Resumo
Canine herpesvirus (CaHV-1) affects canids worldwide, causing death in neonates and immunosuppressed hosts. Acute infection by CaHV-1 can cause reproductive, respiratory, and neurological problems in adult animals. Viral pathogenesis and host genes expressions during of CaHV-1infection are not clearly understood. In the present study, the transcriptome of canine kidney cell Mardin-Darby (MDCK) infected in vitro with canine herpesvirus was explored. For this, RNA sequencing (RNA-seq) of the samples in different moments during infection was carried out. Subsequently, the transcriptomic analysis genes related to cell activities and process involved to viral cycle infection were evaluated until 32h post-inoculation (pi). Among evaluated genes, was verified a significant and gradative increase of the prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2) or cyclooxygenase 2 (COX2) gene expression, throughout of infection, though differential gene expression analysis and validated by quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR). High COX2 expression is usually induced in response to inflammation, pathogens or activation of the immune system but can be a viral mechanism to favor viral replication. Thus, COX2 level increase can be a favorable factor for viral infection with Cahv-1 virus and the use of selective COX2 inhibitors may be beneficial for limiting the infection or clinical signs by causing interruption of the viral replication cycle during active infection. Additionally, the regulation genes expression differential verified in this study can contribute to determining important targets for inhibiting canine herpesvirus infection either by cellular or viral mechanisms.(AU)
O herpesvírus canino (CaHV-1) afeta os canídeos em todo o mundo, causando morte em neonatos e hospedeiros imunossuprimidos. A infecção aguda por CaHV-1 pode causar problemas reprodutivos, respiratórios e neurológicos em animais adultos. A patogênese viral e expressão de genes hospedeiros durante a infecção por CaHV-1 ainda não são bem compreendidos. No presente estudo, o transcriptoma de células de rim canino Madin-Darby (MDCK) infectadas in vitro com herpesvirus canino foi explorado. Para isso, foi realizado o sequenciamento de RNA (RNA-seq) de amostras coletadas em diferentes momentos durante a infecção. Subsequentemente, a análise transcriptômica dos genes relacionados à atividade celular e aos processos envolvidos no ciclo de infecção do vírus foram avaliadas até 32 horas após a inoculação (pi). Dentre os genes avaliados, constatamos uma elevação significativa e gradativa da expressão da Prostaglandina-endoperoxide sintase 2 (PTGS2) ou ciclooxigenase 2 (COX2), ao longo da infecção viral, foi verificada por análise de expressão gênica diferencial e validada por resultados de transcrição reversa por PCR quantitativo (RT-qPCR). O aumento da expressão de COX2 geralmente é induzida em resposta a inflamação, patógenos ou ativação do sistema imune, mas também pode ser um mecanismo para favorecer a replicação viral. Assim, o aumento do nível de COX2 pode ser um fator favorável à infecção viral pelo vírus CaHV-1 e o uso de inibidores seletivos da COX2 pode ser benéfico para limitar a infecção ou os sinais clínicos, causando a interrupção do ciclo de replicação viral durante a infecção ativa. Além disso, a regulação diferencial da expressão dos genes verificados neste estudo podem contribuir para determinar alvos importantes para inibir a infecção por herpesvírus canino, seja por mecanismos celulares ou virais.(AU)
Assuntos
Animais , Cães , Expressão Gênica , Herpesvirus Canídeo 1 , Infecções por Herpesviridae/veterinária , Transcriptoma , Ciclo-Oxigenase 2 , Análise de Sequência de RNA/veterinária , Reação em Cadeia da PolimeraseResumo
O uso de produtos medicinais a base de plantas é uma prática comum na terapêutica, desde épocas remotas. Dessa forma, são essenciais os estudos sobre caracterização dos compostos químicos presentes nas plantas e suas atividades farmacológicas. Os objetivos desde trabalho foram: caracterizar os compostos fitoquímicos presentes no extrato de S. oleraceus L.; avaliar a citotoxicidade do extrato de S. oleraceus L. com atividades em fibroblastos e avaliar a toxicidade sistêmica de formulações contendo extrato de S. oleraceus L. por meio de análises hematológica, bioquímica e histopatológica. Para a triagem fitoquímica utilizou-se a cromatografia em fase reversa com detecção de compostos apolares empregando HPLC-UV, e quantificação de polifenóis e flavonóides totais pela técnica espectrofotométrica. Para a análise da citoxicidade utilizou-se cultivo celular das linhagens celulares utilizadas foram: MDCK e NIH-3T3, medida melo MTT. Para a toxicidade sistêmica utilizou-se uma amostra experimental com 100 ratos. Os grupos: VEM (veículo/macho); VEF (veículo/fêmea); SSOM (suspensão manipulada/macho); SSOF (suspensão manipulada/ fêmea); contendo sete animais em cada grupo (28 animais) foram utilizados para o teste da dose única (aguda) com indução oral da formulação com a dose equivalente a 6g/kg do extrato. Para os grupos de doses repetidas (crônica) utilizou-se um total de 72 animais, subdivididos em grupos de nove animais: VEM; VEF; SSOM1; SSOM2; SSOM3; SSOF1; SSOF2; SSOF3 com indução oral de formulações nas doses de 100, 200 e 300mg/Kg. Sobre a triagem fitoquímica do extrato de S. oleraceus L. o resultado mostrou a presença de compostos apolares como: ácido arjúnico, ácido maslínico, ácido betulínico, lupeol, -amirina, -amirina, estgmasterol e sitosterol, ambos com atividades biológicas benéficas ao organismo. Verificouse que em cada grama do extrato contém 22,83mg de polifenóis e 7,77mg de flavonóides. Após o tempo de 60 horas de exposição das linhagens de células normais de fibroblastos NHI/3T3, verificou-se que de acordo com o EC50 o extrato em concentrações 2,057µg/mL estimulam a crescimento e viabilidade celular. As avaliações sistêmicas, parâmetros hematológicos e bioquímicos, mostraram pouca divergência entre a dose única e as doses repetidas ressaltando que na maioria das vezes a variação foi quanto à diferença entre os sexos, quando comparado aos tratamentos. A avaliação anatomopatológica mostrou integridade dos órgãos avaliados tanto macroscopicamente quando microscopicamente. Esses dados conferem segurança para uso em testes clínicos de formulações contendo extrato de S. oleraceus L.
The use of medicinal herbal products has been a common practice in therapeutics since ancient times. Thus, studies of the characterization of the chemical compounds present in plants and their pharmacological activities are essential. The objectives of this study were: to characterize the phytochemical compounds present in the extract of S. oleraceus L .; to evaluate the cytotoxicity of the extract of S. oleraceus L. with activities over fibroblasts and to evaluate the systemic toxicity of formulations containing extract of S. oleraceus L. by hematologist, serum biochemical and histopathological analyzes. Phytochemical screening was performed using reverse phase chromatography with detection of apolar compounds using HPLC-UV, and quantification of polyphenols and total flavonoids by the spectrophotometric technique. To cell cytotoxicity analysis, the cell lines used were MDCK and NIH-3T3, measured melo MTT. For the systemic toxicity, an experimental sample with 100 rats was used. The groups VEM (vehicle/male), VEF (vehicle/female), SSOM (manipulated suspension/male), SSOF (manipulated suspension/female), containing seven animals in each group (28 animals) and were used for the single dose test (acute test) with oral induction of the formulation at the dose equivalent to 6g / kg of the extract. For the repeated dose groups (chronic test) a total of 72 animals were used, subdivided into groups of nine animals: VEM; VEF; SSOM1; SSOM2; SSOM3; SSOF1; SSOF2; SSOF3 with oral induction of formulations at doses of 100, 200 and 300mg/kg. On the phytochemical evaluation of the S. oleraceus L. extract, the results showed the presence of apolar compounds such as arjunic acid, maslinic acid, betulinic acid, lupeol, amirin, -amirin, stgmasterol and sitosterol, both with beneficial biological activities into human organism. It was verified that in each gram of the extract contains 22.83mg of polyphenols and 7.77mg of flavonoids. After the 60-hour exposure time of normal NHI / 3T3 fibroblast cell lines, it was found that according to the EC50 the extract at concentrations 2,057 g / mL stimulated cell growth and viability. The systemic evaluations, hematological and biochemical parameters, showed little divergence between the single dose and the repeated doses, emphasizing that most of the time the variation was regarding the difference between the sexes, when compared to the treatments. The anatomopathological evaluation showed integrity of the evaluated organs both macroscopically and microscopically. These data confer safety for use in clinical trials of formulations containing extract of S. oleraceus L.
