Ethylene responsive element binding factors contributes to waterlogging tolerance by regulating photosynthetic and physiological parameters in petunia / Os fatores de ligação do elemento responsivo ao etileno contribuem para a tolerância ao encharcamento, regulando os parâmetros fotossintéticos e fisiológicos na petúnia

ABSTRACT: Ethylene-responsive element binding factors (ERFs) are widely involved in the regulation of plant responses to different abiotic stresses. In petunia (Petunia × hybrida), PhERF2 belonging to the subfamily Ⅶ of ERF transcription factors participates in the response to waterlogging stress. In this study, we investigated waterlogging tolerance variation of WT and transgenic petunia plants with RNAi silencing and overexpression of PhERF2 through photosynthetic and physiological performance. Chlorophyll content and root vigor declined continuously in both WT and PhERF2 transgenic lines under waterlogging stress, but the extent of the fall in PhERF2-overexpressing lines was less than that in WT and PhERF2-RNAi lines. At the end of waterlogging treatment, soluble protein levels in PhERF2-overexpressing lines were significantly higher than those in WT and PhERF2-RNAi lines, while the latter showed a higher malondialdehyde content overall. Different degrees of reductions in Pn, Gs, and Tr levels occurred in both WT and PhERF2 transgenic lines upon exposure to waterlogging. The Ci levels of PhERF2-overexpressing lines decreased after 3 hours of waterlogging treatment, and the Ci levels of WT and PhERF2-RNAi lines gradually increased from 6 to 72 hours of waterlogging treatment. These data suggested that non-stomatal factors were the primary limiting factors for Pn in WT and PhERF2-RNAi lines under severe stress, while the stomatal opening was the main factor limiting Pn in PhERF2-overexpressing lines. Our results demonstrated that the contribution of PhERF2 to the waterlogging tolerance of petunia appears to depend on the regulation of physiological and photosynthetic responses. PhERF2 represents a hopeful candidate gene for enhancing waterlogging tolerance of ornamental plants.

RESUMO: Fatores de transcrição de resposta ao etileno (ERF) estão amplamente envolvidos na regulação das respostas das plantas a diferentes estresses abióticos. Em petúnia (Petunia × hybrida), PhERF2 pertencente à subfamília Ⅶ de fatores de transcrição ERF participa da resposta ao estresse de alagamento. Este estudo teve como objetivo investigar a variação da tolerância ao alagamento de plantas WT e petúnia transgênica com silenciamento de RNAi e superexpressão de PhERF2 através do desempenho fotossintético e fisiológico. O conteúdo de clorofila e o vigor da raiz diminuíram continuamente em ambas as linhagens transgênicas WT e PhERF2 sob estresse de alagamento, mas a extensão da queda nas linhas de superexpressão de PhERF2 foi menor do que nas linhas WT e PhERF2-RNAi. No final do tratamento de alagamento, os níveis de proteína solúvel nas linhas com superexpressão de PhERF2 foram significativamente maiores do que nas linhas WT e PhERF2-RNAi, enquanto a última mostrou um teor geral de malondialdeído maior. Diferentes graus de reduções nos níveis de Pn, Gs e Tr ocorreram em ambas as linhas transgênicas WT e PhERF2 após a exposição ao alagamento. Os níveis de Ci das linhas de superexpressão de PhERF2 diminuíram após três horas de tratamento de alagamento, e os níveis de Ci das linhas de WT e PhERF2-RNAi aumentaram gradualmente de seis para 72 horas de tratamento de alagamento. Esses dados sugeriram que os fatores não estomáticos foram os principais fatores limitantes para Pn em linhas WT e PhERF2-RNAi sob estresse severo, enquanto a abertura estomática foi o principal fator limitante de Pn em linhas com superexpressão de PhERF2. Nossos resultados demonstraram que a contribuição do PhERF2 para a tolerância ao alagamento da petúnia parece depender da regulação das respostas fisiológicas e fotossintéticas. PhERF2 representa um gene candidato esperançoso no aumento da tolerância ao alagamento de plantas ornamentais.

Ethylene responsive element binding factors contributes to waterlogging tolerance by regulating photosynthetic and physiological parameters in petunia / Os fatores de ligação do elemento responsivo ao etileno contribuem para a tolerância ao encharcamento, regulando os parâmetros fotossintéticos e fisiológicos na petúnia

Ethylene-responsive element binding factors (ERFs) are widely involved in the regulation of plant responses to different abiotic stresses. In petunia (Petunia × hybrida), PhERF2 belonging to the subfamily Ⅶ of ERF transcription factors participates in the response to waterlogging stress. In this study, we investigated waterlogging tolerance variation of WT and transgenic petunia plants with RNAi silencing and overexpression of PhERF2 through photosynthetic and physiological performance. Chlorophyll content and root vigor declined continuously in both WT and PhERF2 transgenic lines under waterlogging stress, but the extent of the fall in PhERF2-overexpressing lines was less than that in WT and PhERF2-RNAi lines. At the end of waterlogging treatment, soluble protein levels in PhERF2-overexpressing lines were significantly higher than those in WT and PhERF2-RNAi lines, while the latter showed a higher malondialdehyde content overall. Different degrees of reductions in Pn, Gs, and Tr levels occurred in both WT and PhERF2 transgenic lines upon exposure to waterlogging. The Ci levels of PhERF2-overexpressing lines decreased after 3 hours of waterlogging treatment, and the Ci levels of WT and PhERF2-RNAi lines gradually increased from 6 to 72 hours of waterlogging treatment. These data suggested that non-stomatal factors were the primary limiting factors for Pn in WT and PhERF2-RNAi lines under severe stress, while the stomatal opening was the main factor limiting Pn in PhERF2-overexpressing lines. Our results demonstrated that the contribution of PhERF2 to the waterlogging tolerance of petunia appears to depend on the regulation of physiological and photosynthetic responses. PhERF2 represents a hopeful candidate gene for enhancing waterlogging tolerance of ornamental plants.

