Cellular components and TGF-beta1 content of a closed Tube system for Platelet Rich Plasma acquisition in horse] / [Componentes celulares e TGF-beta1 do plasma rico em plaquetas obtido por sistema fechado em equinos]

Platelet-rich plasma (PRP) has been proposed as an agent to accelerate the healing process and stimulate the regenerative capacity of tissues due to its abundance of growth factors. A large variety of kits and protocols are available to obtain PRP by different cell-separation systems. However, the lack of standardization may lead to inconsistent results. The aim of this study was to characterize cellular composition, platelet parameters using the ADVIA 120 flow cytometer, and TGF-ß1 concentration from the PRP product obtained through a closed system, using simple centrifugation. Six clinically healthy horses were used in this study. The protocol in the closed system resulted in approximately 1.6-fold higher platelet and approximately 2.0-fold lower white blood cell concentrations in comparison with whole blood values. The evaluated system was efficient in concentrating platelets and in retrieving a small number of leukocytes, using a protocol of single centrifugation at low speed.

O plasma rico em plaquetas (PRP) tem sido proposto como um agente para acelerar o processo de cicatrização e estimular a capacidade regenerativa dos tecidos, devido à sua abundância de fatores de crescimento. Uma grande variedade de kits e de protocolos está disponível para obtenção de PRP, utilizando-se diferentes sistemas de separação de células. No entanto, a falta de padronização pode levar a resultados inconsistentes. O objetivo deste estudo foi caracterizar a composição celular, os parâmetros plaquetários pelo citômetro de fluxo ADVIA 120 e a concentração de TGF-ß1 do PRP obtido em sistema fechado, por centrifugação simples. Seis cavalos clinicamente saudáveis ​​foram usados ​​neste estudo. O protocolo no sistema fechado resultou em concentrações de plaquetas aproximadamente 1,6 vez maior e concentrações de leucócitos aproximadamente 2,0 vezes menores em comparação com os valores do sangue total. O sistema avaliado foi eficiente na concentração de plaquetas e na recuperação de um pequeno número de leucócitos, utilizando um protocolo de centrifugação única em baixa velocidade.

Retorno de cavalos da raça Puro-Sangue Inglês às corridas após tratamento de fraturas slab do osso terceiro carpiano com PRP e células-tronco / Return of Thoroughbred racing horses to the races after treating slab fractures of the third carpal bone with PRP and stem cells

Background: Despite the fact that slab fracture of the third carpal bone is an event of great worldwide relevance in racehorses, the third carpal fracture doesn’t have data on treatments and return to racing in Brazil. The search for efficient treatments and which provide recovery providing horses return to racing is an objective of sports equine medicine. Regenerative therapies like Platelet Rich Plasma (PRP) and Stem Cells (MSc) have demonstrated a great potential in the treatment of several injuries. For the treatment of three Thoroughbred racing horses at Brazilian Jockey Club, with sagittal plane slab fractures of the third carpal bone, we used the association of PRP and Stem Cells for reduction of the rest and good return to conditions athletics of these horses. Cases: Three Thoroughbred racing horses, males, 4 and 5 years old, showed slab fracture third carpal bone in different moments of their activity at Brazilian Jockey Club. Usually, the treatment for this type of fracture is the arthroscopic repair and the conservative management. We performed after initial radiographic evaluation dorsoproximal-dorsodistal oblique (DPr-DDiO) “skyline”, intra-articular applications of PRP and MSCs. The treatments were performed according to the radiographic follow-up of the lesion evolution. No other treatment was performed concomitantly with cell therapy in the 3 treated patients. Three treatments were performed in the first patient and 2 in the second and third patients. Before each treatment for all patients, we performed radiography dorsoproximal-dorsodistal oblique (DPr-DDiO) ‘skyline’ of the carpus. After this step, the animal was sedated with 10% xylazine hydrochloride at a dose of 0.5 mg/kg intravenously. Antisepsis of the carpus was performed and applied with radiographic monitoring of the needle positioning, first the PRP in the volume of 2 mL and in sequence, 20 million cells MSCs suspended in autologous...

Comparação de diferentes protocolos para obtenção de plasma rico em plaquetas canino / Comparison of different protocols to obtain canine platelets rich plasma

O plasma rico em plaquetas (PRP) é um hemocomponente produzindo a partir do plasma, visando a obtenção de citocinas e fatores do crescimento com fins terapêuticos, como a cicatrização e reparação de diferentes tecidos. Esse estudo quantificou a concentração plaquetária obtida utilizando-se de três diferentes protocolos de obtenção do PRP de 13 amostras de sangue de 7 cães hígidos. As velocidades de centrifugação utilizadas no protocolo I foram de 1ª centrifugação de 1.500 rpm e 2ª centrifugação de 3.000 rpm; no protocolo II, de 2.000 rpm e 3.000 rpm; e o protocolo III com 3.000 rpm e 4.000 rpm, respectivamente. O melhor resultado para a produção de PRP autólogo foi obtido no protocolo 1, seguido do protocolo 2, com aumentos de 116% e 83,05% após a 2ª centrifugação, respectivamente. Entretanto, os resultados obtidos na 1ª centrifugação foram superiores aos apresentados após a 2ª. centrifugação, observando elevações de 203,66% e 210,20% comparados aos valores basais.

Platelet-rich plasma (PRP) is a blood component produced0 from plasma, aiming at obtaining cytokines and growth factors for therapeutic purposes, such as healing and repair of different tissues. This study quantified the platelet concentration resulting from three different protocols for obtaining PRP from 13 blood samples from 8 healthy dogs. The centrifugation speeds used in protocol I was 1,500 rpm in the first centrifugation and 3,000 rpm in the second centrifugation; in protocol II, 2,000 rpm and 3,000 rpm; and protocol III with 3,000 rpm and 4,000 rpm, respectively. The best result for autologous PRP production was obtained in protocol 1, followed by protocol 2, with increases of 116% and 83.05% after the 2nd centrifugation, respectively. However, the results obtained in the 1st centrifugation were superior to those presented after the 2nd. centrifugation, observing increases of 203.66% in protocol 1 and 210.20% in protocol 2, when compared to baseline.

Comparação de diferentes protocolos para obtenção de plasma rico em plaquetas canino / Comparison of different protocols to obtain canine platelets rich plasma

O plasma rico em plaquetas (PRP) é um hemocomponente produzindo a partir do plasma, visando a obtenção de citocinas e fatores do crescimento com fins terapêuticos, como a cicatrização e reparação de diferentes tecidos. Esse estudo quantificou a concentração plaquetária obtida utilizando-se de três diferentes protocolos de obtenção do PRP de 13 amostras de sangue de 7 cães hígidos. As velocidades de centrifugação utilizadas no protocolo I foram de 1ª centrifugação de 1.500 rpm e 2ª centrifugação de 3.000 rpm; no protocolo II, de 2.000 rpm e 3.000 rpm; e o protocolo III com 3.000 rpm e 4.000 rpm, respectivamente. O melhor resultado para a produção de PRP autólogo foi obtido no protocolo 1, seguido do protocolo 2, com aumentos de 116% e 83,05% após a 2ª centrifugação, respectivamente. Entretanto, os resultados obtidos na 1ª centrifugação foram superiores aos apresentados após a 2ª. centrifugação, observando elevações de 203,66% e 210,20% comparados aos valores basais.(AU)

Platelet-rich plasma (PRP) is a blood component produced0 from plasma, aiming at obtaining cytokines and growth factors for therapeutic purposes, such as healing and repair of different tissues. This study quantified the platelet concentration resulting from three different protocols for obtaining PRP from 13 blood samples from 8 healthy dogs. The centrifugation speeds used in protocol I was 1,500 rpm in the first centrifugation and 3,000 rpm in the second centrifugation; in protocol II, 2,000 rpm and 3,000 rpm; and protocol III with 3,000 rpm and 4,000 rpm, respectively. The best result for autologous PRP production was obtained in protocol 1, followed by protocol 2, with increases of 116% and 83.05% after the 2nd centrifugation, respectively. However, the results obtained in the 1st centrifugation were superior to those presented after the 2nd. centrifugation, observing increases of 203.66% in protocol 1 and 210.20% in protocol 2, when compared to baseline.(AU)

Comparison of the protocols for obtaining platelet-rich plasma in dogs: a cellular study / Comparação entre protocolos para obtenção de plasma rico em plaquetas em cães: estudo celular