Resumo
The control of enterotoxemia caused by the epsilon toxin, produced by Clostridium perfringenstype D, is based on vaccination with epsilon toxoid. The potency test for this immunogen is conducted using seroneutralization in mice. Here, an in vitro test for detection of neutralizing antibodies with Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells was standardized in order to study alternative methodologies for the potency test. Titers observed in the in vivo and in vitro seroneutralization tests had a correlation of 99.73%.
O controle da enterotoxemia causada pela toxina épsilon produzida por Clostridium perfringenstipo D é baseado na vacinação com toxoide. O teste de potência desse imunógeno é realizado utilizando-se a técnica de soroneutralização em camundongos. Objetivando-se estudar metodologias alternativas a essa técnica, padronizou-se um teste in vitropara detecção de anticorpos neutralizantes utilizando-se a linhagem celular Madin-Darby Canine Kidney (MDCK). Os títulos observados nas soroneutralizações in vivoe in vitro apresentaram correlação de 99,73%.
Resumo
The control of enterotoxemia caused by the epsilon toxin, produced by Clostridium perfringens type D, is based on vaccination with epsilon toxoid. The potency test for this immunogen is conducted using seroneutralization in mice. Here, an in vitro test for detection of neutralizing antibodies with Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells was standardized in order to study alternative methodologies for the potency test. Titers observed in the in vivo and in vitro seroneutralization tests had a correlation of 99.73%.
O controle da enterotoxemia causada pela toxina épsilon produzida por Clostridium perfringens tipo D é baseado na vacinação com toxoide. O teste de potência desse imunógeno é realizado utilizando-se a técnica de soroneutralização em camundongos. Objetivando-se estudar metodologias alternativas a essa técnica, padronizou-se um teste in vitro para detecção de anticorpos neutralizantes utilizando-se a linhagem celular Madin-Darby Canine Kidney (MDCK). Os títulos observados nas soroneutralizações in vivo e in vitro apresentaram correlação de 99,73%.
Assuntos
Camundongos , Toxoides , Técnicas In Vitro , Vacinação , Clostridium perfringensResumo
As doenças causadas pelas bactérias pertencentes ao gênero Clostridium estão entre as mais importantes enfermidades que causam efeitos deletérios e prejuízos aos produtores de rebanho de ovinos, caprinos e bovinos. Entre estas se destaca a enterotoxemia, causada pela toxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D. Devido ao rápido curso dessa doença é preconizado a vacinação com a toxina épsilon inativada como o método mais indicado para a sua prevenção. Entretanto é reconhecida a baixa capacidade de manutenção dos anticorpos neutralizantes persistentes a partir das vacinas comerciais para a espécie caprina e pouca evidência do comportamento da duração da imunidade em bovinos. Com isso, o presente trabalho objetivou: (a) produzir, concentrar e purificar a toxina épsilon (ETX) de C. perfringens tipo D para a produção do seu respectivo toxoide na forma ultrafiltrada (EToX-U) e ultrafiltrada, dialisada e purificada em cromatografia de troca iônica (EToX-UC); (b) produzir vacinas utilizando os referidos toxoides em formulações do tipo microemulsão (ME), adsorvidos em micropartícula de quitosana (MQ), em nanopartículas de sílica mesosporosa (NSM), em nanopartículas de hidroxiapatita (HANP) e em hidróxido de alumínio (HA); (c)triagem das melhores formulações em imunizações de coelhos observando-se o título de anticorpos neutralizantes obtido pós vacinação segundo diretrizes da normativa oficial do MAPA com leitura da soroneutralização in vitro realizada em monocamada de células Madin Darby Canine Cells (MDCK); (d) avaliar as opções vacinais selecionadas em coelhos nas espécies alvos caprinos e bovinos por meio do acompanhamento da cinética da resposta humoral antitoxina épsilon nestas espécies pelo período de um ano. Além disso, avaliar o comportamento da curva de anticorpos em caprinos após a aplicação de uma terceira dose vacinal na semana 52 pós primovacinação. A produção da toxina épsilon de C. perfringens tipo D permitiu obter antígeno ETX-U e ETX-UC em qualidade e quantidade suficiente para as formulações pretendidas, bem como seus respectivos toxoides oriundos da inativação pelo formaldeído (EToX-U e EToX-UC). As vacinas formuladas à base de HA, MQ, NSM e HANP administradas em duas doses (t=0 e 21 dias) obtiveram títulos sorológicos médios superiores ou igual ao índice mínimo de aprovação de 2UI/mL na triagem inicial em coelhos, tornando-se opções viáveis de proteção imunológica frente à enterotoxemia causada pela toxina épsilon de C. perfringens tipo D. Por outro lado as vacinas à base de MQ, NSM e HANP administradas em dose única (t=0) não obtiveram títulos médios iguais ou acima do índice de aprovação, sugerindo que nas condições formuladas tais vacinas não seriam recomendados em esquema vacinal single shot. De forma similar, as vacinas em ME formuladas neste trabalho não lograram êxito na geração de título detectável nos coelhos, administrando-se tanto duas doses quanto dose única. Frente aos resultados obtidos em coelhos, as vacinas selecionadas para teste em espécie alvo foram: EToX-UC e EToX-U adsorvidos em hidróxido de alumínio e EToX-U adsorvido em micropartícula de quitosana cujos títulos médios de antitoxina épsilon em coelhos foram 10,24 UI/mL, 7,45 UI/mL e 6,03 UI/mL respectivamente. Quando avaliados nas espécies alvo, observou-se que os mais elevados títulos tanto no grupo de caprinos quanto bovinos foram aos 60 dias pós primovacinação, correspondendo a 10,5 UI/mL, 11,5 UI/mL e 6,9 UI/mL para as vacinas EToX-U HA, EToX-UC HA e EToX-UC MQ respectivamente em bovinos e 1,1 UI/mL, 3,9 UI/mL e 2,1 UI/mL para as vacinas EToX-U HA, EToX-UC HA e EToX-UC MQ respectivamente em caprinos. O estudo da concordância entre os títulos obtidos nos grupos animais neste experimento corrobora fortemente o fato do coelho representar um excelente modelo animal para a resposta em bovinos nas formulações à base de hidróxido de alumínio, 22 corroborando a indicação deste nos testes oficiais, porém com fraca concordância com caprinos para formulações com épsilon não purificado. O estudo de duração de imunidade com as formulações avaliadas em caprinos corroborou a necessidade de revacinação de três a quatro meses referendada por outros autores. Em relação aos bovinos, apesar de não existirem trabalhos na literatura que estabeleçam a duração de imunidade para a espécie, o resultado do título de antitoxina épsilon, apesar de limítrofe, conferiu proteção pelo período de um ano em acordo com as recomendações das vacinas comerciais de revacinação anual.