Fatores de transcrição de resposta ao etileno (ERF) estão amplamente envolvidos na regulação das respostas das plantas a diferentes estresses abióticos. Em petúnia (Petunia × hybrida), PhERF2 pertencente à subfamília Ⅶ de fatores de transcrição ERF participa da resposta ao estresse de alagamento. Este estudo teve como objetivo investigar a variação da tolerância ao alagamento de plantas WT e petúnia transgênica com silenciamento de RNAi e superexpressão de PhERF2 através do desempenho fotossintético e fisiológico. O conteúdo de clorofila e o vigor da raiz diminuíram continuamente em ambas as linhagens transgênicas WT e PhERF2 sob estresse de alagamento, mas a extensão da queda nas linhas de superexpressão de PhERF2 foi menor do que nas linhas WT e PhERF2-RNAi. No final do tratamento de alagamento, os níveis de proteína solúvel nas linhas com superexpressão de PhERF2 foram significativamente maiores do que nas linhas WT e PhERF2-RNAi, enquanto a última mostrou um teor geral de malondialdeído maior. Diferentes graus de reduções nos níveis de Pn, Gs e Tr ocorreram em ambas as linhas transgênicas WT e PhERF2 após a exposição ao alagamento. Os níveis de Ci das linhas de superexpressão de PhERF2 diminuíram após três horas de tratamento de alagamento, e os níveis de Ci das linhas de WT e PhERF2-RNAi aumentaram gradualmente de seis para 72 horas de tratamento de alagamento. Esses dados sugeriram que os fatores não estomáticos foram os principais fatores limitantes para Pn em linhas WT e PhERF2-RNAi sob estresse severo, enquanto a abertura estomática foi o principal fator limitante de Pn em linhas com superexpressão de PhERF2. Nossos resultados demonstraram que a contribuição do PhERF2 para a tolerância ao alagamento da petúnia parece depender da regulação das respostas fisiológicas e fotossintéticas. PhERF2 representa um gene candidato esperançoso no aumento da tolerância ao alagamento de plantas ornamentais.

Short interfering RNAs targeting a vampire-bat related rabies virus phosphoprotein mRNA

The aim of this study was to assess the in vitro and in vivo effects of short-interfering RNAs (siRNAs) against rabies virus phosphoprotein (P) mRNA in a post-infection treatment for rabies as an extension of a previous report (Braz J Microbiol. 2013 Nov 15;44(3):879-82). To this end, rabies virus strain RABV-4005 (related to the Desmodus rotundus vampire bat) were used to inoculate BHK-21 cells and mice, and the transfection with each of the siRNAs was made with Lipofectamine-2000™. In vitro results showed that siRNA 360 was able to inhibit the replication of strain RABV-4005 with a 1 log decrease in virus titter and 5.16-fold reduction in P mRNA, 24 h post-inoculation when compared to non-treated cells. In vivo, siRNA 360 was able to induce partial protection, but with no significant difference when compared to non-treated mice. These results indicate that, despite the need for improvement for in vivo applications, P mRNA might be a target for an RNAi-based treatment for rabies.(AU)

USO DE NANOPARTÍCULAS DE CARBONO EM MODELOS IN VITRO E IN VIVO PARA CONTROLE DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA ENDOMETRIAL BOVINA

Nanobiotecnologias baseadas em nanopartículas de carbono para controle de doenças, seja via silenciamento da expressão gênica ou ação anti-inflamatória, surgem como possibilidade para o controle da resposta inflamatória endometrial em fêmeas bovinas no pós-parto. Tendo em vista a possível aplicação de nanotubos de carbono de parede múltipla (MWCNT) em fêmeas bovinas e o desenvolvimento de método de detecção para avaliação da segurança de MWCNT in vivo, a primeira parte do estudo objetivou avaliar a capacidade da técnica de FT-Raman em detectar, qualitativamente e quantitativamente, MWCNT diluídos em leite de vaca in natura. A técnica de FT-Raman descriminou qualitativamente a presença de MWCNT em leite acima de 1g/mL. Entretanto, o modelo de análise de regressão linear não determinou, quantitativamente, diferentes concentrações de MWCNT em leite in natura. Na segunda parte do trabalho, células endometriais bovinas foram submetidas a silenciamento gênico da molécula MyD88, utilizando MWCNT como agente de transcrição, ou cultivadas em meio contendo fulerol ou dexametasona, com o objetivo de controlar a transcrição endometrial de IL-1, IL-6 e CXCL8 induzida in vitro por lipopolissacarídeo (LPS). MWCNT não induziram resposta inflamatória endometrial, porém o complexo silenciador MWCNT-MyD88 siRNA não silenciou a expressão de MyD88 (P>0,05) ou reduziu o número de transcritos para IL-1 (P>0,05), IL-6 (P>0,05) e CXCL8 (P>0,05) pós-estimulação com LPS. Fulerol reduziu o número de transcritos para IL-1 (P<0,01) e dexametasona o número de transcritos para IL-1 (P<0,05) e IL-6 (P<0,05) após estimulação de células endometriais com LPS. O último estudo teve como objetivo verificar, por meio de avaliação histopatológica, a ação anti-inflamatória do fulerol sobre modelo murino in vivo de endometrite induzida por LPS. Entretanto, o modelo proposto não foi efetivo em gerar uma resposta inflamatória endometrial, impossibilitando assim a avaliação da ação anti-inflamatória do fulerol sobre o endométrio murino inflamado. Em conclusão, o uso de MWCNT padronizados como agente de transfecção para siRNA em células endometriais bovinas requer estudos mais aprofundados visando atingir o potencial da técnica no controle da expressão de citocinas pró-inflamatórias. Entretanto, fulerol e dexametasona podem reduzir a expressão de citocinas pró-inflamatórias in vitro, com potencial para controlar, in vivo, a resposta inflamatória endometrial bovina.

