An RT-rtPCR assay for detection of rabies virus in bovine specimens / Um ensaio RT-rtPCR para detecção de vírus da raiva em espécimes bovinos

ABSTRACT: Bovine rabies is endemic in most Brazilian States, including Rio Grande do Sul (RS), which has faced an unprecedented rabies outbreak between 2011 and 2018. We described a real-time reverse transcription quantitative PCR (RT-rtPCR) for detection of rabies virus (RABV) in bovine samples. The primers were designed targeting a highly conserved region of the nucleoprotein (N) gene of RABV obtained from cattle. The detection limit corresponded to 13 DNA copies and the intra- and inter-run repeatability was adequate (CV<9%) in all dilutions tested. Amplification of other pathogens associated with neurological disease in cattle or cross-contamination was not observed. Brain samples from cattle suspicious of rabies (n=21) were tested in triplicate by the RT-rtPCR and by the gold-standard direct fluorescent antibody test (DFAT), resulting in 100% of sensitivity and specificity of the RT-rtPCR. Testing of additional 41 bovine brain samples submitted to the routine DFAT testing yielded 37 (90.2%) concordant results (30 positive/7 negative) and 4 (9.7%) inconclusive in DFAT and RT-rtPCR positive. These results showed a good concordance between the tests and a higher sensitivity of the RT-rtPCR. This assay represents an alternative for RABV detection, either as a confirmatory test or for large-scale diagnosis in endemic regions.

RESUMO: A raiva bovina é endêmica na maioria dos estados brasileiros, inclusive no Rio Grande do Sul (RS), que enfrentou um surto de raiva sem precedentes entre 2011 e 2018. Descrevemos um PCR quantitativo de transcrição reversa em tempo real (RT-rtPCR) para detecção do vírus da raiva (RABV) em bovinos. Os primers foram desenhados visando uma região altamente conservada do gene da nucleoproteína (N) de RABV obtido de bovinos. O limite de detecção correspondeu a 13 cópias de DNA e a repetibilidade intra e inter-ensaios foi adequada (CV <9%) em todas as diluições testadas. Não foi observada amplificação de outros patógenos associados a doenças neurológicas em bovinos ou contaminação cruzada. Amostras de cérebro de bovinos com suspeita de raiva (n = 21) foram testadas em triplicata no RT-rtPCR e pelo teste de anticorpo fluorescente padrão ouro (DFAT), resultando em 100% de sensibilidade e especificidade do RT-rtPCR. O teste de 41 amostras de cérebro bovino adicionais submetidas ao teste de DFAT de rotina rendeu 37 (90,2%) resultados concordantes (30 positivos / sete negativos) e quatro (9,7%) inconclusivos em DFAT e RT-rtPCR positivo. Esses resultados mostraram boa concordância entre os testes e maior sensibilidade do RT-rtPCR. Este ensaio representa uma alternativa para a detecção do vírus da raiva, seja como teste confirmatório ou para diagnóstico em larga escala em regiões endêmicas.

An RT-rtPCR assay for detection of rabies virus in bovine specimens / Um ensaio RT-rtPCR para detecção de vírus da raiva em espécimes bovinos

Bovine rabies is endemic in most Brazilian States, including Rio Grande do Sul (RS), which has faced an unprecedented rabies outbreak between 2011 and 2018. We described a real-time reverse transcription quantitative PCR (RT-rtPCR) for detection of rabies virus (RABV) in bovine samples. The primers were designed targeting a highly conserved region of the nucleoprotein (N) gene of RABV obtained from cattle. The detection limit corresponded to 13 DNA copies and the intra- and inter-run repeatability was adequate (CV<9%) in all dilutions tested. Amplification of other pathogens associated with neurological disease in cattle or cross-contamination was not observed. Brain samples from cattle suspicious of rabies (n=21) were tested in triplicate by the RT-rtPCR and by the gold-standard direct fluorescent antibody test (DFAT), resulting in 100% of sensitivity and specificity of the RT-rtPCR. Testing of additional 41 bovine brain samples submitted to the routine DFAT testing yielded 37 (90.2%) concordant results (30 positive/7 negative) and 4 (9.7%) inconclusive in DFAT and RT-rtPCR positive. These results showed a good concordance between the tests and a higher sensitivity of the RT-rtPCR. This assay represents an alternative for RABV detection, either as a confirmatory test or for large-scale diagnosis in endemic regions.

A raiva bovina é endêmica na maioria dos estados brasileiros, inclusive no Rio Grande do Sul (RS), que enfrentou um surto de raiva sem precedentes entre 2011 e 2018. Descrevemos um PCR quantitativo de transcrição reversa em tempo real (RT-rtPCR) para detecção do vírus da raiva (RABV) em bovinos. Os primers foram desenhados visando uma região altamente conservada do gene da nucleoproteína (N) de RABV obtido de bovinos. O limite de detecção correspondeu a 13 cópias de DNA e a repetibilidade intra e inter-ensaios foi adequada (CV <9%) em todas as diluições testadas. Não foi observada amplificação de outros patógenos associados a doenças neurológicas em bovinos ou contaminação cruzada. Amostras de cérebro de bovinos com suspeita de raiva (n = 21) foram testadas em triplicata no RT-rtPCR e pelo teste de anticorpo fluorescente padrão ouro (DFAT), resultando em 100% de sensibilidade e especificidade do RT-rtPCR. O teste de 41 amostras de cérebro bovino adicionais submetidas ao teste de DFAT de rotina rendeu 37 (90,2%) resultados concordantes (30 positivos / sete negativos) e quatro (9,7%) inconclusivos em DFAT e RT-rtPCR positivo. Esses resultados mostraram boa concordância entre os testes e maior sensibilidade do RT-rtPCR. Este ensaio representa uma alternativa para a detecção do vírus da raiva, seja como teste confirmatório ou para diagnóstico em larga escala em regiões endêmicas.

Construction and characterization of a recombinant vaccine encoding the nucleocapsid protein gene of avian infectious bronchitis virus / Construção e caracterização de uma vacina recombinante codificando o gene da proteina do nucleocapsideo do virus da bronquite infecciosa das galinhas

A vacinação é a forma mais utilizada para prevenir a bronquite infecciosa causada pelo vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV). Contudo, as vacinas convencionais são incapazes de diferenciar aves infectadas de vacinadas. No presente trabalho foi construído, caracterizado, e avaliado como candidato vacinal, um adenovírus recombinante expressando o gene N do IBV. O gene N foi clonado em um adenovírus humano tipo 5 defectivo e transfectado para as células HEK-293A para gerar rAd5_N. Após o vetor ser obtido como esperado e a confirmação da expressão da proteína N em HEK-293ª, foi realizada inoculação pela via oculo-nasal na dose de 10 7 TCID 50 /0,1mL para imunização de galinhas livres de patógenos específicos (SPF). A resposta imunológica do Ad5_N e a proteção contra o desafio ao IBV foram avaliadas e comparadas com uma vacina viva comercial. Não foram detectados anticorpos anti-IBV em aves vacinadas com o Ad5_N. A vacina comercial induziu anticorpos detectáveis a partir do 7º dia pós-vacinal. Em aves vacinadas com o Ad5_N não houve aumento na expressão de IFNγ. Neste estudo, o rAd5_N obtido não conferiu proteção contra desafio com IBV-M41. Os resultados indicam a necessidade de avaliar adenovírus recombinantes expressando outros genes do IBV.(AU)