The diseases caused by bacterial belonging to the genus Clostridium are among the most important diseases that cause deleterious and loss effects to sheep, goat and cattle herds producers. Among these stand out the enterotoxemias, caused by Clostridium perfringens type D toxin. Because rapid course of this disease it is recommended vaccination with inactivated epsilon toxin as the most appropriate method for its prevention. However, the low maintenance capacity of persistent neutralizing antibodies from commercial vaccines in goat and the little evidence of the duration of immunity in cattle is recognized. The aim of the present work was to: (a) produce, concentrate and purify epsilon toxin (ETX) of C. perfringens type D for the production of its toxoid in the ultrafiltered form (EToX-U) and ultrafiltered, dialyzed and purified in chromatography (EToX-UC); (b) produce vaccines using toxoids in microemulsion (ME) -type formulations, adsorbed on microparticles of chitosan (MQ), mesosporous silica nanoparticles (NSM), hydroxyapatite nanoparticles (HANP) and aluminum hydroxide ); (c) screening the best formulations in rabbits by observing the titre of neutralizing antibodies obtained after vaccination according to guidelines of the official MAPA standard with in vitro seroneutralization readings performed on a monolayer of Madin Darby Canine Cells (MDCK) cells; (d) evaluate the selected vaccine options in rabbits in the caprine and bovine target species by monitoring the kinetics of the humoral epsilon antitoxin response in these species for a period of one year. In addition, to evaluate the antibody of profile curve in goats after the inoculation of a third vaccine dose at week 52 post-vaccination. The C. perfringens type D epsilon toxin production allowed to obtain ETX-U and ETX-UC antigen in sufficient quality and quantity for the desired formulations and their respective toxoids from inactivation by formalin (EToX-U and EToX-UC). The HA, MQ, NSM and HANP formulated vaccines administered at two doses (t = 0 and 21 days) produced high titers over 2UI/mL at initial screening in rabbits, making them viable options for immunological protection against enterotoxemia caused by the epsilon toxin of C. perfringens type D. On the other hand, MQ, NSM and HANP vaccines administered in a single dose (t = 0) did not obtain high titres suggesting that under formulated conditions such vaccines would not be recommended in a single shot vaccine scheme. Similarly, the ME vaccines formulated in this work did not succeed in generating detectable titer of antibodies in rabbits both when given two doses and a single dose. Based on the results obtained in rabbits, the best vaccines were: EToX-UC and EToX-U adsorbed on aluminum hydroxide and EToX-U adsorbed on microparticles of chitosan whose mean efficacy of epsilon antitoxin in rabbits was 10.24 IU / mL, 7.45 IU / mL and 6.03 IU / mL respectively. When evaluated in the livestock animals it was observed that the highest titers in both the goat and bovine groups were 60 days post-vaccination corresponding to 10.5 IU / mL, 11.5 IU / mL and 6.9 IU / mL for the the EToX-U HA, EToX-UC HA and EToX-UC MQ vaccines respectively in cattle and, 1.1 IU / mL, 3.9 IU / mL and 2.1 IU / mL for the EToX-U HA, EToX-UC HA and EToX-UC MQ respectively in goats. The study of the concordance between the titers obtained in the animal groups in this experiment corroborates strongly with the fact that rabbits represents an excellent animal model for the response bovines immune response in the formulations based on aluminum hydroxide corroborating with the indication of this one in the official tests, but with weak agreement with goats for formulations with unpurified epsilon. The study of duration of immunity with the formulations evaluated in goats showed the need of revaccination of three to four months as recommended by other authors. Regarding cattle, although there are no studies in the 24 literature that establish the duration of immunity for the species, the result of the epsilon antitoxin titer, although borderline, conferred protection for a period of one year
Resumo
Cytotoxicity of venoms from eleven medically important snakes found in Southeast Asia (Naja kaouthia, Naja siamensis, Naja sumatrana, Ophiophagus hannah, Bungarus candidus, Bungarus fasciatus, Enhydrina schistosa, Calloselasma rhodostoma, Trimeresurus purpureomaculatus and Tropidolaemus sumatranus) was determined, based on the MTS cytotoxicity assay, which determines the survival of viable cells in monolayer MDCK and Vero cell cultures upon exposure to the snake venoms. Snake venom toxicity was expressed as the venom dose that killed 50% of the cells (CTC50) under the assay conditions. Venoms of C. rhodostoma (2.6 µg/mL, 1.4 µg/mL) and O. hannah were the most cytotoxic (3.8 µg/mL, 1.7 µg/mL) whereas N. siamensis venom showed the least cytotoxicity (51.9 µg/mL, 45.7 µg/mL) against Vero and MDCK cells, respectively. All the viper venoms showed higher cytotoxic potency towards both Vero and MDCK cell lines, in comparison to krait and cobra venoms. E. schistosa did not cause cytotoxicity towards MDCK or Vero cells at the tested concentrations. The cytotoxicity correlates well with the known differences in the composition of venoms from cobras, kraits, vipers and sea snakes.(AU)
Assuntos
Animais , Venenos de Serpentes , Elapidae , Citotoxicidade Imunológica , Elapidae , Naja najaResumo
Cytotoxicity of venoms from eleven medically important snakes found in Southeast Asia (Naja kaouthia, Naja siamensis, Naja sumatrana, Ophiophagus hannah, Bungarus candidus, Bungarus fasciatus, Enhydrina schistosa, Calloselasma rhodostoma, Trimeresurus purpureomaculatus and Tropidolaemus sumatranus) was determined, based on the MTS cytotoxicity assay, which determines the survival of viable cells in monolayer MDCK and Vero cell cultures upon exposure to the snake venoms. Snake venom toxicity was expressed as the venom dose that killed 50% of the cells (CTC50) under the assay conditions. Venoms of C. rhodostoma (2.6 µg/mL, 1.4 µg/mL) and O. hannah were the most cytotoxic (3.8 µg/mL, 1.7 µg/mL) whereas N. siamensis venom showed the least cytotoxicity (51.9 µg/mL, 45.7 µg/mL) against Vero and MDCK cells, respectively. All the viper venoms showed higher cytotoxic potency towards both Vero and MDCK cell lines, in comparison to krait and cobra venoms. E. schistosa did not cause cytotoxicity towards MDCK or Vero cells at the tested concentrations. The cytotoxicity correlates well with the known differences in the composition of venoms from cobras, kraits, vipers and sea snakes.(AU)
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Animais , Venenos de Serpentes/efeitos adversos , Venenos de Serpentes/análise , Venenos de Serpentes/intoxicação , Venenos de Serpentes/toxicidade , Ensaios Enzimáticos Clínicos/efeitos adversosResumo
Canine parvovirus type 2 (CPV-2) is a leading cause of diarrhea in puppies in several parts of the world. In this study CPV-2 was detected and recovered from puppies showing clinical disease from Montevideo, Uruguay. Samples were processed and used to infect CRFK and MDCK cells in order to isolate the virus. Out of twelve, two samples were positive for CPV-2. A genomic region of 583 bp was amplified and the molecular characterization was performed by sequencing, phylogenetic analysis and Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Two isolated viruses (UY1 and UY2) were CPV-2c-like viruses. The comparison between the cytophatic effect (CPE) of CPV-2 (vaccinal virus) and CPV-2c (isolated virus) on primary canine cells cultures and on CRFK line cells, demonstrated that CPV-2c is less citopathogenic in CRFK than in primary cultures. Our study represents the first report on isolation and characterization of canine parvovirus type 2c (CPV-2c) in cell cultures from South American dogs.