Nanobiotechnologies based on carbon nanoparticles for disease control, either by gene silencing or anti-inflammatory action, rise as a possibility for the control of endometrial inflammatory response in post-partum cows. The possibility to apply multi-walled carbon nanotubes (MWCNT) in cow and the development of a methodology to detect carbon nanotubes safety in vivo, the first study aimed to evaluate the qualitative and quantitative potential of the FT-Raman technique to detect MWCNT diluted in bovine whole fresh milk. The FT-Raman qualitatively identified MWCNT in milk over 1g/mL. However, the linear regression analysis model did not quantitatively predict, with precision, different MWCNT dilutions in fresh milk. In the second study, bovine endometrial cells were cultured with MyD88 silencing complex, composed by MWCNT as vector for siRNA targeting MyD88, fullerol, or dexamethasone aiming to control the endometrial transcription of IL-1, IL-6 and CXCL8 induced by lipopolysaccharide (LPS) stimulation in vitro. MWCNT did not induce endometrial inflammatory response. However, the silencing complexes MWCNT-MyD88 siRNA did not silence the MyD88 expression (P>0.05) or reduced the transcript levels for IL-1 (P>0.05), IL-6 (P>0.05) and CXCL8 (P>0.05) post LPS stimulation. Fullerol reduced the transcript level for IL-1 (P<0.01) and dexamethasone decreased transcription of IL-1 (P<0.05) and IL-6 (P<0.05) post endometrial cells stimulation with LPS. The third study aimed to evaluate, by histopathological analysis, the anti-inflammatory effect of fullerol over an in vivo murine model of endometritis induced by LPS. However, the proposed model was not effective to induce an endometrial inflammatory response, avoiding the evaluation of the fullerol anti-inflammatory effect over murine inflamed endometrium. In conclusion, the use standardized MWCNT as transfection agent for siRNA in bovine endometrial cells require more studies aiming to achieve the technique potential for control the expression of pro-inflammatory cytokines. However, fullerol and dexamethasone can reduce the expression of pro-inflammatory cytokines in vitro, with potential to control, in vivo, the endometrial inflammatory response in cattle

ATIVAÇÃO DO MECANISMO DE RNA INTERFERENTE (RNAi) VIA Bacillus subtilis GENETICAMENTE MODIFICADO CONTRA A REPLICAÇÃO DO VÍRUS DA SÍNDROME DA MANCHA BRANCA (WSSV) NO CAMARÃO Litopenaeus vannamei

Desde 1992, o Vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV) vem causando problemas para o desenvolvimento da carcinicultura em todo o mundo. Dentre as alternativas para o combate a esse vírus está a utilização de duplas fitas de RNA (dsRNAs) para bloquear a expressão dos genes virais através do mecanismo de RNA interferente (RNAi) presente em eucariontes. A produção e entrega dessas moléculas aos animais pode ser realizada in vitro (através de kits comerciais) ou in vivo (como por exemplo, através de bactérias gram-negativas como Escherichia coli). O uso de kits encarece o tratamento e E. coli tem potencial patogênico. Assim, a utilização bactérias probióticas como bioreatores de dsRNAs pode ser uma alternativa interessante. Dessa forma, esta dissertação teve como objetivo validar o potencial da cepa probiótica Bacillus subtilis manipulada para produção das dsRNAs, na proteção do camarão Litopenaeus vannamei contra o WSSV. Para isso, foi otimizada a produção dessas moléculas com o acréscimo de nutrientes aos meios de cultura. As dsRNAs foram extraídas e purificadas do probiótico e validadas quanto à sua capacidade de ativar o sistema RNAi nos hemócitos. Adicionalmente o probiótico vivo foi administrado na dieta dos animais e avaliado quanto à sua capacidade de ativar o sistema RNAi e, também, quanto à sua capacidade de proteger o camarão contra o WSSV. Os resultados mostraram que o enriquecimento dos meios de cultura aumentou significativamente (p<0,05) a produção das dsRNAs pelo probiótico. Tanto as dsRNAs purificadas injetadas nos camarões quanto o próprio probiótico administrado na dieta foram capazes de ativar o sistema RNAi, como evidenciado pelo aumento da expressão dos genes relacionados sid1 e argonauta2. Também, foi observado que o pré-tratamento por 15 dias com o probiótico é suficiente para ativar o sistema RNAi. Quando expostos ao vírus, os camarões tratados com o probiótico geneticamente modificado tiveram uma redução significativa (p<0,05) na carga viral, o que resultou em uma sobrevivência de 34%. Não foram observadas inclusões virais nas brânquias, cutícula e epitélio gástrico dos sobreviventes. Este estudo demonstra, pela primeira vez, que uma cepa probiótica geneticamente modificada para ativar o sistema RNAi contra um gene específico do WSSV é capaz de reduzir a carga viral e aumentar a sobrevivência do camarão.

Since 1992, the White Spot Syndrome Virus (WSSV) has been causing problems for the development of shrimp farming worldwide. Among the alternatives to control this virus is the use of double-stranded RNAs (dsRNAs) to block the expression of viral genes through the mechanism of RNA interference (RNAi) present in eukaryotes. The production and delivery of these molecules can be achieved in vitro through commercial kits or in vivo through gram-negative bacteria like Escherichia coli. The use of kits makes treatment more expensive and E. coli has a pathogenic potential. Thus, the use of probiotic bacteria as bioreactors of dsRNAs can be an interesting alternative. This dissertation aimed to validate the potential of a probiotic strain of Bacillus subtilis manipulated for the production of dsRNAs, in the protection of the shrimp Litopenaeus vannamei against WSSV. For this, the production of these molecules was optimized with the addition of nutrients to the culture media. The dsRNAs were extracted and purified from the probiotic and validated for their ability to activate the RNAi system in the hemocytes. In addition, the live probiotic was administered to the animals' diet and assessed for its ability to activate the RNAi system and also for its ability to protect shrimp against WSSV. The results showed that enrichment of the culture media significantly (p<0,05) increased the production of dsRNAs by the probiotic. Both the purified dsRNAs injected into the shrimp and the probiotic administered in the diet were able to activate the RNAi system, as evidenced by the increased expression of the related genes sid1 and argonaute2. Also, it was observed that the pretreatment for 15 days with the probiotic is sufficient to activate the RNAi system. When exposed to the virus, shrimp treated with the genetically modified probiotic had a significant (p<0,05) reduction in viral load, which resulted in a 34% survival. No viral inclusions were observed in the gills, cuticle and gastric epithelium of the survivors. This study demonstrates, for the first time, that a probiotic strain genetically modified to activate the RNAi system against a specific WSSV gene is capable of reducing viral load and increasing shrimp survival.

