O bisfenol-A é considerado um poluente ambiental capaz de interferir no sistema endócrino dos organismos, ocasionando alterações em seu desenvolvimento e sistema de reprodução. Um método alternativo ao tratamento químico desse tipo de poluente tem sido a utilização de enzimas oxidativas, especialmente as lacases, produzidas por fungos. A fim de diminuir custos de produção, resíduos agroindustriais podem compor o meio de cultivo. Assim, surfactantes não iônicos e pouco tóxicos para as membranas biológicas, como o Tween 80, podem ser utilizados para facilitar a excreção dessas enzimas para o meio de cultivo. Os objetivos deste trabalho foram: caracterizar quimicamente o resíduo água de imersão de palha de bananeira, usado na formulação do meio de cultivo; avaliar a produção de lacase por Pleurotus sajor-caju em meio de cultivo líquido (frascos Erlenmeyer) com e sem adição de Tween 80; e avaliar a eficiência do caldo enzimático bruto em degradar bisfenol-A. Os frascos foram incubados a 30°C, por 12 dias. A água de imersão apresentou relação C:N 13,8, percentual de cinzas 28,6% e pH próximo da neutralidade. O cultivo adicionado de Tween 80 (7,5%, m/v) propiciou valores de atividade e produtividade em lacase iguais a 3.016,47 U L-1 e 502,7 U L-1 dia-1, respectivamente. Esses valores são 50 e 33,5 vezes maiores que os obtidos no cultivo sem adição de Tween 80, para atividade e produtividade em lacase, respectivamente. O caldo enzimático bruto degradou 100% do bisfenol-A após 48 horas, independentemente da concentração (500, 750 e 1.000 mg L-1).(AU)

Produção de lacase de Pycnoporus sanguineus em meio de cultivo à base de melaço soja / Laccase production by Pycnoporus sanguineus in culture media with soybean molasses / Producción de lacasa de Pycnoporus sanguineus en medio de cultivo con melaza de soja

Lacases são polifenol oxidases que utilizam a capacidade redox de íons cobre para reduzir oxigênio a água e oxidar um substrato fenólico. A síntese e secreção de lacases de basidiomicetos dependem de vários fatores como os nutrientes presentes no meio de cultura. Visando à produção de lacase, Pycnoporus sanguineus foi cultivado em meio contendo melaço de soja como única fonte de carbono, ureia como fonte de nitrogênio suplementar em diferentes concentrações (0,6; 1,2; 2,4; 4,8 e 9,6 g/L de nitrogênio) e diferentes concentrações de CuSO4 (0, 150, 200, 250 e 300 µM). O extrato enzimático produzido nas melhores condições de cultivo foi utilizado para a descoloração dos corantes remazol azul brilhante R (antraquinona), amarelo 145, preto 5, vermelho 195 (azo) e verde malaquita (trifenilmetano). As concentrações de nitrogênio não afetaram a produção de lacase, exceto a maior concentração (9,6 g/L) que reduziu a atividade enzimática. A adição de cobre ao meio de cultivo (150 µM) aumentou a atividade de lacase em 112%. A maior atividade de lacase (~34300 U/L) promoveu a descoloração dos corantes remazol azul brilhante R (67,5%) e verde malaquita (28,3%) em 24h, sendo os corantes azo descoloridos apenas parcialmente. Concluiu-se que o melaço de soja é um resíduo agroindustrial adequado para produção de lacase de P. sanguineus com potencial para degradação de corantes.(AU)

Laccases are multicopper oxidases using the redox ability from copper ions to reduce oxygen to water, while oxidizing a phenolic substrate. Laccase synthesis and secretion in basidiomycetes depend on the conditions provided and on the nutrients present in the culture medium. Pycnoporus sanguineus was cultivated in medium containing soybean molasses as the sole carbon source, with urea as the source of supplemental nitrogen at different concentrations (0.6, 1.2, 2.4, 4.8 and 9.6 g/L nitrogen), and different CuSO4 concentrations (0, 150, 200, 250 and 300 µM). The enzymatic extract produced under the best cultivation conditions was used for the depigmentation of remazole brilliant blue R (anthraquinone), yellow 145, black 5, red 195 (azo) and malachite green (triphenylmethane). Nitrogen concentrations did not affect laccase production, except for the higher concentration (9.6 g/L) reducing enzymatic activity. The addition of copper to the culture medium (150 µM) increased laccase activity by 112%. The highest laccase activity (~34300 U/L) promoted the depigmentation of remazol brilliant blue R (67.5%) and malachite green (28.3%) dyes in 24 hours. Azo dyes were only partially discolored. Therefore, it can be considered that soybean molasses is an agro-industrial byproduct suitable for the production of P. sanguineus laccase with potential for dye degradation.(AU)

