Changes in expression levels of Nod-like receptors in the spleen of ewes

Nucleotide-binding oligomerization domain receptors (NOD-like receptors, NLRs) have critical effects on interfaces of the immune and reproductive systems, and the spleen plays a key role in both innate and adaptive immune functions. It is hypothesized that NLR family participates in maternal splenic immune regulation during early pregnancy in sheep. In this study, maternal spleens were collected on day 16 of the estrous cycle, and days 13, 16 and 25 of gestation (n = 6 for each group) in ewes. Expression of NLR family, including NOD1, NOD2, class II transactivator (CIITA), NLR family apoptosis inhibitory protein (NAIP), nucleotide-binding oligomerization domain, Leucine rich repeat and Pyrin domain containing 1 (NLRP1), NLRP3 and NLRP7, was analyzed using quantitative real-time PCR, Western blot and immunohistochemistry analysis. The results revealed that expression levels of NOD1, NOD2, CIITA and NLRP3 were downregulated at days 13 and 16 of pregnancy, but expression of NLRP3 was increased at day 25 of pregnancy. In addition, expression values of NAIP and NLRP7 mRNA and proteins were improved at days 16 and 25 of pregnancy, and NLRP1 was peaked at days 13 and 16 of pregnancy in the maternal spleen. Furthermore, NOD2 and NLRP7 proteins were limited to the capsule, trabeculae and splenic cords. In summary, early pregnancy changes expression of NLR family in the maternal spleen, which may be related with the maternal splenic immunomodulation during early pregnancy in sheep.(AU)

Conceptus-modulated innate immune function during early pregnancy in ruminants: a review

Abstract This review focuses on the innate immune events modulated by conceptus signaling during early pregnancy in ruminants. Interferon-tau (IFN-τ) plays a role in the recognition of pregnancy in ruminants, which involves more than the inhibition of luteolytic pulses of PGF2α to maintain corpus luteum function. For successful pregnancy establishment, the allogenic conceptus needs to prevent rejection by the female. Therefore, IFN-τ exerts paracrine and endocrine actions to regulate the innate immune system and prevent conceptus rejection. Additionally, other immune regulators work in parallel with IFN-τ, such as the pattern recognition receptors (PRR). These receptors are activated during viral and bacterial infections and in early pregnancy, but it remains unknown whether PPR expression and function are controlled by IFN-τ. Therefore, this review focuses on the main components of the innate immune response that are involved with early pregnancy and their importance to avoid conceptus rejection.

Conceptus-modulated innate immune function during early pregnancy in ruminants: a review

This review focuses on the innate immune events modulated by conceptus signaling during early pregnancy in ruminants. Interferon-tau (IFN-) plays a role in the recognition of pregnancy in ruminants, which involves more than the inhibition of luteolytic pulses of PGF2 to maintain corpus luteum function. For successful pregnancy establishment, the allogenic conceptus needs to prevent rejection by the female. Therefore, IFN- exerts paracrine and endocrine actions to regulate the innate immune system and prevent conceptus rejection. Additionally, other immune regulators work in parallel with IFN-, such as the pattern recognition receptors (PRR). These receptors are activated during viral and bacterial infections and in early pregnancy, but it remains unknown whether PPR expression and function are controlled by IFN-. Therefore, this review focuses on the main components of the innate immune response that are involved with early pregnancy and their importance to avoid conceptus rejection.(AU)

Endometrial transcription of microbial molecular patterns receptors in Gyr and F1 Holstein x Gyr postpartum cows / Transcrição endometrial de receptores de padrões moleculares microbianos em vacas Gir e F1 Holandês x Gir após o parto

Zebu and Holstein x Zebu crossbred have low incidence of uterine infection when compared to Holstein cows. Resistance to uterine infections may be associated with the ability to recognize invading microorganisms. Endometrial transcription of microbial molecular patterns receptors has been investigated in the postpartum period of Holstein cows, but it is completely unknown in Zebu or Holstein x Zebu cows. In this study, 9 Gyr and 12 F1 Holstein x Gyr cows were submitted to endometrial biopsies at the first and seventh days postpartum, with the objective to measure transcription levels of toll-like receptors (TLRs) 1/6, 2, 4, 5, and 9; nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors 1 and 2; and coreceptors cluster of differentiation 14 (CD14) and myeloid differentiation protein-2 (MD-2). There was a significant (P<0.05) decrease in transcription of TLR5 in Gyr, and an increase in transcription of TLR9 in F1 cows, between the first and seventh day postpartum. Both groups had low incidences of uterine infections up to 42 days postpartum. Uterine involution completed at 27.7 ± 10.1 and 25.1 ± 4.7 days postpartum for Gyr and F1 cows, respectively. In Gyr cows, higher transcription levels of TLR1/6 and NOD1 correlated to a longer period required for uterine involution. In F1 cows, lower levels of TLR1/6, TLR2 and NOD2 correlated to a longer period required for uterine involution. In conclusion, some pathogen recognition receptors associated significantly with the time required for uterine involution in Gyr and F1 cows.(AU)