This study aimed to evaluate two protocols (PA and PB) that are used to obtain canine platelet-rich plasma (PRP) for cellularity. Twenty healthy dogs were used. Blood samples were collected and placed in two tubes of 3.2% sodium citrate. PA used double centrifugation at 210 x g, and 370 x g and PB used double centrifugation with 140 x g and 330 x g. The PRP samples from the protocols were examined in terms of their platelet, erythrocyte, and leukocyte count in the Neubauer chamber, differential leukocyte count and platelet morphological observation in blood smears. Data (mean and standard deviation) were analyzed with the 95% probability t-test (P <0.05) using Pearsons correlation to test the relationship between platelets and erythrocytes, platelets, and leukocytes, and the leukocyte count versus the erythrocytes. Very weak negative correlation between platelets and leukocytes (p= -0.03), weak negative correlation between platelets and erythrocytes (p= -0.3) and a strong positive correlation between leukocytes and erythrocytes (ρ = 0.75) were noted. Although, BP did not reach the desired mean of one million platelets (979300 ± 79631 cells / μL), both protocols, A and B (4.42 ± 1.61 and 3.85 ± 1.55 times more platelets than total blood, respectively) (p <0.05) were efficient in concentrating platelets. Platelet activation was present in 26.55 ± 6.72% of the PA platelets and 26.25 ± 7.03% in PB (p> 0.05). PA and PB presented low erythrocyte concentration (p> 0.05), and PA had more leukocytes (p <0.05) than PB, with higher concentrations of basophils that were segmented, and lymphocytes.(AU)

Foi proposto avaliar dois protocolos (PA e PB) para obtenção de plasma rico em plaquetas (PRP) canino quanto a celularidade. Foram utilizados 20 cães sadios e coletadas amostras sanguíneas, sendo acondicionados em dois tubos de citrato de sódio a 3,2%. O PA utilizando centrifugação dupla com 210 xG e 370 xG e PB utilizando centrifugação dupla com 140 xG e 330 xG. Amostras de PRP dos protocolos foram destinadas a contagem plaquetária, eritrocitária e leucocitária em câmara de Neubauer, contagem diferencial leucocitária e observação morfológica plaquetária em esfregaços sanguíneos. Analisou-se os dados (médias e desvios padrão) pelo Teste t com 95% de probabilidade (p<0,05) utilizando-se correlação de Pearson para testar a relação entre a contagem de plaquetas e eritrócitos, plaquetas e leucócitos e leucócitos em relação aos eritrócitos. Houve correlação negativa muito fraca entre plaquetas e leucócitos (ρ= -0,03), negativa fraca entre plaquetas e eritrócitos (ρ= -0,3) e correlação positiva forte entre leucócitos e eritrócitos (ρ=0,75). Embora o PB não tenha alcançando a média de um milhão de plaquetas desejado (979300 ± 79631 células/µL), ambos os protocolos, A e B (4,42 ± 1,61 e 3,85 ± 1,55 vezes mais plaquetas que o sangue total, respectivamente) (p<0,05), foram eficientes em concentrar plaquetas. A ativação plaquetária esteve presente em 26,55 ± 6,72 % das plaquetas do PA e 26,25 ± 7,03 % nas do PB (p>0,05). PA e PB apresentaram baixa concentração eritrocitária (p>0,05) e PA apresentou mais leucócitos (p<0,05) que PB, com maiores concentrações de basófilos, segmentados e linfócitos.(AU)

Method to obtain platelet-rich plasma from rabbits (Oryctolagus cuniculus ) / Método de obtenção de plasma rico em plaquetas de coelhos (Oryctolagus cuniculus)

Platelet-rich plasma (PRP) is a product easy and inxpesnsive, and stands out to for its growth factors in tissue repair. To obtain PRP, centrifugation of whole blood is made with specific time and gravitational forces. Thus, the present work aimed to study a method of double centrifugation to obtain PRP in order to evaluate the effective increase of platelet concentration in the final product, the preparation of PRP gel, and to optimize preparation time of the final sample. Fifteen female White New Zealand rabbits underwent blood sampling for the preparation of PRP. Samples were separated in two sterile tubes containing sodium citrate. Tubes were submitted to the double centrifugation protocol, with lid closed and 1600 revolutions per minute (rpm) for 10 minutes, resulting in the separation of red blood cells, plasma with platelets and leucocytes. After were opened and plasma was pipetted and transferred into another sterile tube. Plasma was centrifuged again at 2000rpm for 10 minutes; as a result it was split into two parts: on the top, consisting of platelet-poor plasma (PPP) and at the bottom of the platelet button. Part of the PPP was discarded so that only 1ml remained in the tube along with the platelet button. This material was gently agitated to promote platelets resuspension and activated when added 0.3ml of calcium gluconate, resulting in PRP gel. Double centrifugation protocol was able to make platelet concentration 3 times higher in relation to the initial blood sample. The volume of calcium gluconate used for platelet activation was 0.3ml, and was sufficient to coagulate the sample. Coagulation time ranged from 8 to 20 minutes, with an average of 17.6 minutes. Therefore, time of blood centrifugation until to obtain PRP gel took only 40 minutes [...](AU)

O plasma rico em plaquetas (PRP) é um produto de fácil obtenção a baixo custo, destacando-se pelos seus fatores de crescimento na reparação tecidual. Para obtenção do PRP, a centrifugação do sangue total é realizada com tempos e forças gravitacionais específicas. Assim, o presente trabalho teve por objetivo estudar o método da dupla centrifugação para obtenção do PRP, a fim de avaliar a eficácia de aumento da concentração de plaquetas no produto final, a preparação de gel de PRP e otimizar o tempo de preparação da amostra final. Quinze coelhos Nova Zelândia Branco, fêmeas, foram submetidos à coleta de sangue para a preparação de PRP. As amostras foram separadas em dois tubos estéreis contendo citrato de sódio. Os tubos foram submetidos ao protoloco de dupla centrifugação, com a tampa fechada a 1600 revoluções por minuto (rpm) durante 10 minutos, resultando na separação dos glóbulos vermelhos, plaquetas e plasma contendo os leucócitos. Na sequência, foram destapados para pipetar o plasma e transferí-lo para outro tubo de estéril. O plasma foi novamente centrifugado a 2000pm durante 10 minutos, resultando em duas partes: a parte superior, que consistia em plasma pobre em plaquetas (PPP) e a parte inferior do botão de plaquetas. Parte PPP foi descartado de modo que apenas 1ml de PPP permaneceu no frasco juntamente com o botão de plaquetas. Este material foi agitado suavemente para promover a ressuspensão das plaquetas, o que resultou na produção de PRP. O protocolo de centrifugação dupla foi capaz de promover a concentração de plaquetas 3 vezes maior em relação à amostra de sangue inicial. O volume de gluconato de cálcio utilizado para a ativação das plaquetas foi de 0,3ml, e foi suficiente para coagular a amostra, e o tempo de coagulação variou de 8 a 20 minutos, com uma média de 17,6 minutos. O tempo da centrifugação do sangue até a obtenção do PRP gel levou apenas 40 minutos [...](AU)

Utilização de plasma rico em plaquetas de coelhos com poucos leucócitos e hemácias para a consolidação de ossos / Use of plasma rich in platelets of rabbits with few leukocytes and erythrocytes to consolidate bones

Objetivou-se utilizar o plasma rico em plaquetas, obtido por técnica capaz de produzir um produto autólogo, com reduzido número de leucócitos e hemácias, e avaliar, por meio de radiografias, a capacidade de cicatrização de uma falha óssea induzida no rádio de coelhos. Foram coletados 10,5mL de sangue por via intracardíaca, o qual foi distribuído em três tubos de hemossedimentação contendo citrato de sódio. Os tubos contendo as amostras foram submetidos a uma centrifugação a 2.000rpm (670,8G) por 20 minutos, e da coluna de sedimentação foram aspirados de cada tubo 1.000µL de plasma para a redução do volume sobrenadante. Aspirou-se o plasma acima do anel de leucócitos e transferiu-se para outro tubo para centrifugação a 2.000rpm por 10 minutos. O conteúdo plaquetário no fundo do tubo foi ressuspendido e homogeneizado a 1.000µL do plasma sobrenadante para formar o PRP líquido. Uma falha de 1,0cm foi realizada no rádio esquerdo de cada coelho. O tempo de consolidação foi observado por meio de exame radiográfico aos 45 e 90 dias de pós-operatório (PO). As imagens foram comparadas entre o grupo controle (G1) e o grupo que recebeu o implante de PRP por via transdérmica (G2). A evolução da cicatrização foi verificada com auxílio do programa Adobe Photoshop CC e em uma escala de cinza que representa o contraste. No G2 foi verificada média de 63% de contraste aos 45 dias de PO e de 65% aos 90 dias de PO. No G2, aos 45 dias de PO, a média encontrada foi de 42,7%, e aos 90 dias de PO, 31,25%, indicando que houve evolução do processo de reparação óssea em comparação ao grupo que não recebeu o implante de PRP. O método de obtenção de plasma rico em plaqueta autólogo de coelhos reduziu o número de leucócitos e hemácias e recuperou o número de plaquetas, sendo este maior ou igual aos valores fisiológicos para a espécie. O PRP obtido foi capaz de acelerar o processo de consolidação óssea em coelhos.(AU)