Construction and characterization of a recombinant vaccine encoding the nucleocapsid protein gene of avian infectious bronchitis virus / Construção e caracterização de uma vacina recombinante codificando o gene da proteina do nucleocapsideo do virus da bronquite infecciosa das galinhas

A vacinação é a forma mais utilizada para prevenir a bronquite infecciosa causada pelo vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV). Contudo, as vacinas convencionais são incapazes de diferenciar aves infectadas de vacinadas. No presente trabalho foi construído, caracterizado, e avaliado como candidato vacinal, um adenovírus recombinante expressando o gene N do IBV. O gene N foi clonado em um adenovírus humano tipo 5 defectivo e transfectado para as células HEK-293A para gerar rAd5_N. Após o vetor ser obtido como esperado e a confirmação da expressão da proteína N em HEK-293ª, foi realizada inoculação pela via oculo-nasal na dose de 10 7 TCID 50 /0,1mL para imunização de galinhas livres de patógenos específicos (SPF). A resposta imunológica do Ad5_N e a proteção contra o desafio ao IBV foram avaliadas e comparadas com uma vacina viva comercial. Não foram detectados anticorpos anti-IBV em aves vacinadas com o Ad5_N. A vacina comercial induziu anticorpos detectáveis a partir do 7º dia pós-vacinal. Em aves vacinadas com o Ad5_N não houve aumento na expressão de IFNγ. Neste estudo, o rAd5_N obtido não conferiu proteção contra desafio com IBV-M41. Os resultados indicam a necessidade de avaliar adenovírus recombinantes expressando outros genes do IBV.(AU)

Serological diagnosis of influenza A subtype H1 on family poultry of Belo Horizonte, Minas Gerais and Santa Maria, Rio Grande Do Sul, in Brazil

Serum samples (n=687) from Gallus gallus domesticus were collected for the investigation of antibodies to avian influenza virus (AIV-A) in the family poultry of the surrounding counties of Santa Maria/RS and the metropolitan region of Belo Horizonte/MG, totaling twenty different counties. Additional samples of seventeen (n=17) free-flying ducks (C. moschata pure or hybrid with Anas platyrhynchos) were collected in Belo Horizonte. The chosen tests for the survey were performed as described by the World Organization for Animal Health (OIE), including agar gel immunodiffusion (AGID) for antibodies to AIV-A nucleoprotein (N) and haemagglutination- inhibition (HI) for antibodies to subtype H1. Out of the 704 serum tests performed by AGID, eight (8/704) were revealed positive for antibodies to AIV-A N protein, with six (6/704) retested positive for subtype H1. Two sera tested positive by AGID were shown to be non reactive to the H1 subtype, suggesting specificity to another subtype. A low occurrence of antibodies to influenza A (1.13%) was found, and mostly (75%) specific to subtype H1. This represents an approximately 0,85% overall occurrence for subtype H1 antibodies, with an unknown subtype specific antibodies detected in one free-flying anatid. The low occurrence of antibodies in the family poultry may suggest a low AIV-A activity during the period of study, information which remains to be confirmed by virus detection.(AU)

Serological diagnosis of influenza A subtype H1 on family poultry of Belo Horizonte, Minas Gerais and Santa Maria, Rio Grande Do Sul, in Brazil

Serum samples (n=687) from Gallus gallus domesticus were collected for the investigation of antibodies to avian influenza virus (AIV-A) in the family poultry of the surrounding counties of Santa Maria/RS and the metropolitan region of Belo Horizonte/MG, totaling twenty different counties. Additional samples of seventeen (n=17) free-flying ducks (C. moschata pure or hybrid with Anas platyrhynchos) were collected in Belo Horizonte. The chosen tests for the survey were performed as described by the World Organization for Animal Health (OIE), including agar gel immunodiffusion (AGID) for antibodies to AIV-A nucleoprotein (N) and haemagglutination- inhibition (HI) for antibodies to subtype H1. Out of the 704 serum tests performed by AGID, eight (8/704) were revealed positive for antibodies to AIV-A N protein, with six (6/704) retested positive for subtype H1. Two sera tested positive by AGID were shown to be non reactive to the H1 subtype, suggesting specificity to another subtype. A low occurrence of antibodies to influenza A (1.13%) was found, and mostly (75%) specific to subtype H1. This represents an approximately 0,85% overall occurrence for subtype H1 antibodies, with an unknown subtype specific antibodies detected in one free-flying anatid. The low occurrence of antibodies in the family poultry may suggest a low AIV-A activity during the period of study, information which remains to be confirmed by virus detection.

Infecção pelo vírus influenza A em suínos no sul de Moçambique / Influenza A virus infection in pigs in southern Mozambique

A influenza suína (IS) é uma doença aguda e altamente contagiosa do trato respiratório de suínos, causada pelo vírus influenza A (VIA). A doença provoca perdas econômicas na suinocultura e também, tem importância na saúde pública devido ao seu potencial zoonótico. O objetivo deste trabalho foi relatar a infecção pelo VIA em suínos de Moçambique e realizar a caracterização anatomopatológica e imuno-histoquímica (IHQ) das lesões pulmonares associadas. Pulmões de 457 suínos abatidos foram avaliados e coletados 38 (8,3%) pulmões de suínos com áreas de consolidação pulmonar em um abatedouro na cidade da Matola, no Sul de Moçambique. As áreas de consolidação em cada lobo pulmonar foram classificadas em 4 graus de acordo com a extensão da lesão. Amostras de pulmões com consolidação foram submetidas ao exame histopatológico e IHQ para a detecção de antígenos do VIA, Circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e Mycoplasma hyopneumoniae. Os pulmões coletados apresentaram áreas multifocais ou coalescentes de consolidação pulmonar, frequentemente, observadas nos lobos craniais, mediais e acessório. Estas lesões acometiam principalmente um ou três lobos pulmonares e as lesões de grau 1 e 2 foram as mais frequentes. As principais lesões histopatológicas observadas foram bronquiolite necrotizante (23/38), infiltrado de neutrófilos nos alvéolos (24/38), hiperplasia de pneumócitos tipo II (26/38), hiperplasia de tecido linfoide peribronquiolar (28/38), e pneumonia intersticial mononuclear (29/38). No exame de IHQ, antígenos do VIA foram detectados em 84.3% (32/38) dos pulmões com pneumonia, e a nucleoproteína do vírus foi visualizada, no núcleo de células epiteliais de brônquios e bronquíolos e em macrófagos alveolares. Suínos positivos para o VIA na IHQ eram provenientes do distrito de Matutuine (5/32), distrito da Moamba (2/32), distrito de Namaacha (21/32), distrito de Boane (3/32) e Cidade da Matola (1/32). Todas as amostras foram negativas para PCV2 e Mycoplasma hyopneumoniae pelo exame de IHQ. Os resultados demonstram que o VIA está presente e é causa de pneumonia em suínos em Moçambique.(AU)

