Analysis of nuclear maturation, DNA damage and repair gene expression of bovine oocyte and cumulus cells submitted to ionizing radiation'

Radiotherapy causes destruction of tumor cells, but also threatens the integrity and survival of surrounding normal cells. Then, woman submitted to irradiation for cancer treatment may present permanent ovary damage, resulting in impaired fertility. The objective of this study was to investigate the effects of therapeutic doses of ionizing radiation (IR), used for ovarian cancer treatment in humans, on bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) as experimental model. Bovine ovaries were exposed to 0.9 Gy, 1.8 Gy, 3.6 Gy or 18.6 Gy IR, and then COCs were collected and used to evaluate: (a) oocyte nuclear maturation; (b) presence of phosphorylated H2A.X (γH2AX), as an indicator of DNA double-strand breaks (DSBs); and (c) expression of genes involved in DNA repair (TP53BP1, RAD52, ATM, XRCC6 and XRCC5) and apoptosis (BAX). The radiation doses tested in this study had no detrimental effects on nuclear maturation and did not increase γH2AX in the oocytes. However, IR treatment altered the mRNA abundance of RAD52 (RAD52 homolog, DNA repair protein) and BAX (BCL2-associated X protein). We conclude that although IR doses had no apparent effect on oocyte nuclear maturation and DNA damage, molecular pathways involved in DNA repair and apoptosis were affected by IR exposure in cumulus cells.(AU)

Insulin-like growth factor-1 improves in vitro meiotic resumption of dromedary camel (Camelus Dromedarius) oocytes

Despite relatively high maturation rate of in vitro matured oocytes in the dromedary camel, however, blastocyst production is very low after in vitro fertilization (IVF). Herein, the influences of oocyte collection method (follicular aspiration vs slicing; Experiment I), the addition of Insulin-like growth factor I (IGF-I) to the maturation medium (Experiment II) on in vitro maturation (IVM) of oocyte were investigated. Although the nuclear maturation did not differ regardless of collecting method, follicular aspiration led to lower degeneration rates than those in controls (P < 0.05). The percentages of oocytes at MII were greater in the presence of IGF-1 than in its absence (71.9% vs 48.4%, respectively, P<0.05). Additionally, the percentages of degenerated oocytes were higher in the control group compared to oocytes cultured in the presence of IGF-I (23.6% vs 10.4%, respectively, P<0.05). IGF-I treatment improved the quality of MII matured oocytes as evidenced by the decrease of cathepsin B (CTSB) activity, a marker of poor quality oocytes, when compared to control ones (P < 0.05). In conclusion, follicular aspiration decreased the degeneration rate; however, it had no effect on completion of maturation. IGF-I enhanced the IVM of oocyte and decreased degeneration rate.(AU)

Dynamics of nuclear and cytoplasm maturation of bovine oocytes cultivated in vitro in medium supplemented with fulerol / Dinâmica da maturação nuclear e citoplasmática de oócitos bovinos cultivados in vitro em meio suplementado com fulerol

The aim of this work was to evaluate, in vitro, the dynamics of nuclear and cytoplasmic maturation of bovine oocytes in traditional IVM medium (CT) and supplemented with fullerol (MF50), for 36 hours. The nuclear maturation of CT (n=300) and MF50 (n=270) every 6 hours, stained with Hoechst33342 and cytoplasmic, the mitochondrial distribution of CT (n=197) and MF50 (n=159) at every 12 hours, stained with Mitotracker Orange. At 6 hours, CT oocytes (19%) were in MI (metaphase I), while in MF50 they were in GV (germ vesicle) or GVB (GV breakeage), repeating at 12 hours. At 18 hours, 46.3% were matured in CT, and 20% in MF50. At 24 hours, 43.9% of maturation was observed in the MF50 group, and 63.8% in the CT. At 30 and 36 hours, the maturation pattern was stable, but with the onset of oocyte degeneration. There was a delay in cytoplasmic maturation with 36 hours (P < 0.05) in MF50 (53.9% of mature gametes), compared to CT (69.8%). With immature cytoplasm, they were 10.4% and 31.7% for CT and MF50 (P< 0.05), respectively. It was concluded that fullerol possibly interfered in the expansion of cumulus oophorus cells, as well as delayed the meiotic progression and cytoplasmic maturation.

O objetivo deste estudo foi avaliar, in vitro, a dinâmica da maturação nuclear e citoplasmática de oócitos bovinos em meio MIV tradicional (TC) e suplementado com fulerol (MF50), durante 36 horas. Na maturação nuclear do TC (n=300) e do MF50 (n=270) a cada seis horas, corados com Hoechst 33342, e na citoplasmática, avaliou-se a distribuição mitocondrial do TC (n=197) e do MF50 (n=159) a cada 12 horas, corados com Mitotracker Orange (Life® Technologies). Às seis horas, oócitos do TC (19%) se encontravam em MI (metáfase I), enquanto no MF50 estavam em VG (vesícula germinativa) ou QVG (quebra VG), repetindo com 12 horas. Às 18 horas, 46,3% estavam maturados no TC, e 20% no MF50. Com 24 horas, verificaram-se 43,9% de maturação no grupo MF50, e 63,8% no TC. Às 30 e 36 horas, o padrão de maturação foi estável, mas com início de degeneração oócitária. Houve retardo na maturação citoplasmática com 36 horas (P<0,05) no MF50 (53,9% de gametas maduros), comparado ao TC (69,8%). Com citoplasma imaturo, foram 10,4% e 31,7% para TC e MF50 (P<0,05), respectivamente. Conclui-se que o fulerol possivelmente interferiu na expansão das células do cumulus oophorus, bem como retardou a progressão meiótica e a maturação citoplasmática dos oócitos.