The aim of this study was to use the platelet-rich plasma obtained by a technique capable of producing an autologous product, with a reduced number of white blood cells and red blood cells and assessed by radiographs, the healing ability of a bone defect induced in the radio rabbits. 10.5mL of blood was collected via intracardiac blood sedimentation and distributed into three tubes containing sodium citrate. The tubes containing the samples were subjected to centrifugation at 2,000 rpm (670.8G) for 20 minutes and the sediment column were aspirated from each plasma tube1,000μL to reduce the supernatant volume. The plasma was aspirated from above the leukocytes ring and transferred to another tube for centrifugation at 2,000 rpm for 10 minutes. The platelet content in the tube bottom was resuspended and homogenized to 1,000μL plasma supernatant PRP to form the liquid. A1.0 cm failure was performed on the left radio of each rabbit. The healing time was observed by means of radiographic examination at 45 and 90 days after surgery. The images were compared between the control group (G1) and the group receiving PRP implant transdermally (G2). The healing progress was assessed with the help of Adobe Photoshop program and a gray scale that represents the contrast. G2 had an average of 63% contrast at 45 days PO and 65% at 90 days PO. In G2, at 45 days PO the average was 42.7% and at 90 days PO 31.25% indicating that there was an increase in bone repair process compared to the group that did not receive the PRP implant. The method of obtaining an autologous platelet rich plasma of rabbits reduced the number of leukocytes and erythrocytes and platelets recovered which is greater than or equal to the physiological range for the species. The obtained PRP was able to accelerate the process of bone healing in rabbits.(AU)

Modulação da resposta inflamatória no útero de éguas tratadas com plasma rico em plaquetas

A endometrite é a causa mais comum de subfertilidade em éguas. Todas as éguas apresentam uma inflamação endometrial fisiológica pós-cobertura; entretanto, 15-20% das éguas têm endometrite persistente pós-cobertura (EPPC). Recentemente, o plasma rico em plaquetas (PRP) vêm se tornando popular no manejo reprodutivo de éguas susceptíveis a EPPC. Atualmente, não existe uma padronização dos métodos de preparação do PRP para uso intrauterino em éguas. Desta forma, este estudo teve como objetivo comparar três métodos de preparação de PRP para infusão intrauterina em éguas e avaliar a resposta inflamatória pós-cobertura, cultura endometrial e recuperação embrionária em éguas suscetíveis a EPPC tratadas com PRP. No primeiro estudo, o PRP foi produzido por três métodos. Método 1, o sangue foi coletado em bolsa de transfusão, transferido para tubos Falcon e duplamente centrifugadas; Método 2, sangue foi coletado em tubos vacutainer e centrifugado uma única vez; Método 3 sangue foi coletado em uma seringa de 60 mL contendo anticoagulante, a qual foi mantida em posição vertical para sedimentar por 4h. Após o processamento, a contagem de células e a viabilidade plaquetária foram avaliadas. Em um subgrupo de éguas (n = 6), o PRP foi avaliado 6 e 24h pós-refrigeração a 5 °C. No estudo 2, éguas (n = 12) suscetíveis a EPPC tiveram três ciclos atribuídos aleatoriamente para receber infusões intrauterinas de LRS (controle), ou PRP autólogo ou plasma pobre em plaquetas (PPP) antes (48 e 24h) e após a inseminação artificial (IA) (6 e 24h). Tanto o PRP quanto o PPP foram obtidos pelo Método 1 no experimento 2. As éguas foram inseminadas com sêmen fresco de um garanhão com fertilidade conhecida. O acúmulo de líquido intrauterino (IUF) e as células polimorfonucleares endometriais (PMNs) foram avaliados a cada 24h até 96h pós-inseminação. Citocinas uterinas (Il, IL6, CXCL8 e IL10) foram avaliadas antes (0h), 6 e 24h após IA, e cultura endometrial três e nove dias após IA. A lavagem do embrião foi realizada 8 dias após a ovulação. Os dados foram analisados com modelo misto, teste post-hoc de Tukeys e regressão multivariada. No estudo 1, o Método 1 resultou no maior e o método 3 nas menores concentrações de plaquetas, e o último teve maior concentração de leucócitos que os outros (P<0,05). A viabilidade das plaquetas foi semelhante entre os tratamentos. O resfriamento por 24h não afetou a contagem de plaquetas. No entanto, a viabilidade plaquetária foi reduzida após o resfriamento do PRP produzido pelo método 3. Estudo 2, o tratamento com PRP reduziu os PMNs endometriais, IUF pós-reprodução e citocinas pró-inflamatórias quando comparados aos ciclos atribuídos pelo controle, mas não significativamente diferente do PPP. Os controles tiveram uma porcentagem significativamente maior de culturas bacterianas positivas (33%) em comparação com os ciclos atribuídos a PRP (0%), enquanto os ciclos tratados com PPP não foram significativamente diferentes dos outros grupos (25%). Os ciclos atribuídos ao PRP tiveram taxas de recuperação embrionária significativamente maiores (83%) do que o controle (33%), embora não significativamente diferente do PPP (60%). Em conclusão, o Método 1 resultou nas maiores concentrações de plaquetas, enquanto o método 3 resultou em maiores contagens de leucócitos. O resfriamento afetou a viabilidade das plaquetas no PRP obtido com o método 3. Resta determinar se os diferentes métodos e o resfriamento afetariam a eficácia clínica do PRP. A infusão de plasma reduziu a duração e intensidade da resposta inflamatória pós-IA e melhorou a recuperação embrionária em éguas suscetíveis a EPPC. As plaquetas parecem ter uma propriedade antimicrobiana e anti-inflamatória dependente da dose

Endometritis is the most common cause of subfertility in mares. All mares display a physiological post-breeding endometrial inflammation; however, 15-20% of mares have persistent breeding-induced endometritis (PBIE). Recently, platelet-rich plasma (PRP) is becoming popular in mare practice to mitigate post-breeding induced endometritis and improve fertility. Currently, there is no standardization of methods to prepare PRP for intrauterine use in mares. This study aimed to compare three methods to prepare PRP for intrauterine infusion in mares and to assess the post-breeding inflammatory response, endometrial culture and embryo recovery in mares susceptible to PBIE treated with PRP. In the first study, PRP was produce by three methods. Method 1, blood was collected in blood transfusion bag, transferred to Falcon tubes and double centrifuged; Method 2, blood was collected in vacutainer tubes and centrifuged once; Method 3, blood was collected in a syringe containing anticoagulant, which was kept in an upright-position to sediment for 4h. After processing, cell counts and platelet viability were assessed. In a subset of mares (n=6), PRP was evaluated at 6 and 24h post-cooling at 5°C. In study 2, mares (n=12) susceptible to PBIE had three cycles randomly assigned in a crossover design to receive intrauterine infusions of LRS (control), or autologous PRP or platelet-poor plasma (PPP) pre- (48 and 24h) and post-breeding (6 and 24h). Both PRP and PPP were obtained by Method 1. Mares were bred with fresh semen from one stallion. Intrauterine fluid accumulation (IUF) and endometrial polymorphonuclear cells (PMNs) were assessed every 24h up to 96h post-breeding. Uterine cytokines (Il, IL6, CXCL8 and IL10) were evaluated before (0h), 6 and 24h post-breeding, and endometrial culture three and nine-days after breed. Embryo flushing was performed 8d post-ovulation. Data were analyzed with mixed model, Tukeys post-hoc test, and multivariate regression. In study 1, Method 1 resulted in the greatest and method 3 in the fewest platelet concentrations, and the latter had greater WBC than the others (P<0.05). Platelet viability was similar across treatments. Cooling for 24h did not affect platelet counts. However, platelet viability was reduced after cooling PRP produced by method 3. Study 2, PRP treatment reduced endometrial PMNs, post-breeding IUF and pro-inflammatory cytokines when compared to control-assigned cycles, but not significantly different than PPP. Controls had a significantly higher percentage of positive bacterial cultures (33%) in comparison to PRP-assigned cycles (0%), whereas cycles treated with PPP were not significantly different from the other groups (25%). The PRP-assigned cycles had significantly higher embryo recovery rates (83%) than the control (33%), though not significantly different than PPP (60%). In conclusion, Method 1 resulted in the greatest platelet concentrations, while method 3 resulted had greater WBC counts. Cooling affected platelet viability in PRP obtained with method 3. It remains to be determined whether the different methods and cooling would affect PRP's clinical efficacy. Plasma infusion reduced the duration and intensity of the post-breeding inflammatory response and improved embryo recovery in mares susceptible to PBIE. Platelets incrementally downregulate PBIE and appear to have a dose-dependent antimicrobial property.