Swine influenza (SI) is an acute and highly contagious disease of the respiratory tract of pigs caused by influenza A virus (IAV). The disease causes economic losses in swine production and is of great public importance for its zoonotic potential. The aim of the present study was to report IAV infection in pigs from Mozambique and characterize the anatomopathological and immunohistochemical features of associated lung lesions. Lungs from 457 slaughtered pigs were subjected to gross evaluation and 38 (8.3%) lungs with cranioventral consolidation were collected from a slaughterhouse in Matola City, southern Mozambique. Areas of consolidation in each lung lobe were classified in 4 grades according to the lesion extension. Samples with consolidated lung tissue were examined for histopathology and immunohistochemistry (IHC) for the presence of IAV, Porcine circovirus type 2 (PCV2) and Mycoplasma hyopneumoniae antigens. The lungs had multifocal to coalescing areas of consolidation observed most frequently in the cranial, middle, and accessory lobes. The lesions involved mainly one or three pulmonary lobes and grade 1 and 2 lesions were the most frequent. The main histopathological findings were necrotizing bronchiolitis (23/38), alveolar neutrophil infiltration (24/38), type II pneumocytes hyperplasia (26/38), peribronchiolar lymphoid tissue hyperplasia (28/38) and interstitial mononuclear cells infiltrate (29/38). Immunohistochemistry revealed positive staining in 84.3% (32/38) of the samples and IAV nucleoprotein was present in the nucleus of bronchial and bronchiolar epithelial cells and alveolar macrophages. Positive IHC pigs were from Matutuine district (5/32), Moamba district (2/32), Namaacha district (21/32), Boane district (3/32) and Matola city (1/32). All lung samples were immunohistochemically negative for PCV2 and Mycoplasma hyopneumoniae. These results demonstrate that IAV is a cause of pneumonia in pigs in Mozambique.(AU)

Infecção pelo vírus influenza A em suínos no sul de Moçambique / Influenza A virus infection in pigs in southern Mozambique

A influenza suína (IS) é uma doença aguda e altamente contagiosa do trato respiratório de suínos, causada pelo vírus influenza A (VIA). A doença provoca perdas econômicas na suinocultura e também, tem importância na saúde pública devido ao seu potencial zoonótico. O objetivo deste trabalho foi relatar a infecção pelo VIA em suínos de Moçambique e realizar a caracterização anatomopatológica e imuno-histoquímica (IHQ) das lesões pulmonares associadas. Pulmões de 457 suínos abatidos foram avaliados e coletados 38 (8,3%) pulmões de suínos com áreas de consolidação pulmonar em um abatedouro na cidade da Matola, no Sul de Moçambique. As áreas de consolidação em cada lobo pulmonar foram classificadas em 4 graus de acordo com a extensão da lesão. Amostras de pulmões com consolidação foram submetidas ao exame histopatológico e IHQ para a detecção de antígenos do VIA, Circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e Mycoplasma hyopneumoniae. Os pulmões coletados apresentaram áreas multifocais ou coalescentes de consolidação pulmonar, frequentemente, observadas nos lobos craniais, mediais e acessório. Estas lesões acometiam principalmente um ou três lobos pulmonares e as lesões de grau 1 e 2 foram as mais frequentes. As principais lesões histopatológicas observadas foram bronquiolite necrotizante (23/38), infiltrado de neutrófilos nos alvéolos (24/38), hiperplasia de pneumócitos tipo II (26/38), hiperplasia de tecido linfoide peribronquiolar (28/38), e pneumonia intersticial mononuclear (29/38). No exame de IHQ, antígenos do VIA foram detectados em 84.3% (32/38) dos pulmões com pneumonia, e a nucleoproteína do vírus foi visualizada, no núcleo de células epiteliais de brônquios e bronquíolos e em macrófagos alveolares. Suínos positivos para o VIA na IHQ eram provenientes do distrito de Matutuine (5/32), distrito da Moamba (2/32), distrito de Namaacha (21/32), distrito de Boane (3/32) e Cidade da Matola (1/32). Todas as amostras foram negativas para PCV2 e Mycoplasma hyopneumoniae pelo exame de IHQ. Os resultados demonstram que o VIA está presente e é causa de pneumonia em suínos em Moçambique.(AU)

Swine influenza (SI) is an acute and highly contagious disease of the respiratory tract of pigs caused by influenza A virus (IAV). The disease causes economic losses in swine production and is of great public importance for its zoonotic potential. The aim of the present study was to report IAV infection in pigs from Mozambique and characterize the anatomopathological and immunohistochemical features of associated lung lesions. Lungs from 457 slaughtered pigs were subjected to gross evaluation and 38 (8.3%) lungs with cranioventral consolidation were collected from a slaughterhouse in Matola City, southern Mozambique. Areas of consolidation in each lung lobe were classified in 4 grades according to the lesion extension. Samples with consolidated lung tissue were examined for histopathology and immunohistochemistry (IHC) for the presence of IAV, Porcine circovirus type 2 (PCV2) and Mycoplasma hyopneumoniae antigens. The lungs had multifocal to coalescing areas of consolidation observed most frequently in the cranial, middle, and accessory lobes. The lesions involved mainly one or three pulmonary lobes and grade 1 and 2 lesions were the most frequent. The main histopathological findings were necrotizing bronchiolitis (23/38), alveolar neutrophil infiltration (24/38), type II pneumocytes hyperplasia (26/38), peribronchiolar lymphoid tissue hyperplasia (28/38) and interstitial mononuclear cells infiltrate (29/38). Immunohistochemistry revealed positive staining in 84.3% (32/38) of the samples and IAV nucleoprotein was present in the nucleus of bronchial and bronchiolar epithelial cells and alveolar macrophages. Positive IHC pigs were from Matutuine district (5/32), Moamba district (2/32), Namaacha district (21/32), Boane district (3/32) and Matola city (1/32). All lung samples were immunohistochemically negative for PCV2 and Mycoplasma hyopneumoniae. These results demonstrate that IAV is a cause of pneumonia in pigs in Mozambique.(AU)

Monitoramento Do Vírus Da Raiva Em Diferentes Espécies De Morcegos Em Maringá, Sul Do Brasil / Rabies Virus Monitoring In Different Species Of Bats In Maringá, Southern Brazil / Vigilancia De Virus De La Rabia En Especies Diferentes De Murciélagos En Maringá, Sur De Brasil

A raiva é uma enfermidade infectocontagiosa de caráter zoonótico, causada pelo vírus da raiva (RABV). Os quirópteros juntamente com os canídeos são os principais reservatórios do RABV, sendo responsáveis respectivamente pela manutenção dos ciclos aéreo e terrestre da doença. O presente trabalho teve por objetivo identificar interações entre o vírus e o reservatório no ciclo aéreo da raiva. Para isto, a presença do RABV foi investigada em amostras de saliva de morcegos de diferentes espécies. Foram realizadas trinta e seis capturas de morcegos, na Região de Maringá, Paraná, sul do Brasil, no período de abril a dezembro de 2013. Os morcegos foram capturados com auxílio de redes de nylon e acondicionados em sacos de algodão. Foram registrados os dados biométricos e coletada uma amostra de swab oral de cada exemplar. Para a identificação do RABV, foi realizada a técnica de Semi-Nested RT-PCR (“Reverse transcription polymerase chain reaction”) tendo como alvo o gene N que codifica a nucleoproteína do vírus. A análise de dados foi realizada por estatística descritiva. Ao longo do estudo, foram capturados 444 morcegos, pertencentes a quatro famílias e quinze espécies. O RABV não foi identificado em nenhuma das amostras analisadas. Estes resultados demonstram a ausência de excreção do RABV pela saliva de morcegos saudáveis na região alvo do estudo e salientam para a necessidade de mais estudos sobre a manutenção da raiva nas diferentes espécies de morcegos.(AU)