Effect of the presence and location of corpus luteum on competence of bovine cumulus-oocyte complexes

This study aimed to determine the effect of presence of the corpus luteum (CL) and its influence on cumulus­oocyte complexes (COCs) obtained from the ipsilateral or contralateral ovary in bovine on the recovery and capacity of the oocytes to sustain mono-spermic fertilization, undergo preimplantation development, and develop to the blastocyst stage. Ovaries were collected at a local slaughterhouse and kept in pairs corresponding to the same animal. In the first experiment the variables evaluated were compared between cows with (CCL+) and without (CCL- ) CL, and for the second experiment, comparisons were made between ovaries with an ipsilateral (CL+), contralateral (CL−), and no (NCL). The recovery rate of COCs was higher in ovaries from CCL− cows, and a higher proportion of grade 1 COCs were recovered from this group. A higher proportion of metaphase I oocytes at 7 h of maturation, and a higher rate of cleavage were observed in the CCL+ group; however, a higher proportion of embryos were obtained from the CCL− group. Besides, COCs from the CL+ group had a lower proportion of grades 1 and 2 morphological qualities, lower rate of metaphase II oocytes at 22 h of maturation, and lower rate of formation of two pronuclei, whereas a higher proportion of unfertilized oocytes after in vitro fertilization. On the other hand, the COCs from the CL− group displayed a lower proportion of oocytes with more than two pronuclei, higher cleavage rate, and higher final blastocyst production were obtained when compared to CL+. Thus, the effects of CL on the competence of bovine COCs are different depending on the anatomical proximity of their location in the animal, negatively affecting the quality of COCs located in the same ovary, but not having negative effects on the competence of COCs in the ovaries contralateral to their location.(AU)

Taxas de maturação de oócitos congelados lentamente de caprinos / Slowly frozen caprine oocyte maturation rate

The objective was to evaluate the maturation rates of goat oocytes submitted to slow freezing in conventional medium for IVM. For this purpose, cumulus-oocyte complexes aspirated from pubic goat ovaries were classified morphologically and slowly frozen with 1.5 M ethylene glycol. After thawing the cryopreserved oocytes, those classified as viable were matured in conventional in vitro maturation medium. Evaluating the maturation rate, the percentage of matured oocytes in the group that underwent the cryopreservation process is significantly lower (17.6%) when compared to the control group (69.2%), also showing a high percentage of immature oocytes. Several oocyte injuries were found, caused by the studied cryopreservation method, interfering with their oocyte competence. Even with nuclear maturation rates, observed through the extrusion of the first polar corpuscle, the morphologies were altered in most oocytes, and further studies using new techniques and / or other cryoprotectants are necessary.

Taxas de maturação de oócitos congelados lentamente de caprinos / Slowly frozen caprine oocyte maturation rate

The objective was to evaluate the maturation rates of goat oocytes submitted to slow freezing in conventional medium for IVM. For this purpose, cumulus-oocyte complexes aspirated from pubic goat ovaries were classified morphologically and slowly frozen with 1.5 M ethylene glycol. After thawing the cryopreserved oocytes, those classified as viable were matured in conventional in vitro maturation medium. Evaluating the maturation rate, the percentage of matured oocytes in the group that underwent the cryopreservation process is significantly lower (17.6%) when compared to the control group (69.2%), also showing a high percentage of immature oocytes. Several oocyte injuries were found, caused by the studied cryopreservation method, interfering with their oocyte competence. Even with nuclear maturation rates, observed through the extrusion of the first polar corpuscle, the morphologies were altered in most oocytes, and further studies using new techniques and / or other cryoprotectants are necessary.(AU)

Maturação in vitro de oócitos bovinos é negativamente afetada por CHIR99021, inibidor específico de GSK3 / In vitro maturation of bovine oocytes is negatively affected by CHIR99021, a specific inhibitor of GSK3

A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) atua em várias vias de sinalização pela fosforilação e desfosforilação de proteínas, participando de várias funções celulares. Poucos estudos descrevem sua participação na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos, mas sabe-se que sua inibição inespecífica tem um impacto negativo nesse processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de CHIR99021, inibidor específico da GSK3, em diferentes aspectos da MIV de complexos de cumulusoócito (CCOs) bovino e seu impacto na produção in vitro. Os CCOs foram aspirados de ovários de vacas abatidas e maturados em meio suplementado com 0; 1,5; 3,0 e 6,0 μM de CHIR99021. A análise estatística dos resultados por regressão linear (p≤0,01) mostrou que após 22 h de MIV, o tratamento causou redução dose-dependente no grau de expansão das células cumulus; na viabilidade de oócitos avaliada por coloração com calceína-AM e iodeto de propídio; nas taxas de maturação nuclear, e migração de grânulos corticais avaliadas por marcação com orceína acética a 2% e com lectina Lens culinaris-FITC (LCA), respectivamente, além de uma redução na produção de blastocistos. Assim, conclui-se que o CHIR99021 interfere negativamente, de forma dose-dependente na MIV de oócitos bovinos, sugerindo a importância da GSK3 na maturação nuclear e citoplasmática, com consequente impacto para a produção in vitro de embriões bovinos.

The enzyme glycogen synthase kinase-3 (GSK3) acts in several signaling pathway through phosphorylation and protein dephosphorylation, participating in various cellular functions. Few studies describe its participation in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes, but its nonspecific inhibition is known to have a negative impact on this process. The objective of this work was to evaluate the effect of CHIR99021, specific inhibition of GSK3, on different aspects of the in vitro maturation of bovine cumulus-oocyte (COCs) complexes. COCs were aspirated from ovaries of slaughtered cows and matured in medium supplemented with0; 1.5; 3.0 and 6.0 μM CHIR99021. Statistical analysis of the results by linear regression (p≤0.01) showed that after 22 hours of IVM the treatment caused dose-dependent reduction in the degree of cumulus cell expansion; oocyte viability evaluated by staining with calcein-AM and propidium iodide; rates of nuclear maturation and migration of cortical granules evaluated by labeling with 2% acetic orcein and Lens culinaris-FITC (LCA), respectively; and a reduction in the of blastocyst rate. It is concluded that CHIR99021 interferes negatively, in a dose-dependent manner in the IVM of bovine oocytes, suggesting the importance of GSK3 in nuclear and cytoplasmic maturation, with a consequent impact on the in vitro bovine embryos production.