Lacasas son polifenoles oxidasas que utilizan la capacidad redox de iones de cobre para reducir el oxígeno del agua y oxidar un sustrato fenólico. La síntesis y secreción de lacasas de basidiomicetos dependen de las condiciones como los nutrientes presentes en el medio de cultura. Buscando la producción de lacasa, se cultivó Pycnoporus sanguineus en medio que contenía melaza de soja como única fuente de carbono, urea como fuente de nitrógeno suplementar a diferentes concentraciones (0,6, 1,2, 2,4, 4,8 y 9,6 g/L de nitrógeno) y diferentes concentraciones de CuSO4 (0, 150, 200, 250 y 300 µM). El extrato enzimático producido en mejores condiciones de cultivo ha sido utilizado para la decoloración de los colorantes remazol azul brillante R (antraquinona), amarillo 145, negro 5, rojo 195 (azoico) y verde malaquita (trifenilmetano). Las concentraciones de nitrógeno no afectaron la producción de lacasa, excepto la mayor concentración (9,6 g/L) que redujo la actividad enzimática. La adición de cobre al medio de cultivo (150 µM) aumentó la actividad de la lacasa en un 112%. La mayor actividad de lacasa (~34300 U/L) promovió la decoloración de los colorantes remazol azul brillante R (67,5%) y verde malaquita (28,3%) en 24h, siendo que los colorantes azoicos fueran parcialmente decolorados. Se concluye que la melaza de soja es un desecho agroindustrial adecuado para la producción de lacasa de P. sanguineus con potencial para degradación de colorantes.(AU)

Produção de lacase de Pycnoporus sanguineus em meio de cultivo à base de melaço soja / Laccase production by Pycnoporus sanguineus in culture media with soybean molasses / Producción de lacasa de Pycnoporus sanguineus en medio de cultivo con melaza de soja

Lacases são polifenol oxidases que utilizam a capacidade redox de íons cobre para reduzir oxigênio a água e oxidar um substrato fenólico. A síntese e secreção de lacases de basidiomicetos dependem de vários fatores como os nutrientes presentes no meio de cultura. Visando à produção de lacase, Pycnoporus sanguineus foi cultivado em meio contendo melaço de soja como única fonte de carbono, ureia como fonte de nitrogênio suplementar em diferentes concentrações (0,6; 1,2; 2,4; 4,8 e 9,6 g/L de nitrogênio) e diferentes concentrações de CuSO4 (0, 150, 200, 250 e 300 µM). O extrato enzimático produzido nas melhores condições de cultivo foi utilizado para a descoloração dos corantes remazol azul brilhante R (antraquinona), amarelo 145, preto 5, vermelho 195 (azo) e verde malaquita (trifenilmetano). As concentrações de nitrogênio não afetaram a produção de lacase, exceto a maior concentração (9,6 g/L) que reduziu a atividade enzimática. A adição de cobre ao meio de cultivo (150 µM) aumentou a atividade de lacase em 112%. A maior atividade de lacase (~34300 U/L) promoveu a descoloração dos corantes remazol azul brilhante R (67,5%) e verde malaquita (28,3%) em 24h, sendo os corantes azo descoloridos apenas parcialmente. Concluiu-se que o melaço de soja é um resíduo agroindustrial adequado para produção de lacase de P. sanguineus com potencial para degradação de corantes.

Laccases are multicopper oxidases using the redox ability from copper ions to reduce oxygen to water, while oxidizing a phenolic substrate. Laccase synthesis and secretion in basidiomycetes depend on the conditions provided and on the nutrients present in the culture medium. Pycnoporus sanguineus was cultivated in medium containing soybean molasses as the sole carbon source, with urea as the source of supplemental nitrogen at different concentrations (0.6, 1.2, 2.4, 4.8 and 9.6 g/L nitrogen), and different CuSO4 concentrations (0, 150, 200, 250 and 300 µM). The enzymatic extract produced under the best cultivation conditions was used for the depigmentation of remazole brilliant blue R (anthraquinone), yellow 145, black 5, red 195 (azo) and malachite green (triphenylmethane). Nitrogen concentrations did not affect laccase production, except for the higher concentration (9.6 g/L) reducing enzymatic activity. The addition of copper to the culture medium (150 µM) increased laccase activity by 112%. The highest laccase activity (~34300 U/L) promoted the depigmentation of remazol brilliant blue R (67.5%) and malachite green (28.3%) dyes in 24 hours. Azo dyes were only partially discolored. Therefore, it can be considered that soybean molasses is an agro-industrial byproduct suitable for the production of P. sanguineus laccase with potential for dye degradation.