Rabies is an zoonotic infectious disease, caused by rabies virus (RABV). The bats with canids are the main RABV reservoirs, accounting respectively for maintaining the air cycles and terrestrial of the disease. This study aimed to identify interactions between the virus and the reservoir in air rabies cycle. For this, the presence of RABV was investigated in bat saliva samples from different species. Thirty-six capture bats were held in Maringá Region Parana, southern Brazil, from April to December 2013. The bats were captured with the help of nylon nets and placed in cotton bags. Were registered biometric data and collected a sample of oral swab of each especimen. For the identification of RABV, the semi-nested RT-PCR technique ("Reverse transcription polymerase chain reaction") targeting the N gene encodes the nucleoprotein of the virus was performed. Data analysis was performed using descriptive statistics. Throughout the study, were captured 444 bats belonging to four families and fifteen species. The RABV was not identified in the evaluated samples. These results demonstrate the absence of excretion of RABV in the saliva of healthy bats in the studied area and reinforce the need for more studies about the maintenance of rabies in different species of bats.(AU)

La rabia es una enfermedad infecciosa de zoonótica causada por el virus de la rabia (RABV). Los murciélagos con los cánidos son los principales reservorios RABV, que representan, respectivamente, para el mantenimiento de los ciclos de aire y terrestre de la enfermedad. Este estudio tuvo como objetivo identificar las interacciones entre el virus y el reservatório en el ciclo aéreo de la rabia. Para ello, la presencia de RABV se investigó en muestras de saliva de murciélago de diferentes especies. treinta y seis colecciones de murciélagos de hisopos orales se llevaron a cabo en Maringá Región Paraná, sur de Brasil, de abril a diciembre de 2013. Los murciélagos fueron capturadas con la ayuda de redes de nylon y se colocaron en bolsas de algodón eran registrado los datos biométricos y se recogió una muestra de hisopo bucal de cada individuo. Para la identificación de RABV, la técnica de semi-anidada RT-PCR ( "reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa") en el gen N se realizó codifica la nucleoproteína del virus. El análisis de datos se realizó mediante estadística descriptiva. Durante todo el estudio, 444 murciélagos fueron capturados pertenecientes a cuatro familias y quince especies. El RABV no fue identificado en ninguna de las muestras. Estos resultados demuestran la ausencia de RABV en excreción de la saliva de los murciélagos sanos en el estudio de la región de destino y subrayan la necesidad de más estudios sobre la ira de mantenimiento en diferentes especies de murciélagos.(AU)

Avaliação do ensaio RT-qPCR LN34 Pan-Lyssavirus para a detecção do vírus da raiva no Brasil

A raiva, causada pelo rabies virus (RABV), caracteriza-se por ser uma encefalomielite viral aguda. O RABV pertence ao gênero Lyssavirus, que contempla outros 17 vírus. Como a raiva é uma doença que apresenta letalidade próxima a 100%, as técnicas de diagnóstico devem se mostrar precisas e fidedignas, para que possa ser realizado o controle da doença. A prova padrão ouro para o diagnóstico é a imunofluorescência direta (IFD), uma vez que apresenta alta sensibilidade e especificidade. Porém, problemas como o estado avançado de autólise das amostras, baixa carga viral, qualidade inapropriada dos insumos e até mesmo a inexperiência de profissionais para a leitura das lâminas, podem diminuir a acurácia dos resultados. O ensaio LN34 Pan-Lyssavirus para RT-PCR em tempo real (RT-qPCR), que combina primers degenerados e múltiplos com sonda de hidrólise do tipo Locked Nucleic Acid (LNA), é um candidato para ser prova confirmatória da IFD, devido a sua facilidade de manuseio e capacidade de detectar as diferentes espécies de vírus dentro do gênero Lyssavirus, e por apresentar alta especificidade e sensibilidade. Esse ensaio detecta e amplifica porção leader 3 do genoma e a região inicial do gene codificador da nucleoproteína, considerada a mais conservada entre os Lyssavirus. Esse estudo visa a padronização e implementação do ensaio LN34 Pan-Lyssavirus de RT-qPCR para detecção das diferentes linhagens genéticas e variantes antigênicas do RABV descritas no Brasil. Para isso, foram coletadas 324 amostras positivas e compatíveis com as diferentes variantes antigênicas e linhagens genéticas do RABV presentes no Brasil, e testadas na RT-qPCR utilizando o ensaio LN34 Pan-Lyssavirus. A RT-qPCR two-steps com ensaio LN34 Pan-Lyssavirus apresentou uma positividade de 87,3%, e 41 amostras obtiveram resultado falso negativo. Estas amostras, que tiveram resultado falso-negativo na RT-qPCR two-steps, foram testadas na técnica de RT-qPCR one-step com ensaio LN34 Pan-Lyssavirus, e todas tiveram o resultado verdadeiro positivo confirmado. Diante desses resultados, é possível inferir que a utilização do ensaio LN34 com a RT-qPCR em duas etapas apresenta dificuldade de detecção das diferentes linhagens genéticas e variantes antigênicas do RABV, possivelmente devido ao não anelamento do primer senso durante a transcrição reversa. Por outro lado, a RT-qPCR em uma etapa com o ensaio LN34 Pan-Lyssavirus foi capaz de detectar e amplificar aquelas amostras falso negativas pela reação em duas etapas, se mostrando um teste altamente sensível, e com potencial para ser utilizado como prova confirmatória à IFD para o diagnóstico da raiva no Brasil.

Rabies, caused by rabies virus (RABV), is characterized by viral acute progressive encephalitis. The RABV belongs to Lyssavirus genus, that includes seventeen others virus. Due to the high lethality, almost 100%, diagnosis techniques for rabies must be accurate and reliable for the accomplishment of diseases control. The gold standard for rabies diagnostic is the direct fluorescent antibody test (dFAT), due to its high sensibility and specificity. Although, sample conservation, low viral title, poor quality inputs, and skilled technicians may hamper results accurate. The RT-qPCR LN34 Pan-Lyssavirus assay is a combination of degenerated and multiple primers with Locked Nucleic Acid (LNA) probe that can be used as secondary test for dFAT, due to its ease manipulation and capacity for detecting the different virus species within the Lyssavirus genus, and due its high sensitivity and specificity. This assay detects and amplifies the leader region 3 and the initial portion of nucleoprotein gene that is considered the most conserved gene within the Lyssavirus. This study aims the LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay standardization and implementation for detecting the different RABV genetic lineages and antigenic variants described in Brazil. Therefore, 324 positive samples compatible with different RABV genetic lineages or antigenic variants were collected and tested in RT-qPCR, using LN34 Pan-Lyssavirus assay. The two steps LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay, showed positivity of 87,3%, and 41 samples obtained false negative result. Those false negative samples in the two steps LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay were tested in the one step LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay, and 100% of those samples confirmed the true positive result. Based in these results, is possible to infer that the two steps RT-qPCR assay may hamper the detection of different RABV genetic lineages and antigenic variants, probably due to mismatches between sense primer and the target region during the revere transcription technique. On the other hand, the one step RT-qPCR LN34 Pan-Lyssavirus assay were able to detect and amplify those false negative samples in two steps RT-qPCR, showing to be a highly sensitivity test, and showing potential to be used as confirmatory test to dFAT for rabies diagnosis.