Resumo
A análise de transcriptoma é essencial para determinar a relação entre as informações codificadas num genoma, a sua expressão e variação fenotípica. O transcriptoma é o conjunto completo de transcritos e a quantidade gerada, relacionado a um estágio de desenvolvimento específico ou condição fisiológica da célula. Estes transcritos podem ser mapeados utilizando genomas como referência, para investigação de expressão do genes. Para isso, exige procedimentos de mineração de grandes volumes de dados de RNA-Seq para extrair conhecimentos biológicos. As ferramentas de bioinformática foram desenvolvidas para facilitar e agilizar essas análises, transformando dados em informações. Assim, alguns desses recursos foram empregados na análise de dados gerados pelo RNAseq, a partir de RNAm de cultura celular MDCK infectada por herpesvírus canino tipo 1 (1CaHV-1 - Canid alphaherpesvirus type 1) em diferentes momentos pós infecção. Dessa forma, foi realizado um dual RNAseq, em que foi avaliado tanto a expressão gênica celular do hospedeiro como do patógeno viral, no curso da infecção. Para isso, foram analisados o transcriptoma das atividades celulares e os processos envolvidos no ciclo de infecção viral, até o momento 32h-pi. Assim, foram identificados as atividades de respostas celulares à infecção viral, mecanismos regulatórios induzidos pelo vírus, transcrição de genes virais imediatos, iniciais e tardios. Dentre eles, foi verificado a elevação da expressão do gene COX-2 induzido pela replicação viral, sendo relacionado à hipóxia e apoptose. Tal fato levanta a possibilidade do uso de inibidores seletivos de COX-2 para interrupção do ciclo de replicação viral e no tratamento da infecções por CaHV-1. Também se verificou a quebra de paradigma quanto o ativação da expressão de genes do ciclo de infecção em cascata. No qual foi verificado a expressão de genes tardios precocemente, e genes imediatos e iniciais permanecendo a expressão tardiamente. Até o momento foi primeiro trabalho realizado de dual RNAseq para análise de expressão gênica celular e viral para CaHV-1.
Transcriptome analysis is essential to determine the relationship between the information encoded in a genome, its expression and phenotypic variation. The transcriptome is the complete set of transcripts and the amount generated, related to a specific developmental stage or physiological condition of the cell. These transcripts can be mapped using genomes as reference for investigation of gene expression. Therefore, were required procedures to mine large volumes of RNA-Seq data to extract biological knowledge. Bioinformatics tools have been developed to facilitate and streamline these analyzes, transforming data into information. Thus, some of these features were employed in the analysis of data generated by RNAseq from canine herpesvirus type 1 (1CaHV-1 - Canid alphaherpesvirus type 1) MDCK cell culture mRNA at different post-infection stages. Thereby, a double RNAseq was performed, in which both the host cell and the viral pathogen gene expression were evaluated in the course of infection. For this, was analyzed the transcriptome of the cellular activities and the processes involved in the cycle of viral infection, until the moment 32h-pi. Thus, the activities of cellular responses to viral infection, regulatory mechanisms induced by the virus, and transcription of early, early and late viral genes were identified. Among them, was verified the elevation of COX-2 gene expression induced by viral replication, unleashing the hypoxia and apoptosis mecanisms. This fact would suggest the possibility of the use of selective COX-2 inhibitors to interrupt the viral replication cycle and in the treatment of CaHV-1 infections. We also observed the paradigm break of activation of the expression of genes from the cascade infection cycle, in which the expression of late genes was verified early, and earlyimmediate and early genes remaining expression tardily. To date, it was the first work of dual RNAseq of cellular and viral gene expression analysis for CaHV-1.
Resumo
Mature mouse beta defensin 2 (mBD2) is a small cationic peptide with antimicrobial activity. Here we established a prokaryotic expression vector containing the cDNA of mature mBD2 fused with thioredoxin (TrxA), pET32a-mBD2. The vector was transformed into Escherichia Coli (E. coli) Rosseta-gami (2) for expression fusion protein. Under the optimization of fermentation parameters: induce with 0.6 mM isopropylthiogalactoside (IPTG) at 34ºC in 2×YT medium and harvest at 6 h postinduction, fusion protein TrxA-mBD2 was high expressed in the soluble fraction (>95%). After cleaved fusion protein by enterokinase, soluble mature mBD2 was achieved 6 mg/L with a volumetric productivity. Purified recombinant mBD2 demonstrated clear broad-spectrum antimicrobial activity for fungi, bacteria and virus. The MIC of antibacterial activity of against Staphylococcus aureus was 50 µg/ml. The MIC of against Candida albicans (C. albicans) and Cryptococcus neoformans (C. neoformans) was 12.5µg/ml and 25µg/ml, respectively. Also, the antimicrobial activity of mBD2 was effected by NaCl concentration. Additionally, mBD2 showed antiviral activity against influenza A virus (IAV), the protective rate for Madin-Darby canine kidney cells (MDCK) was 93.86% at the mBD2 concentration of 100 µg/ml. These works might provide a foundation for the following research on the mBD2 as therapeutic agent for medical microbes.
Resumo
Mature mouse beta defensin 2 (mBD2) is a small cationic peptide with antimicrobial activity. Here we established a prokaryotic expression vector containing the cDNA of mature mBD2 fused with thioredoxin (TrxA), pET32a-mBD2. The vector was transformed into Escherichia Coli (E. coli) Rosseta-gami (2) for expression fusion protein. Under the optimization of fermentation parameters: induce with 0.6 mM isopropylthiogalactoside (IPTG) at 34ºC in 2×YT medium and harvest at 6 h postinduction, fusion protein TrxA-mBD2 was high expressed in the soluble fraction (>95%). After cleaved fusion protein by enterokinase, soluble mature mBD2 was achieved 6 mg/L with a volumetric productivity. Purified recombinant mBD2 demonstrated clear broad-spectrum antimicrobial activity for fungi, bacteria and virus. The MIC of antibacterial activity of against Staphylococcus aureus was 50 µg/ml. The MIC of against Candida albicans (C. albicans) and Cryptococcus neoformans (C. neoformans) was 12.5µg/ml and 25µg/ml, respectively. Also, the antimicrobial activity of mBD2 was effected by NaCl concentration. Additionally, mBD2 showed antiviral activity against influenza A virus (IAV), the protective rate for Madin-Darby canine kidney cells (MDCK) was 93.86% at the mBD2 concentration of 100 µg/ml. These works might provide a foundation for the following research on the mBD2 as therapeutic agent for medical microbes.