Maturação in vitro de oócitos bovinos é negativamente afetada por CHIR99021, inibidor específico de GSK3 / In vitro maturation of bovine oocytes is negatively affected by CHIR99021, a specific inhibitor of GSK3

A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) atua em várias vias de sinalização pela fosforilação e desfosforilação de proteínas, participando de várias funções celulares. Poucos estudos descrevem sua participação na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos, mas sabe-se que sua inibição inespecífica tem um impacto negativo nesse processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de CHIR99021, inibidor específico da GSK3, em diferentes aspectos da MIV de complexos de cumulusoócito (CCOs) bovino e seu impacto na produção in vitro. Os CCOs foram aspirados de ovários de vacas abatidas e maturados em meio suplementado com 0; 1,5; 3,0 e 6,0 μM de CHIR99021. A análise estatística dos resultados por regressão linear (p≤0,01) mostrou que após 22 h de MIV, o tratamento causou redução dose-dependente no grau de expansão das células cumulus; na viabilidade de oócitos avaliada por coloração com calceína-AM e iodeto de propídio; nas taxas de maturação nuclear, e migração de grânulos corticais avaliadas por marcação com orceína acética a 2% e com lectina Lens culinaris-FITC (LCA), respectivamente, além de uma redução na produção de blastocistos. Assim, conclui-se que o CHIR99021 interfere negativamente, de forma dose-dependente na MIV de oócitos bovinos, sugerindo a importância da GSK3 na maturação nuclear e citoplasmática, com consequente impacto para a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

The enzyme glycogen synthase kinase-3 (GSK3) acts in several signaling pathway through phosphorylation and protein dephosphorylation, participating in various cellular functions. Few studies describe its participation in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes, but its nonspecific inhibition is known to have a negative impact on this process. The objective of this work was to evaluate the effect of CHIR99021, specific inhibition of GSK3, on different aspects of the in vitro maturation of bovine cumulus-oocyte (COCs) complexes. COCs were aspirated from ovaries of slaughtered cows and matured in medium supplemented with0; 1.5; 3.0 and 6.0 μM CHIR99021. Statistical analysis of the results by linear regression (p≤0.01) showed that after 22 hours of IVM the treatment caused dose-dependent reduction in the degree of cumulus cell expansion; oocyte viability evaluated by staining with calcein-AM and propidium iodide; rates of nuclear maturation and migration of cortical granules evaluated by labeling with 2% acetic orcein and Lens culinaris-FITC (LCA), respectively; and a reduction in the of blastocyst rate. It is concluded that CHIR99021 interferes negatively, in a dose-dependent manner in the IVM of bovine oocytes, suggesting the importance of GSK3 in nuclear and cytoplasmic maturation, with a consequent impact on the in vitro bovine embryos production.(AU)

Influência da idade na ultrassonografia renal de cães e gatos: o que se sabe / Age influence on renal ultrasonography of dogs and cats: what is known / Influencia de la edad em la ultrasonografía renal de perros y gatos: lo que se sabe

Para o correto diagnóstico clínico de doença renal, é importante que se conheça o aspecto normal do órgão e sistemas, incluindo como o amadurecimento, crescimento e envelhecimento podem influenciar os parâmetros nos exames diagnósticos. O rim é um órgão de extrema importância para a manutenção da homeostase corporal, e o comprometimento de sua função pode resultar em desequilíbrios, predispondo a morte. Deste modo torna-se primordial a detecção precoce de lesões renais, sendo o exame ultrassonográfico rotineiramente usado para sua avaliação. Nos mamíferos os rins são considerados imaturos ao nascimento, passando por um gradativo processo de amadurecimento e, com o envelhecimento o rim é submetido a um progressivo processo degenerativo. Ambos os processos resultam em alterações ultrassonográficas morfológicas, dimensionais e vasculares que não são consideradas patológicas, sendo um assunto bem estudado na medicina humana. Em humanos é relatada a presença de diferenças ultrassonográficas significativas entre os rins de neonatos, crianças, adultos e idosos. Na medicina veterinária existem poucos estudos que demonstrem a influência da idade sobre o aspecto ultrassonográfico renal, sendo a maioria destes estudos direcionados para a diferença dos valores hemodinâmicos renais entre cães jovens e adultos, mas não entre cães adultos e idosos ou entre diferentes faixas etárias de gatos. Ademais, as diferenças bidimensionais e morfométricas relacionadas à idade são ainda pouco estudadas, tanto nos cães quanto nos gatos. Embora a influência da idade sobre a ultrassonografia renal seja bem evidente em humanos, existe ainda um déficit de estudos em cães e gatos.

For a correct diagnosis of renal diseases, it is important to know the normal appearance of organs and systems, including how maturation, growth and aging can influence the parameters in diagnostic tests. The kidney is an extremely important organ for the maintenance of body homeostasis, and impairment of its function may result in imbalances, predisposing in death. Thus, early detection of renal lesions is relevant, and ultrasound examination is routinely used for renal evaluation. In mammals the kidneys are considered immature at birth, undergoing a gradual process of maturation and, with aging, the kidney undergoes a progressive degenerative process. Both processes result in morphological, dimensional and vascular ultrasound changes that are not considered pathological. This topic is well-studied in human medicine, with the presence of significant sonographic differences between the kidneys of neonates, children, adults and the elderly. In veterinary medicine there are few studies about the influence of age on the renal ultrasound, and most of these studies focuses on the difference of renal hemodynamic values between young and adult dogs, but not between adult and elderly dogs or between different age groups in cats. Moreover, age-related two-dimensional and morphometric differences are still poorly studied in both dogs and cats. Although the influence of age on renal ultrasound is quite evident in humans, there is still a lack of studies in dogs in cats.