Detection of respiratory viruses in shelter dogs maintained under varying environmental conditions

Three dog shelters in Rio Grande do Sul were investigated for associations between the occurrence of respiratory viruses and shelter environmental conditions. Nasal secretions randomly collected during the cold season were tested via PCR, and this data collection was followed by nucleotide sequencing of the amplicons. In shelter /1 (poor sanitary and nutritional conditions, high animal density and constant contact between dogs), 78% (58/74) of the nasal samples were positive, 35% (26/74) of which were in single infections and 44% (32/74) of which were in coinfections. Shelters /2 and /3 had satisfactory sanitary and nutritional conditions, outdoors exercise areas (/2) and animal clustering by groups (/3). In shelter /2, 9% (3/35) of the samples were positive for Canine parainfluenza virus (CPIV), and 6% (2/35) were positive for Canid herpesvirus 1 (CaHV-1). In shelter /3, 9% (7/77) of the samples were positive for Canine adenovirus type 2 (CAdV-2), and 1% (1/77) were positive for Canine distemper virus (CDV). The amplicon sequences (CPIV and CDV nucleoprotein gene; CAdV-2 E3 gene; CaHV-1 glycoprotein B gene) showed 94-100% nucleotide identity with GenBank sequences. Our results demonstrate that CPIV, CAdV-2 and CDV are common in dog shelters and that their frequencies appear to be related with environmental and nutritional conditions. These results indicate the need for control/prevention measures, including vaccination and environmental management, to minimize these infections and improve dog health.(AU)

AVALIAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DO ESTRESSE OXIDATIVO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL DE CÃES POSITIVOS PARA CINOMOSE

A cinomose canina é uma doença causada pelo Canine morbillivirus (CM), um patógeno pantrópico que pode afetar o Sistema Nervoso Central (SNC), causando desmielinização. No entanto, a patogênese dessa lesão ainda precisa ser esclarecida. Amostras do SNC de 14 cães naturalmente infectados por CM foram analisadas para avaliar a correlação entre estresse oxidativo e desmielinização. Fragmentos de SNC desses cães foram submetidos à RT-PCR para detecção parcial do gene que codifica a nucleoproteína de CM; imunohistoquímica anti-CM para localizar as proteínas virais no tecido e imunohistoquímica anti-4-hidroxinonenal (4-HNE) como marcador de produto da peroxidação lipídica. A presença de peroxidação lipídica foi comparada com a presença de desmielinização em cortes histológicos corados com HE. Foi possível a detecção de material gênico de CM em todas as amostras. Por meio dos resultados, observou-se que a área desmielinizada foi positiva para a presença de proteínas virais e células imunomarcadas para 4-HNE. Após a análise dos resultados, conclui-se que a presença do vírus gera estresse oxidativo que leva a peroxidação lipídica, causando danos aos tecidos e resulta em desmielinização. Logo, o estresse oxidativo desempenha um papel importante na patogênese da cinomose canina.

Canine Distemper is a disease caused by Canine morbillivirus (CM), a pantropic pathogen that can affect the Central Nervous System (CNS) causing demyelination. However, the pathogenesis of this lesion remains to be clarified. CNS fragments were submitted to RT-PCR for partial detection of the gene that encodes the CM nucleoprotein; anti-CM immunohistochemistry to locate viral proteins in the tissue and anti-4-hydroxynonenal immunohistochemistry (4-HNE) as a marker of lipid peroxidation product. Through the results, it was observed that the demyelinated area was positive for the presence of viral proteins and cells immunostained for 4-HNE. The results showed the presence of virus proteins in the demyelinated area with the presence of 4-HNE. Considering these results, we strongly believe that the virus presence causes oxidative stress leading to lipid peroxidation, which causes tissue damage and results in demyelination. In conclusion, oxidative stress plays an important role in canine distemper pathogenesis.

ANÁLISE FILOGENÉTICA DE AMOSTRAS DE VÍRUS DA RAIVA DE HERBÍVOROS NO RIO GRANDE DO SUL (2012-2017) E VALIDAÇÃO DE UM TESTE DE RT-PCR EM TEMPO REAL PARA DIAGNÓSTICO

O vírus da raiva (Rabies lyssavirus, RABV) é o agente da raiva, uma doença zoonótica de distribuição mundial, caracterizada por sinais neurológicos graves, de curso geralmente fatal, que afeta mamíferos domésticos e selvagens. O RABV pertence à ordem Mononegavirales, família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus. O genoma do RABV consiste de uma molécula de RNA de fita simples de sentido negativo, com aproximadamente 12 quilobases (kb) e contém 5 genes, entre eles o gene da nucleoproteína (N) que é altamente conservado e tem sido amplamente utilizado como alvo de estudos filogenéticos, assim como no desenvolvimento de testes de diagnóstico. No primeiro estudo que compõe esta Tese, descreve-se uma análise filogenética de 145 amostras de RABV oriundas de herbívoros no Rio Grande do Sul (RS), entre 2012 e 2017, baseada na análise da sequência parcial do gene da proteína N. Estas sequências exibiram uma alta identidade de nucleotídeos (nt) e similaridade de aminoácidos (aa) entre si, bem como com sequências de RABV identificadas em bovinos e de morcegos hematófagos. Os vírus segregaram em dois clusters distintos. O cluster 1 agrupou sequências de RABV abrangendo todo o período estudado, enquanto o cluster 2 agrupou um número menor de vírus detectados em 2013, 2014, 2015 e 2017. Em alguns casos, vírus obtidos de uma mesma região em um curto período de tempo agruparam em clusters ou sub-clusters distintos, indicando a co-circulação de vírus de diferentes linhagens. A separação em sub-clusters também foi observada em sequências virais obtidas de uma mesma região em diferentes momentos, indicando o envolvimento de mais de um vírus. O segundo estudo reporta o desenvolvimento e validação de um ensaio em tempo real, baseado em transcrição reversa seguida de reação da polimerase em cadeia (RT-PCR em tempo real; RT-qPCR) para o diagnóstico da raiva em bovinos. Os primers foram desenhados visando a região altamente conservada do gene da proteína N a partir de sequências de RABV de bovinos do RS obtidas do GenBank. O limite de detecção correspondeu a 12,99 cópias de DNA e a repetibilidade intra- e inter-ensaio foi adequada. Não foram detectadas amplificações inespecíficas com outros patógenos de síndromes neurológicas semelhantes à raiva em bovinos no RS, nem contaminação cruzada. Amostras de cérebro bovino de 21 casos suspeitos de raiva foram testadas com o novo ensaio e com o teste padrão-ouro de imunofluorescência direta (FA). A sensibilidade e a especificidade da RT-qPCR foram determinadas. A sensibilidade e a especificidade diagnóstica foram ambas 100%. Em resumo, os estudos apresentados na presente Tese revelaram uma alta conservação do gene da proteína N e a circulação de duas linhagens e sub-linhagens diferentes de RABV no RS, confirmando a adequação do gene N no estudo das relações genéticas entre amostras de RABV. Além disso, a RT-qPCR se apresentou sensível e específica nos critérios analítico e diagnóstico. Em função disso, o ensaio aqui proposto se mostrou útil para diagnóstico da raiva em bovinos, apresentando rapidez, sensibilidade e especificidade adequadas.