EXPRESSÃO DE GENES IMUNOLÓGICOS EM CAMARÕES Litopenaeus vannamei DESAFIADOS EXPERIMENTALMENTE COM O VÍRUS DA MIONECROSE INFECCIOSA E TRATADOS COM dsRNA PRODUZIDAS in vivo

O cultivo de camarão marinho vem se expandido mundialmente desde o inicio do século, e o camarão branco do Pacífico (Litopenaeus vannamei) é a espécie mais cultivada. Embora a carcinicultura apresente crescimento expressivo, a manifestação de enfermidades dificulta seu avanço. A doença causada pelo vírus da mionecrose infecciosa (IMNV), primeiramente relatada no nordeste brasileiro em 2002, ainda provoca significativas perdas na carcinicultura brasileira. Dentre as alternativas de combate a infecções virais, o RNA de interferência (RNAi) é promissor, pois há evidências da eficácia na aplicação dessa técnica no tratamento dessas enfermidades. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a dinâmica da expressão de genes imunológicos em camarões L. vannamei infectados experimentalmente com o IMNV e tratados com moléculas de dsRNA produzidos in vivo pelo Bacillus subtilis JJBs3 contendo a sequência do ORF1a referente ao IMNV. Num primeiro experimento, foi realizado o acompanhamento do desenvolvimento da mionecrose infecciosa para duas diluições (1,02 x 104 e 1,02 x 103 cópias/100 l) de um extrato de tecido infectado por IMNV, por quantificação das cópias virais por RT-qPCR e métodos histopatológicos; foram validados os extratos IMNV e SPF (livre de IMNV, WSSV e IHHNV) através de infecção experimental por injeção intramuscular, com duração de 22 dias. Os grupos infectados com o extrato IMNV apresentaram curvas de sobrevivência com diferenças significativas (p<0,05) em relação aos dois grupos controle (solução salina e extrato de tecido SPF), bem como alterações histopatológicas. Foram verificadas ainda, diferenças significativas (p<0,05) na carga viral dos tratamentos III e IV entre o 2° pré e o 6° dia pós-injeção, dentre os três pontos de coleta, com valores médios de 1,33 x 102 a 1,59 x 107 cópias virais, respectivamente. A expressão dos genes imunológicos (Sid-1, Dicer-2, Argonauta-2, proPO-1 e PPAE-1), avaliada por qPCR e aplicando o método 2-Cq, apresentou diminuição ao longo do experimento, com exceção do Sid-1 e Argonauta-2 no tratamento com menor dose viral. No segundo experimento (25 dias; seis tratamentos; quatro pontos de coleta), foi avaliado o efeito de diferentes doses (0.5, 1.0, 3.0 e 5.0 g de dsRNA por grama de camarão) produzidas in vivo pelo Bacillus subtilis JJBs3, ministradas através de injeção intramuscular dois dias antes do desafio. Foram utilizados dois grupos controles, em um deles os animais foram injetados com solução salina e extrato de tecido SPF (negativo), e no outro com solução salina e extrato de tecido infectado (positivo). Alterações histopatológicas características de IMN e diferenças significativas (p<0,05) na carga viral entre o 2° pré e 8° dia pós-injeção foram verificadas nos tratamentos que receberam injeção com extrato IMNV. Não foram observadas diferenças na sobrevivência ou na expressão dos genes analisados ao longo do experimento, mostrando que da forma e nas condições em que foram ofertadas, as dsRNAs não surtiram efeito protetivo. Por se tratar de um novo modelo de produção de dsRNA, as técnicas de obtenção, purificação, quantificação e métodos de entrega dessas moléculas precisam ser aprimoradas.

Shrimp farming is one of the fastest growing aquaculture activities in the world and the Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) is the most widely cultivated species. Although shrimp farming shows significant growth, the manifestation of diseases hinders its progress. The disease caused by the Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) causes significant losses in Brazilian shrimp farming. Recent evidence has suggested that interference RNA (RNAi) could be a viable alternative to control viral diseases. The present work aimed to evaluate the dynamics of immunological gene expression in L. vannamei shrimp experimentally infected with IMNV and treated with dsRNA molecules produced in vivo by Bacillus subtilis JJBs3 containing the IMNV sequence of ORF1a. In a first experiment, the progress of the infection caused by two dilutions (1.02 x 104 and 1.02 x 103 copies / 100 l) of an IMNV-infected tissue extract was monitored by quantifying viral copies by RT- qPCR and histopathological methods; IMNV and SPF (free from IMNV, WSSV and IHHNV) extracts were validated through experimental intramuscular injection infection lasting 22 days. Groups infected with IMNV extract showed survival curves with significant differences (p<0.05) in relation to the two control groups (saline solution and SPF tissue extract), as well as histopathological alterations. Significant differences (p<0.05) in viral load were observed in treatments III and IV between the 2nd and 6th day after infection, among three collection points, with average values of 1.33 x 102 to 1.59. x 107 viral copies, respectively. Expression of immunological genes (Sid-1, Dicer-2, Argonaut-2, proPO-1 and PPAE-1), was evaluated by qPCR, applying the 2-Cq method. In most cases expression reduction was observed. However, Sid-1 and Argonaut-2 showed expression increase in the treatment with the lowest viral dose. In the second experiment (25 days; six treatments; four sampling points), the effect of different doses (0.5, 1.0, 3.0 and 5.0 g dsRNA per gram of shrimp), administered by intramuscular injection two days before the challenge, was monitored. Two control groups were used, in one of them the animals were injected with saline and SPF tissue extract (negative), and in the other, with saline and infected tissue extract (positive). Histopathological changes characteristic of IMN and significant differences (p<0.05) in viral load between the 2nd and 8th post-injection day were verified in cases where IMNV was applied. No differences were observed in the extent or expression of the genes analyzed throughout the experiment, suggesting that in the present conditions dsRNAs had no protective effect. Because this is a new model of dsRNA production, the techniques of use, purification, quantification as well as the delivery methods of these molecules need to be improved.