Para el diagnóstico clínico de enfermedad renal, es importante conocer la apariencia normal de los órganos y sistemas, incluida la forma en que la maduración, el crecimiento y el envejecimiento pueden influir en los parámetros de las pruebas de diagnóstico. El riñón es un órgano extremadamente importante para el mantenimiento dela homeostasis del cuerpo, y el deterioro de su función puede provocar desequilibrios y predisponer a la muerte. Por lo tanto, la detección temprana de las lesiones renales es primordial, y el examen de ultrasonido se usa de forma rutinaria para la evaluación renal. En los mamíferos, los riñones se consideran inmaduros al nacer, passado por un proceso gradual de maduración y, con el envejecimiento, el riñón sufre un proceso degenerativo progresivo. Ambos procesos dan como resultado alteraciones morfológicas, dimensionales y vasculares del ultrasonido que no se consideran patológicas, siendo un tema bien estudiado en medicina humana. En humanos, se informa la presencia de diferencias sonográficas significativas entre los riñones de los recién nacidos, niños, adultos y ancianos. En medicina veterinaria hay pocos estudios que demuestren la influencia de la edad en el aspecto de la ecografía renal, la mayoría de estos estudios abordan la diferencia en los valores hemodinámicos renales entre perros jóvenes y adultos, pero no entre perros adultos y ancianos o entre diferentes grupos de edad gatos. Además, las diferencias bidimensionales y morfométricas relacionadas con la edad aún se estudian poco en perros y gatos. Aunque la influencia de la edad en la ecografía renal es bastante evidente en humanos, todavía faltan estudios en perros en gatos.

Influência da idade na ultrassonografia renal de cães e gatos: o que se sabe / Age influence on renal ultrasonography of dogs and cats: what is known / Influencia de la edad em la ultrasonografía renal de perros y gatos: lo que se sabe

Para o correto diagnóstico clínico de doença renal, é importante que se conheça o aspecto normal do órgão e sistemas, incluindo como o amadurecimento, crescimento e envelhecimento podem influenciar os parâmetros nos exames diagnósticos. O rim é um órgão de extrema importância para a manutenção da homeostase corporal, e o comprometimento de sua função pode resultar em desequilíbrios, predispondo a morte. Deste modo torna-se primordial a detecção precoce de lesões renais, sendo o exame ultrassonográfico rotineiramente usado para sua avaliação. Nos mamíferos os rins são considerados imaturos ao nascimento, passando por um gradativo processo de amadurecimento e, com o envelhecimento o rim é submetido a um progressivo processo degenerativo. Ambos os processos resultam em alterações ultrassonográficas morfológicas, dimensionais e vasculares que não são consideradas patológicas, sendo um assunto bem estudado na medicina humana. Em humanos é relatada a presença de diferenças ultrassonográficas significativas entre os rins de neonatos, crianças, adultos e idosos. Na medicina veterinária existem poucos estudos que demonstrem a influência da idade sobre o aspecto ultrassonográfico renal, sendo a maioria destes estudos direcionados para a diferença dos valores hemodinâmicos renais entre cães jovens e adultos, mas não entre cães adultos e idosos ou entre diferentes faixas etárias de gatos. Ademais, as diferenças bidimensionais e morfométricas relacionadas à idade são ainda pouco estudadas, tanto nos cães quanto nos gatos. Embora a influência da idade sobre a ultrassonografia renal seja bem evidente em humanos, existe ainda um déficit de estudos em cães e gatos.(AU)

For a correct diagnosis of renal diseases, it is important to know the normal appearance of organs and systems, including how maturation, growth and aging can influence the parameters in diagnostic tests. The kidney is an extremely important organ for the maintenance of body homeostasis, and impairment of its function may result in imbalances, predisposing in death. Thus, early detection of renal lesions is relevant, and ultrasound examination is routinely used for renal evaluation. In mammals the kidneys are considered immature at birth, undergoing a gradual process of maturation and, with aging, the kidney undergoes a progressive degenerative process. Both processes result in morphological, dimensional and vascular ultrasound changes that are not considered pathological. This topic is well-studied in human medicine, with the presence of significant sonographic differences between the kidneys of neonates, children, adults and the elderly. In veterinary medicine there are few studies about the influence of age on the renal ultrasound, and most of these studies focuses on the difference of renal hemodynamic values between young and adult dogs, but not between adult and elderly dogs or between different age groups in cats. Moreover, age-related two-dimensional and morphometric differences are still poorly studied in both dogs and cats. Although the influence of age on renal ultrasound is quite evident in humans, there is still a lack of studies in dogs in cats.(AU)

Para el diagnóstico clínico de enfermedad renal, es importante conocer la apariencia normal de los órganos y sistemas, incluida la forma en que la maduración, el crecimiento y el envejecimiento pueden influir en los parámetros de las pruebas de diagnóstico. El riñón es un órgano extremadamente importante para el mantenimiento dela homeostasis del cuerpo, y el deterioro de su función puede provocar desequilibrios y predisponer a la muerte. Por lo tanto, la detección temprana de las lesiones renales es primordial, y el examen de ultrasonido se usa de forma rutinaria para la evaluación renal. En los mamíferos, los riñones se consideran inmaduros al nacer, passado por un proceso gradual de maduración y, con el envejecimiento, el riñón sufre un proceso degenerativo progresivo. Ambos procesos dan como resultado alteraciones morfológicas, dimensionales y vasculares del ultrasonido que no se consideran patológicas, siendo un tema bien estudiado en medicina humana. En humanos, se informa la presencia de diferencias sonográficas significativas entre los riñones de los recién nacidos, niños, adultos y ancianos. En medicina veterinaria hay pocos estudios que demuestren la influencia de la edad en el aspecto de la ecografía renal, la mayoría de estos estudios abordan la diferencia en los valores hemodinámicos renales entre perros jóvenes y adultos, pero no entre perros adultos y ancianos o entre diferentes grupos de edad gatos. Además, las diferencias bidimensionales y morfométricas relacionadas con la edad aún se estudian poco en perros y gatos. Aunque la influencia de la edad en la ecografía renal es bastante evidente en humanos, todavía faltan estudios en perros en gatos.(AU)

Maturação in vitro de oócitos ovinos submetidos à congelação lenta / In vitro maturation of cryopreserved ovine oocytes subjected to slow freezing