Rabies virus (Rabies lyssavirus, RABV) is the agent of rabies, a zoonotic disease distributed worldwide, characterized by severe neurological signs of course generally fatal in domestic and wild mammals. The RABV belongs to the order Mononegavirales, family Rhabdoviridae and genus Lyssavirus. The RABV genome consists of a single-stranded, negative-sense RNA molecule of approximately 12 kilobases (kb) containing 5 genes, including the highly conserved nucleoprotein (N) gene. The N gene has been widely used as a target in phylogenetic studies and for development of molecular tests for diagnosis. In a first study, we describe a phylogenetic analysis of 145 RABV recovered from herbivorous from Rio Grande do Sul state (RS) between 2012 and 2017, based on partial sequence analysis of the N gene. These sequences displayed a high sequence nucleotide (nt) identity and amino acid (aa) similarity to each other and with bovine and hematophagous bat RABV sequences. The viruses segregated into two distinct clusters. Cluster 1 comprised RABV sequences covering the whole studied period, whereas cluster 2 grouped a lower number of viruses from 2013, 2014, 2015 and 2017. In some cases, viruses obtained from the same region within a short period of time grouped to distinct clusters or sub-clusters, indicating the co-circulation of distinct virus lineages in these outbreaks. The segregation into sub-clusters was also observed for viral sequences obtained from the same region at different times, indicating the involvement of distinct viruses. The second study reports the development and validation of a real-time reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) for diagnostics of rabies in cattle. The primers were designed targeting the highly conserved N gene of RABV from samples obtained from cattle in RS, obtained from GenBank. The detection limit corresponded to 12.99 DNA copies and the intra- and inter-run repeatability was adequate. Non-specific amplification with a range of other pathogens causing neurological syndromes similar to rabies in cattle in RS, as well as cross-contamination were not detected. Bovine brain samples from 21 suspected cases of rabies were tested with the new RABV RT-qPCR assay and with a gold-standard fluorescent antibody test (FAT) and the sensitivity and specificity of the RT-qPCR assay were determined. Both the sensitivity and specificity of the RT-qPCR were 100%. In summary, the studies presented in this Thesis revealed a high conservation of N protein gene and the circulation of two lineages and different sublineages of RABV in the RS, confirming the suitability of N gene to study the genetic relationships among RABV isolates. Furthermore, the RABV RT-qPCR assay provides is analytically and diagnostically sensitive and specific. Thus, this assay may be very useful for a rapid, sensitive and specific diagnosis of rabies in cattle.

Evaluation of RT-PCR and hemi-nested RT-PCR in brain samples from dogs with neurologic signs compatible with distemper / Avaliação das técnicas de RT-PCR e heminested RT-PCR em cérebros de cães com sinais neurológicos compatíveis com cinomose

The diagnostic value of RT-PCR and hemi-nested RT-PCR (hnRT-PCR) was compared in brain samples of dogs presenting neurological signs compatible with canine distemper. Samples of central nervous system (CNS) were collected from 68 dogs and tested by direct immunofluorescence test (RFID) and, independent of the results, they were stored at -20°C for at least three years. They were submitted to the RT-PCR and hnRT-PCR techniques aiming to determine the gene responsible for the viral nucleoprotein decoding. Fifty-nine samples were positive for RIFD, 40 for RT-PCR (Kappa = 0.358) and 54 for hnRT-PCR (Kappa = 0.740). All nine RIFD negative samples were also negative for RT-PCR and hnRT-PCR. In spite of the storage duration and proper sample conditions, the estimated accordance between hnRT-PCR and RIFD demonstrated that hnRT-PCR technique can be applied in retrospective studies(AU)

Foi comparado o valor diagnóstico das técnicas de RT-PCR e heminested RT-PCR (hnRT-PCR) em amostras de cérebro de cães com sintomatologia nervosa compatível com cinomose. Fragmentos do sistema nervoso central (SNC) colhidos de 68 animais foram testados pela Imunofluorescência direta (IFD) e, independentemente do resultado, foram armazenados a -20°C por pelo menos três anos. Após esse período, foram submetidos a RT-PCR e a hnRT-PCR com oligonucleotídeos iniciadores direcionados ao gene codificador da nucleoproteína N. As proporções de resultados positivos/examinados foram: 59/68 para a IFD, 40/68 para a RT-PCR (Kappa = 0,358) e 54/68 quando associada à heminested PCR (Kappa = 0,740). Houve nove resultados negativos nas três técnicas empregadas. Os resultados do coeficiente Kappa entre a IFD e hnRT-PCR demonstram que apesar das condições de armazenamento, a hnRT-PCR pode ser utilizada em estudos retrospectivos(AU)

Phylogenetic analysis of rabies virus isolated from herbivores in Minas Gerais and São Paulo border (2000-2009), Brazil / Análise filogenética de isolados do vírus da raiva de herbívoros na fronteira de Minas Gerais e São Paulo (2000-2009), Brasil

Rabies transmitted by the hematophagous bat Desmodus rotundus represents a public health concern and a burden for the Brazilian livestock industry. Current evidence suggests that rabies occurrence is related to landscape characteristics, topography, hydrography, animal production systems and land use. However, a few studies have analyzed the possible connections among geographic factors and the molecular diversity of the rabies virus, furthering the understanding of the spatial and temporal dynamics of outbreaks. A study reported that the latest rabies epizootics in herbivores reported in the eastern region of São Paulo (close to the Minas Gerais border) occurred in two epidemic waves; the first was before 1998, and the other occurred after 1999. Using this evidence, the aim of the present study was to analyze cases of rabies in herbivores in the southern region of Minas Gerais (2000-2009) and their possible relationship with the aforementioned epidemics, considering the geographic characteristics of the region. Partial sequences of glycoprotein (539 nt) and nucleoprotein genes (414 nt) were obtained from 31 rabies virus isolates from herbivores. A phylogenetic tree was proposed for each genomic region using the Neighbor joining method, fixing the Kimura 2-parameter evolution model with a bootstrap level of 1,000 replications. Genetic sublineages were plotted on maps, considering rabies risk areas for herbivores in São Paulo, as well as topographic characteristics and hydrographic basins, to visualize any apparent distribution pattern influenced by those features. The phylogenetic trees had concordant topologies, suggesting a possible common origin for rabies outbreaks in herbivores along the SP/MG border, surrounding the less elevated portions of the Serra da Mantiqueira and along the hydrographic basins of Piracicaba/Jaguarí, Paranaíba do Sul, Grande, Pardo and Mogi-Guaçu rivers.The co-circulation of several viral lineages was observed in some municipalities, possibly due to an overlapping of rabies outbreaks. Inferred protein sequences of both genes showed synonymous mutations, except among residues 20 to 200, corresponding to the external domain of the glycoprotein. This information prompted cooperation among the animal health services of both states to reinforce rabies control in the border area.(AU)