Lacasas son polifenoles oxidasas que utilizan la capacidad redox de iones de cobre para reducir el oxígeno del agua y oxidar un sustrato fenólico. La síntesis y secreción de lacasas de basidiomicetos dependen de las condiciones como los nutrientes presentes en el medio de cultura. Buscando la producción de lacasa, se cultivó Pycnoporus sanguineus en medio que contenía melaza de soja como única fuente de carbono, urea como fuente de nitrógeno suplementar a diferentes concentraciones (0,6, 1,2, 2,4, 4,8 y 9,6 g/L de nitrógeno) y diferentes concentraciones de CuSO4 (0, 150, 200, 250 y 300 µM). El extrato enzimático producido en mejores condiciones de cultivo ha sido utilizado para la decoloración de los colorantes remazol azul brillante R (antraquinona), amarillo 145, negro 5, rojo 195 (azoico) y verde malaquita (trifenilmetano). Las concentraciones de nitrógeno no afectaron la producción de lacasa, excepto la mayor concentración (9,6 g/L) que redujo la actividad enzimática. La adición de cobre al medio de cultivo (150 µM) aumentó la actividad de la lacasa en un 112%. La mayor actividad de lacasa (~34300 U/L) promovió la decoloración de los colorantes remazol azul brillante R (67,5%) y verde malaquita (28,3%) en 24h, siendo que los colorantes azoicos fueran parcialmente decolorados. Se concluye que la melaza de soja es un desecho agroindustrial adecuado para la producción de lacasa de P. sanguineus con potencial para degradación de colorantes.

Copper induction and differential expression of laccase in Aspergillus flavus

Aspergillus flavus was isolated from soil and exhibited laccase activity under both constitutive and copper induced conditions. Spiking the medium with 1 mM copper sulfate resulted in an increase in the activity which reached 51.84 U/mL, a distinctive protein band was detected at 60 kDa. The extracellular enzyme was purified 81 fold using gel filtration chromatography and resulted in two different laccase fractions L1 and L2, the latter had a higher enzymatic activity which reached 79.57 U/mL and specific activity of 64.17 U/μg protein. The analysis of the spectrum of the L2 fraction showed a shoulder at 330 nm which is characteristic for T2/T3 copper centers; both copper and zinc were detected suggesting that this is an unconventional white laccase. Primers of laccase gene were designed and synthesized to recover specific gene from A. flavus. Sequence analysis indicated putative laccase (Genbank ID: JF683612) at the amino acid level suggesting a close identity to laccases from other genera containing the copper binding site. Decolorization of textile waste water under different conditions showed possible application in bioremediation within a short period of time. The effect of copper on A. flavus was concentration dependent.(AU)

Cloning, characterization and expression of a novel laccase gene Pclac2 from Phytophthora capsici

Laccases are blue copper oxidases (E.C. 1.10.3.2) that catalyze the one-electron oxidation of phenolics, aromatic amines, and other electron-rich substrates with the concomitant reduction of O2 to H2O. A novel laccase gene pclac2 and its corresponding full-length cDNA were cloned and characterized from Phytophthora capsici for the first time. The 1683 bp full-length cDNA of pclac2 encoded a mature laccase protein containing 560 amino acids preceded by a signal peptide of 23 amino acids. The deduced protein sequence of PCLAC2 showed high similarity with other known fungal laccases and contained four copper-binding conserved domains of typical laccase protein. In order to achieve a high level secretion and full activity expression of PCLAC2, expression vector pPIC9K with the Pichia pastoris expression system was used. The recombinant PCLAC2 protein was purified and showed on SDS-PAGE as a single band with an apparent molecular weight ca. 68 kDa. The high activity of purified PCLAC2, 84 U/mL, at the seventh day induced with methanol, was observed with 2,2'-azino-di-(3-ethylbenzothialozin-6-sulfonic acid) (ABTS) as substrate. The optimum pH and temperature for ABTS were 4.0 and 30 ºC, respectively . The reported data add a new piece to the knowledge about P. Capsici laccase multigene family and shed light on potential function about biotechnological and industrial applications of the individual laccase isoforms in oomycetes.(AU)

Produção de lacase de fungos basidiomicetos por fermentação submersa com cascas de café / Laccase production from basidiomycetes by submerged fermentation with coffee hurks / Producción de lacase de hongos basidiomicetos por fermentación sumergida con cascaras de café

Cascas de café são fonte de carboidratos e nutrientes que podem ser bioconvertidos em produtos de interesse como enzimas. Lacases são cobre polifenol oxidases que oxidam compostos fenólicos, enquanto reduzem oxigênio molecular à água e; sua baixa especificidade a substratos permite sua aplicação em várias áreas como indústria têxtil, de alimentos e biorremediação. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a capacidade de produção de lacase de três linhagens de fungos basidiomicetos (Lentinula edodes U6/1, Pleurotus ostreatus U6/9 e Pleurotus florida U6/10) por fermentação submersa com cascas de café e avaliar o uso de cobre como indutor dessa enzima. A casca de café mostrou ser um bom substrato para produção de lacases e das três linhagens testadas Pleurotus ostreatus (U6/9) foi a mais produtiva (22,5 U mL-1). A melhor fonte de nitrogênio para produção de lacases de Pleurotus ostreatus (U6/9) foi o extrato de levedura na concentração de 9 g/L (20 U mL-1). A adição de 150 μM de CuSO4 resultou na indução significativa na produção de lacases nessa linhagem (21 U mL-1) no 12° dia de cultivo.