A maturação in vitro de oócitos submetidos ao processo de criopreservação, ainda compreende um desafio para o sucesso da reprodução assistida na medicina veterinária. Devido a isso, estudos são desenvolvidos a fim de identificar, amenizar e superar as limitações encontradas. Nesse sentido, objetivou-se realizar a avaliação da maturação in vitro de oócitos ovinos após criopreservação pelo método de congelação lenta. Para tanto, foram colhidos 204 ovários oriundos de 102 ovelhas púberes (SPRD) pertencentes a abatedouros localizados no município de Teresina, Piauí. Os ovários foram transportados para o laboratório e, posteriormente, foram aspirados por meio de um aspirador cirúrgicoadaptado. Um total de 180 oócitos foram desnudados e, então, submetidos à congelação lenta em sistema automatizado (TK 3000®). Posteriormente foram descongelados, e submetidos à maturação in vitro(MIV). Em seguida, procedeu-se a avaliação da maturação nuclear. Os resultados foram avaliados por meio do teste de Qui-quadrado de Pearson (P ≤ 0,05). Após descongelação, 22,8% dos oócitos na avaliação em estereomicroscópio (45x) apresentavam lesões de zona pelúcida e de oolema. Dos 139 oócitos submetidos a MIV, oito maturaram (5,75%). Conclui-se que a congelação lenta de oócitos ovinos pode influenciar a maturação in vitro, devido a lesões de membrana plasmática e zona pelúcida.(AU)

The in vitro maturation of oocytes submitted to the cryopreservation process, still comprises a challenge for the success of assisted reproduction in veterinary medicine. Due to this, studies are developed in order to identify, ameliorate and overcome the limitations found. The objective of this study was to evaluate the in vitro maturation of ovine oocytes after cryopreservation by the slow freezing method. For that, 204 ovaries from 102 pubertal sheep (SPRD) belonging to slaughterhouses located in the city of Teresina, Piauí, were collected. The ovaries were transported to the laboratory and subsequently aspirated by means of an adapted surgical aspirator. A total of 180 CCO's were obtained, which were stripped and then subjected to slow freezing in an automated system (TK 3000®). Later they were thawed and submitted to in vitro maturation (IVM). Next, the nuclear maturation was evaluated. Results were evaluated using Pearson's chi-square test (P ≤ 0.05). After thawing, 22.8% of the oocytes in the stereomicroscope (45x) evaluation presented lesions of the zona pellucida and oolema. Of the 139 oocytes submitted to IVM, eight maturated (5.75%). It is concluded that slow freezing of sheep oocytesmay influence in vitro maturation due to plasma membrane and zona pellucida lesions.(AU)

Maturação in vitro de oócitos ovinos submetidos à congelação lenta / In vitro maturation of cryopreserved ovine oocytes subjected to slow freezing

A maturação in vitro de oócitos submetidos ao processo de criopreservação, ainda compreende um desafio para o sucesso da reprodução assistida na medicina veterinária. Devido a isso, estudos são desenvolvidos a fim de identificar, amenizar e superar as limitações encontradas. Nesse sentido, objetivou-se realizar a avaliação da maturação in vitro de oócitos ovinos após criopreservação pelo método de congelação lenta. Para tanto, foram colhidos 204 ovários oriundos de 102 ovelhas púberes (SPRD) pertencentes a abatedouros localizados no município de Teresina, Piauí. Os ovários foram transportados para o laboratório e, posteriormente, foram aspirados por meio de um aspirador cirúrgicoadaptado. Um total de 180 oócitos foram desnudados e, então, submetidos à congelação lenta em sistema automatizado (TK 3000®). Posteriormente foram descongelados, e submetidos à maturação in vitro(MIV). Em seguida, procedeu-se a avaliação da maturação nuclear. Os resultados foram avaliados por meio do teste de Qui-quadrado de Pearson (P ≤ 0,05). Após descongelação, 22,8% dos oócitos na avaliação em estereomicroscópio (45x) apresentavam lesões de zona pelúcida e de oolema. Dos 139 oócitos submetidos a MIV, oito maturaram (5,75%). Conclui-se que a congelação lenta de oócitos ovinos pode influenciar a maturação in vitro, devido a lesões de membrana plasmática e zona pelúcida.

The in vitro maturation of oocytes submitted to the cryopreservation process, still comprises a challenge for the success of assisted reproduction in veterinary medicine. Due to this, studies are developed in order to identify, ameliorate and overcome the limitations found. The objective of this study was to evaluate the in vitro maturation of ovine oocytes after cryopreservation by the slow freezing method. For that, 204 ovaries from 102 pubertal sheep (SPRD) belonging to slaughterhouses located in the city of Teresina, Piauí, were collected. The ovaries were transported to the laboratory and subsequently aspirated by means of an adapted surgical aspirator. A total of 180 CCO's were obtained, which were stripped and then subjected to slow freezing in an automated system (TK 3000®). Later they were thawed and submitted to in vitro maturation (IVM). Next, the nuclear maturation was evaluated. Results were evaluated using Pearson's chi-square test (P ≤ 0.05). After thawing, 22.8% of the oocytes in the stereomicroscope (45x) evaluation presented lesions of the zona pellucida and oolema. Of the 139 oocytes submitted to IVM, eight maturated (5.75%). It is concluded that slow freezing of sheep oocytesmay influence in vitro maturation due to plasma membrane and zona pellucida lesions.

Goat incubator: Can bovine oocytes be matured in the uterine horn of a goat? / Cabra incubadora: os oócitos bovinos podem ser maturados no corno uterino de uma cabra?