A raiva transmitida por morcegos hematófagos da espécie Desmodus rotundus representa uma preocupação de saúde pública e causa de importantes prejuízos para a pecuária brasileira. A evidência atual sugere que a ocorrência de raiva está relacionada às características da paisagem, topografia, hidrografia, sistemas de produção animal e usos da terra. Contudo, existem poucos estudos que analisem as possíveis conexões entre fatores geográficos e a diversidade molecular do vírus da raiva, permitindo a compreensão da dinâmica espacial e temporal dos focos de raiva. Um desses trabalhos estabeleceu que a última epizootia de raiva dos herbívoros registrada no leste do estado de São Paulo (na fronteira com Minas Gerais), aconteceu em duas ondas epidêmicas, sendo a primeira em 1998 e, em 1999, a segunda. Considerando esta evidência, o intuito do presente estudo foi analisar casos de raiva em herbívoros na região sudeste de Minas Gerais (2000-2009) e sua possível relação com a epidemia previamente mencionada, incluindo as características geográficas da região. Foram obtidas sequencias parciais dos genes da glicoproteína (539 nt) e da nucleoproteína (414 nt) a partir de 31 isolados de vírus da raiva procedentes de herbívoros. Foi proposta uma árvore filogenética para cada região genômica usando o método de Neighbor joining, fixando o modelo evolutivo Kimura 2 - parâmetros com um nível de bootstrap de 1000 replicações. As sublinhagens genéticas foram localizadas sobre mapas, considerando as áreas de risco para raiva dos herbívoros em São Paulo, assim como as características topográficas e bacias hidrográficas com o intuito de visualizar qualquer padrão aparente de distribuição segundo essas características. As duas árvores filogenéticas mostraram topologias concordantes, sugerindo uma possível origem comum para os surtos que aconteceram ao longo da fronteira SP/MG, ao redor das porções menos elevadas da Serra da Mantiqueira e acompanhando as bacias hidrográficas dos rios Piracicaba/Jaguarí, Paranaíba do Sul, Grande, Pardo e Mogi-Guaçu. Foi possível observar circulação de varias linhagens virais simultaneamente em alguns municípios, possivelmente por causa de sobreposição de surtos. As sequencias de proteína inferidas a partir dos dois genes mostraram mutações sinônimas, excetuando aquelas encontradas entre os resíduos 20 a 200, correspondentes ao domínio externo da glicoproteína. Esta informação salienta a importância da cooperação entre as autoridades sanitárias de ambos os estados para reforçar o programa de controle da doença nas áreas limítrofes.(AU)

Molecular epidemiology of rabies virus isolated of herbivores from Brazilian Amazon / Epidemiologia molecular de vírus da raiva isolados de herbívoros procedentes da Amazônia brasileira

Rabies virus samples (n = 17) A1 to A3 exhibit a similar composition and geographic distribution. Diverse composition of remaining groups of N and G gene is attributable to different sequences used in the alignments for each genomic region. Glycoprotein amino acid sequence showed molecular markers in sub-lineages A2, A3, A4 and A7. This information provides a better comprehension of molecular epidemiology of rabies, starting with the knowledge of viral lineages circulating in the Brazilian Amazon.(AU)

Amostras do vírus da raiva (n = 17) isoladas de bovinos (n = 11), equinos (n = 4) e bubalinos (n = 2) procedentes do Pará (n = 7), Tocantins (n = 6) e Rondônia (n = 4) foram submetidas à técnica de RT-PCR para amplificação parcial dos genes da Nucleoproteína (N) e Glicoproteína (G). As sequências nucleotídicas obtidas foram analisadas pelo método de reconstrução filogenética Neighbor-Joining com o modelo evolutivo Kimura 2-parâmetros. Todas as 17 amostras pertenceram ao cluster A, que se encontrou na linhagem associado com morcego hematófago Desmodus rotundus. A análise filogenética baseada nos genes N e G, sugere a presença de cinco sublinhagens (A1-A5) e sete sublinhagens (A1-A7), respectivamente. Quando se compara ambas as filogenias, as sublinhagens A1 até A3 mostram composição e distribuição geográfica concordante, já a diversidade observada na composição das sublinhagens restantes é atribuída ao uso de sequências de diferentes alinhamentos. A glicoproteína mostrou marcadores moleculares nas sublinhagens A2, A3, A4 e A7, o que fornece elementos para melhor compreensão da epidemiologia molecular da raiva das linhagens circulantes na Amazônia Brasileira.(AU)

Epidemiologia molecular de surto de raiva bovina na região central do Rio Grande do Sul, 2012 / Molecular epidemiology of an outbreak of bovine rabies in central Rio Grande do Sul, Brazil, 2012

A raiva é uma doença infecciosa do sistema nervoso central de mamíferos causada pelo vírus da raiva (RabV), geralmente, transmitido pela mordedura de animais infectados. No Brasil, os morcegos hematófagos Desmodus rotundus são as principais fontes de infecção do RabV para bovinos e equinos. Este artigo descreve uma investigação epidemiológica e molecular de surtos de raiva ocorridos na região central do Rio Grande do Sul, entre maio e agosto de 2012. Nesse período, 45 casos suspeitos de raiva foram relatados em 22 pequenos rebanhos, localizados dentro de um raio de 4,7km, no município de Pinhal Grande. Desses, 32 amostras foram submetidas para diagnóstico da raiva, sendo que o RabV e/ou antígenos virais foram identificados em 27 amostras. Em um segundo momento, 11 amostras foram submetidas à transcrição reversa/reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) para o gene da nucleoproteína (N) do RabV, seguido de sequenciamento nucleotídico e análise filogenética. Sete das 11 amostras apresentaram sequências nucleotídicas idênticas e uma apresentou mutação sinônima, não-codificante, indicando uma provável origem comum dos vírus. Por outro lado, três amostras apresentaram mutações que resultaram em alterações de aminoácidos, sugerindo uma origem diferente do vírus. Esses resultados sugerem que RabV de diferentes origens/linhagens co-circulam na região e foram envolvidos nos surtos descritos. Investigações sobre a circulação de ambos os genótipos em morcegos na região estão em andamento.(AU)

Rabies is an infectious disease of the central nervous system of mammals caused by rabies virus (RabV), generally transmitted by the bite of rabid animals. In Brazil, vampire bats Desmodus rotundus are the main reservoirs of RabV for livestock. The present study describes a molecular and epidemiological investigation of outbreaks of bovine rabies occurring in the central region of Rio Grande do Sul state, Brazil, between May and August 2012. In this period, 45 cases suspected of rabies were reported in 22 small herds, located within a 4.7km range, in the county of Pinhal Grande. From these, 32 samples were submitted to rabies diagnosis and RabV and/or viral antigens were identified in 27 samples. Subsequently, 11 brain samples were submitted to reverse transcription/polymerase chain reaction (RT-PCR) for the nucleoprotein gene (N) followed by nucleotide sequencing and phylogenetic analysis. Seven out of 11 samples yielded identical sequences; one presented a synonymous, non-coding mutation, indicating a likely common origin of the virus. However, three other samples presented nucleotide mutations which resulted in amino acid changes, suggesting a different origin of the virus. In summary, these results suggest that RabV strains of different origin/lineages co-circulate in the region and were involved in the outbreaks. Investigations on the circulation of both genotypes in bats in the region are currently underway.(AU)

Análise filogenética de isolados do vírus da bronquite infecciosa aviária (vbi) no brasil com base na sequência 3’-terminal do gene da nucleoproteína / Phylogenetic analysis of isolates of avian infectious bronchitis virus (ibv)in brazil based on the 3'-terminal sequence of the nucleoprotein gene

A bronquite infecciosa é causada pelo VBI, que é classificado no gênero Gammacoronavirus da Família Coronaviridae. Essa enfermidade está distribuída mundialmente e destaca-se como um dos mais importantes problemas sanitários para o plantel avícola industrial. Recentemente tem sido identificado no Brasil um número elevado de variantes do VBI, diferindo na análise filogenética com base no gene S1 de estirpes Americanas, Europeias, Asiáticas e Australianas. No entanto, pouco tem sido investigado com relação a outros genes codificadores de proteínas importantes como a nucleoproteina (N), que é fator chave nos processos de replicação e montagem de novas partículas virais, e contém epítopos importantes para interação com as células T e B. O objetivo do presente estudo foi determinar as seqüências 3’-terminal do gene da proteina N de isolados do VBI no Brasil e compará-las com as de estirpes do VBI de outras regiões do mundo. Para tanto, foram submetidos à análise molecular, 15 isolados do VBI obtidos durante o período de 1988 a 2000, de surtos à campo da Bronquite Infecciosa (BI), em aves de corte ou de postura das regiões Sul e Sudeste do Brasil. A análise filogenética de sequências parciais do gene N resultou na segregação dos 15 isolados brasileiros do VBI em cinco grupos diferentes, sendo que três desses grupos são relacionados a estirpes do genótipos Massachusetts, enquanto que os outros dois grupos são associados aos genótipos Connecticut ou Variante Brasileira. Esses grupos genotípicos coincidiram na sua maior parte com os que foram previamente determinados pela análise filogenética com base no gene S1. Concluindo, a análise filogenética do gene N é capaz de diferenciar estirpes brasileiras do VBI e avaliar a sua evolução, especialmente nos casos em que a amplificação do gene S1 é mais difícil por causa da sua variabilidade entre estirpes muito diferentes do VBI.