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In the present study, the effects of Polybia paulista venom (PPV) on renal and vascular tissues were investigated. Isolated kidneys perfused with PPV (1 and 3 μg/mL) had increased perfusion pressure, renal vascular resistance, urinary flow, and glomerular filtration rate; and reduced sodium tubular transport. Histological evaluation demonstrated deposits of proteins in Bowman's space and tubular lumen, and focal areas of necrosis. The venom promoted a cytotoxic effect on Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells. A significant increase in lactic dehydrogenase levels was observed in response to venom exposure. In isolated mesenteric vascular beds, pressure and vascular resistance augmented in a dose-dependent manner. PPV increased the contractility of aortic rings maintained under basal tension. This contractile response was inhibited when preparations were maintained in Ca2+-free medium. Likewise, verapamil, a voltage-gated calcium channel blocker, also inhibited the contractile response. In this study, phentolamine, a blocker of α-adrenergic receptor blocker, significantly reduced the contractile effect of PPV in the aortic ring. In conclusion, PPV produced nephrotoxicity, which suggests a direct effect on necrotic cellular death in renal tubule cells. The vascular contractile effect of PPV appears to involve calcium influx through voltage-gated calcium channels via adrenergic regulation.(AU)
Assuntos
Humanos , Venenos de Vespas/toxicidade , Cálcio/análise , Rim/anatomia & histologia , Aorta/anatomia & histologiaResumo
Clostridium perfringens tipo é um bacilo anaeróbio, de ampla distribuição geográfica, podendo ser encontrado no solo, pastagens, água doce e salgada e como habitante normal do trato digestivo dos animais e do homem. É o principal micro-organismo produtor da toxina épsilon. Essa toxina tem ação necrótica e letal, provocando aumento da permeabilidade da mucosa intestinal, edema em vários órgãos, hidropericárdio e lesões renais. A enterotoxemia é a principal doença causada pelo Clostridium perfringens tipo D em ovinos, caprinos e bovinos, submetidos a fatores predisponentes, como mudança brusca na alimentação e alteração na microbiota intestinal. Trata-se de uma doença altamente letal, ocorrendo, na maioria dos casos, morte dos animais durante as primeiras 6 a 18 horas de infecção. Por sua rápida evolução e gravidade, o controle da doença baseia-se em medidas de manejo e em vacinações sistemáticas dos rebanhos. As vacinas comerciais possuem o toxoide adsorvido em hidróxido de alumínio, porém, em muitos casos, a eficiência destas vacinas não é boa, promovendo apenas uma proteção parcial, níveis de anticorpos protetores de curta duração e/ou estímulo de resposta celular deficiente (LOBATO, 2000). O interesse de estudar novos adjuvantes para uso em vacinas é antigo e de grande importância na medicina veterinária. Associado ao aumento de vacinas desenvolvidas com subunidades purificadas (que são mais seguras, porém menos imunogênicas), pesquisadores buscam o desenvolvimento de sistemas de liberação que promovam a estimulação eficiente do sistema imunológico. De modo geral espera-se que o adjuvante promova uma elevada e prolongada resposta imune, além de direcionar essa resposta imune para uma resposta protetora, evitando a doença (MOTA, 2006). O objetivo desse trabalho é o desenvolvimento de novas formulações de vacinas com diferentes candidatos a adjuvantes, utilizando o toxoide épsilon como modelo. Foram desenvolvidas vacinas contendo microemulsão e micropartículas de quitosana, como adjuvantes. As formulações de micropartícula de quitosana foram caracterizas quanto ao tamanho, potencial zeta e morfologia. A potência das vacinas foi avaliada por imunização em coelhos, seguida de titulação dos soros em células MDCK. O hidróxido de alumínio foi utilizado como adjuvante padrão, por ser o mais utilizado comercialmente em vacinas contra a toxina épsilon.
Clostridium perfringens is an anaerobic bacillus widely distributed and can be found in soil, pastures, water and as normal inhabitant of the digestive tract of animals and mans. It is the major microorganism producer of epsilon toxin. This toxin have lethal and necrotizing action, causing increased permeability of the intestinal mucosa, edema, hydropericardium and renal lesions. The enterotoxemia is the main disease caused by Clostridium perfringens type D in sheep, goats and cattle, submitted to predisposing factors, such as sudden change in diet and changes in intestinal microbiota. This is a highly lethal disease, occurring in most cases death of the animals, during the first 6 to 18 hours of infection. For being a rapid disease progression and severity, its control is based on management measures and in systematic vaccination of flocks. The commercial vaccines have toxoid adsorbed in aluminum hydroxide, but in many cases the effectiveness of these vaccines is not good, promoting only partial protection, protective antibody levels of short duration (LOBATO, 2000). The interest in studying new adjuvants for use in vaccines is old and of great importance in the veterinary medicine. Associated with increased of vaccines developed with purified subunits (which are safer, but less immunogenic), researchers seek to develop delivery systems that promote the efficient stimulation of the immune system. In general it is expected that the adjuvant promotes a high and prolonged immune response and direct this immune response to a protective response, avoiding the disease (MOTA, 2006). The aim of this work is the development of new formulations of vaccines with different candidates the adjuvants, using the epsilon toxoid as a model. Vaccines have been developed containing microemulsion and chitosan microparticles as adjuvants. The chitosan microparticle formulations was characterized s by size, zeta potential and morphology. The potency of the vaccines was evaluated by immunization of rabbits, followed by titration of the sera in MDCK cells. Aluminum hydroxide was used as standard adjuvant, for being the most used commercially in vaccines against epsilon toxin.
Resumo
A busca de novas substâncias com atividade antiviral levou este estudo a investigar a ação do peptídeo antimicrobiano P34, produzido pelo Bacillus sp. P34, frente ao herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e de moléculas sintetizadas da 2-picolilamina e 2-aminoetilpiperidina derivadas da classe da 4-tiazolidinona denominadas V19 (2a), V20 (2b), V23 (2c), V28 (2d), V29 (2e), AK11 (1a), AK16 (1d), AK17 (1e), AK18 (1b) e AK20 (1c) frente a diversos vírus que infectam animais. Inicialmente foram determinadas as concentrações não citotóxicas dos diferentes compostos, em diferentes linhagens celulares, através dos métodos MTT e vermelho neutro. A seguir a atividade antiviral foi avaliada mediante um ensaio de inibição do efeito citopático. Em todos os testes, o título viral em cultivo celular foi comparado ao título viral na presença de cada composto para a determinação do percentual de inibição (PI). O P34 demonstrou um PI de 99,94% e alto índice de seletividade (SI de 22,9). Os testes para identificar o modo de ação indicaram que o peptídeo P34 não atua sobre as células MDBK, ou receptores celulares. Em concentrações citotóxicas o P34 obteve efeito virucida e 100% de inibição viral nos ensaios de redução viral e de penetração. Foi evidenciada total inibição na produção das partículas de BoHV-1 quando as células foram tratadas com o P34 posterior a 8 h de infecção. Houve redução significativa (p< 0.01) do título do BoHV-1 na presença do P34 após 8 h de infecção (PI de 90%), chegando a 99,9% de PI após 18 h de tratamento pósinfecção. O P34 inibiu o BoHV-1 tanto no meio extracelular, inibindo a infecção celular, quanto no meio intracelular, após a infecção, impedindo o egresso. Com relação às moléculas derivadas da 4-tiazolidinona a menos tóxica foi a AK 16 (157 µg/mL) nas quatro linhagens de células (RK13, MDCK, CRFK e MDBK) e as mais tóxicas foram as AK11, AK18 e AK20 (19 µg/mL). O PI da molécula AK16 foi de 96,9%, 90,1% e 90,1% contra o EAV, FCV e CPV-2, respectivamente. O composto AK17 mostrou PI de 90,1% contra o EAV, a V20 de 78% contra BVDV, a V28 de 94,4% contra EIV e 78% contra BVDV e a V29 de 94,4% contra CPV-2. As moléculas V20 e V28 foram escolhidas para dar continuidade ao estudo frente ao BVDV. Foram determinados para V20 um SI de 16,8 e de 14,73 para V28. Nos ensaios de inibição da produção de partículas virais, adsorção, competição com receptores celulares, penetração viral e efeito virucida não foram observadas diferenças significativas entre os títulos do BVDV com e sem tratamentos com as moléculas. A associação das moléculas V20 e V28 aumentou de 78 para 82% o PI, não sendo verificada alteração no PI quando as moléculas foram associadas com os antivirais interferon- 2b ou ribavirina. Através da determinação da curva de crescimento do BVDV foi evidenciada atuação no período entre 1 a 5 h pós-infecção com o BVDV, sugerindo ação posterior à entrada viral, mas antes do egresso, provavelmente no período de síntese do RNA e enzimas virais. Os resultados demonstram que o peptídeo P34 e os compostos V20 e V28 derivados da 4tiazolidinona podem ser considerados promissores antivirais contra BoHV-1 e BVDV.
