Isolation, expansion and differentiation of cellular progenitors obtained from dental pulp of agouti (Dasyprocta prymnolopha Wagler, 1831) / Isolamento, expansão e diferenciação de progenitors celulares obtidos da polpa dentária de cutia (Dasyprocta prymnolopha Wagler, 1831)

The study aimed to isolate, expand, differentiate and characterize progenitor cells existent in the dental pulp of agouti. The material was washed with PBS solution and dissociated mechanically with the aid of a scalpel blade on plates containing culture medium D-MEM/F-12, and incubated at 5% CO2-37⁰C. The growth curve, CFU assay, osteogenic/adipogenic differentiation and characterization were obtained from the isolation. The cells began to be released from the explant tissue around the 7th day of culture. By day 22 of culture, cells reached 80% confluence. At the UFC test, 81 colonies were counted with 12 days of cultivation. The growth curves before and after freezing showed a regular growth with intense proliferation and clonogenic potential. The cell differentiation showed formation of osteoblasts and fat in culture, starting at 15 days of culture in a specific medium. Flow cytometry (FACs) was as follows: CD34 (positive), CD14 (negative), CD45 (negative), CD73 (positive), CD79 (negative), CD90 (positive), CD105 (positive), demonstrating high specificity and commitment of isolated cells with mesenchymal stem cells strains. These results suggest the existence of a cell population of stem cells with mesenchymal features from the isolated tissue in the explants of agouti dental pulp, a potential model for study of stem cell strains obtained from the pulp tissue.(AU)

Isolation, expansion and differentiation of cellular progenitors obtained from dental pulp of agouti (Dasyprocta prymnolopha Wagler, 1831). Este estudo teve como objetivo isolar, expandir, diferenciar e caracterizar células progenitoras existentes na polpa dentária de cutia. O material foi lavado em solução de PBS e dissociado mecanicamente, com o auxílio de uma lâmina de bisturi, em placas contendo meio de cultura D-MEM/F-12, e incubadas em 5% de CO2-37⁰C. A curva de crescimento, o ensaio de CFU, a diferenciação osteogênica/adipogênica e a caracterização foram obtidas a partir do isolamento. As células começaram a ser liberadas, a partir do explante, em torno do sétimo dia de cultura. A partir do 22o dia, as células atingiram 80% de confluência. No teste para UFC, 81 colônias foram contadas aos 12 dias de cultivo. As curvas de crescimento pré- e pós-congelamento apresentaram crescimento regular, com intensa proliferação e potencial clonogênico. A diferenciação das células mostrou a formação de osteoblastos e de células de gordura, a partir de 15 dias de cultura em meio específico. A citometria de fluxo (FACS) apresentou-se como segue: CD34 (positivo), CD14 (negativo), CD45 (negativo), CD73 (positivo), CD79 (negativo), CD90 (positivo), CD105 (positivo), demonstrando a grande especificidade e comprometimento das células isoladas com linhagens de células-tronco mesenquimais. Estes resultados sugerem a existência de uma população de células-tronco mesenquimais isolada a partir de explantes da polpa dentária cutia, um modelo potencial para o estudo de linhagens de células-tronco obtidas a partir do tecido pulpar.(AU)

CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DERIVADAS DE POLPA DENTÁRIA E CORDÃO UMBILICAL DE CÃES

O campo de medicina regenerativa para animais de companhia vem crescendo nos últimos anos. As células-tronco mesenquimais (MSC) podem ser definidas como células-tronco adultas, multipotentes, com capacidade de se diferenciar em vários tipos celulares. A Sociedade Internacional de Terapia Celular (ISCT) estabeleceu critérios mínimos para definir MSC. As MSC podem ser isoladas de diferentes fontes como: polpa dentária e cordão umbilical. A polpa dentária contém uma população de células-tronco com localização perivascular e potencial de diferenciação em múltiplas linhagens semelhante à MSC obtidas a partir de outros tecidos. O fluconazol é um composto antifúngico usado isoladamente ou em combinação com outras drogas, por ter um amplo espectro. Ele exerce sua atividade antifúngica inibindo a síntese de ergosterol fúngico em um dos passos finais de sua biossíntese. Portanto, ele pode ser usado na coleta de dentes e na cultura de células-tronco de polpa dentária. Outra fonte de MSC utilizada é o cordão umbilical, onde sua coleta é menos invasiva, não gera riscos ao paciente e seu material normalmente seria descartado. O objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar e avaliar o potencial de proliferação e formação de colônias das células-tronco mesenquimais derivadas de polpa de dente canina (cDPSCs) e do tecido do cordão umbilical de cães (cUCSC). Foram coletadas três amostras de polpa dentária e três de cordão umbilical. As amostras foram dissociadas mecanicamente e isoladas por digestão enzimática usando colagenase tipo II. As células foram expandidas e foi realizada a diferenciação para as linhagens adipogênica, osteogênica e condrogênica. Para diferenciação osteogênica, o meio foi trocado três vezes por semana, em seguida as células foram coradas com Alizarina Red evidenciando os cristais de cálcio. Para diferenciação adipogênica, o meio foi trocado três vezes por semana e então as células foram coradas com Oil Red evidenciando os vacúolos lipídicos. Para a diferenciação condrogênica o meio foi trocado três vezes por semana e foram coradas com azul de toluidina evidenciando os mucopolissacarídeos. Para o ensaio clonogênico foram plaqueadas 300 células/poço em placas de seis poços e cultivadas durante nove dias, em seguida as colônias foram coradas com violeta cristal para serem contadas. Para o ensaio de proliferação, foram plaqueadas 1x104 células/poço em placa de seis poços, então a cada cinco dias foi realizada a dissociação enzimática e as células foram contadas em câmara de Neubauer. As cDPSC e cUCSC apresentaram aderência ao plástico e morfologia fibroblastoide após cultivo de acordo com os critérios mínimos da ISCT. Tanto as cDPSCs quanto as cUCT apresentaram potencial de diferenciação para as três linhagens (osteogênica, adipogênica e condrogênica). As cUCSC apresentaram maior taxa de proliferação (p=0.0414) e número de unidades formadora de colônia (p=0.0002) quando comparada as cDPSC na passagem três. Conclui-se que as cDPSC e cUCSC apresentaram as características de células-tronco mesenquimais e que as cUCSC até a passagem três possuem uma maior taxa de proliferação e maior quantidade de unidades formadoras de colônias que as cDPSC, podendo ser utilizadas na terapia celular.

The field of regenerative medicine for pets has been growing in recent years. Mesenchymal stem cells (MSCs) can be defined as adult, multipotent stem cells with the ability to differentiate into several cell types. The International Society of Cell Therapy (ISCT) has set minimum criteria for defining MSCs. These MSCs can be isolated from different sources such as: dental pulp and umbilical cord. The dental pulp contains a population of stem cells (DPSC) with perivascular location and differentiation potential in multiple lineages similar to MSCs obtained from other tissues. Fluconazole is an antifungal compound used alone or in combination with other drugs because it has a large spectrum. It exerts its antifungal activity by inhibiting ergosterol fungal synthesis in one of the final steps of its biosynthesis. Therefore, it can be used in teeth collection and stem cell culture of dental pulp. Another source of MSCs used is umbilical cord. The collection is less invasive, painful and with lower mortality when compared to collection of the bone marrow. The aim were isolate, characterize and evaluate the potential of proliferation and colonies formation of mesenchymal stem cells derived from dental pulp (cDPSC) and umbilical cord tissue of dogs (cUCSC). Three samples of dental pulp and umbilical cord were collected. The samples were mechanically dissociated and isolated by enzymatic digestion using type II collagenase and cultivate with IMDM and fetal bovine serum. The differentiation was made for adipogenic, osteogenic and chondrogenic lineages. For osteogenic differentiation, the medium was changed three times per week for seven days, then the cells were stained with Alizarin Red evidencing calcium crystals. For adipogenic differentiation, the medium was changed three times per week for 21 days, then the cells were stained with Oil Red evidencing lipid vacuoles. For chondrogenic differentiation the medium was changed three times at week for 21 days, then stained with toluidine blue evidencing mucopolysaccharides. For clonogenic assay, 300 cells/well were plated in 6-well plates and cultured for nine days, then colonies were stained with crystal violet and counted. For proliferation assay, 10,000 cells/well were plated in six-well plate, enzymatic dissociation was performed every five days and cells were counted in a hemocytometer. The cDPSC and cUCSC showed adherence to the plastic and fibroblastroid morphology after culture according to guidelines of the ISCT. In addition, they also shown differentiation potential for the three lineages: osteogenic, adipogenic and chondrogenic. The cUCSC presented higher number of colony forming units when compared to cDPSC at third passage. Regarding proliferation, cUCT presented a higher rate when compared to cDPSCs at third passage. In conclusion, cDPSC and cUCSC showed characteristics of mesenchymal stem cells and cUCSC at third passage had a higher rate of proliferation and more of colony-forming units in comparison to cDPSC, can be used in cell therapy.