Identificação de genes candidatos a uma assinatura transcricional no intestino médio de camarões Litopenaeus vannamei associada ao cultivo em bioflocos e à infecção pelo vírus da síndrome da mancha branca

Os mecanismos moleculares envolvendo a imunidade de camarões associada ao intestino, bem como a interação patógeno-hospedeiro nesse tecido permanecem desconhecidos. O presente estudo avaliou o perfil transcricional no intestino médio (IM) de camarões Litopenaeus vannamei e identificou 19 genes candidatos a uma assinatura transcricional associada ao cultivo em bioflocos e ao desafio oral pelo vírus da síndrome da mancha branca (WSSV). O efeito do cultivo (bioflocos ou água clara) revelou 347 genes diferencialmente expressos (GDEs) no IM de camarões cultivados em bioflocos (B) e 277 GEDs em animais em água clara (C). A presença do WSSV no intestino promoveu diferenças na abundância de clusters associada à condição de cultivo. Animais cultivados em água clara (CW/C) registraram 771 GDEs, sendo 359 mais expressos em CW e 412 em C. Já, nos animais cultivados em bioflocos, 834 GDEs foram encontrados no IM, sendo 270 mais expressos em BW e 564 nos animais não desafiados (B). Estes resultados indicam que a infecção pelo WSSV, independente do cultivo, alterou a expressão de um menor número de transcritos no IM dos camarões. O efeito de ambas condições, abiótica (cultivo) e biótica (infecção viral), sobre o perfil transcritômico dos camarões (BW/CW) revelou a expressão diferencial de 117 genes, especialmente em camarões cultivados em água clara (CW; 70). A validação dos dados transcritômicos permitiu identificar 19 genes candidatos (30% dos 67 DEGs avaliados) a compor uma assinatura transcricional do intestino médio em camarões, associada ao cultivo em bioflocos e à infecção pelo WSSV. Entre eles, destacam-se uma C-type lectin protein, uma chitinase 5 e uma chitin binding-like protein, além de oito novos transcritos ainda não anotados. Ademais, genes associados às vias de sinalização IMD e JAK-STAT, à defesa antiviral via RNAi e ao gene da dual oxidase-1 apresentaram expressão diferencial em função do sistema de cultivo e/ou da infecção viral. O transcritoma intestinal de L. vannamei permitiu ainda identificar um transcrito do Whenzou shrimp vírus 8, codificante para a enzima RdRP, cuja expressão foi significativa em animais cultivados em bioflocos e infectados pelo WSSV. Contudo, o significado deste achado é ainda desconhecido. Em conjunto, os resultados do presente estudo servem de base para um melhor entendimento da participação do intestino na imunidade dos peneídeos, bem como podem auxiliar no desenvolvimento futuro de ferramentas biotecnológicas visando o controle de viroses nos cultivos.

The molecular mechanisms involving the gut-associated immunity of shrimp, as well as the pathogen-host interaction in this tissue remain unknown. The present study evaluated the transcriptional profile in the midgut (MG) of Litopenaeus vannamei shrimp and identified 19 candidate genes for a transcriptional signature associated with biofloc culture and oral challenge by white spot syndrome virus (WSSV). The culture effect (biofloc or clear water) revealed 347 differentially expressed genes (GEDs) in MG of shrimp grown in biofloc (B) and 277 GEDs in clear water (C). The presence of WSSV in the gut promoted differences in cluster abundance associated with culture conditions. Animals reared in clear water (CW/C) recorded 771 GEDs, with 359 more expressed in CW and 412 in C. However, in animals reared in biofloc, 834 GDEs were found in MG, being 270 more expressed in BW and 564 in the non-challenged animals (B). These results indicate that WSSV infection, independent of culture, altered the expression of a lower number of transcripts in the shrimps MG. The effect of both abiotic (culture) and biotic (viral infection) conditions on the transcriptomic profile of shrimp (BW/CW) revealed 117 genes with differential expression, especially in shrimp reared in clear water (CW; 70). Transcriptomic data validation allowed the identification of 19 candidate genes (30% of the 67 DEGs evaluated), that potentially compose a midgut transcriptional signature in shrimp associated with biofloc culture and WSSV infection. These include a C-type lectin protein, a chitinase 5 and a chitin binding-like protein, as well eight new transcripts not annotated yet. Furthermore, genes associated with IMD and JAK-STAT signaling pathways, antiviral defense via RNAi and the dual oxidase-1 gene showed differential expression depending on the culture system and/or viral infection. The intestinal transcriptome of L. vannamei also allowed the identification of a transcript from Whenzou shrimp virus 8, encoding for the RdRp enzyme, whose expression was significant in animals cultured in biofloc and infected by WSSV. However, the significance of this finding is still unknown. Taken together, the results of the present study serve as basis for a better understanding of the gut participation in the immunity of peneids, as well may assist in the future development of biotechnological tools aiming to control crops viruses.