The search for new substances with antiviral activity has led this study to investigate the action of the antimicrobial peptide P34, produced by Bacillus sp. P34 against bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and of the synthetic molecules 2-picolylamine and 2-aminoethylpiperidine, which are derived from the class of thiazolidin-4-one named V19 (2a), V20 (2b), V23 (2c), V28 (2d), V29 (2e), AK11 (1a), AK16 (1d), AK17 (1e), AK18 (1b) and AK20 (1c) in opposition to several viruses that infect animals. Initially non-cytotoxic concentrations of the different compounds were determined, in different cell lines, through the MTT and neutral red methods. Then, the antiviral activity was evaluated by an assay of the cytopathic effect inhibition. In all tests, the viral titer in cell culture was compared to the viral titer in the presence of each compound to determine the percentage of inhibition (PI). The P34 demonstrated a PI of 99.94% and high selectivity index (SI 22.9). Tests to identify the mode of action indicated that the peptide P34 has no effect on MDBK cells, or cell receptors. In cytotoxic concentrations P34 obtained virucidal effect and 100% inhibition in viral reduction viral and penetration assays. Total inhibition was observed in the production of the BoHV-1 particles when cells were treated with P34 after 8 h of infection. There was a significant reduction (p <0.01) in BoHV-1 titer in the presence of P34 after 8 h of infection (PI 90%), reaching 99.9% PI after 18 h postinfection treatment. P34 inhibited BoHV-1 as extracellularly, inhibiting cell infection, as intracellularly, after infection, preventing its egress. Regarding molecules derived from thiazolidin-4-one the less toxic was AK16 (157 µg/mL) in the four cell lines (RK13, MDCK, CRFK and MDBK), and the most toxics were AK11, AK18 and AK20 (19 µg/mL). The PI of AK16 molecule was 96.9%, 90.1% and 90.1% against EAV, FCV and CPV-2, respectively. The compound AK17 showed PI of 90.1% against EAV, V20 of 78% against BVDV, V28 of 94.4% against EIV and 78% against BVDV and the V29 of 94.4% against CPV-2. V20 and V28 molecules were chosen to continue the study against BVDV. To V20 and V28 molecules, were determined SI of 16.8 and 14.73, respectively. In assays of inhibition of production of viral particles, adsorption, competing with cellular receptors, viral penetration and virucidal effect no significant differences were observed between titers the BVDV with and without treatment with the molecules. The association of V20 and V28 molecules increased the PI from 78 to 82%, and changes in the PI were not verified when the molecules were associated with antiviral interferon- 2b and ribavirin. Through the determination of BVDV growth curve, was observed activity in the period between 1 to 5 h post-infection with BVDV, suggesting further action on viral entry, but probably, before the egress, in the period of RNA synthesis and viral enzymes. The results demonstrate that peptide P34 and compounds V20 and V28 derived from thiazolidin4-one can be considered as promising antiviral against BoHV-1 and BVDV.
Resumo
O vírus influenza A (IAV) é um agente zoonótico de grande relevância tanto para saúde humana como animal. A influenza suína teve seu primeiro reconhecimento clínico em 1918, em suínos do Meio Oeste dos EUA, coincidindo com a pandemia de influenza em humanos. Desde então, o IAV permanece como um importante patógeno para a indústria suinícola em todo o mundo. A grande variabilidade genética destes vírus é causada por dois principais mecanismos genéticos: mutações pontuais e recombinações genéticas. A influenza é endêmica em muitos países e a emergências de recombinantes tem desafiado o controle e o diagnóstico desta enfermidade. No Brasil, a infecção pelo IAV em suínos (swIAV) não está bem caracterizada; poucos relatos evidenciam a prevalência deste agente antes do ano de 2009, especialmente no Estado do Rio Grande do Sul, que alberga um dos maiores rebanhos de suínos do Brasil. Em vista disso, este trabalho teve como objetivo investigar ocorrência de swIAV em alguns rebanhos suínos comerciais do Estado do Rio Grande do Sul, Brasil, no período de 2013-2014, e determinar os tipos e subtipos de vírus circulantesnaquelas propriedades. O primeiro capítulo deste estudo reporta os aspectos clínicos,patológicos e virológicos da ocorrência de influenza suína e co-infecções identificadas em seis propriedades suinícolas selecionadas na região do Vale do Taquari. Neste estudo foram analisados suabes nasais coletados de 66 animais e 6 amostras de tecido pulmonar de suínos com sinais de infecção respiratória. A detecção viral foi feita através de uma PCR de triagem e confirmada através do isolamento viral em célulasMDCK. A identificação dos subtipos virais foi feita através de uma PCR em Tempo Real (rRT-PCR) para o subtipo A(H1N1)pdm09 ou através de uma PCR multiplex(RT-PCR) para outros subtipos de swIAV. A detecção de agentes bacterianos foi realizada apenas nas amostras de tecido pulmonar, através da pesquisa de genomas bacterianos por PCR. O subtipo A(H1N1)pdm09 foi identificado em 4/6 granjas e o subtipo H1N2 em 2/6 granjas. Além disso, agentes envolvidos no complexo respiratório dos suínos foram identificados em todas as granjas; Pasteurella multocida foi identificada em 5/6 granjas e Mycoplasma hyopneumoniae em 3/6 granjas. Actinobacillus pleuropneumoniae (1/6), Haemophilus parasuis (1/6) e PCV2 (1/6) também foram detectados. O segundo capítulo deste estudo teve como objetivo o sequenciamento do genoma completo de um novo recombinante H1N2 de origem humana, detectado em suínos. O genoma completo foi gerado através de uma RT-PCR. Os produtos forampurificados e submetidos ao sequenciamento utilizando a plataforma MiSeq(illumina). A análise filogenética revelou que as sequencias dos genes HAe NA correspondem a genes de IAV de origem humana, enquanto que as sequencias dos genes que codificam as proteínas internas do vírus (PB1, PB2, PA, NP, M e NS) correspondem a genes de amostras do vírus A(H1N1)pdm09. O terceiro capítulo reporta o sequenciamento completo dos genomas de 8 amostras de vírus influenza identificados nas populações de suínos amostradas. Foram identificados dois subtipos virais de origem humana (H1N2 e H3N2), além do vírus A(H1N1)pdm09. Os subtipos de origem humana possuem os genes HAe NA similares a vírus sazonais de humanos e os genes internos são estreitamente relacionados com o vírus A(H1N1)pdm09.