Vacas Zebu e mestiças Holandês x Zebu apresentam baixas incidências de infecções uterinas quando comparadas às Holandesas. A resistência às infecções uterinas pode estar relacionada com a capacidade de reconhecimento dos microrganismos invasores. A transcrição endometrial de receptores de padrões moleculares microbianos tem sido investigada em vacas Holandesas recém-paridas, porém ainda é desconhecida em vacas Zebu e mestiças Holandês x Zebu. No presente estudo, nove vacas Gir e 12 F1 Holandês x Gir foram submetidas a biópsias endometriais no primeiro e no sétimo dia após o parto, com o objetivo de mensurar os níveis de transcrição gênica dos receptores tipo Toll (TLRs) 1/6, 2, 4, 5 e 9; receptores tipo NOD 1 e 2; e dos coreceptores CD14 e MD-2. Houve diminuição significativa (P < 0,05) do nível de transcrição de TLR5 em vacas Gir e aumento da transcrição de TLR9 em vacas F1, entre o primeiro e o sétimo dia após o parto. Os dois grupos apresentaram baixas incidências de infecções uterinas até 42 dias pós-parto. O período de involução uterina foi de 27,7 ± 10,1 e 25,1 ± 4,7 dias pós-parto, para vacas Gir e F1, respectivamente. No grupo de vacas Gir, altos níveis de transcrição de TLR1/6 e NOD1 tiveram correlação significativa com o prolongamento do período de involução uterina. No grupo de vacas F1, baixos níveis de transcrição de TLR1/6, TLR2 e NOD2 foram associados a maiores períodos de involução uterina. Portanto, os níveis de transcrição endometrial de alguns receptores de padrões moleculares microbianos na primeira semana após o parto podem estar relacionados com o tempo requerido para ocorrência da involução uterina em vacas Gir e F1.(AU)

Endometrial transcription of microbial molecular patterns receptors in Gyr and F1 Holstein x Gyr postpartum cows / Transcrição endometrial de receptores de padrões moleculares microbianos em vacas Gir e F1 Holandês x Gir após o parto

Zebu and Holstein x Zebu crossbred have low incidence of uterine infection when compared to Holstein cows. Resistance to uterine infections may be associated with the ability to recognize invading microorganisms. Endometrial transcription of microbial molecular patterns receptors has been investigated in the postpartum period of Holstein cows, but it is completely unknown in Zebu or Holstein x Zebu cows. In this study, 9 Gyr and 12 F1 Holstein x Gyr cows were submitted to endometrial biopsies at the first and seventh days postpartum, with the objective to measure transcription levels of toll-like receptors (TLRs) 1/6, 2, 4, 5, and 9; nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors 1 and 2; and coreceptors cluster of differentiation 14 (CD14) and myeloid differentiation protein-2 (MD-2). There was a significant (P<0.05) decrease in transcription of TLR5 in Gyr, and an increase in transcription of TLR9 in F1 cows, between the first and seventh day postpartum. Both groups had low incidences of uterine infections up to 42 days postpartum. Uterine involution completed at 27.7 ± 10.1 and 25.1 ± 4.7 days postpartum for Gyr and F1 cows, respectively. In Gyr cows, higher transcription levels of TLR1/6 and NOD1 correlated to a longer period required for uterine involution. In F1 cows, lower levels of TLR1/6, TLR2 and NOD2 correlated to a longer period required for uterine involution. In conclusion, some pathogen recognition receptors associated significantly with the time required for uterine involution in Gyr and F1 cows.(AU)