Infectious bronchitis is caused by IBV, which is classified in the genus Gammacoronavirus, Family Coronaviridae. This disease is distributed worldwide and stands as one of the most important health problems for the poultry industry. Recently, researchers in Brazil have identified a large number of IBV variants, the phylogenetic analysis based on the S1 gene shows that they differ from the American, European, Asian and Australian strains. However, little research has been conducted about other encoding genes of important proteins such as the nucleoprotein (N), which is a key factor in replication and assembly processes of new viral particles, and contains epitopes important for interaction with T and B cells. The aim of this study was to determine the 3'-terminal sequences of the N protein gene isolated from IBV in Brazil and compare them with those of IBV strains from other regions of the world. So, 15 IBV isolates obtained from 1988 to 2000, during outbreaks of Infectious Bronchitis (IB) in broilers or laying birds in Southern and Southeastern Brazil, were submitted to molecular analysis. Phylogenetic analysis of partial sequences of the N gene resulted in the separation of the 15 Brazilian IBV isolates in five different groups while three of these groups are related to strains of the Massachusetts genotypes, whereas the other two groups are associated with the Connecticut genotypes or a Brazilian variant. These genotypic groups mostly coincided with those previously determined by phylogenetic analysis based on the S1 gene. In conclusion, the phylogenetic analysis of the N gene can differentiate Brazilian strains of IBV and evaluate its development, especially in cases where the S1 gene amplification is more difficult due to wide variability between different IBV strains.

Análise filogenética de isolados do vírus da bronquite infecciosa aviária (vbi) no brasil com base na sequência 3-terminal do gene da nucleoproteína / Phylogenetic analysis of isolates of avian infectious bronchitis virus (ibv)in brazil based on the 3'-terminal sequence of the nucleoprotein gene

A bronquite infecciosa é causada pelo VBI, que é classificado no gênero Gammacoronavirus da Família Coronaviridae. Essa enfermidade está distribuída mundialmente e destaca-se como um dos mais importantes problemas sanitários para o plantel avícola industrial. Recentemente tem sido identificado no Brasil um número elevado de variantes do VBI, diferindo na análise filogenética com base no gene S1 de estirpes Americanas, Europeias, Asiáticas e Australianas. No entanto, pouco tem sido investigado com relação a outros genes codificadores de proteínas importantes como a nucleoproteina (N), que é fator chave nos processos de replicação e montagem de novas partículas virais, e contém epítopos importantes para interação com as células T e B. O objetivo do presente estudo foi determinar as seqüências 3-terminal do gene da proteina N de isolados do VBI no Brasil e compará-las com as de estirpes do VBI de outras regiões do mundo. Para tanto, foram submetidos à análise molecular, 15 isolados do VBI obtidos durante o período de 1988 a 2000, de surtos à campo da Bronquite Infecciosa (BI), em aves de corte ou de postura das regiões Sul e Sudeste do Brasil. A análise filogenética de sequências parciais do gene N resultou na segregação dos 15 isolados brasileiros do VBI em cinco grupos diferentes, sendo que três desses grupos são relacionados a estirpes do genótipos Massachusetts, enquanto que os outros dois grupos são associados aos genótipos Connecticut ou Variante Brasileira. Esses grupos genotípicos coincidiram na sua maior parte com os que foram previamente determinados pela análise filogenética com base no gene S1. Concluindo, a análise filogenética do gene N é capaz de diferenciar estirpes brasileiras do VBI e avaliar a sua evolução, especialmente nos casos em que a amplificação do gene S1 é mais difícil por causa da sua variabilidade entre estirpes muito diferentes do VBI.(AU)

Infectious bronchitis is caused by IBV, which is classified in the genus Gammacoronavirus, Family Coronaviridae. This disease is distributed worldwide and stands as one of the most important health problems for the poultry industry. Recently, researchers in Brazil have identified a large number of IBV variants, the phylogenetic analysis based on the S1 gene shows that they differ from the American, European, Asian and Australian strains. However, little research has been conducted about other encoding genes of important proteins such as the nucleoprotein (N), which is a key factor in replication and assembly processes of new viral particles, and contains epitopes important for interaction with T and B cells. The aim of this study was to determine the 3'-terminal sequences of the N protein gene isolated from IBV in Brazil and compare them with those of IBV strains from other regions of the world. So, 15 IBV isolates obtained from 1988 to 2000, during outbreaks of Infectious Bronchitis (IB) in broilers or laying birds in Southern and Southeastern Brazil, were submitted to molecular analysis. Phylogenetic analysis of partial sequences of the N gene resulted in the separation of the 15 Brazilian IBV isolates in five different groups while three of these groups are related to strains of the Massachusetts genotypes, whereas the other two groups are associated with the Connecticut genotypes or a Brazilian variant. These genotypic groups mostly coincided with those previously determined by phylogenetic analysis based on the S1 gene. In conclusion, the phylogenetic analysis of the N gene can differentiate Brazilian strains of IBV and evaluate its development, especially in cases where the S1 gene amplification is more difficult due to wide variability between different IBV strains.(AU)

In vitro and in vivo inhibition of rabies virus replication by RNA interference

Rabies is a zoonotic disease that affects all mammals and leads to more than 55,000 human deaths every year, caused by rabies virus (RABV) (Mononegavirales: Rhabdoviridae: Lyssavirus). Currently, human rabies treatment is based on the Milwaukee Protocol which consists on the induction of coma and massive antiviral therapy. The aim of this study was to assess the decrease in the titer of rabies virus both in vitro and in vivo using short-interfering RNAs. To this end, three siRNAs were used with antisense strands complementary to rabies virus nucleoprotein (N) mRNA. BHK-21 cells monolayers were infected with 1000 to 0.1 TCID50 of PV and after 2 hours the cells were transfected with each of tree RNAs in separate using Lipofectamine-2000. All three siRNAs reduced the titer of PV strain in a least 0.72 logTCID50/mL and no cytotoxic effect was observed in the monolayers treated with Lipofectamine-2000. Swiss albino mice infected with 10.000 to 1 LD of PV strain by the intracerebral route were also transfected after two hours of infection with a pool 3 siRNAs with Lipofectamine-2000 by the intracerebral route, resulting in a survival rate of 30% in mice inoculated with 100 LD50, while the same dose led to 100% mortality in untreated animals. Lipofectamine-2000 showed no toxic effect in control mice. These results suggest that intracerebral administration of siRNAs might be an effective antiviral strategy for rabies.(AU)