We used a goat as a live incubator, along with associated nonsurgical embryo transfer techniques, to perform ex situ (in vivo) maturation of bovine oocytes. Immature bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) aspirated from 3-8 mm follicles from slaughterhouse ovaries were randomly split into two groups for in vitro (IVM; n = 38) and ex situ maturation (ESM; n = 40). IVM was performed for a period of 24 h at 38.5 ºC and with 5% CO2 in the air of maximum humidity. For ESM, a presynchronized nulliparous goat (12 months old) received 40 immature COCs in the uterine horn apiece, via the transcervical route. After 24 h the structures were retrieved through uterine flushing. Analyses of nuclear maturation and lipid quantification were performed on oocytes from both groups. Fluorescent intensity was compared using the Student’s t-test. Forty-seven percent of the structures were recovered after uterine flushing (19/40). The nuclear maturation rate was 94.5% (18/19) and 81.6% (31/38) for the ESM and IVM groups, respectively. In vitro-matured COCs contained more lipid droplets, expressed as a higher amount (p < 0.05) of emitted fluorescent light than ex situ-matured COCs (858 ± 73 vs. 550 ± 64 arbitrary fluorescence units, respectively). This is the first report to associate nonsurgical embryo transfer techniques and a goat as a live incubator for the maturation of bovine oocytes. We

Utilizamos uma cabra como incubadora viva, juntamente com técnicas de transferência de embriões não cirúrgicas associadas, para realizar a maturação ex situ (in vivo) de oócitos bovinos. Os complexos cumulus-oócitos bovinos (COCs), aspirados de folículos de 3-8 mm de ovários de abatedouro foram aleatoriamente divididos em dois grupos para maturação in vitro (IVM; n = 38) e ex situ (ESM; n = 40). A MIV foi realizada por um período de 24 h no meio TCM-199, a 38,5 ºC, e com 5% de CO2 em umidade máxima. Para o ESM, uma cabra nulípara pré-sincronizada (12 meses de idade) recebeu 40 COCs imaturos no ápice do corno uterino, por via transcervical. Após 24 h as estruturas foram recuperadas através de lavagem uterina. Análises de maturação nuclear e quantificação de lipídios foram realizadas em oócitos de ambos os grupos. A intensidade de fluorescente foi comparada usando o teste t de Student. Quarenta e sete por cento das estruturas foram recuperadas após lavagem uterina (19/40). A taxa de maturação nuclear foi de 94,5% (18/19) e 81,6% (31/38) para os grupos ESM e IVM, respectivamente. Os COCs maturados in vitro continham mais gotículas lipídicas, expressos como uma quantidade maior (p < 0,05) da luz fluorescente emitida do que os COCs ex situ (858 ± 73 vs 550 ± 64 unidades de fluorescência arbitrárias, respectivamente). Este é o primeiro relató

Influência do hepes na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro / Influence of hepes on in vitro maturation of canine oocytes in different stages of the estrous cycle

Diferentemente de outras espécies domésticas, a maturação in vitro (MIV) de oócitos caninos apresenta sucesso limitado. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do HEPES na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro. Os ovários foram coletados, isolados assepticamente e transportados refrigerados a uma temperatura de 4 ºC. Os complexos cumulus-oócito (CCOs), provenientes das duas fases do ciclo estral, foram submetidos a dois tratamentos: meio TCM-199 com adição de 25 mM de HEPES (GT) e meio sem suplementação (GC). Depois de 72 horas de maturação, os CCOs foram desnudados, fixados e corados com HOESCHT 33342 para avaliação da maturação nuclear. Os oócitos obtidos da fase de anestro e diestro do GT demonstraram, em relação ao grupo GC, maior frequência de oócitos nos estágios de M-II (p<0,01). Comparando-se os diferentes status reprodutivos, observou-se que os oócitos obtidos da fase de diestro apresentaram índices maiores de QVG e M-II. Nossos resultados demonstraram que o HEPES preserva a viabilidade e morfologia oocitária, indispensáveis para a aquisição da competência meiótica, potencializando as taxas de M-II, e que os oócitos obtidos da fase de diestro estão mais aptos a completarem a maturação oocitária.

Unlike other domestic animals, in vitro maturation (IVM) of canine oocytes still has limited success. The aim of this study was to evaluate the effect of HEPES on the in vitro maturation of dog oocytes in anestrus and diestrus. Ovaries were collected, aseptically isolated and transported refrigerated at a temperature of 4ºC. Cumulus-oocyte complexe (COCs) from the two phases of estrous cycle were subjected to two treatments: medium TCM-199 with addition of 25 mM HEPES (TG) and medium without supplementation (CG). After 72 h of maturation, COCs were denuded, fixed and stained with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The oocytes obtained from the anestrus and diestrus phases of the TG showed a higher frequency of oocytes in metaphase II (M-II) (p <0.01) stage.Comparing the different reproductive status, it was observed that the oocytes obtained from the diestrus phase presented higher rates of GVBD (germinal vesicle breakdown) and M-II. Our results showed that HEPES preserves the viability and oocyte morphology essential for the acquisition of meiotic competence, increasing the M-II rates and that the oocytes obtained from the diestrus phase are better able to complete oocyte maturation.

Influência do hepes na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro / Influence of hepes on in vitro maturation of canine oocytes in different stages of the estrous cycle

Diferentemente de outras espécies domésticas, a maturação in vitro (MIV) de oócitos caninos apresenta sucesso limitado. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do HEPES na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro. Os ovários foram coletados, isolados assepticamente e transportados refrigerados a uma temperatura de 4 ºC. Os complexos cumulus-oócito (CCOs), provenientes das duas fases do ciclo estral, foram submetidos a dois tratamentos: meio TCM-199 com adição de 25 mM de HEPES (GT) e meio sem suplementação (GC). Depois de 72 horas de maturação, os CCOs foram desnudados, fixados e corados com HOESCHT 33342 para avaliação da maturação nuclear. Os oócitos obtidos da fase de anestro e diestro do GT demonstraram, em relação ao grupo GC, maior frequência de oócitos nos estágios de M-II (p<0,01). Comparando-se os diferentes status reprodutivos, observou-se que os oócitos obtidos da fase de diestro apresentaram índices maiores de QVG e M-II. Nossos resultados demonstraram que o HEPES preserva a viabilidade e morfologia oocitária, indispensáveis para a aquisição da competência meiótica, potencializando as taxas de M-II, e que os oócitos obtidos da fase de diestro estão mais aptos a completarem a maturação oocitária.(AU)