Vacas Zebu e mestiças Holandês x Zebu apresentam baixas incidências de infecções uterinas quando comparadas às Holandesas. A resistência às infecções uterinas pode estar relacionada com a capacidade de reconhecimento dos microrganismos invasores. A transcrição endometrial de receptores de padrões moleculares microbianos tem sido investigada em vacas Holandesas recém-paridas, porém ainda é desconhecida em vacas Zebu e mestiças Holandês x Zebu. No presente estudo, nove vacas Gir e 12 F1 Holandês x Gir foram submetidas a biópsias endometriais no primeiro e no sétimo dia após o parto, com o objetivo de mensurar os níveis de transcrição gênica dos receptores tipo Toll (TLRs) 1/6, 2, 4, 5 e 9; receptores tipo NOD 1 e 2; e dos coreceptores CD14 e MD-2. Houve diminuição significativa (P < 0,05) do nível de transcrição de TLR5 em vacas Gir e aumento da transcrição de TLR9 em vacas F1, entre o primeiro e o sétimo dia após o parto. Os dois grupos apresentaram baixas incidências de infecções uterinas até 42 dias pós-parto. O período de involução uterina foi de 27,7 ± 10,1 e 25,1 ± 4,7 dias pós-parto, para vacas Gir e F1, respectivamente. No grupo de vacas Gir, altos níveis de transcrição de TLR1/6 e NOD1 tiveram correlação significativa com o prolongamento do período de involução uterina. No grupo de vacas F1, baixos níveis de transcrição de TLR1/6, TLR2 e NOD2 foram associados a maiores períodos de involução uterina. Portanto, os níveis de transcrição endometrial de alguns receptores de padrões moleculares microbianos na primeira semana após o parto podem estar relacionados com o tempo requerido para ocorrência da involução uterina em vacas Gir e F1.(AU)

SNPs E MICROSSATÉLITES NA CARACTERIZAÇÃO RACIAL E DE RESISTÊNCIA A ENFERMIDADES EM BOVINOS DA RAÇA CURRALEIRO PÉ-DURO

A raça bovina local brasileira Curraleiro Pé-Duro é patrimônio genético importante que tem como características rusticidade, adaptabilidade às condições ambientais e resistência a doenças e intoxicações. Objetivou-se com esse estudo observar a variabilidade genética em populações de Curraleiro Pé-Duro, verificando a ocorrência de polimorfismos em marcadores SNP e microssatélites para caracterização racial e resistência a infeções por Brucella abortus, Leptospira spp, Neospora caninum, e pelos vírus da leucose, rinotraqueite infecciosa e diarreia viral bovina. Foram utilizadas 1.182 amostras de soro e sangue de bovinos Curraleiro Pé-Duro, oriundos dos estados de Goiás, Tocantins e Piauí, pertencentes ao banco de dados da Rede Pró-Centro-Oeste. O DNA foi obtido por método de extração salting out modificado e as reações em cadeia da polimerase (PCR) foram realizadas em sistema multiplex. Foram utilizados 27 marcadores de caracterização racial indicados pela FAO e 13 marcadores relacionados aos genes do complexo antígeno leucocitário bovino (BoLA) e ao SLC11A1. Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em sequenciador automático ABI3500 e genotipados com auxílio do software GeneMapper. Foram investigados 24 polimorfismos de base única (SNP) nas mesmas amostras, detectados por meio da técnica de KASP (Kompetitive Allele-Specific PCR). Os SNPs foram pesquisados em genes relacionados à expressão de citocinas (integrina, interleucina, toll like receptor e nod like receptors), comumente associados à resistência ou suscetibilidade a enfermidades parasitárias, bacterianas e virais. A análise Bayesiana agrupou os animais em dois clusters em ambas análises de microssatélites, indicando a presença de uma subpopulação. Os valores de heterozigosidade observada foram inferiores à esperada na maioria dos locos e os Fst indicaram pouca diferenciação entre os clusters, sugerindo homozigotia aumentada. Foi realizada análise univariada para associação dos genótipos com os fenótipos, seguida de regressão logística considerando nível de significância de 5% ao teste de Fisher. Foram identificados 42 alelos significativos (p<0,05) para as infecções, indicando ter importante papel na resposta imune do hospedeiro. Todos os microssatélites analisados mostraram-se informativos. Os haplótipos dos SNPs rs55617325, rs55617286, rs55617437 e rs43702941, presentes no cromossomo 6, foram associados a animais negativos contra Neospora caninum, podendo ser indicativos de uma resistência inata ao patógeno. Os alelos identificados podem ser utilizados em pesquisas futuras sobre a resistência bovina.