Aspectos hematológicos e epidemiológicos de cães naturalmente infectados por Hepatozoon sp. no município de Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil / Hematological and epidemiological aspects of dogs naturally infected wiht Hepatozoon sp. in the municipalityof Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil

O objetivo deste estudo é descrever os achados hematológicos e epidemiológicos de cães infectadosnaturalmente por Hepatozoon sp. Foram selecionados 48 hemogramas, utilizando-se como critério de inclusão apresença da infecção a partir da detecção de gamontes em esfregaços de sangue periférico. Coinfecção foiconstatada em 20,83% dos animais e incluíram Babesia sp., Ehrlichia sp., Anaplasma sp. Leishmania spp. eCorpúsculos de Lentz. As alterações hematológicas mais frequentes foram anemia (34/48) e trombocitopenia(26/48). Quando se comparou grupos de coinfectados e não coinfectados, observou-se diferença estatísticasignificativa (p<0,05%) em relação aos valores de hemoglobina, volume globular e contagem de plaquetas,indicando que cães coinfectados apresentam alterações hematológicas mais severas em relação aos nãocoinfectados. As alterações no quadro eritrocitário e na concentração plaquetária enfatizam a hipótese decomprometimento hematológico causado pelo Hepatozoon sp. em cães não coinfectados. O agravamento dessesparâmetros pode ser atribuído a associação com outros patógenos

The aim of this study is to describe the hematologic and epidemiological findings of dogsnaturally infected by Hepatozoon sp. 48 hemogram were selected. Gamontes detection in peripheral bloodsmears was the inclusion criterion. Coinfection was found in 20.83% of the animals and included Babesia sp.,Ehrlichia sp., Anaplasma sp. Leishmania spp. and Lentz body inclusion. The most common hematologicabnormalities were anemia (34/48) and thrombocytopenia (26/48). When comparing coinfected and notcoinfected groups, we observed a statistically significant difference (p <0.05%) between hemoglobin, packedcell volume and platelet values, indicating more severe haematological disorders in co-infected dogs than noncoinfected. Changes in erythrocyte framework and platelet concentration emphasize hematological interferencehypothesis caused by Hepatozoon sp. in dogs not coinfected. The deterioration of these parameters can beassigned to combination with other pathogens

Aspectos hematológicos e epidemiológicos de cães naturalmente infectados por Hepatozoon sp. no município de Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil / Hematological and epidemiological aspects of dogs naturally infected wiht Hepatozoon sp. in the municipalityof Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil

O objetivo deste estudo é descrever os achados hematológicos e epidemiológicos de cães infectadosnaturalmente por Hepatozoon sp. Foram selecionados 48 hemogramas, utilizando-se como critério de inclusão apresença da infecção a partir da detecção de gamontes em esfregaços de sangue periférico. Coinfecção foiconstatada em 20,83% dos animais e incluíram Babesia sp., Ehrlichia sp., Anaplasma sp. Leishmania spp. eCorpúsculos de Lentz. As alterações hematológicas mais frequentes foram anemia (34/48) e trombocitopenia(26/48). Quando se comparou grupos de coinfectados e não coinfectados, observou-se diferença estatísticasignificativa (p<0,05%) em relação aos valores de hemoglobina, volume globular e contagem de plaquetas,indicando que cães coinfectados apresentam alterações hematológicas mais severas em relação aos nãocoinfectados. As alterações no quadro eritrocitário e na concentração plaquetária enfatizam a hipótese decomprometimento hematológico causado pelo Hepatozoon sp. em cães não coinfectados. O agravamento dessesparâmetros pode ser atribuído a associação com outros patógenos(AU)

The aim of this study is to describe the hematologic and epidemiological findings of dogsnaturally infected by Hepatozoon sp. 48 hemogram were selected. Gamontes detection in peripheral bloodsmears was the inclusion criterion. Coinfection was found in 20.83% of the animals and included Babesia sp.,Ehrlichia sp., Anaplasma sp. Leishmania spp. and Lentz body inclusion. The most common hematologicabnormalities were anemia (34/48) and thrombocytopenia (26/48). When comparing coinfected and notcoinfected groups, we observed a statistically significant difference (p <0.05%) between hemoglobin, packedcell volume and platelet values, indicating more severe haematological disorders in co-infected dogs than noncoinfected. Changes in erythrocyte framework and platelet concentration emphasize hematological interferencehypothesis caused by Hepatozoon sp. in dogs not coinfected. The deterioration of these parameters can beassigned to combination with other pathogens(AU)

UTILIZAÇÃO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Um dos aspectos relevantes a se considerar para o sucesso durante a produção in vitro (PIV) de embriões é a constituição dos meios que compõem as etapas da biotecnologia reprodutiva. Os meios precisam suprir as necessidades metabólicas tanto dos gametas, durante a maturação oocitária e capacitação espermática, quanto do embrião durante as primeiras divisões celulares. A maior parte dos protocolos de PIV utiliza algum soro sanguíneo na composição dos meios como fonte de hormônios, proteínas, fatores de crescimento e nutrientes. Por outro lado, o soro contém citocinas, vitaminas e muitas outras substâncias que podem afetar a maturação, a fertilização e o desenvolvimento embrionário. Diversos trabalhos vêm reportando a utilização de Plasma Rico em Plaquetas (PRP) como alternativa para utilização de soros fetais durante o cultivo de células, principalmente de células tronco. Outros estudos demonstraram que o PRP está repleto de fatores de crescimento, como FGF, TGF, PDGF, IGF e EGF, bem como fatores de ligação como fibrinogênio e serotonina, vitais para a cultura celular e foliculogênese. Portanto, este trabalho tem por objetivo avaliar a utilização de PRP em substituição ao soro fetal bovino (SFB) durante a maturação de oócitos utilizados na produção in vitro de embriões bovinos. Os complexos cúmulos-oócitos (CCOs) foram distribuídos nos seguintes grupos experimentais durante a maturação in vitro (MIV): Grupo G1 (Meio de MIV com adição de 5% de PRP); Grupo G2 (Meio de MIV com adição de 5% de PRP mais 5% de SFB); Grupo G3 (Meio de MIV com adição de 5% de SFB); e grupo G4 (Meio de MIV sem adição de PRP e/ou SFB); . Após 20 horas de maturação, os CCOs foram passados para a placa de fecundação contendo o meio TALP FERT livre de soros. Aproximadamente 24 horas após a fertilização, os prováveis zigotos foram transferidos para gotas com meio SOF (Synthetic fluid oviduct) contendo 10% de SFB. foram avaliadas as taxas de clivagem e formação de blastocistos nos dias 2 e 7, do desenvolvimento embrionário, respectivamente. Também foi avaliada a qualidade dos CCOs maturados a partir da análise de expressão gênica de alguns marcadores genéticos. Os resultados demonstraram que não houveram diferenças significativas em relação aos grupos experimentais no tocante a taxas de produção de embriões (tanto nas primeiras clivagens quanto na formação de blastocistos) evidenciando que o PRP pode se tornar uma alternativa mais barata na PIVE em comparação ao SFB.