Unlike other domestic animals, in vitro maturation (IVM) of canine oocytes still has limited success. The aim of this study was to evaluate the effect of HEPES on the in vitro maturation of dog oocytes in anestrus and diestrus. Ovaries were collected, aseptically isolated and transported refrigerated at a temperature of 4ºC. Cumulus-oocyte complexe (COCs) from the two phases of estrous cycle were subjected to two treatments: medium TCM-199 with addition of 25 mM HEPES (TG) and medium without supplementation (CG). After 72 h of maturation, COCs were denuded, fixed and stained with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The oocytes obtained from the anestrus and diestrus phases of the TG showed a higher frequency of oocytes in metaphase II (M-II) (p <0.01) stage.Comparing the different reproductive status, it was observed that the oocytes obtained from the diestrus phase presented higher rates of GVBD (germinal vesicle breakdown) and M-II. Our results showed that HEPES preserves the viability and oocyte morphology essential for the acquisition of meiotic competence, increasing the M-II rates and that the oocytes obtained from the diestrus phase are better able to complete oocyte maturation.(AU)

Avaliação dos efeitos da melatonina sobre a produção de embriões bovinos obtidos por fecundação in vitro e transferência nuclear de células somáticas / Evaluation of melatonin effects on the production of bovine embryos obtained by in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer

Na reprodução assistida, o estresse oxidativo pode provocar efeitos deletérios sobre as taxas de produção de embriões. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da suplementação com o antioxidante melatonina (MEL) sobre a produção de embriões bovinos obtidos por fecundação in vitro(FIV) e transferência nuclear de células somáticas (TNCS). Os resultados mostraram que a MEL (10-7 M) no meio de maturação ou de cultivo embrionário in vitro não afetou a taxa de clivagem ou de produção de blastocistos na FIV ou na TNCS, e também não afetou a prenhez, a taxa de nascimento ou o peso dos bezerros na TNCS. O tratamento das células doadoras de núcleo com MEL (10-9M) também não levou a um aumento na produção de embriões, prenhez ou taxa de nascimento na TNCS. Assim, conclui-se que a MEL não foi capaz de aumentar a eficiência da reprodução assistida bovina, nas condições experimentais utilizadas.(AU)

n assisted reproduction, oxidative stress can cause deleterious effects on embryo production rates. The aim of the present study was to evaluate the effect of melatonin supplementation (MEL) on the production of bovine embryos obtained by in vitro fertilization (IVF) and somatic cell nuclear transfer (SCNT). The findings of this work demonstrated that melatonin enrichment (10-7 M) of the in vitro maturation (IVM) medium or in the embryo culture medium does not affect both cleavage and blastocyst rates in IVF or SCNT, and does not affect pregnancy, birth rate or weight calf in SCNT either. The treatment of nucleus donor cells with melatonin (10-9M) could not also improve embryo production, pregnancy or birth rate in SCNT. According to these work it is concluded that melatonin is not able toameliorate bovine assisted reproduction efficiency, under experimental conditions used.(AU)

Avaliação dos efeitos da melatonina sobre a produção de embriões bovinos obtidos por fecundação in vitro e transferência nuclear de células somáticas / Evaluation of melatonin effects on the production of bovine embryos obtained by in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer

Na reprodução assistida, o estresse oxidativo pode provocar efeitos deletérios sobre as taxas de produção de embriões. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da suplementação com o antioxidante melatonina (MEL) sobre a produção de embriões bovinos obtidos por fecundação in vitro(FIV) e transferência nuclear de células somáticas (TNCS). Os resultados mostraram que a MEL (10-7 M) no meio de maturação ou de cultivo embrionário in vitro não afetou a taxa de clivagem ou de produção de blastocistos na FIV ou na TNCS, e também não afetou a prenhez, a taxa de nascimento ou o peso dos bezerros na TNCS. O tratamento das células doadoras de núcleo com MEL (10-9M) também não levou a um aumento na produção de embriões, prenhez ou taxa de nascimento na TNCS. Assim, conclui-se que a MEL não foi capaz de aumentar a eficiência da reprodução assistida bovina, nas condições experimentais utilizadas.

n assisted reproduction, oxidative stress can cause deleterious effects on embryo production rates. The aim of the present study was to evaluate the effect of melatonin supplementation (MEL) on the production of bovine embryos obtained by in vitro fertilization (IVF) and somatic cell nuclear transfer (SCNT). The findings of this work demonstrated that melatonin enrichment (10-7 M) of the in vitro maturation (IVM) medium or in the embryo culture medium does not affect both cleavage and blastocyst rates in IVF or SCNT, and does not affect pregnancy, birth rate or weight calf in SCNT either. The treatment of nucleus donor cells with melatonin (10-9M) could not also improve embryo production, pregnancy or birth rate in SCNT. According to these work it is concluded that melatonin is not able toameliorate bovine assisted reproduction efficiency, under experimental conditions used.

Efeito de diferentes sistemas de maturação e cultivo sobre a produção in vitro de embriões bovinos / Effect of different maturation and growth systems on in vitro production of bovine embryos

O objetivo desse estudo foi comparar dois diferentes sistemas de incubação (incubadora convencional – CONV e minibancada – MINI) sobre a produção in vitro de embriões (PIVE) de bovinos. Para tanto, complexos cumulusoócito (CCOs) foram submetidos a maturação in vitro e posterior fecundação e cultivo in vitro em ambos os sistemas. As estruturas foram avaliadas pós-maturação e pós-cultivo, para avaliação de maturação nuclear e quantidade de células/blastocisto, respectivamente. Não foram observadas diferenças estatísticas (p>0,05) nos diferentes parâmetros estudados. Concluímos que ambos os sistemas testados demonstraram ser eficientes para PIVE de bovinos.

The objective of this study was to compare two different incubation systems (conventional incubator - CONV and minibank - MINI) on the in vitro production of bovine embryos (PIVE). For this purpose, cumulus cytotoxic complexes (CCOs) were submitted to in vitro maturation and subsequent fertilization and in vitro culture in both systems. The structures were evaluated post-maturation and post-culture, for evaluation of nuclear maturation and amount of cells / blastocyst, respectively. No statistical differences (p>0.05) were observed in the different parameters studied. We conclude that both tested systems proved to be efficient for bovine PIVE.