Coffee husks are a source of carbohydrates and nutrients that may be bioconverted into products of interest, such as enzymes. Laccases are copper polyphenol oxidases that oxidize phenolic compounds while reducing molecular oxygen to water. Laccase’s low specificity to substrates allows its application in several areas such as textiles, food processing and bioremediation industries. The aims of this study were to evaluate the potential to produce laccase from three strains of basidiomycetous fungi (Lentinula edodes U6/1, Pleurotus ostreatus U6/9, and Pleurotus florida U6/10) by submerged fermentation with coffee husks, and to evaluate the use of copper as an inducer of the enzyme. Coffee husk proved to be a good substrate for laccase production, with Pleurotus ostreatus (U6/9) being the most productive strain (22.5 U mL-1). The best source of nitrogen for laccase production of Pleurotus ostreatus (U6/9) was yeast extract 9 g/L (20 U mL-1). The addition of CuSO4 (150 μM) resulted in significant induction of laccase (21 U mL-1) on the 12th day of cultivation.

Cáscaras de café son fuente de carbohidratos y nutrientes que pueden ser bioconvertidos en productos de interés, tales como enzimas. Lacases son cobre polifenol oxidasas que oxidan compuestos fenólicos, mientras reducen el oxígeno molecular a el agua y; su baja especificidad a sustratos permite su aplicación en diversas áreas, como la industria textil, de alimentos y de biorremediación. Los objetivos de este estudio fueron evaluar la capacidad de producción de lacase de tres linajes de hongos basidiomicetos (Lentinula edodes U6/1, Pleurotus ostreatus U6/9 y Pleurotus florida U6/10) por fermentación sumergida con cáscaras de café, y evaluar el uso del cobre como inductor de esta enzima. La cáscara de café resultó ser un buen sustrato para la producción de lacases y, de las tres linajes probadas, Pleurotus ostreatus (U6/9) fue la más productiva (22,5 U mL-1). La mejor fuente de nitrógeno para la producción de lacases de Pleurotus ostreatus (U6/9) fue el extracto de levadura a una concentración de 9 g L-1 (20 U mL-1). La adición de 150 μM de CuSO4 resultó en la inducción significativa de Cáscaras de café son fuente de carbohidratos y nutrientes que pueden ser bioconvertidos en productos de interés, evadura a una concentración de 9 g L-1 (20 U mL-1). La adición de 150 μM de CuSO4 resultó en la inducción significativa de la producción de lacases en esa linaje (21 U mL-1), en el 12º día de cultivo.

Produção de lacase de fungos basidiomicetos por fermentação submersa com cascas de café / Laccase production from basidiomycetes by submerged fermentation with coffee hurks / Producción de lacase de hongos basidiomicetos por fermentación sumergida con cascaras de café

Cascas de café são fonte de carboidratos e nutrientes que podem ser bioconvertidos em produtos de interesse como enzimas. Lacases são cobre polifenol oxidases que oxidam compostos fenólicos, enquanto reduzem oxigênio molecular à água e; sua baixa especificidade a substratos permite sua aplicação em várias áreas como indústria têxtil, de alimentos e biorremediação. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a capacidade de produção de lacase de três linhagens de fungos basidiomicetos (Lentinula edodes U6/1, Pleurotus ostreatus U6/9 e Pleurotus florida U6/10) por fermentação submersa com cascas de café e avaliar o uso de cobre como indutor dessa enzima. A casca de café mostrou ser um bom substrato para produção de lacases e das três linhagens testadas Pleurotus ostreatus (U6/9) foi a mais produtiva (22,5 U mL-1). A melhor fonte de nitrogênio para produção de lacases de Pleurotus ostreatus (U6/9) foi o extrato de levedura na concentração de 9 g/L (20 U mL-1). A adição de 150 μM de CuSO4 resultou na indução significativa na produção de lacases nessa linhagem (21 U mL-1) no 12° dia de cultivo.(AU)

Coffee husks are a source of carbohydrates and nutrients that may be bioconverted into products of interest, such as enzymes. Laccases are copper polyphenol oxidases that oxidize phenolic compounds while reducing molecular oxygen to water. Laccases low specificity to substrates allows its application in several areas such as textiles, food processing and bioremediation industries. The aims of this study were to evaluate the potential to produce laccase from three strains of basidiomycetous fungi (Lentinula edodes U6/1, Pleurotus ostreatus U6/9, and Pleurotus florida U6/10) by submerged fermentation with coffee husks, and to evaluate the use of copper as an inducer of the enzyme. Coffee husk proved to be a good substrate for laccase production, with Pleurotus ostreatus (U6/9) being the most productive strain (22.5 U mL-1). The best source of nitrogen for laccase production of Pleurotus ostreatus (U6/9) was yeast extract 9 g/L (20 U mL-1). The addition of CuSO4 (150 μM) resulted in significant induction of laccase (21 U mL-1) on the 12th day of cultivation.(AU)