One of the relevant aspects to be considered for success during the in vitro production (IVP) of embryos is the constitution of the means that make up the stages of reproductive biotechnology. The media must meet the metabolic needs of both gametes, during oocyte maturation and sperm formation, and of the embryo during the first cell divisions. Most IVP protocols use some blood serum in the composition of the media as a source of hormones, proteins, growth factors, and nutrients. On the other hand, the serum contains cytokines, vitamins and many other substances that can affect maturation, fertilization, and embryonic development. Several studies have reported the use of Platelet Rich Plasma (PRP) as an alternative to the use of fetal sera during cell culture, mainly stem cells. Other studies have shown that PRP is full of growth factors, such as FGF, TGF, PDGF, IGF, and EGF, as well as binding factors such as fibrinogen and serotonin, which are vital for cell culture and folliculogenesis. Therefore, this work aims to evaluate the use of PRP to replace fetal bovine serum (SFB) during the maturation of oocytes used in the in vitro production of bovine embryos. Cumulus-oocyte complexes (CCOs) were distributed in the following experimental groups during in vitro maturation (IVM): Group G1 (IVM medium with addition of 5% PRP); Group G2 (MIV medium with addition of 5% PRP plus 5% SFB); Group G3 (MIV medium with addition of 5% SFB); and group G4 (MIV medium without addition of PRP and/or SFB). After 20 hours of maturation, the CCOs were passed to the fertilization plate containing the serum-free TALP FERT medium. Approximately 24 hours after fertilization, the probable zygotes were transferred to drops with SOF (Synthetic fluid oviduct) medium containing 10% SFB. the rates of cleavage and blastocyst formation were evaluated on days 2 and 7, of embryonic development, respectively. The quality of matured CCOs was also evaluated from the analysis of gene expression of some genetic markers. The results demonstrated that there were no significant differences in relation to the experimental groups regarding embryo production rates (both in the first cleavages and in the formation of blastocysts), showing that PRP can become a cheaper alternative in PIVE compared to SFB

Uso de plasma rico em plaquetas em úlceras de córnea em cães / Use of platelet rich plasma on corneal ulcers in dogs

Este trabalho teve por objetivo avaliar, clínica e macroscopicamente, o tratamento adjuvante com plasma rico em plaquetas na forma de colírio ou tampão, em úlceras de córnea de cães atendidos no Serviço de Oftalmologia Veterinária. Foram analisados 20 olhos com diagnóstico de ceratite ulcerativa, distribuídos em dois grupos experimentais. O grupo colírio (GC) foi constituído por olhos tratados topicamente com colírio autólogo de plasma rico em plaquetas (PRP), e o grupo tampão (GT) por olhos submetidos ao tratamento à base de tampão sólido de PRP, associado ao recobrimento com terceira pálpebra para retenção deste. Os grupos foram avaliados, por meio de avaliação clínica, macroscópica e análise da redução do defeito epitelial, em diferentes momentos, aos três, cinco, dez, 15 e 30 dias, com exceção do terceiro dia no GT. O recobrimento da terceira pálpebra foi removido no quinto dia no GT. Em ambos os grupos, houve redução dos sinais de inflamação, melhora na sensibilidade ocular e adequada reparação do defeito epitelial. Todos os olhos do GT apresentaram completa cicatrização no quinto dia e 70% no GC, atingindo a totalidade no 10º dia. O PRP na forma de colírio ou tampão é uma excelente terapia adjuvante a ser instituída no tratamento clínico da úlcera de córnea em cães, pois atua na diminuição dos sinais inflamatórios, da dor ocular e auxilia potencialmente na cicatrização do defeito epitelial.(AU)

This study aims to clinically and macroscopically evaluate the adjuvant therapy with platelet-rich plasma in the form of eyedrops or clot, for corneal ulcers in dogs treated at the Veterinary Ophthalmology Service. We analyzed 20 eyes diagnosed with ulcerative keratitis, divided into two experimental groups. The eyedrop group (GC) was composed of eyes treated topically with eyedrops of autologous platelet-rich plasma (PRP), and the clot group (GT) was composed of eyes treated with a platelet-rich clot and covered with a third eyelid for retention of the clot. The groups were evaluated by clinical and macroscopic analysis and by the analysis of epithelial defect reduction, at different times, at three, five, ten, 15 and 30 days, except for the third day in GT. The coverage of the third eyelid was removed on the fifth day. In both groups the inflammation signs reduced, there was an improvement in ocular sensibility and proper repair of epithelial defect. All GT eyes and 70% GC eyes showed complete healing on the fifth day, the remainder of GC completed healing on the tenth day. PRP in the form of eyedrops and clot is an excellent adjuvant therapy to be instituted in the clinical treatment for corneal ulcer in dogs, because it decreases the inflammatory signs and the ocular pain and it potentially assists in healing epithelial defects.(AU)

Células-tronco mononucleares associadas ao plasma rico em plaquetas na consolidação de falha óssea no cão. Estudo piloto / Mononuclear stem cells associated with platelet-rich plasma in the consolidation of bone defects in dogs. A pilot study

A padronização de técnicas e o teste da associação do Plasma Rico em Plaquetas (PRP) e das Células-Tronco Mononucleares (CTMs) na consolidação de falhas ósseas corticais, por meio de avaliação clínica, biomecânica, radiológica e histológica, é avaliada em um estudo piloto. Foram utilizados seis cães adultos, fêmeas, sem raça definida, pesando entre 5 e 10kg, separados por sorteio aleatório em seis tratamentos. Foi confeccionada uma falha elíptica de 1,0x0,4cm na cortical medial diafisária da tíbia direita de cada animal, sendo preenchida de acordo com o tratamento proposto. No cão I, a falha foi preenchida com solução fisiológica (SF); no II, com o PRP; no III, com a fração total das células mononucleares (FTCM); no IV, com a fração vascular estromal (FVE); no V, com o PRP associado à FTCM; no VI, com a associação PRP e FVE. Foram realizadas avaliações: clínicas, diariamente; dos graus de claudicação, semanalmente; radiológica e perimetria da coxa, antes, no pós-operatório imediato, aos 7, 14, 21 e 30 dias; biomecânica, antes do procedimento, aos 10, 20 e 30 dias; e biópsias, aos 15 e 30 dias. A FTCM obteve uma contagem e viabilidade média de 2,0x108cél. e 90%, respectivamente, enquanto a FVE obteve 3x106cél. e 50%. O PRP concentrou, em média, sete vezes o número inicial de plaquetas do sangue total, de 250.000 µl-1 plaquetas no sangue total para 1.750.000 µl-1 plaquetas no PRP. Obteve-se padronização adequada de técnicas, possibilitando o teste da associação entre as células-tronco mononucleares (CTMs) e o plasma rico em plaquetas (PRP), assim como seu uso isolado, no reparo de falhas ósseas corticais, indicando a possibilidade de a associação FTCM e PRP ser o melhor tratamento.(AU)

The standardization of techniques and tests of the association of Platelet Rich Plasma (PRP) and Mononuclear Stem Cells (MSCs) in the consolidation of cortical bone defects by clinical, biomechanical, radiological, and histological analysis is evaluated in a pilot study. Six adult female dogs of mixed breed, weighing between 5 and 10kg, separated by random draw in six treatments were used. An elliptical failure of 1.0 x0.4cm was done in the medial diaphyseal cortical of the right tibia of each animal, that was filled according with the proposed treatment. In dog I, the failure was filled with saline (S), in dog II with PRP, in dog III with total mononuclear cell fraction (TMCF), in dog IV with stromal vascular fraction (SVF), in dog V with association of PRP and TMCF, and in dog VI with an association of PRP and SVF. Daily clinical evaluation, weekly degrees of lameness, radiological and girth before, immediate postoperative, 7, 14, 21 and 30 days, biomechanics before the procedure, at 10, 20 and 30 days, and biopsies at 15 and 30 days were performed. The TMCF got a count and viability of 2,0x108cells and 90% respectively, while for SVF it was 3x106cells and 50%, respectively. The PRP concentrated on average seven times the original number of platelets from whole blood, platelets from whole blood 250.000 μl-1 to 1.750.000 μl-1 platelets in PRP. This afforded adequate standardization of techniques, enabling the test of association between mononuclear stem cells (MSCs) and platelet-rich plasma(PRP), as well as their separate use to repair cortical bone defects, indicating the possibility of the association between FTCM and PRP to be the best treatment.(AU)

USO ALOGÊNICO DE CÉLULAS-TRONCO E PLASMA RICO EM PLAQUETAS NO TRATAMENTO DE CERATOCONJUNTIVITE SECA EM CÃO

O objetivo deste estudo foi comparar e avaliar a aplicação de célula tronco mesenquimal de tecido adiposo (CTM-TA) e plasma rico em plaquetas aquecido alogênico (PRP-AA) perilacrimal em cães com ceratoconjuntivite seca (CCS), bem como, se há diferença na resposta segundo o grau de gravidade da afecção. Foram analisados 20 cães com produção lacrimal <15mm/min e distribuídos aleatoriamente em dois grupos (n=10). O grupo 1 tratado com CTM-TA (5x106 e 3x106 células) (GCTM-TA) e com grupo 2 PRP-AA (0,7mL e 0,3mL) (GPRP-AA), ambos injetados perilacrimal nas glândulas lacrimal principal e da terceira pálpebra, respectivamente. Todos os olhos foram avaliados em quatro momentos (M0 M15, M30, M60 dias). As variáveis avaliadas foram: osmolaridade da lágrima; teste lacrimal de Schirmer (TLS); sensibilidade corneal; tempo de ruptura do filme lacrimal (TRFL); pressão intraocular; espessura corneal; e biopsia da conjuntiva bulbar, além das variáveis clínico-oftalmológicas. Houve melhora nos dois grupos a partir de M15 (p<0,05) na qualidade do filme lacrimal, avaliada por meio da osmolaridade e TRFL, sem diferença entre os grupos. A produção de lágrima aumentou, entretanto notou-se diferença significativa nos animais com CCS discreta no GPRP-AA a partir do M30, e nos cães com CCS grave no GCTM-TA a partir do M30 e no GPRP-AA a partir do M60. Verificou-se melhora dos sinais clínicos da inflamação em ambos os grupos. Aplicação única perilacrimal de CTM-TA e PRP aquecido alogênicos normaliza a qualidade do filme lacrimal e melhora os sinais clínicos da inflamação em cães com CCS e a resposta ao tratamento está associada a gravidade da doença