Nanotechnology: meeting the future of Veterinary Parasitology Research

The field of nanotechnology involves an array of different areas of expertize with the application of innovative products in Medicine, Engineering, and to a less extent to Veterinary Medicine. In our opinion, more research is needed, in special to Animal Parasitology, to develop state of the art products to solve old problems. Livestock, pets and wildlife may benefit from products in nanoscale, such as vaccines, target recombinant proteins, or new drug candidates. Thus, we want to give some food for thought to drive scientific programs into nanotechnology, creating a safer environment to animals and humans.(AU)

Salmonella in a Brazilian pork production chain: occurrence, diversity, virulence genotypes and antibiotic resistance profile

Salmonella spp. é mundialmente considerada um dos principais patógenos associados com surtos de origem alimentar. Estirpes de Salmonella multirresistentes aos antibióticos tem sido detectadas em diversos países do mundo. O objetivo desse trabalho foi rastrear a contaminação de Salmonella spp. na cadeia de produção de suínos durante o abate e processamento além de realizar a caracterização molecular dos isolados. As coletas foram realizadas em dez diferentes granjas de suínos de sistema intensivo com média de 1000 suínos/granja. Todos as granjas abatiam os animais em um mesmo matadouro-frigorífico. Nas granjas as amostras coletadas foram: ração (n=10), água (n = 10) e swab do piso (n = 10). Posteriormente, no local do abate, as seguintes amostras foram coletadas: piso da pocilga de espera (n = 10), carcaça de suínos (n = 100), swabs de produto final (n = 40), amostras de sangue (n = 100), amostras do diafragma (n = 100), tonsilas palatinas (n = 100), linfonodos mesentéricos (n = 100) e amostras do ambiente de processamento (n = 120). Sangue e suco da carne (proveniente do pilar do diafragma) foram submetidos ao teste de ELISA e as demais amostras a detecção microbiológica de Salmonella de acordo com a ISO 6579. Nos isolados confirmados foram realizadas as analíses de soroagrupamento, PFGE e pesquisa de genes de virulência e resistência antimicrobiana. Além disso, foram selecionados 41 isolados para sequenciamento completo do genoma. Salmonella spp. foi detectada em pisos de granjas (03/10), pocilgas de espera (07/10), carcaça após a sangria (2/100) carcaça após a lavagem final (1/100), tonsilas (45/100), linfonodos mesentericos (43/100), utensílios (3/120) e cortes (4/40). Os isolados encontrados nas amostras pertenciam aos sorogrupos: O:4 (82%), O:3 (7,7%), O:9 (5,1%), O:8 (2,6%) and O:7 (2,6%). Baseado no teste de ELISA, 86 e 46 amostras do plasma sanguíneo foram positivas (ponto de corte 20% e 40%), enquanto 68 e 46 amostras de suco da carne foram positivas (ponto de corte 20% e 40%). Foi verificado uma alta correlação (r = 0.93, p < 0.05), entre as leituras da densidade ótica do soro e do suco de carne. Baseado na análise de PFGE, 109 cepas foram alocadas em 24 diferentes padrões de pusotipos, arranjados em cinco diferentes clusters. Catorze diferentes perfis de virulência foram observados de acordo com a combinação dos genes detectados e todos os isolados foram positivos para o gene invA, sitC, pagC e tolC. Com base na análise do genoma, a sorotipificação in silico identificou nove diferentes sorovares, sendo que Salmonella enterica sorovar Typhimurium foi o mais comum (n = 17). A análise do MLST revelou oito ST diferentes, em que O ST-19 foi o mais comum (n = 21). Detectou-se múltiplos replicons de plasmídeos, sendo que os mais abundantes foram Col (RNAI) (n = 30), IncR (n = 22), IncI1 (n = 10) e IncA/C2 (n = 10). Altas taxas de resistência antimicrobiana foram observadas no estudo, principalmente frente aos seguintes antimibrocianos: estreptomicina, tetraciclina, ampicilina, cloranfenicol e ciprofloxacina. Apenas dois isolados foram resistentes a cefalosoprinas de terceira geração e nenhum isolado foi resistente aos carbapenens testados. Vinte e seis genes de resistência foram identificados, sendo blaTEM-1A e blaTEM-1B os maiores responsáveis pela resistência aos beta-lactâmicos e floR o gene responsável pela maioria das resistências ao cloranfenicol. Durante o período em que as coletas foram realizadas, a adição de ciprofloxacina de maneira preventiva era feita via ração, fato que pode ter contribuído para a alta prevalência de resistência a este antibiótico. A maioria dos isolados avaliados foram considerados multirresistentes (resistentes a 3 ou mais classes de antibióticos). Este estudo elucidou pontos importantes da epidemiologia de Salmonella na cadeia de produção de carne suína. Apesar da baixa ocorrência do patógeno em carcaça e cortes finais, a presença do mesmo em linfonodos e tonsilas deixa claro a importância da adoção de medidas de higiene pelo abatedouro. Considerando o cenário mundial de resistência a antibióticos, a alta ocorrência de isolados multirresistentes provenientes da produção de suínos é um dado de extrema importância, visto que o uso de antibióticos deve ser controlado e é recomendado que os antibióticos considerados de importância crítica à saúde humana sejam evitados em uso animal.