The Brazilian cattle breed Curraleiro Pé-Duro is an important genetic resource by the characteristics of rusticity, adaptability to environmental conditions and resistance to diseases and intoxications. The aim of this study was to analyse the genetic diversity of Curraleiro Pé-Duro populations and verify the presence of SNPs and microsatellite polymorphisms for breed characterization and disease resistance to Brucella abortus, Leptospira spp, Neospora caninum, leukosis virus, herpesvirus and diarrhea viral infections. A total of 1.182 serum and blood samples of Curraleiro Pé-Duro cattle, from Goiás, Tocantins and Piauí states, belonging to the Pro-Centro-Oeste Network database were used. DNA was obtained by modified salting out extraction method and polymerase chain reactions (PCR) were performed in a multiplex system. A panel of 27 markers of breed characterization indicated by FAO and 13 markers related to the bovine leukocyte antigen (BoLA) and SLC11A gene were used. PCR products were separated by eletroforesis in an ABI3500 automatic sequencer and genotyped on GeneMapper software. Twenty-four single-base polymorphisms (SNPs) were investigated in the same samples, detected by KASP (Kompetitive Allele-Specific PCR). SNPs were investigated in genes related to the expression of cytokines (integrin, interleukin, toll like receptor and nod-like receptors), commonly associated with resistance or susceptibility to parasitic, bacterial and viral diseases. Bayesian analysis grouped the animals into two clusters in both microsatellite analyzes, indicating the presence of a subpopulation. The observed heterozygosity were lower than expected in most loci and and Fst values indicated little differentiation between clusters and increased homozygosity. Univariate analysis was performed for the association of genotypes with phenotypes, followed by logistic regression considering a significance level of 5% for the Fisher test. We identified 42 significant alleles (p <0.05) for infections that play an important role in the host immune response. All microsatellites were informative. SNP haplotypes rs55617325, rs55617286, rs55617437 e rs43702941, present on chromosome 6, were associated with negative animals against Neospora caninum and could be indicative of an innate resistance to the pathogen. The identified alleles can be used in future research on bovine resistance.

Produção recombinante do padrão Molecular associado ao Patógeno Flagelina e do padrão Molecular associado ao Dano HSP70 Agonistas dos receptores de reconhecimento de padrões em Aves

A resposta imune aviária pode ser dividida em resposta imune inata e adquirida. A imunidade inata é a primeira linha de defesa contra patógenos microbianos e possui como um de seus componentes moleculares os receptores de reconhecimento de padrão (PRRs). Três famílias dos PRRs têm sido maior alvo de pesquisas nas aves: os receptores semelhantes ao Toll (TLR), receptores semelhantes ao NOD (NLR) e os receptores semelhante a RIG-1 (RLR). Estruturas denominadas Padrão Molecular Associado ao Patógeno (PAMP) e Padrão Molecular Associado ao Dano (DAMP) são reconhecidos por esses receptores, induzem respostas imunes inatas e podem modular a imunidade adquirida. O objetivo deste trabalho foi selecionar PAMPs e DAMPs agonistas de PRRS das aves,analisar in silico sequências genéticas do PAMP flagelina e DAMP HSP70 das aves, clonar e expressar de de forma recombinante esses agonistas. O modelo de clonagem e expressão utilizado para a geração do PAMP e DAMP alvos desta pesquisa, pET100-D/TOPO, clonados em E. coli TOP10 e expressos em E. coli C4 (DE3) e C43 (DE3) mostrou ser eficiente, e ambas as proteínas foram expressas e confirmadas por Western Blotting. Os resultados da caracterização in silico realizadas para as proteínas expressas justificaram a adoção do fragmento genético das sequências da flagelina e HSP70 devido a seleção de uma região de cada agonista que foi traduzida em uma proteína com características físico-químicas e imunológicas viáveis para sua adoção como imunobiógicos das aves. Os resultados obtidos nesta tese aumenta a possibilidade de obter novos ensaios in vitro e in vivo que visam analisar PAMPs e DAMPs recombinantes como estimulantes dos componentes do sistema imune inato das aves e desta forma atuarem como possíveis adjuvantes vacinais.