Combination of stem cells from deciduous teeth and electroacupuncture in dogs with chronic spinal cord injury

Estudos anteriores demonstraram que a associação da eletroacupuntura e células-tronco mesenquimais/estromais (CTMs) pode promover a sobrevivência e diferenciação das CTMs, assim como recuperação funcional em ratos com transecção da medula espinal. Neste estudo, foram avaliados os efeitos terapêuticos da associação de células-tronco derivadas de polpa de dente decíduo esfoliado de cães (CPDEc) e eletroacupuntura (EAP) em cães com lesão de medula espinhal crônica causada de forma natural por herniação do disco interververtebral. Os cães foram divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais (n=4 para cada grupo; total de 16 animais): CPDEc, EAP, CPDEc+EAP e grupo controle. Foram encontradas pequenas melhoras na pontuação do exame neurológico em um animal do grupo CPDEc (1/4; 2 pontos ganhos), um do grupo EAP (1/4; 8 pontos ganhos), três do grupo CPDEc+EAP (3/4; 16 pontos ganhos) e um do grupo controle (1/4; 2 pontos ganhos). Na avaliação funcional, pequenas melhoras também foram observadas em dois animais do grupo CPDEc (2/4; 3 pontos ganhos), dois do grupo EAP (2/3; 4 pontos ganhos), um do grupo CPDEc+EAP (1/4; 1 ponto ganho) e dois do grupo controle (2/4; 6 pontos ganhos). No entanto, não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos. Os achados ressonância magnética não sugeriram melhoras comparando os exames pré e pós tratamento entre os grupos, com exceção de um animal do grupo CPDEc (1/4), e 10 animais dentre todos os grupos (10/16) apresentaram sinais de progressão na lesão da medula espinhal, que não puderam ser associados com os procedimentos do estudo, mas podem estar relacionados à progressão natural da doença. Além disso, os dentes decíduos esfoliados foram obtidos facilmente e as CPDEc foram isoladas de forma simples, ademais, não foi observada nenhuma mortalidade foi observada até 7 meses após o procedimento.

Previous studies have reported that combination of electroacupuncture (EA) and mesenchymal stem/stromal cells (MSC) promoted survival, differentiation and functional recovery in spinal cord-transected rats. In this study, it was examined the therapeutic effects of stem cells from canine exfoliated dental pulp (SCED) combined with EA treatment in dogs with chronic naturally occurred spinal cord injury due to intervertebral disc herniation (IVDH). Dogs were randomly assigned to four experimental groups (n=4 for each group; total of 16 animals): SCED, EA, SCED + EA) and control. Mild increase in the neurological scoring was found in one animal from SCED group (1/4; 2 points gained), one from EA group (1/4; 8 points gained), three from SCED+EA group (3/4; 16 points gained) and one from control group (1/4; 2 points gained). Functional outcome improvements were observed two animals from SCED group (2/4; 3 points gained), two from EA group (2/4; 4 points gained), one from SCED+EA group (1/4; 1 point gained) and two were from control group (2/4; 6 points gained). However no statistical differences were observed. Magnetic resonance imaging (MRI) findings did not suggest improvement comparing pre- and post-treatment within groups, excepted from one animal from SCED group (1/4), and 10 animals from all groups (10/16) presented signs of injury progression in the SCI in post-treatment exam, which could not be associated to the procedures from study, but could be related to the natural evolution of the disease. Limitation such as number of transplanted stem cells, delivery route, injury chronicity and intrinsic variation among naturally spinal cord injured dogs could have influence outcomes negatively. Moreover, canine deciduous exfoliated teeth were easily obtained and SCED were simply isolated, and no mortality followed up 7 month from procedure were observed.

Successful transplant of mesenchymal stem cells in induced osteonecrosis of the ovine femoral head: preliminary results / Sucesso no transplante de células tronco mesenquimais em ovinos com osteonecrose induzida da cabeça do fêmur: resultados preliminares

PURPOSE: Evaluate the bone tissue recovery following transplantation of ovine mesenchymal stem cells (MSC) from bone marrow and human immature dental-pulp stem cells (hIDPSC) in ovine model of induced osteonecrosis of femoral head (ONFH). METHODS: Eight sheep were divided in three experimental groups. First group was composed by four animals with ONFH induced by ethanol through central decompression (CD), for control group without any treatment. The second and third group were compose by two animals, six weeks after ONFH induction received transplantation of heterologous ovine MSC (CD + oMSC), and hIDPSC (CD + hIDPSC), respectively. In both experiments the cells were transplanted without application of any type of immunosupression protocol. RESULTS: Our data indicate that both cell types used in experiments were able to proliferate within injured site providing bone tissue recovery. The histological results obtained from CD+hIDPSC suggested that the bone regeneration in such animals was better than that observed in CD animals. CONCLUSION: Mesenchymal stem cell transplant in induced ovine osteonecrosis of femoral head by central decompression technique is safe, and apparently favors bone regeneration of damaged tissues.(AU)