Salmonella spp. is considered one of the main foodborne pathogens associated to food poisoning outbreaks worldwide. Salmonella strains have been detected in several countries. The aim of this study was to track Salmonella spp. contamination in pork production chain during slauthering and processing. Also, the aim was to provide a deep characterization of the isolates by molecular analysis. The collections were carried out in ten different farms, which were selected based on the existence of an intensive breeding system with a similar number of pigs in all the farms (average 1000), and the same company provided the piglets and feed. All selected pig farms sent stock to the same slaughterhouse. At pig farms, the following samples were collected: feed from the top of feeder pigs (n=10), water from the bite drinkers (n = 10), barn floor (n = 100). After transport, pigs were sampled at the slaughterhouse including the lairage floor (n=10, as sampled in barn floors), swine carcasses (10 carcasses per lot, n = 100), blood samples (n = 100), processing environment (n = 120), and pork cuts (n = 40). Also, portions of diaphragm (n = 100), palatine tonsils (n = 100) and mesenteric lymph nodes (n=100) were sampled from each pig carcass after evisceration. Blood and meat juice were subjected to ELISA to detect antibodies against Salmonella, and other samples were subjected to Salmonella detection by ISO 6579. After confirmation the isolates were subjected to serogrouping, macrorestriction digests and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), detection of virulence-related genes and antimicrobial-resistance phenotyping. Also, 41 isolates were selected to wholegenome sequencing. Salmonella was recovered from barn floors from 3 pig farms (3/10), lairage floors (7/10), carcasses after bleeding (2/100) and final washing (1/100), palatine tonsils (45/100), mesenteric lymph nodes, (43/100), utensils (3/120) and cuts (4/40). The most prevalent serogroup was O: 4 (82%) followed by O:3 (7.7%); O:9 (5.1%); O:8 (2.6%) and O:7 (2.6%). Based on ELISA, Salmonella positive samples were: 86 and 46 blood serum (20% and 40% cut-offs) and 68 and 46 meat juice (20% and 40% cutoffs). Optical density readings from blood serum and meat juice presented a high and significant correlation (r = 0.93, p < 0.001). Recovered strains (n = 109) were classified into 24 different pulsotypes (XbaI restriction digest), which were arranged into five different clusters. Fourteen different virulence genotypes were observed based on 15 loci, and all isolates were positive for invA, sitC, pagC and tolC. Whole-genome sequencing and in silico serotyping demonstrated that the S. enterica serovar Typhimurium was the most common serotype (n = 17), but eight additional servoars were identified. Eight multilocus sequence types were identified with ST19 being most common (n = 21). Several plasmids replicons were detected, with Col (RNAI) the most abundant (n = 30), followed by IncR (n = 22), IncI1 (n = 10) and IncA/C2 (n = 10). High rates os resistance were observed, mainly to streptomycin, tetracycline, ampicillin, chloramphenicol and ciprofloxacin. Only two isolates were resistant to third-generation cephalosporins and no isolates were resistant to two tested carbapenems. Twenty-six unique antimicrobial-resistance genes were identified with blaTEM-1A and blaTEM-1B likely responsible for most beta-lactam resistance and floR responsible for most chloramphenicol resistance. At the time of collection, the sampled farms were adding ciprofloxacin to feed, and this may have contributed to the high prevalence of resistance to this antibiotic. A majority of isolates were considered multidrug resistant (resistant to 3 or more antibiotic classes). This study provides valuable insight about the epidemiology of Salmonella in swine production. Despite the low presence of this pathogen in carcasses and meat cuts, the presence of the pathogen in lymph nodes and tonsils emphasizes the importance of slaughterhouse hygiene measures. Considering the antimicrobial resistance global scenario, the high occurrence of multidrug resistant isolates from pork production is a serious data. The antibiotic use must be controlled, and it is recommended that antibiotics considered to be of critical importance to human health should be avoided in animal use

ENGENHARIA GENÉTICA EM PROBIÓTICOS PARA ATIVAÇÃO DO SISTEMA DE RNA INTERFERENTE (RNAi) EM CAMARÕES: UMA POTENCIAL APLICAÇÃO NO CONTROLE DE DOENÇAS VIRAIS

As doenças infecciosas, principalmente de etiologia viral, tem sido o principal desafio da produção de camarão. A ativação do mecanismo RNAi (RNA de interferência) pode permitir o controle da replicação de viroses importantes na carcinicultura o WSSV (Vírus da Síndrome da Mancha Branca) e o IMNV (Vírus da Mionecrose Infecciosa). Os trabalhos descritos nessa Tese estão relacionados com o método de produção e entrega de dsRNA (RNA dupla fita) para o camarão branco do Litopenaeus vannamei, com o intuito de ativar o mecanismo do RNAi. Na tentativa de produzir dsRNA utilizando bactérias foi realizado sequenciamento genômico e manipulação genética em cepas nativas de Bacillus, bem como realizadas edições genômicas em B. subtilis através da técnica CRISPR/Cas9. No capítulo I foi sequenciado o genoma de duas cepas nativas de B. cereus, isoladas do trato gastrointestinal do caranguejo Ucides sp. coletado no Rio Pacoti em Fortaleza (CE). Esses resultados moleculares fornecem novas sobre essas cepas, bem como subsídios para manipulação genética. No capítulo II, uma cepa nativa de B. cereus foi manipulada geneticamente para produzir fluorescência (GFPmut1). Além disso, foi promovido seu fornecimento via ração e avaliação da colonização na mucosa do trato intestinal do L. vannamei. No capítulo III, foram criados plasmídeos para edição genômica em B. subtilis usando o sistema CRISPR/Cas9. Primeiramente o gene rnc foi nocauteado e, na sequência, foram integrados genes para produção de GFPmut1, dsRNA relacionadas com as viroses WSSV e IMNV, bem como dsRNA não relacionada. No final, foram produzidas duas cepas B. subtilis (JJBs5 e JJBs8) livres de resistência a antibióticos que estão prontas para serem testadas em bioensaios com desafio viral. Em conclusão, os resultados demonstrados nesse trabalho podem representar novas perspectivas na tentativa de mitigar os problemas com as doenças nos cultivos de camarão.