The immune responses of birds are carried out in coordination by the innate and acquired immune systems. The innate immunity is the first line of defense against microbial pathogens, and is structured with cells equipped with receptors for pattern recognition (PRR). Three families of PRR have been the subject of research in birds: Toll-like receptors (TLR), NOD-like receptors (NLR), and RIG-1-like receptors (RLR). Structures known as Pathogen Associated Molecular Pattern (PAMP), present in pathogens, and Damage Associated Molecular Standard (DAMP), present in the damaged tissue, are recognized by cells with these receptors, and induce innate immune responses which will modulate the acquired immunity. The objective of this work was to perform a review that addresses the intrinsic characteristics of the innate immune system of birds, pointing out the mechanisms of action of PRRs in avian species, and consider the perspective of studies aimed at improving the vaccine responses through the adoption of PAMPs and DAMPs as adjuvants. In addition, we aimed at selecting and analyzing in silico the genetic sequences of the flagellin (PAMP) and HSP70 (DAMP) from birds and to produce these PRR agonists through genetic engineering. The in silico expressed proteins characterization results justified the adoption of the genetic fragment of the fljB (flagellin encoding) and HSP70 gene sequences. The selected region was chosen considering the ideal physico-chemical and immunological characteristics of the translated segment and considering the immunogenicity to birds. The expression system pET100-D / TOPO was used for the generation of flagellin and HSP70 and subsequently cloned in E. coli TOP10. Using E. coli C4 (DE3) and C43 (DE3) for expression, the system showed to be efficient, enabling both proteins be correctly expressed and confirmed by western blotting. The results obtained indicate the possibility of using the recombinant proteins for the immunomodulation in birds. In vitro and In vivo studies are needed aiming at analyzing recombinant PAMPs and DAMPs as stimulants of the innate immune system of birds and their potential use as vaccine adjuvants

RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DE GENES DE IMUNIDADE INATA E GRAU DE SOBREVIVÊNCIA INTRACELULAR DE Leishmania infantum EM MACRÓFAGOS CANINOS EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS

A leishmaniose visceral canina é uma importante zoonose causada pelo protozoário Leishmania infantum, transmitida pela picada de insetos flebotomíneos. Apesar do avanço no conhecimento dos mecanismos imunológicos frente à infecção por Leishmania nos últimos anos, há poucos estudos sobre o estabelecimento da resposta imune em cães, especialmente sobre os mecanismos de imunidade inata. Nesse contexto, visando medidas futuras de controle dos casos caninos e humanos, a imunoterapia desponta como uma opção viável. Desta forma, o objetivo desse trabalho foi determinar o perfil de expressão gênica dos receptores TLR9, NOD1 e NOD2 e avaliar sua correlação com a sobrevivência intracelular de L. infantum em macrófagos caninos. Após exames de triagem e confirmação de diagnóstico negativo para a doença, foram selecionados 43 animais clinicamente saudáveis para coleta de sangue para cultivo celular. Após diferenciação de monócitos em macrófagos, parte do sobrenadante da cultura foi coletado e armazenado a -80ºC para posterior extração de RNA e realização de PCR em tempo real, para avaliação da expressão dos genes de imunidade inata. A outra parte foi experimentalmente infectada por L. infantum, com posterior avaliação da sobrevivência intracelular do parasito. Observou-se que a expressão desses genes é baixa, além de correlação positiva entre a expressão de NOD2 e a sobrevivência intracelular de L. infantum. Esses resultados evidenciam a importância de estudos que visem descrever, de forma mais aprofundada, a função destes e de outros receptores, tanto na infecção experimental como em animais naturalmente infectados.

Canine visceral leishmaniasis is an important zoonosis caused by Leishmania infantum, transmitted by sand flies. Despite the advance in the understanding of the immune mechanisms against Leishmania infection in recent years, there are few studies about the establishment of the immune response in dogs, especially on the mechanisms of innate immunity. In this context, aiming future control measures of canine and human cases, immunotherapy has emerged as a viable option. This way, the aim of this study was to determine the gene expression of the receptors TLR9, NOD1 and NOD2 in canine macrophages and evaluate their correlation with the intracellular survival of L. infantum. After screening tests and confirmation of negative diagnosis for the disease, 43 clinically healthy animals were selected for blood collection for cell culture. After monocytes differentiation into macrophages, part of the culture supernatant was collected and stored at -80°C for subsequent RNA extraction and real-time PCR, for evaluation of the expression of innate immunity genes. The other part was experimentally infected with L. infantum, with further evaluation of the intracellular survival of the parasite. It was observed the low expression of these receptors and a positive correlation between the expression of NOD2 and intracellular survival of L. infantum. These results highlight the importance of studies that aim to describe, in a more detailed manner, the function of these and other receptors, both in experimental infection as in naturally infected animals.