Cáscaras de café son fuente de carbohidratos y nutrientes que pueden ser bioconvertidos en productos de interés, tales como enzimas. Lacases son cobre polifenol oxidasas que oxidan compuestos fenólicos, mientras reducen el oxígeno molecular a el agua y; su baja especificidad a sustratos permite su aplicación en diversas áreas, como la industria textil, de alimentos y de biorremediación. Los objetivos de este estudio fueron evaluar la capacidad de producción de lacase de tres linajes de hongos basidiomicetos (Lentinula edodes U6/1, Pleurotus ostreatus U6/9 y Pleurotus florida U6/10) por fermentación sumergida con cáscaras de café, y evaluar el uso del cobre como inductor de esta enzima. La cáscara de café resultó ser un buen sustrato para la producción de lacases y, de las tres linajes probadas, Pleurotus ostreatus (U6/9) fue la más productiva (22,5 U mL-1). La mejor fuente de nitrógeno para la producción de lacases de Pleurotus ostreatus (U6/9) fue el extracto de levadura a una concentración de 9 g L-1 (20 U mL-1). La adición de 150 μM de CuSO4 resultó en la inducción significativa de Cáscaras de café son fuente de carbohidratos y nutrientes que pueden ser bioconvertidos en productos de interés, evadura a una concentración de 9 g L-1 (20 U mL-1). La adición de 150 μM de CuSO4 resultó en la inducción significativa de la producción de lacases en esa linaje (21 U mL-1), en el 12º día de cultivo.(AU)

Mycoremediation of Congo red dye by filamentous fungi

Azo, anthroquinone and triphenylmethane dyes are the major classes of synthetic colourants, which are difficult to degrade and have received considerable attention. Congo red, a diazo dye, is considered as a xenobiotic compound, and is recalcitrant to biodegradative processes. Nevertheless, during the last few years it has been demonstrated that several fungi, under certain environmental conditions, are able to transfer azo dyes to non toxic products using laccases. The aim of this work was to study the factors influencing mycoremediation of Congo red. Several basidiomycetes and deuteromycetes species were tested for the decolourisation of Congo red (0.05 g/l) in a semi synthetic broth at static and shaking conditions. Poor decolourisation was observed when the dye acted as the sole source of nitrogen, whereas semi synthetic broth supplemented with fertilizer resulted in better decolourisation. Decolourisation of Congo red was checked in the presence of salts of heavy metals such as mercuric chloride, lead acetate and zinc sulphate. Decolourisation parameters such as temperature, pH, and rpm were optimized and the decolourisation obtained at optimized conditions varied between 29.25- 97.28% at static condition and 82.1- 100% at shaking condition. Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoretic analysis revealed bands with molecular weights ranging between 66.5 to 71 kDa, a characteristic of the fungal laccases. High efficiency decolourisation of Congo red makes these fungal forms a promising choice in biological treatment of waste water containing Congo red.

Ligninases production by Basidiomycetes strains on lignocellulosic agricultural residues and their application in the decolorization of synthetic dyes

Wood rotting Basidiomycetes collected in the "Estação Ecológica do Noroeste Paulista", São José do Rio Preto, São Paulo State, Brazil, concerning Aphyllophorales order and identified as Coriolopsis byrsina SXS16, Lentinus strigellus SXS355, Lentinus sp SXS48, Picnoporus sanguineus SXS 43 and Phellinus rimosus SXS47 were tested for ligninases production by solid state fermentation (SSF) using wheat bran or rice straw as culture media. C. byrsina produced the highest laccase (200 U mL-1) and Lentinus sp produced the highest activities of manganese peroxidase (MnP) and lignin peroxidase (LiP) (7 and 8 U mL-1, respectively), when cultivated on wheat bran. The effect of N addition on enzyme production was studied in medium containing rice straw and the data showed an increase of 3 up to 4-fold in the laccase production compared to that obtained in SSF on wheat bran. The laccases presented optimum pH at 3.0-3.5 and were stable at neutral pH values. Optimum pH for MnP and LiP activities was at 3.5 and between 4.5 and 6.0, respectively. All the strains produced laccase with optimum activities between 55-60°C while the peroxidases presented maximum activity at temperatures of 30 to 55°C. The crude enzymes promoted decolorization of chemically different dyes with around 70% of decolorization of RBBR and cybacron blue 3GA in 6h of treatment. The data indicated that enzymes from these basidiomycetes strains are able to decolorize synthetic dyes.