Efeito de diferentes sistemas de maturação e cultivo sobre a produção in vitro de embriões bovinos / Effect of different maturation and growth systems on in vitro production of bovine embryos

O objetivo desse estudo foi comparar dois diferentes sistemas de incubação (incubadora convencional CONV e minibancada MINI) sobre a produção in vitro de embriões (PIVE) de bovinos. Para tanto, complexos cumulusoócito (CCOs) foram submetidos a maturação in vitro e posterior fecundação e cultivo in vitro em ambos os sistemas. As estruturas foram avaliadas pós-maturação e pós-cultivo, para avaliação de maturação nuclear e quantidade de células/blastocisto, respectivamente. Não foram observadas diferenças estatísticas (p>0,05) nos diferentes parâmetros estudados. Concluímos que ambos os sistemas testados demonstraram ser eficientes para PIVE de bovinos.(AU)

The objective of this study was to compare two different incubation systems (conventional incubator - CONV and minibank - MINI) on the in vitro production of bovine embryos (PIVE). For this purpose, cumulus cytotoxic complexes (CCOs) were submitted to in vitro maturation and subsequent fertilization and in vitro culture in both systems. The structures were evaluated post-maturation and post-culture, for evaluation of nuclear maturation and amount of cells / blastocyst, respectively. No statistical differences (p>0.05) were observed in the different parameters studied. We conclude that both tested systems proved to be efficient for bovine PIVE.(AU)

Impairment on nuclear maturation rate in oocytes from cows naturally infected by bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) / Comprometimento na taxa de maturação nuclear em ovócitos de vacas naturalmente infectadas pelo herpesvírus bovino 1 (BoHV-1)

Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) is an important bovine pathogen that is responsible for causing respiratory diseases and reproductive failures. The presence of BoHV-1 in an in vitro embryo production system affects fertilization, maturation, and embryonic development. The objective of this study was to evaluate the developmental capacity of oocytes from naturally infected cows with no reproductive history. Moreover, this study investigated the presence of viral DNA in cumulus oophorus complexes (COCs). Experimental groups were differentiated by titrating the antibodies detected through seroneutralization assays, establishing three groups: seronegative animals (titer lower than 2), low titer (2 to 8), and animals with a titer above or equal to 16. COCs were obtained from 15 donors during 22 sessions of ultrasound-guided follicular aspiration. DNA was extracted from a pool of COCs obtained from all aspirations from the same donor as well as from whole blood and nested PCR reactions were performed. Only COCs with a compact layer of cumulus cells, an intact zona pellucida, and homogeneous cytoplasm were selected for in vitro culture and evaluation of nuclear maturation rate. After culturing for 24 hours, the oocytes were fixed and stained to evaluate the meiotic cell cycle stage. Oocytes that showed a chromosomal configuration in metaphase II were considered to have reached nuclear maturation. Compared with the other groups, the oocyte nuclear maturation rate in animals with a titer greater than or equal to 16 (50%) was compromised (P<0.05). However, the viral titer did not influence the maturation rate of bovine oocytes in animals exhibiting low titration (62.2%) when compared with the control group (76.7%). Viral DNA was not observed in the blood samples but was detected in the COC pool from three seropositive donors. In view of the results obtained, we conclude that natural infections by the BoHV-1 virus can compromise the nuclear maturation rate in cows, depending on the titration levels of antibodies against the virus. Moreover, viral DNA could be present in COCs, contradicting the hypothesis that seropositive animals with no history of clinical symptomatology pose a negligible risk of transmitting BoHV-1 by COCs.(AU)

Herpesvírus bovino 1 (BoHV-1) é um importante patógeno bovino, responsável por causar doenças respiratórias e falhas reprodutivas. A presença do BoHV-1 em sistema de produção in vitro de embriões afeta a fertilização, a maturação e o desenvolvimento embrionário. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de desenvolvimento de ovócitos oriundos de vacas infectadas naturalmente sem histórico reprodutivo. Além disso, este estudo investigou a presença do DNA viral em Complexos Cumulus Ooforus (COCs). Os tratamentos foram definidos a partir do título de anticorpos detectados pelos ensaios de soroneutralização, sendo estabelecidos três grupos: animais soronegativos (título menor do que 2), título baixo (2 a 8) e animais com título maior ou igual a 16. Os COCs foram obtidos de 15 doadoras durante 22 sessões de aspiração folicular guiada por ultrassom. A extração do DNA foi realizada em um pool de COCs de todas as aspirações de uma mesma doadora e no sangue total para a realização das reações de Nested-PCR. Para avaliação da taxa de maturação nuclear, foram selecionados para o cultivo in vitro somente os COCs com camada compacta de células do cumulus, zona pelúcida íntegra e citoplasma homogêneo. Após 24 horas de cultivo, os ovócitos foram fixados e corados em lâmina para a avaliação do estádio do ciclo celular meiótico. Os ovócitos que apresentaram configuração cromossômica em metáfase II foram considerados como tendo alcançado a maturação nuclear. Verificou-se comprometimento na taxa de maturação nuclear ovocitária (P<0.05) nos animais de título maior ou igual a 16 (50%). No entanto, não houve influência do título viral na taxa de maturação de ovócitos bovinos em animais que apresentaram titulação baixa (62,2%) quando comparados com o grupo controle (76,7%). O DNA viral não foi identificado nas amostras de sangue, mas foi detectado no pool de COCs de três doadoras soropositivas. Diante dos resultados encontrados conclui-se que vacas infectadas naturalmente pelo vírus BoHV-1 apresentam comprometimento na taxa de maturação nuclear, dependendo do grau de titulação de anticorpos contra o vírus. Ademais, o DNA viral pode estar presente em COCs contrariando a hipótese de que animais sorologicamente positivos e sem histórico de sintomatologia clínica oferecem risco negligível de transmissão do BoHV-1 por COCs.(AU)