Influenza A virus (IAV) is a zoonotic agent of great relevance to human and animal health. Swine influenza was first recognized clinically in pigs in the Midwestern U.S., in 1918, coinciding with the human influenza pandemic.Since that time swine influenza has remained of importance to the swine industry throughout the world. The great genetic variability of influenza viruses is caused by two main genetic mechanisms: point mutations (antigenic drift) and gene reassortment (antigenic shift). Influenza is endemic in pigs in many countries and the emergence of new viruses has been challenging its control and diagnostics. Influenza virus (swIAV) infection in Brazilian swine population is not well characterized, and little evidence existed of swIAV circulation before 2009, especially in Rio Grande do Sul State, which hosts one of the largest swine populations in Brazil. Thus, this study aimed to investigate the occurrence of IAV in commercial swine herds in the state of Rio Grande do Sul, Brazil, between 2013-2014 and to know the types and subtypes of swine influenza viruses that are circulating in these herd. The first chapter of this study reports the clinical, pathological and virological aspects of the occurrence of swine influenza and related co-infections in six pig properties of the Taquari Valley region. In this study were analyzed nasal swabs collected from 66 animals and six lung tissue samples from pigs showing clinical signs of respiratory disease. IAV detection was performed by PCR screening and confirmed by virus isolation in MDCK cells and hemagglutination (HA). Influenza A subtyping was performed by real-time reverse transcription PCR (rRT-PCR) to detect the 2009 H1N1pandemic A(H1N1)pdm09; other swIAV subtypes were identifieded by multiplex RT-PCR. Bacterial infections were identified through detection of bacterial genomes by PCR, only in lung samples. Influenza A was detected by screening PCR in 46/66 swab samples and from 5/6 lungs. Virus was recovered from pigs of the six herds. Subtype A(H1N1)pdm09 was detected in 4/6 herds and H1N2 in the other 2/6 herds. In lung tissues, further agents involved in porcine respiratory disease complex were detected in all cases; Pasteurella multocida was identified in 5/6 samples and Mycoplasma hyopneumoniae in 3/6. Actinobacillus pleuropneumoniae (1/6), Haemophilus parasuis (1/6) and PCV2 (1/6) were also detected. The aim ofthe second chapter was to sequence the whole-genome of a novel human-like H1N2 swine influenza virus. Whole-genome sequences were generated by RT-PCR. Amplicons were purified followed by sequencing in the MiSeq sequencing platform (Illumina). Phylogenetic analyses revealed that the HA and NA genes clustered with influenza viruses of human lineage, whereas the internal genes (PB1, PB2, PA, NP, M andNS) clustered with the A(H1N1)pdm09. The third chapter reports the geneticsequencing of the full genomes of eight swine influenza viruses circulating in the sampled pig population. Two swine human-like subtypes (H1N2 and H3N2) and the A(H1N1)pdm09 virus were identified. The human-like subtypes have the HA and NA genes similar to the human seasonal strains and the internal genes are closely related to the virus A(H1N1)pdm09.
Resumo
Enterotoxemia (also called pulpy kidney disease) is an enteric disease, that affect ruminants, produced by epsilon toxin from Clostridium perfringens type D, an anaerobic commonly isolated from soil and feces of healthy animals. The diagnostic is based on detection of this exotoxin in the intestinal content by soroneutralization in mice. Therefore, this study aimed to standardize a test for detection and titration of the toxin in vitro, and compare it with the phenomenon in vivo. A volume of epsilon toxin was titrated in mice and in some cell lines. After concluding the most sensitive cell line, were held in vitro titrations of dilutions from a toxin wich one had in vivo titer known. The results were grouped and a mathematical equation was developed. MDCK cell line showed that the phenomenon observed in vitro can be expressed by a mathematical equation wich shows a correlation of 98.33% with a minimum lethal dose determined in vivo. Therefore, the soroneutralization using MDCK allows a specific, sensitive, practical, fast, and doesn't requere use of animal titration of epsilon toxin.
Enterotoxemia, também chamada de doença do rim pulposo, doença que acomete os ruminantes domésticos, é causada pela ação da toxina épsilon produzida pelo Clostridium perfringens tipo D, um anaeróbio comumente isolado do solo e das fezes de animais sadios. O método tradicional de diagnóstico baseia-se na detecção e classificação dessa exotoxina no conteúdo intestinal por meio da soroneutralização em camundongos. Com isso, o objetivo deste estudo foi padronizar um teste para detecção e titulação dessa toxina in vitro e compará-lo ao fenômeno in vivo. Para isso, uma partida de toxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D foi titulada em camundongos e em várias linhagens contínuas de células. Após a determinação da linhagem celular mais sensível, realizaram-se ensaios de titulação in vitro de diluições de uma partida de toxina, comparando-os com os títulos in vivo conhecidos. Os resultados foram agrupados, e foi desenvolvida a equação matemática que melhor adaptou-se aos intervalos trabalhados. A linhagem MDCK, além de mais sensível, demonstrou que o fenômeno observado in vitro pode ser expresso por meio da equação matemática que apresenta uma correlação de 98,33%, com a dose mínima mortal determinada in vivo. Portanto, a linhagem MDCK permite titular a toxina épsilon de C. perfringens tipo D de forma específica e sensível, além de ser uma técnica prática, rápida e que dispensa o uso de animais.
Resumo
Enterotoxemia (also called pulpy kidney disease) is an enteric disease, that affect ruminants, produced by epsilon toxin from Clostridium perfringens type D, an anaerobic commonly isolated from soil and feces of healthy animals. The diagnostic is based on detection of this exotoxin in the intestinal content by soroneutralization in mice. Therefore, this study aimed to standardize a test for detection and titration of the toxin in vitro, and compare it with the phenomenon in vivo. A volume of epsilon toxin was titrated in mice and in some cell lines. After concluding the most sensitive cell line, were held in vitro titrations of dilutions from a toxin wich one had in vivo titer known. The results were grouped and a mathematical equation was developed. MDCK cell line showed that the phenomenon observed in vitro can be expressed by a mathematical equation wich shows a correlation of 98.33% with a minimum lethal dose determined in vivo. Therefore, the soroneutralization using MDCK allows a specific, sensitive, practical, fast, and doesn't requere use of animal titration of epsilon toxin.
Enterotoxemia, também chamada de doença do rim pulposo, doença que acomete os ruminantes domésticos, é causada pela ação da toxina épsilon produzida pelo Clostridium perfringens tipo D, um anaeróbio comumente isolado do solo e das fezes de animais sadios. O método tradicional de diagnóstico baseia-se na detecção e classificação dessa exotoxina no conteúdo intestinal por meio da soroneutralização em camundongos. Com isso, o objetivo deste estudo foi padronizar um teste para detecção e titulação dessa toxina in vitro e compará-lo ao fenômeno in vivo. Para isso, uma partida de toxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D foi titulada em camundongos e em várias linhagens contínuas de células. Após a determinação da linhagem celular mais sensível, realizaram-se ensaios de titulação in vitro de diluições de uma partida de toxina, comparando-os com os títulos in vivo conhecidos. Os resultados foram agrupados, e foi desenvolvida a equação matemática que melhor adaptou-se aos intervalos trabalhados. A linhagem MDCK, além de mais sensível, demonstrou que o fenômeno observado in vitro pode ser expresso por meio da equação matemática que apresenta uma correlação de 98,33%, com a dose mínima mortal determinada in vivo. Portanto, a linhagem MDCK permite titular a toxina épsilon de C. perfringens tipo D de forma específica e sensível, além de ser uma técnica prática, rápida e que dispensa o uso de animais.
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Enterotoxemia (also called pulpy kidney disease) is an enteric disease, that affect ruminants, produced by epsilon toxin from Clostridium perfringens type D, an anaerobic commonly isolated from soil and feces of healthy animals. The diagnostic is based on detection of this exotoxin in the intestinal content by soroneutralization in mice. Therefore, this study aimed to standardize a test for detection and titration of the toxin in vitro, and compare it with the phenomenon in vivo. A volume of epsilon toxin was titrated in mice and in some cell lines. After concluding the most sensitive cell line, were held in vitro titrations of dilutions from a toxin wich one had in vivo titer known. The results were grouped and a mathematical equation was developed. MDCK cell line showed that the phenomenon observed in vitro can be expressed by a mathematical equation wich shows a correlation of 98.33% with a minimum lethal dose determined in vivo. Therefore, the soroneutralization using MDCK allows a specific, sensitive, practical, fast, and doesn't requere use of animal titration of epsilon toxin.