Fungos decompositores de madeira, do grupo Basidiomicetes, coletados na "Estação Ecológica do Noroeste Paulista", São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil, pertencentes a ordem Aphyllophorales e identificados como Coriolopsis byrsina SXS16, Lentinus strigellus SXS355, Lentinus sp. SXS48, Picnoporus sanguineus SXS 43 e Phellinus rimosus SXS47 foram estudados para a produção de ligninases por FES (fermentação em estado sólido) usando farelo de trigo ou palha de arroz como meio de cultura. A espécie C. byrsina produziu a maior quantidade de lacase (200 U mL-1) enquanto que Lentinus sp. foi o melhor produtor de manganês peroxidase (MnP) e lignina peroxidase (LiP) (7 e 8 U mL-1, respectivamente), quando cultivados em meio composto por farelo de trigo. A avaliação do efeito da suplementação de nitrogênio do substrato sólido lignocelulósico (palha de arroz) indicou um aumento de 3 a 4 vezes na produção de lacase. A caracterização das enzimas mostrou que as lacases apresentaram atividade ótima em pH 3,0-3,5 e foram estáveis em pH de neutro a alcalino. O pH ótimo para atividade de MnP e LiP foi de 3,5 e entre 4,5 e 6,0, respectivamente. Todas as linhagens produziram lacase com atividade ótima a 55-60°C, enquanto as peroxidases apresentaram atividades máximas entre temperaturas de 30 e 55°C. A aplicação das soluções enzimáticas brutas, obtidas pelo cultivo das linhagens em meio de farelo de trigo, em testes de descoloração de corantes sintéticos de diferentes grupos químicos levou a mais 70% de perda de cor dos corantes RBBR e de cybacron blue 3GA, em 6h de tratamento. Os dados obtidos indicaram que as soluções enzimáticas contendo ligninases produzidas pelas linhagens de basidiomicetos estudadas promoveram a descoloração de corantes sintéticos.

Mycelial growth of strains of Pleurotus ostreatus developed on agar and its correlation with the productivity in pilot production farm

Radial growth rate, intracellular laccases and proteases activities, and protein content were evaluated in five strains of Pleurotus ostreatus, grown on starch-based and glucose-based agar media containing different concentrations of the glucose analogue 2-deoxyglucose (2-DG). Productivity of the strains in pilot scale cultivation was also determined. The mycelium of four strains had approximately between 0.6- to 3-fold higher protein content when grown on glucose medium containing 0.01 g/L of 2-DG than when grown on glucose medium. The radial growth rate and intracellular laccases activity of some strains showed a positive and a negative correlation with the productivity, respectively. These results suggest that the strains with high radial growth rate and low intracellular laccases activity on glucose without 2-DG, on starch without 2-DG or on glucose containing 0.01 g/L of 2-DG are highly productive in pilot production farm.

Avaliou-se o crescimento radial, as atividades de proteases e lacases e o conteúdo protéico de cinco cepas de Pleurotus ostreatus cultivado em agar à base de amido e à base de glicose contendo diferentes concentrações de 2-deoxiglicose (2-DG), um análogo da glicose. A produtividade das cepas em cultivo em escala piloto foi também determinada. Em quatro cepas o conteúdo protéico do micélio foi aproximadamente 0,6 a 3 vezes maior quando foram cultivadas em meio à base de glicose contendo 0,01g/L de 2-DG. O crescimento radial e a atividade de lacases apresentaram correlação positiva e negativa, respectivamente, com a produtividade. Esses resultados sugerem que as cepas com elevada taxa de crescimento radial e baixa atividade de lacases em glicose sem 2-DG, ou em amido sem 2-DG, ou em glicose com 0,01 g/L de 2-DG, são altamente produtivas em cultivo em escala piloto.

Purification of laccases PPO-I of fungus Botryosphaeria rhodina - DOI: 10.4025/actascibiolsci.v27i3.1317 / Purificação de lacases PPO-I de Botryosphaeria rhodina - DOI: 10.4025/actascibiolsci.v27i3.1317

Laccases are glycoprotein polyphenol oxidases which are involved in fungal pathogenicity and they are also useful for biotechnological applications. The ligninolytic ascomycete, Botryosphaeria rhodina, has been studied as producer of exopolysaccharide and PPO-I and PPO-II laccases induced by veratryl alcohol. However, as the induced laccases have not been isolated, the aim of this study was to purify the enzyme and to identify the carbohydrates constituents of the glycosidic moiety. The fungus was cultivated on broth Vogel, 1% glucose and 30.4mM veratryl alcohol during 4.5 days at 28C/180 rpm. The extracellular fluid showed high carbohydrate concentration and the stability of PPO-I laccase under conditions of refrigeration and freezing at 4ºC-18ºC over 40 days. The purification was developed by ultrafiltration using a NMWL 100 and 30 kDa membrane, gelfiltration on Sephadex G-100, and ion-exchange chromatography on DEAE-cellulose. The purified laccase was identified as a glycoprotein, weight molecular 113 kDa, consisting of 40% protein and 60% carbohydrate identified by HPAEC-PAD as fucose, galactose, mannose, glucose and glucosamine