The aim of the study was to compare and evaluate the application of allogenic mesenchymal stem cell adipose tissue derived (MSCs-AD) and inativate platelet-rich plasma allogenic (PRP-IA), perilacrimal in dogs with keratoconjunctivitis sicca (KCS), and if there is difference in the response according to the degree of severity of the condition. Twenty dogs with lacrimal production <15mm/min randomly assigned to two groups were used. Group treated with MSCs-AD (5x106 and 3x106) (GMSCs-AD) and with PRP-IA (0.7ml and 0.3ml) (GPRP-IA), both intralacrimal in the main lacrimal glands and third eyelid, respectively. The eyes were evaluated in four moments after application (M0 M15, M30, M60). The variables evaluated were: tear osmolarity e; Schirmer's tear test (STT); sensitivity corneal; tear film break time (TBUT); intraocular pressure; corneal thickness; and biopsy of the bulbar conjunctiva, in addition to clinical-ophthalmologic variables. There was improvement in two groups at M15 (p <0.05) on tear film quality, assessed by osmolarity and TBUT, with there was no difference between groups. STT increased, however, statistical difference was only observed in animals with mild KCS in the GPRP-IA from the M30 and in the intense KCS at M30 in the G MSCs-AD and at M60 in the GPRP-IA. There was an improvement in the clinical signs of inflammation in both groups. The unique Intralacrimal application of MSCs-AD and PRP-IA normalizes tear film quality and improves clinical signs of inflammation in dogs with KCS, response to treatment is associated with disease severity

POTENCIAL INFLAMATÓRIO DA MEMBRANA PLAQUETÁRIA NO LÍQUIDO SINOVIAL DE EQUINOS

O plasma rico em plaquetas (PRP) é utilizado no tratamento de enfermidades articulares, porém, após a aplicação de PRP intra-articular, observa-se se observa algumas reações adversas locais em equinos, como efusão sinovial, influxo celular e aumento da concentração de PGE2 sinoviais. Os antígenos da membrana plaquetária podem causar diversas alterações imunológicas e alterar a expressão de proteínas. O lisado plaquetário (LP) seria uma alternativa para a aplicação do conteúdo íntegro do PRP, porém sem a membrana plaquetária. Portanto, esse trabalho tem por finalidade a investigação do possível potencial inflamatório da membrana plaquetária no líquido sinovial e comparação com o PRP, após a indução de sinovite experimental aguda. Foram utilizadas 20 articulações radiocárpicas de equinos hígidos. Cada grupo foi composto por 5 articulações sendo eles: o grupo controle, grupo PRP, grupo LP e grupo LPS. O grupo PRP recebeu o tratamento com plasma rico em plaquetas, o grupo LP recebeu o lisado plaquetário e o grupo LPS recebeu o tratamento com lipopolissacarideo. Todos os grupos, menos o controle, receberam a dose de 0,25 ng/mL intra-articular, e foi colhido amostras de líquido sinovial em seriados momentos (0,4,8,24, 48 horas e 7 dias) e exame físico individual de cada animal. Além disso, foi feito a dosagem de PGE2. Os resultados após indução da sinovite experimental aguda e a aplicação do LP e PRP, apontaram que houve alterações semelhantes no líquido sinovial e redução dos sinais de inflamação da mesma forma em ambos os grupos (P< 0,05). Desta maneira, o uso do LP foi semelhante em comparação com o PRP intra-articular, na redução da inflamatória articular local.

Platelet-rich plasma (PRP) is used in the treatment of joint diseases, however, after administered of intra-articular PRP, there are some local adverse reactions in horses, as synovial effusion, cellular influx and increased concentration of synovial PGE2. Antigens of the platelet membrane can case various immunological changes and alter the expression of proteins. Platelet lysate (LP) would be an alternative for the application of the full content of PRP, but without the platelet membrane. Therefore, this work is to investigate the possible inflammatory potential of the platelet membrane in the synovial fluid and to compare it with PRP after the induction of acute experimental synovitis. Twenty radiocarpal joints of healthy horses were used. Each group consisted of 5 joints: the control group, the PRP group, the LP group and the LPS group. The PRP group received treatment with platelet rich plasma, the LP group received the platelet lysate.All groups, except the control, received the intra- (0,4,8,24, 48 hours and 7 days) and physical examination of each animal. In addition, PGE 2 was dosed. The results after induction of acute experimental synovitis and the application of LP and PRP, indicated that there were similar alterations in the synovial fluid and reduction of the signs of inflammation in the same way in both groups (P< 0,05). In this method, the use of LP was similar in comparison to the intra-articular PRP, in the reduction of local inflammatory joint.

Comparação entre três protocolos de obtenção de plasma rico em plaquetas (PRP) utilizando o coelho como modelo experimental / Comparison of Three Protocols to Obtain Platelet Rich Plasma (PRP) with Rabbits as Experimental Model

Background: Platelet rich plasma (PRP) is a blood-derived source of growth factors and several cytokines, which are essential for tissue regeneration and important for wound healing due to their angiogenic, mitogenic, and chemotactic activities. To date no protocol has been established for PRP production. Standardization of this technique should consider fundamental factors such as experimental model used, blood collection method, anticoagulant choice, rotation and amount of centrifugations, elapsed time between sample activation and its clinical use in order to ensure quality and biological effects of the product. This study aimed to compare three protocols for PRP achievement in order to evaluate platelet enrichment ability and method reproducibility for further use in clinical investigations regarding PRP therapeutic properties. Materials, Methods & Results: New Zealand higid rabbit's whole blood was collected in tubes containing sodium citrate. Samples were obtained through exsanguination, via abdominal aortic puncture, and separated in four aliquots designed for PRP processing and basal platelet count. The count was conducted at the time blood was collected and after every concentration protocol. Methods were tested in triplicates, and three different individuals repeated each technique for three times, reaching 27 repetitions. Selected methodologies consisted in two centrifugations protocols: protocol A used 250 g for 10 min for the first separation, and another 10 min at 2000 g during the second centrifugation; protocol B proposed that first centrifugation would last 20 min at 160 g, and the second would last 15 min at 400 g, and protocol C consisted of 10 min at 400 g for the first separation, and 10 min at 800 g during second separation. Protocols were performed at the same time in three similar centrifuges, in order to standardize the variables (operator, time, environment, equipments), and also to diminish biases. Comparison objects in this study include: ability of raising platelet concentration, time required for preparing the final product, reproduction handiness, and need for equipment for proper hemoconcentrated production. Achieved platelet count in each protocol and basal value were analyzed following randomized complete. Kurskal-Wallis test was used for independent samples comparison, considering a 5% significance level. For each tested sample, elapsed time for product preparation was evaluated. Subjective analyzes comprehended execution easiness and the need for special material, and were evaluated through questionnaire after each protocol. Protocol A showed a 25-fold increase in platelet count, whereas protocols B and C had 13 and 7-fold, respectively. Results indicate all protocols were efficient in concentrating the samples at least 3 times more than basal count. Elapsed time for product preparation in each protocol was 35, 52, and 41 min for A, B, and C methods, respectively. Subjective analyzes considered protocols A and C as low complexity, and protocol B was defined as medium complexity in regards to execution. With reference to material accessibility for protocols, all were considered of easy reproducibility. Discussion: Besides analyzing experimental model and most proper way to access blood collection, this study was limited to verify in a quantitative manner the platelet concentration in specific protocols, without evaluating their biological effects. Therefore, in regards to proposed objectives - relation between platelet concentration increase, spent time, and easiness of protocol - we conclude that protocol A, formulated by Nagae et al. (2007), was the method that most fitted the work needs, and greatly suited the challenges posed.

AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA EFICÁCIA NA OBTENÇÃO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) PRODUZIDO A PARTIR DE SANGUE DE MUAR (Equus caballus X Equus asininus) E EQUINOS (Equus caballus) SADIOS.