OBJETIVO: Verificar os efeitos das células-tronco mesenquimais da medula óssea de ovinos e da polpa dentária imatura humana em ovinos com osteonecrose induzida, da cabeça do fêmur. MÉTODOS: Oito ovelhas foram distribuídas em três grupos experimentais. O primeiro grupo foi composto por quatro animais com osteonecrose da cabeça do fêmur induzida por etanol através da descompressão central, que não receberam nenhum tratamento. O segundo e o terceiro grupo, cada um composto por dois animais, receberam transplante heterólogo de células tronco mesenquimais de ovinos e polpa dentária imatura humana seis semanas após a indução da osteonecrose da cabeça do fêmur, respectivamente. Em ambos os grupos experimentais as células foram transplantadas sem o uso de drogas imunossupressoras. RESULTADOS: Os achados demonstram que as células-tronco mesenquimais injetadas na cabeça do fêmur se encontravam viáveis após o transplante no novo sítio e proliferaram em pouco tempo. Os dados histológicos sugerem que a regeneração óssea nos animais transplantados com polpa dentária imatura humana foi mais rápida do que nos animais submetidos somente a descompressão central. CONCLUSÃO: O transplante de células tronco mesenquimais na osteonecrose da cabeça do fêmur induzida em ovinos através da técnica de descompressão central é um procedimento seguro, e aparentemente favorece a regeneração óssea de tecidos lesados.(AU)

Transplante heterólogo de células-tronco mesenquimais em ovinos com osteonecrose da cabeça do fêmur induzida / Heterologous Transplant of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Ovine With Osteonecrosis of The Femoral Head Induced

A Osteonecrose da cabeça do fêmur (ONCF) é uma patologia degenerativa que pode levar ao colapso da cabeça do fêmur tendo como conseqüência a necessidade de substituição da articulação coxofemoral. O objetivo principal no tratamento da ONCF é preservar a articulação coxofemoral e não substituí-la. Estudos realizados em pacientes humanos com ONCF demonstraram que os níveis de atividade e o número de células mesenquimais nos compartimentos hematopoiéticos e estromais da medula óssea estão deprimidos. Estes achados indicam a possibilidade da utilização de células-tronco mesenquimais (MSC) nas lesões necróticas da cabeça do fêmur. O presente trabalho propõe a utilização da terapia celular com MSC da medula óssea de ovinos e polpa dentária humana em 8 ovinos com ONCF induzida pela injeção intra-óssea de etanol, além da avaliação da reestruturação óssea através da microscopia de luz, e rastreamento das células transplantadas. Dois animais foram eutanasiados com 6 semanas após a indução da lesão e foram transplantadas as células-tronco mesenquimais em 4 animais, e realizada a descompressão central em 2 outros animais. Com dez semanas foram eutanasiados os animais restantes. O sucesso do transplante da medula óssea foi confirmado pela expressão do gene repórter LacZ na cabeça do fêmur dos animais transplantados macroscopicamente. A análise histológica evidenciou maior processo regenerativo na cabeça do fêmur do animal experimental submetido à terapia com células-tronco da polpa dentária imatura humana

The osteonecrosis of femoral head (ONFH) is a degenerative disease that can lead to the collapse of the femoral head and necessity of total hip replacement. The main objective in the treatment of ONFH is to preserve the hip and not replace it. Studies in human patients with ONFH demonstrated that levels of activity and the number of mesenchymal cells in the hematopoietic and bone marrow stromal compartments are depressed. These findings indicate the possibility of the use of mesenchymal stem cells (MSC) in necrotic lesions on the head of the femur. This research proposes the use of cell therapy with MSC from ovine bone marrow and immature human dental pulp stem cell in ovine ONCF induced by intraosseous injection of ethanol, in addition, the assessment of bone restructuring by light microscopy and tracking of the transplanted cells. Two animals were euthanasied with 6 weeks after the induction of injury, and were transplanted mesenchymal stem cells in 4 animals, and held the central decompression in 2 other animals. After ten weeks were euthanasied the remaining animals. The successful of the bone marrow transplantation was confirmed by the macroscopic expression of the LacZ gene reporter in the femoral head of animals transplanted. The histological analysis showed an advanced regenerative process in the femoral head in the animal using human immature dental pulp stem cell