Lacases são glicoproteínas polifenol oxidases envolvidas na patogenicidade de alguns fungos e úteis em processos biotecnológicos. O ascomiceto ligninolítico Botryosphaeria rhodina tem sido estudado como produtor de exopolissacarídeos e de lacases PPO-I e PPO-II induzidas pelo álcool veratrílico. Como as lacases produzidas ainda não foram isoladas, o objetivo deste trabalho foi purificar lacases PPO-I e identificar os carboidratos constituintes da porção glicosídica. O fungo foi cultivado em meio mínimo de Vogel contendo 1% de glicose e 30,4 mM de álcool veratrílico, a 28C e agitação de 180 rpm durante 4,5 dias. O extrato livre de células apresentou elevada concentração de carboidratos e de PPO-I estáveis a 4ºC e -18ºC durante 40 dias. Técnicas de ultrafiltração, cromatografia em gel Sephadex G-100 e em resina DEAE-Celulose purificaram lacases PPO-I com peso molecular de 113 kDa por eletroforese PAGE-SDS, contendo 40% de proteínas e 60% carboidratos identificados por HPAEC-PAD como fucose, galactose, manose, glucose e glucosamina

Screening of inducers for laccase production by Lentinula edodes in liquid medium

Laccases are enzymes involved in lignin degradation and are produced by various organisms. Due to their low substrate specificity their potential to be used in biotechnological applications has received attention. The addition of laccase inducers to the culture medium of microorganisms can enhance laccase production and facilitate its purification and utilization. The aim of this study was to investigate the effect of some compounds as laccase inducers in cultures of Lentinula edodes (shiitake). First, it was selected a culture medium suitable for laccase production by shiitake using two levels of N (2.6 and 26 mM) and seven levels of Cu (0, 50, 100, 150, 200, 250 and 300 µM). The medium with 2.6 mM N and 250 µM Cu was found to provide the highest laccase activity. To the selected medium it were added gallic acid (1 mM), catechol (1 mM), ammonium tartrate (55 µM), hydroxybenzoic acid (1 mM) and vanillin (1 mM). The two first compounds completely inhibited laccase activity and a 30 day time course experiment was carried out with the remaining compounds. Only cultures with ammonium tartrate exhibited laccase activity higher than control cultures, reaching 251 U/mL of extract after 30 days. A native-PAGE was performed and showed only one band, suggesting that no isozyme was produced.

Lacases são enzimas envolvidas na degradação da lignina e produzidas por diversos organismos. Devido à sua baixa especificidade por substratos, seu potencial para utilização em aplicações biotecnológicas tem sido objeto de investigação. A adição de indutores de lacases ao meio de cultivo de microrganismos aumenta a produção dessas enzimas, facilitando sua purificação e utilização. Este trabalho teve como objetivo investigar o efeito de alguns compostos utilizados como indutores de lacases em fungos na produção destas enzimas por Lentinula edodes (shiitake). Previamente a utilização de indutores, foi selecionado um meio de cultura para a produção de lacases por shiitake, utilizando-se duas concentrações de N (2,6 mM e 26 mM) e sete de Cu (0, 50, 100, 150, 200, 250 e 300 µM). O meio no qual maior atividade de lacases foi detectada continha 2,6 mM N e 250 µM de Cu. Posteriormente, ao meio selecionado foram adicionados ácido gálico (1 mM), catecol (1 mM), tartarato de amônio (55 µM), ácido hidroxibenzóico (1 mM) e vanilina (1 mM). Os dois primeiros compostos inibiram completamente a atividade de lacases por shiitake, e um experimento com os restantes foi conduzido por 30 dias. Apenas as culturas com tartarato de amônio apresentaram atividade de lacase maior que o tratamento controle, alcançando 251 U/mL de extrato após 30 dias de cultivo. Um gel de atividade (native PAGE) exibiu apenas uma banda, sugerindo não haver produção e isozimas.

Ligninolytic enzymes production and Remazol brilliant blue R decolorization by tropical brazilian basidiomycetes fungi

Remazol Brilliant Blue R (RBBR) dye was used as substrate to evaluate ligninolytic activity in 125 basidiomycetous fungi isolated from tropical ecosystems. The extracellular RBBR decolorizing activity produced when selected fungi were grown in solid media and in soil contaminated with organochlorines was also evaluated. A total of 106 fungi decolorized the RBBR during the growth in malt extract agar (MEA, 2%); 96 fungi showed a mycelia growth and decolorization activity stronger than the P. chrysosporium used as reference. Extracellular extracts of 35 selected fungi grown on solid medium with sugar cane bagasse (BGS) were evaluated for RBBR decolorization and peroxidase activity. All fungi showed peroxidase activities, but 5 of those were unable to decolorize the RBBR. Different patterns of ligninolytic enzymes were detected in 12 fungi extracts. Mn-dependent peroxidase (MnP) was produced by Peniophora cinerea, Psilocybe castanella, three strains of Trametes villosa, T. versicolor, Melanoporia nigra and Trichaptum byssogenum. All 12 fungi had laccase activity. Trogia buccinalis showed the highest RBBR decolorization and did not produce MnP activity. RBBR decolorization without MnP production was also observed for three strains of Lentinum tested. Higher levels of peroxidase and laccase cannot be related to high RBBR decolorization. RBBR decolorization by extracellular extract was also detected during the growth of P. castanella, L. crinitus, P. cinerea and two strains of T. Villosa in pentachlorophenol- and hexachlorobenzene-contaminated soils. These fungi showed higher RBBR decolorization when grown in the presence of organochlorine compounds than when in non contaminated soil.