O uso do Plasma Rico em Plaquetas (PRP) autólogo apresenta resultados positivos em diversas enfermidades na medicina equina, tais como tendinites e desmites, no tratamento de feridas, osteoartrite e na cicatrização de fraturas. No entanto, a falta de padronização dos protocolos de preparo do PRP torna difícil a avaliação dos resultados clínicos. O objetivo desse estudo foi avaliar comparativamente a eficácia de obtenção do plasma rico em plaquetas (PRP) utilizando dois protocolos distintos, produzido a partir de sangue de muares (Equus caballus x Equus asininus) e equinos (Equus caballus) sadios. Para este estudo, foram coletados 54mL de sangue total de 19 equídeos sadios, sendo 8 equinos da raça Quarto de Milha, e 11 Muares subdivididos em 12 tubos a vácuo com citrato de sódio a 3,2%. As amostras de cada grupo foram submetidas ao protocolo I com descanso de 2 horas no final do processamento do PRP e o protocolo II com 2 horas de descanso antes do processamento do PRP. A força g e o tempo de centrifugação foram as mesmas utilizados para ambos os protocolos. Após as centrifugações foram aliquotadas 2mL do plasma e congelados para análise do VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular) (estágio A e B) e o PRP (estágio C) por meio de ELISA. Verificou-se que a concentração plaquetária no grupo do protocolo II dos equinos foi superior ao grupo do protocolo I (p< 0,01; 95%), enquanto que nos muares, o protocolo I apresentou uma média de plaquetas no PRP de 816,9 x 103/µL ± 177,50 e para o protocolo II uma média foi de 769,1 x 103/µL ± 212,20, não havendo diferenças significativas. Ao mensurar os níveis de VEGF nos diferentes estágios da produção do PRP, os mesmos não apresentaram diferenças significativas. Desta forma concluímos que não houve ativação plaquetária no processamento do PRP. O protocolo II é o mais eficaz na concentração do PRP em equinos e não difere quanto à eficácia para os muares. Ao comparar as espécies, os muares forneceram o PRP mais concentrado que dos equinos.

Autologous platelet rich plasma (PRP) has been used with positive results in equine veterinary medicine to treat conditions such as tendonitis, desmitis, in wound healing, osteoarthritis and fracture healing. However, lack of standardization for PRP preparation protocols make it difficult to evaluate clinical results. This study evaluates platelet yield using two different PRP preparation protocols from blood obtained from healthy horses (Equus caballus) and mules/jacks (Equus caballus x Equus asininus). Fifty four millilitres of whole blood were collected into twelve 3.2% sodium citrate evacuated tubes from 19 animals, eight horses and eleven mules/jacks. The samples were subjected to different procedural protocols (I and II) using the same g force and centrifugation time but with different moments of sample resting. After the centrifugations, 2mL of the plasma were aliquoted and frozen for analysis of VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) (stage A and B) and PRP (stage C) by ELISA. Mean platelet counts in protocol II were significantly higher than protocol I for the horses (p< 0.01; 95%) while there were no significant differences (p = 0.49) between protocols for the mules (protocol I mean PRP platelet count 816.900 x 103.000/µL ± 177.500; protocol II mean PRP platelet count 769.100 x 103.000/µL ± 212.200). When measuring VEGF levels at the different stages of PRP production, there were no significant differences, indicating there was no platelet activation and degranulation during processing. In conclusion, protocol II for PRP preparation produces a higher yield for horses but not for mules. When species were compared, mules offered a higher platelet yield than horses.

Utilização de plasma rico em plaquetas e rosuvastatina no processo cicatricial de feridas de coelhos: estudo longitudinal

Utilização de plasma rico em plaquetas e rosuvastatina no processo cicatricial de feridas de coelhos: estudo longitudinal A engenharia tecidual, assim como a medicina regenerativa são campos que vêm crescendo nos últimos anos, tendo o objetivo de reparar, regenerar ou substituir tecidos e órgãos lesados. O PRP tem sido bastante estudado nas áreas de cirurgia plástica e dermatologia com enfoque na remodelação de cicatrizes. Numerosos estudos com ainda estão sendo feitos em busca de novas descobertas relacionadas a esse elemento sanguíneo. Evidências estão se mostrando favoráveis ao uso de estatinas em lesões de pele, Além de reduzir o colesterol, as estatinas melhoram a função endotelial, aumentam a estabilidade das placas ateroscleróticas e inibem o processo inflamatório. Neste sentido, o presente estudo analisou as fibras colágenas de feridas de coelhos após tratamento PRP associado ou não à RSV. A hipótese baseia-se que o uso seriado da RSV associado ao PRP possa melhorar a quantidade das fibras colágenas neoformadas após lesão experimentalmente induzida. Foram utilizados 8 coelhos da raça Nova Zelândia, machos, adultos, tratados com PRP autólogo, rosuvastatina (RSV) e associação (PRP+RSV) Para confecção das quatro feridas no dorso de cada coelho utilizou-se um punch de 8mm. A ferida considerada controle foi tratada com solução de cloreto de sódio a 0,9%® e as demais tratadas com PRP isolado e/ou associado à RSV. Os curativos forma trocados a cada 4 dias com aplicação do PRP e rosuvastatina até completarem 16 dias de experimento. Aos 0,7,10,14 e 17 dias foram feitas biópsias para avaliação histopatológica do tecido cicatricial. Com relação à avaliação histopatológica, verificou-se que, ao final de 17 dias de tratamento, houve reepitelização em 100% das feridas que receberam somente PRP, contrapondo com 50% só com rosuvastatina e 75% quando houve associação do biomaterial com a estatina. A associação da rosuvastatina ao PRP inibiu a perda de sangue. O uso do PRP isolado proporcionou 62,5% de neovascularização, contra 50% nas feridas que tiveram associação dos tratamentos. Com relação porcentagem de fibras colágenas ao 170 dia, todas as feridas apresentaram maior porcentagem de fibras quando comparadas ao controle (78,27±4,69). Embora estatisticamente iguais, observou-se que a ferida que recebeu somente a RSV apresentou a menor quantidade de fibras colágenas(85,98±3,51). Já as feridas que receberam PRP ou PRP e RSV apresentaram, respectivamente 90,07±6,20 e 90,76±3,51. Conclui-se que o PRP possui maior atividade nos sete primeiros dias da lesão e que o tratamento com a RSV, sozinho ou associado ao PRP não potencializou as demais fases da cicatrização, nem aumentou a porcentagem de fibras colágenas.

Tissue engineering, as well as regenerative medicine, are fields that have been growing in recent years, aiming to repair, regenerate or replace damaged tissues and organs. PRP has been extensively studied in the areas of plastic surgery and dermatology with a focus on scar remodeling. Numerous studies with are still being done in search of new findings related to this blood element. Evidence is proving to favor the use of statins in skin lesions. In addition to lowering cholesterol, statins improve endothelial function, increase the stability of atherosclerotic plaques, and inhibit the inflammatory process. In this sense, the present study analyzed the collagen fibers of rabbit wounds after PRP treatment associated or not to RSV. The hypothesis is that serial use of RSV associated with PRP may improve the amount of neoformed collagen fibers after experimentally induced injury. 8 male New Zealand rabbits treated with autologous PRP, rosuvastatin (RSV) and association (PRP + RSV) were used to prepare the four wounds on the back of each rabbit. The treated wound was treated with 0.9% sodium chloride solution and the others treated with PRP isolated and / or associated with RSV. The dressings were changed every 4 days with application of PRP and rosuvastatin until 16 days of experiment. Biopsies were made at 0,7,10,14 and 17 days for histopathological evaluation of the scar tissue. Regarding the histopathological evaluation, at the end of 17 days of treatment, there was re-epithelialization in 100% of the wounds that received PRP only, opposing with 50% only with rosuvastatin and 75% when there was an association of the biomaterial with the statin. The combination of rosuvastatin and PRP inhibited blood loss. The use of PRP alone provided 62.5% of neovascularization, against 50% in wounds that had association of treatments. With regard to the percentage of collagen fibers at 170 days, all wounds had a higher percentage of fibers when compared to the control (78.27 ± 4.69). Although statistically equal, it was observed that the wound that received only RSV had the lowest amount of collagen fibers (85.98 ± 3.51). Wounds that received PRP or PRP and RSV presented 90.07 ± 6.20 and 90.76 ± 3.51, respectively. It is concluded that the PRP has greater activity in the first seven days of the lesion and that the treatment with RSV, alone or associated with PRP did not potentiate the other phases of healing, nor did it increase the percentage of collagen fibers.