Enterotoxemia, também chamada de doença do rim pulposo, doença que acomete os ruminantes domésticos, é causada pela ação da toxina épsilon produzida pelo Clostridium perfringens tipo D, um anaeróbio comumente isolado do solo e das fezes de animais sadios. O método tradicional de diagnóstico baseia-se na detecção e classificação dessa exotoxina no conteúdo intestinal por meio da soroneutralização em camundongos. Com isso, o objetivo deste estudo foi padronizar um teste para detecção e titulação dessa toxina in vitro e compará-lo ao fenômeno in vivo. Para isso, uma partida de toxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D foi titulada em camundongos e em várias linhagens contínuas de células. Após a determinação da linhagem celular mais sensível, realizaram-se ensaios de titulação in vitro de diluições de uma partida de toxina, comparando-os com os títulos in vivo conhecidos. Os resultados foram agrupados, e foi desenvolvida a equação matemática que melhor adaptou-se aos intervalos trabalhados. A linhagem MDCK, além de mais sensível, demonstrou que o fenômeno observado in vitro pode ser expresso por meio da equação matemática que apresenta uma correlação de 98,33%, com a dose mínima mortal determinada in vivo. Portanto, a linhagem MDCK permite titular a toxina épsilon de C. perfringens tipo D de forma específica e sensível, além de ser uma técnica prática, rápida e que dispensa o uso de animais.
Resumo
O vírus influenza A (IAV) é capaz de infectar mamíferos e aves, constituindo-se em um risco para a produção animal e para a saúde publica. Devido a ocorrência de mutações pontuais (antigenic drift) e ressortimentos (antigenic shift), o escape imunológico de cepas emergentes é um fenômeno frequente, de modo que a imunidade previamente estabelecida em uma população pode tornar-se ineficiente contra uma nova cepa circulante. Pelo mesmo motivo, ocasionalmente o IAV pode estabelecer novas linhagens virais por meio da transmissão interespécies. O potencial epidêmico e pandêmico do IAV é um risco constante que demanda vigilância epidemiológica e caracterização molecular e antigênica das cepas circulantes. O objetivo deste estudo foi realizar análises filogenéticas e caracterização antigênica do vírus da influenza H3N8 isolado de equinos durante o surto que atingiu o Brasil e a América do Sul em 2012. Também foi realizado o isolamento e caracterização molecular de um IAV do subtipo H3N2 detectado em suínos. No primeiro estudo foi realizado o sequenciamento do genoma completo, a análise filogenética e caracterização antigênica dos vírus isolados em diferentes regiões do Brasil. A análise filogenética da hemaglutinina (HA) e da neuraminidase (NA) mostrou que o isolado pertencia à clade 1 da sublinhagem Florida, agrupando-se com isolados contemporâneos provenientes dos EUA, o que sugere uma possível origem para o vírus detectado durante o surto. As sequências de aminoácidos da HA e NA foram comparadas com a cepa vacinal recomendada pela OIE (Ohio/03 or South Africa/03 ???), com uma vacina contendo a cepa Kentucky/97, com sequências gênicas de vírus H3N8 contemporâneos da América do Sul e EUA. Mudanças consistentes de aminoácidos foram observadas na região HA1 das sequências obtidas de vírus H3N8 contemporâneos. A análise antigênica realizada por inibição da hemaglutinação utilizando antisoros de furões convalescentes contra representantes das linhagens e sublinhagens Europeia, Kentucky e Flórida (clades 1 e 2) mostrou que o isolado brasileiro foi reconhecido por soros produzido contra o vírus Florida clade 1, sem diferenças entre o isolado e a cepa recomendada pela OIE. No segundo estudo, o vírus da influenza suína H3N2 foi isolado em amostras de pulmão de leitões provenientes de um surto de doença respiratória. O isolamento foi realizado em cultura de células MDCK e a caracterização molecular do isolado mostrou um ressortimento de HA e NA semelhante a vírus H3N2 humanos de 1996-1997, e genes internos do H1N1 pandêmico. Na análise filogenética o isolado não agrupou com qualquer cluster de H3.
The influenza A virus (IAV) is able to infect mammals and birds, presenting risks for animal production and public health. Due to occurrence of punctual mutations (antigenic drift) and reassortments (antigenic shift), the immune escape of emerging strains is a frequent phenomenon, so that the previously established immunity in a population may become ineffective against novel circulating strains. For the same reasons, the IAV may establish new viral lineages by interspecies transmission. The epidemic and pandemic potential of IAV is a constant risk demanding epidemiological surveillance with molecular and antigenic characterization of circulating strains. The aim of this study was to perform phylogenetic analysis and antigenic characterization of equine influenza virus (EIV) H3N8 isolated during an outbreak which spread throughout Brazil and South America in 2012. It was also performed the isolation and molecular characterization of a swine IAV subtype H3N2.In the first study the whole genome sequence, phylogenetic analysis and antigenic characterization were performed in EIV strain that was isolated from different regions of Brazil. Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) phylogenetic analysis showed the isolate belonged to Florida clade 1 and clustered with contemporary isolates from USA, suggesting a possible origin for the virus of the outbreak. The amino acid sequences for HA and NA were compared against the OIE recommended vaccine strain, a vaccine with Kentucky/97 strain as antigen, and contemporary sequences from South America and USA. Consistent amino acid changes were observed in the HA1 region of contemporary sequences. The antigenic analysis by haemagglutination inhibition assay using ferret convalescent antisera raised against representatives of European, Kentucky and Florida (clades 1 and 2) lineage and sublineages, showed the Brazilian isolate was recognized by sera raised against Florida clade 1 viruses, without differences between the isolate and the OIE recommended strain. In the second study, a swine influenza virus (SIV) H3N2 was isolated of pulmonary samples of piglets from an outbreak of respiratory disease. The isolation was done in MDCK cell culture, and the molecular characterization of the isolate showed a reassortment with HA and NA similar to human H3N2 viruses from 1996 to 1997, and internal genes from the pandemic H1N1. The phylogenetic analysis showed the isolate not grouped with any cluster of H3.
Resumo
Neospora caninum is a protozoan of wide distribution and great importance to the cattle industry, mainly due to its associated reproductive losses. Cultured cells are widely used for isolation and multiplication of the agent in vitro with several purposes. Thus, this study aimed to evaluate the susceptibility of different cell cultures to infection by N. caninum. Among the cell cultures tested, four presented good susceptibility to the agent: cell lines VERO (yield of 21.2 taquizoites/cell) and MA-104 (17.1); primary bovine testicle (16.3) and lung cells (13.6). Primary bovine kidney (8.2 taquizoites/cell), MDBK (5.1) and RK-13 cell lines (0.4) presented moderate to low sensitivity. No viable taquizoites were detected in the culture of MDCK cells. These results demonstrate that MA-104 cells present adequate susceptibility to N. caninum compared to VERO cells, which have been largely used to multiply the parasite in vitro. Together with its easy manipulation, fast multiplication and relatively low nutritional requirements, these results indicate that MA-104 cells are adequate for multiplication of N. caninum in vitro.
O Neospora caninum é um protozoário de ampla distribuição e grande importância na bovinocultura, principalmente pelas perdas reprodutivas que produz. Cultivos celulares são utilizados para o isolamento e a multiplicação do agente in vitro, com diversas finalidades. Este trabalho teve como objetivo avaliar a suscetibilidade de diferentes cultivos celulares à infecção pelo N. caninum. Dentre oito cultivos testados, quatro apresentaram boa susceptibilidade ao N. caninum: células VERO (produção de 21,2 taquizoítos/célula), MA-104 (17,1), cultivo primário de testículo (16,3) e pulmão bovino (13,6). Cultivo primário de rim bovino (8,2), células MDBK (5,1) e RK-13 (0,4) apresentaram baixa sensibilidade, enquanto células MDCK não produziram taquizoítos viáveis. Os resultados obtidos demonstram que as células MA-104 apresentaram suscetibilidade semelhante a das células VERO - linhagem tradicionalmente utilizada para o cultivo desse protozoário. Pela maior facilidade de cultivo, rápida multiplicação, menor exigência nutricional e produção de taquizoítos em níveis semelhantes às células VERO, as células MA-104 demonstraram ser adequadas para a manutenção e multiplicação do N. caninum in vitro.