O corante azul brilhante Remazol R (RBBR) foi usado como substrato para avaliar 125 fungos basidiomicetos isolados de ecossistemas tropicais brasileiros quanto a atividade ligninolítica. A descoloração do RBBR por extratos obtidos do crescimento de fungos em meio sólido e em solo contaminado com organoclorados foi também avaliada. Cento e seis fungos descoloriram o RBBR durante o crescimento em meio sólido (agar extrato malte); noventa e seis desses fungos mostraram crescimento micelial e descoloração superiores a uma cepa de Phanerochaete chrysosporium usada como referência. Trinta e cinco fungos foram crescidos em meio sólido contendo bagaço de cana-de-açúcar (BGS) e seus extratos foram avaliados quanto a descoloração do RBBR e a produção de atividade de peroxidases. Todos os fungos mostraram atividade de peroxidases, mas 5 foram incapazes de descolorir o RBBR. Diferentes padrões de enzimas lignolíticas foram detectados em 12 desses extratos fúngicos, porém todos mostraram atividade de laccase. Atividade de peroxidase dependente de manganês (MnP) foi produzida por Melanoporia nigra, Peniophora cinerea, Psilocybe castanella, três cepas de Trametes villosa, T. versicolor e Trichaptum byssogenum. Trogia buccinalis apresentou a maior descoloração do RBBR e não produziu MnP. Descoloração do RBBR sem produção de MnP foi também observada para as três cepas de Lentinus testadas. Altos níveis de atividades de peroxidases e laccases não mostraram relação com significativa descoloração do RBBR. Foi observada descoloração do RBBR por extratos obtidos de P. castanella, L. crinitus, P. cinerea e duas cepas de T. Villosa durante crescimento em solos contaminados com pentaclorofenol e hexaclorobenzeno. Estes fungos mostraram maior descoloração de RBBR na presença de compostos organoclorados do que em solos não contaminados.

Influence of Tween on constitutive and inducible laccase production by Botryosphaeria sp - DOI: 10.4025/actascibiolsci.v26i4.1536 / Influência de Tween na produção de lacases constitutivas e indutivas pelo Botryosphaeria sp - DOI: 10.4025/actascibiolsci.v26i4.1536

Botryosphaeria sp. is a ligninolytic fungus that produces laccase. It was previously established that veratryl alcohol (VA) strongly induced laccase production in this ascomyceteous. It is well known that surfactants such as Tween - 80 can increase the production of some fungal exo-enzymes. It has been reported that Tween-80 can also induce laccase production in basidiomycetes. In this work, the influence of Tweens 20, 40, 60 and 80 on the production of constitutive laccases (in the absence of VA) and inducible laccases (in the presence of VA) by Botryosphaeria sp. was evaluated, separately. Laccase activity was assayed using two putative laccase substrates: ABTS (PPO - I) and DMP (PPO - II). All of the Tweens examined increased the production of both constitutive and inducible laccase PPO - I, but did not affect the production of constitutive laccase PPO - II. Tweens 60 and 20 increased the production of inducible laccase PPO - II, while Tween 80 and 40 did not cause any effect

O Botryosphaeria sp. é um fungo ligninolítico produtor de lacases. Estudos anteriores demonstraram que o álcool veratrílico (AV) induziu fortemente a produção de lacases nesse ascomiceto. Sabe-se que surfactantes tais como o Tween - 80 podem aumentar a produção de algumas exoenzimas fúngicas. Tem sido relatado que o Tween-80 pode induzir a produção de lacase em basidiomicetos. No presente trabalho, foi avaliada a influência dos Tweens 80, 60, 40 e 20 na produção de lacases constitutivas (ausência de AV) e indutivas (presença de AV) pelo Botryosphaeria sp. A atividade de lacase foi determinada usando-se dois substratos diferentes, o ABTS (PPO - I) e o DMP (PPO - II). Todos os Tweens estudados aumentaram a produção das lacases (PPO - I) constitutivas e indutivas e não afetaram a produção da lacase (PPO - II) constitutiva. Os Tweens 60 e 20 aumentaram a produção da lacase (PPO - II) indutiva, enquanto que os Tweens 80 e 40 não causaram nenhum efeito