Platelet activation: ultrastructure and morphometry in platelet-rich plasma of horses / Ativação plaquetária: ultraestrutura e morfometria no plasma rico em plaquetas de equinos

This study was conducted to investigate the activation ability of the platelet-rich plasma (PRP) by pharmacological agents, as well as to verify the need or not of this activation for therapeutic use. The PRP was obtained from four healthy crossbred geldings aged 13 to 16 years (15±1years), and was processed for observation and quantification of the platelet morphology by using the transmission electron microscopy. All PRP samples were activated with 10 percent calcium chloride (CaCl2) solution, pure bovine thrombin or associated with CaCl2. The control (pure PRP) was not pharmacologically activated. In the pure PRP samples, 49 percent of the platelets were classified as state of activation uncertain, 41 percent as resting, 9 percent as fully activated and 1 percent as irreversibly damaged. Treatment with 10 percent CaCl2 provided a distribution of 54 percent platelets in state of activation uncertain, 24 percent as fully activated, 20 percent as resting, and 2 percent as irreversibly damaged. The platelet morphology of the bovine thrombin treated samples did not fit into classification adopted, as showing irregular shape with emission of large filamentous pseudopods, appearance of ruptured and whole granules in the remaining cytoplasm and extracellular environment. There was effect of the treatment on the platelet morphology (P=0.03). The 10 percent CaCl2 is an adequate platelet-activating agent. However, in cases the use of PRP under its liquid form is necessary, the use of pure PRP is recommended, since besides presenting an adequate percentage of fully activated platelets it also has significant amount of the resting type, which can be activated by substances found in the injured tissue.(AU)

O objetivo desse estudo foi investigar a capacidade de ativação do plasma rico em plaquetas (PRP) por substâncias farmacológicas, assim como verificar a necessidade ou não dessa ativação para uso terapêutico. O PRP foi obtido de quatro equinos mestiços hígidos, machos castrados, com 13 a 16 anos (15±1anos) de idade, e processado para observação e quantificação da morfologia plaquetária mediante a utilização da microscopia eletrônica de transmissão. Todas as amostras de PRP foram ativadas com cloreto de cálcio (CaCl2) a 10 por cento, trombina bovina pura ou associada a CaCl2. O controle (PRP puro) não foi ativado farmacologicamente. Nas amostras de PRP puro, 49 por cento das plaquetas foram classificadas como ativação incerta, 41 por cento em repouso, 9 por cento totalmente ativada e 1 por cento com dano irreversível. O tratamento com CaCl2 a 10 por cento proporcionou uma distribuição de 54 por cento de plaquetas com ativação incerta, 24 por cento totalmente ativada, 20 por cento em repouso, e 2 por cento como com dano irreversível. Amostras tratadas com trombina bovina apresentaram morfologia plaquetária que não se enquadraram na classificação adotada, apresentando forma irregular com emissão de grandes pseudópodes filamentosos, aspecto de rompimento e grânulos inteiros no citoplasma remanescente e meio extracelular. Houve efeito do tratamento sobre a morfologia plaquetária (P=0,03). O CaCl2 a 10 por cento é um adequado agente ativador de plaquetas. Entretanto, nos casos onde se faz necessário o uso de PRP na forma mais líquida, recomenda-se o uso do PRP puro, que além de apresentar uma adequada porcentagem de plaquetas totalmente ativadas, também possui importante quantidade do tipo em repouso, que pode ser ativado por substâncias presentes no tecido lesionado.(AU)

Comparação entre protocolos de obtenção de plasma rico em plaquetas em cães: estudo celular

VIDAL JUNIOR, André William Masseaux. Comparação entre protocolos para obtenção de plasma rico em plaquetas em cães: estudo celular. 2017. 67p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária, Ciências Clínicas). Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2017. Foi proposto por esse estudo avaliar dois protocolos (PA e PB) para obtenção de PRP canino autólogo, de fácil execução em ambulatório (método semiautomático) e de boa qualidade (capacidade de concentração de plaquetas, avaliação qualitativa da morfologia das plaquetas e reduzida contaminação com eritrócitos), para posteriormente propor diferentes indicações terapêuticas desses PRP como agentes moduladores de recuperação tecidual, de acordo com o padrão celular leucocitário observado. Para isso foram utilizados 20 cães (Canis lupus familiaris) atendidos no Hospital Veterinário da UFRRJ (HV), machos e fêmeas, com idade variando entre 1 e 7 anos (média 4 anos), considerados saudáveis clinica e hematologicamente que se destinavam para cirurgias eletivas e/ou consultas de rotina. Após tricotomia e antissepsia adequadas, eram coletados 8 mL de sangue por venopunção da jugular sendo imediatamente acondicionados em dois frascos de 4 mL, do tipo vacuntainer, contendo citrato de sódio a 3,2%. O protocolo A utilizando centrifugação dupla com 210 xG e 370 xG e protocolo B utilizando centrifugação dupla com 140 xG e 330 xG. Amostras de PRP obtidas a partir de cada protocolo foram destinadas a contagem de plaquetas, hemácias e leucócitos em câmara de Neubauer, contagem diferencial dos leucócitos e observação da morfologia das plaquetas em esfregaços. Analisou-se os dados (médias e desvios padrão) pelo Teste t com 95% de probabilidade (p<0,05) utilizando-se correlação de Pearson para testar a relação entre a contagem de plaquetas e hemácias, plaquetas e leucócitos e leucócitos em relação as hemácias. Houve correlação negativa muito fraca entre plaquetas e leucócitos (= -0,03), negativa fraca entre plaquetas e hemácias (= -0,3) e correlação positiva forte entre leucócitos e hemácias (=0,75). Embora o protocolo B não tenha alcançando a média um milhão de plaquetas desejado (979300 ± 79631 células/µL), ambos os protocolos, A e B (4,42 ± 1,61 e 3,85 ± 1,55 vezes mais plaquetas que o sangue total, respectivamente) (p<0,05) foram eficientes em concentrar plaquetas. Os prolongamentos citoplasmáticos evidenciando ativação plaquetária estiveram presentes em 26,55 ± 6,72 % das plaquetas do protocolo A e 26,25 ± 7,03 % nas do protocolo B (p>0,05). PA e PB apresentaram reduzido número de hemácias (p>0,05) consideradas contaminantes das amostras e, quanto a quantidade de leucócitos, o protocolo A apresentou mais glóbulos brancos (p<0,05) que o protocolo B com maiores concentrações de basófilos, segmentados e linfócitos. Palavras-chave: fatores de crescimento, concentrado de plaquetas, terapia celular, caninos.

ABSTRACT VIDAL JUNIOR, André William Masseaux. Comparison between protocols for obtaining platelet-rich plasma in dogs: a cellular study. 2017. 67p. Dissertation (Master degree in Veterinary Medicine, Clinical Sciences). Veterinary Institute, Federal Rural University of Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2017. It was proposed by this study to evaluate two protocols (PA and PB) to obtain autologous canine PRP, which is easy to perform in an ambulatory (semiautomatic method) and of good quality (platelet concentration, qualitative evaluation of platelet morphology and low contamination with Erythrocytes), to later propose different therapeutic indications of these PRPs as tissue modulating agents, according to the observed cellular leukocyte pattern. For this purpose, 20 dogs (Canis lupus familiaris) were used at the UFRRJ (HV) Veterinary Hospital, males and females, aged between 1 and 7 years (mean 4 years), considered clinically and hematologically healthy for elective surgeries and / or routine consultations. After adequate trichotomy and antisepsis, 8 mL of blood were collected by venipuncture of the jugular, being immediately packed in two 4 mL flasks, vacuntainer type, containing sodium citrate 3,2%. Protocol A using double centrifugation with 210 xG and 370 xG and protocol B using double centrifugation with 140 x G and 330 x G. PRP samples obtained from each protocol were used to count platelets, erythrocytes and leukocytes in the Neubauer chamber, differential leukocyte counting and observation of platelet morphology in smears. Data (mean and standard deviations) were analyzed by the 95% probability t test (p <0,05) using Pearson's correlation to test the relationship between platelet and erythrocyte counts, platelets and leukocytes and leukocytes in Relation to red blood cells. There was a very weak negative correlation between platelets and leukocytes ( = -0,03), weak negative between platelets and erythrocytes ( = -0,3) and strong positive correlation between leukocytes and erythrocytes ( = 0,75). Although Protocol B did not reach the desired one million platelets average (979300 ± 79631 cells / L), both protocols, A and B (4,42 ± 1,61 and 3,85 ± 1,55 times more platelets than Total blood, respectively) (p <0,05) were efficient in concentrating platelets. The cytoplasmic prolongations evidencing platelet activation were present in 26,55 ± 6,72% of platelets of protocol A and 26,25 ± 7,03% in those of protocol B (p> 0,05). A and B presented a small number of red blood cells (p> 0,05), which were considered to be contaminants of the samples and, for the quantity of leukocytes, protocol A presented more white blood cells (p <0,05) than protocol B with higher concentrations of basophils , and lymphocytes. Keywords: growth factors, platelet concentrate, cell therapy, canines.