The infectious diseases, major viral ethology, has been the main challenge in the shrimp production. The activation of the RNAi (interference RNA) mechanism can promote the control of the viral replication, such as (WSSV viruses White Spot Syndrome Virus) and IMNV (Infectious Myonecrosis Virus). Os trabalhos descritos nessa Tese estão relacionados com o método de produção e entrega de dsRNA (RNA dupla fita) para o camarão branco do Litopenaeus vannamei, com o intuito de ativar o mecanismo do RNAi. The studies described in this thesis are related to the production and delivery of dsRNA (double-stranded RNA) for Litopenaeus vannamei, in order to activate the mechanism of RNAi. On the possibility to produce dsRNA using bacteria was made genomic sequencing and genetic manipulation in native Bacillus strains, as well-made genomics editions in B. subtilis using the CRISPR/Cas9 technology. In the chapter I was sequenced the genome of the two native B. cereus strains isolated from the gastrointestinal tract of crab Ucides sp. from the Pacoti River in Fortaleza - CE. These molecular findings can improve information of this strain and give support for genetic manipulation. In the chapter II, a native B. cereus strain was manipulated to fluorescence production (GFPmut1). In addition, it was delivered in feed and evaluated the colonization in the intestinal tract of the L. vannamei. In the chapter III, plasmids were developed for genomic editing of B. subtilis using the CRISPR/Cas9. In the first moment, rnc gene was deleted and, in the second step, genes coding for GFPmut1, dsRNA against WSSV and IMNV viruses, and unrelated dsRNA were integrated into B. subtilis genome. At the end, two B. subtilis strains (JJBs5 and JJBs8) were produced, both of them free of the antibiotic resistance that could be tested in shrimp bioassays with viral challenge. In conclusion, the findings presented in this work could represent new perspectives to mitigate the problems with shrimp disease in commercial farms.

Fatores de transcrição envolvidos com a ativação dos receptores de progesterona durante o diestro não gestacional de cadelas

Resumo: A função do corpo lúteo na cadela foi abordada em vários estudos, visando a identificação de mecanismos luteotróficos e luteolíticos, porém a regressão luteínica na cadela cíclica ainda não foi bem caracterizada, assim como todos os fatores luteotróficos. Sabe-se que a progesterona (P4) é um fator luteotrófico capaz de ativar receptores nucleares de progesterona (PGRs) e exerce diferentes atividades sobre regiões promotoras de genes responsivos à progesterona, aumentando ou diminuindo a transcrição dos genes a depender da disponibilidade de fatores de transcrição em células-alvo. O objetivo do trabalho foi caracterizar a expressão gênica do PGR, seus fatores de transcrição com sítios de ligação ao PGR, o AP-1, o FOXO3 e o HOXA5 e os genes StAR, CYP11A1, HSD3B2, responsivos ao PGR, no corpo lúteo (CL) canino. Foram utilizados CLs provenientes de cadelas que passaram por ovariosalpingohisterectomia nos dias 10, 20, 30, 40, 50 e 60 após a ovulação (p.o). Para determinação do D0 foram realizadas coletas de sangue para dosagem da P4. Os CLs coletados foram utilizados para extração de RNA total a partir do protocolo de TRIZOL e posterior análise por RNA-Seq seguindo o protocolo TruSeq RNA Sample Preparation e validação dos genes por PCR em tempo real. Avaliamos in vitro os efeitos do silenciamento de PGR pela técnica de RNA de interferência (RNAi) e em células estimuladas com P4 para os genes alvos. Após as validações, os resultados obtidos foram testados, através do programa SAS, de acordo com sua homogeneidade e normalidade, e apresentados como média ± EPM, diferenças de p 0,05 foram consideradas significativas. Houve o aumento de AP-1 e FOXO3 nas células com adição de P4 (500 ng/mL) e nas silenciadas com siRNA PGR. A análise de RNA-Seq mostrou o aumento de AP-1 no dia 30 p.o e a análise de qPCR mostrou o aumento de FOXO3 no dia 40 p.o. A análise de RNA-Seq indicou um aumento de HOXA5 no dia 40 p.o e no silenciamento de PGR uma diminuição de HOXA5. Os resultados sugerem que o aumento de AP-1 possa regular positivamente a formação do CL durante diestro e o aumento de HOXA5 possa regular negativamente. A ativação de FOXO3 parece estar evolvida tanto na proliferação quanto na regressão, de acordo com os estímulos hormonais nesta fase. Sugere-se que a ligação da P4 ao PGR ative a transcrição de genes envolvidos com os processos de proliferação e regressão do CL. Assim, concluímos que o receptor de progesterona é responsivo a fatores de transcrição e influencia a expressão de enzimas esteroidogênicas, exercendo papel na regulação da proliferação e sobrevivência celular do corpo lúteo durante o diestro.

Abstract: The function of the corpus luteum in the dog has been approached in several studies aiming the identification of luteotrophic and luteolytic mechanisms, but luteal regression in the cyclic bitch has not been well characterized, as well as all luteotrophic factors. Progesterone (P4) activates the progesterone receptor (PGR) and exerts different activities on promoters of progesterone-responsive gene, and the specificity of transcription depends on the availability of transcription factors in target cells. The objective of this work was to characterize the expression of P4 receptor, as well as transcription factors with PGR binding sites, AP-1, FOXO3 and HOXA5 and StAR, CYP11A1, HSD3B2, genes responsive to PGR, in the canine corpus luteum (CL). The CLs from bitches undergoing ovariosalpingohisterectomy at days 10, 20, 30, 40, 50 and 60 after ovulation (p.o) were used. Blood samples were collected for P4 measurement. The collected CLs were used for total RNA extraction from using the TRIZOL protocol and further RNA-seq analysis was carried out following the TruSeq RNA Sample Preparation protocol. Gene validation was by real time PCR. We evaluated in luteal cell culture the effects of PGR silencing by interference RNA technique (RNAi) and accessed the target genes. After validations, the results obtained were tested by the SAS program, according to their homogeneity and normality, and presented as mean ± SEM, differences of p 0.05 were considered significant. There was an increase of AP-1 and FOXO3 in cells with addition of P4 and silenced with PGR siRNA. RNA-Seq analysis showed an increase in AP-1 on day 30 p.o and qPCR analysis showed an increase in FOXO3 on day 40 p.o. RNA-Seq analysis indicated an increase in HOXA5 on day 40 p.o and PGR silencing a decrease in HOXA5. The results suggest that AP-1 increase can up-regulate CL formation during diestrus canine and HOXA5 increase can down-regulate. The FOXO3 participates of these processes according to hormonal stimuli that occur during diestrus canine. Thus, we conclude that the PGR is responsive to specific transcription factors and modulates the expression of steroidogenic enzymes, playing a role in regulating cell proliferation and survival of the corpus luteum during diestrus. Progesterone. Progesterone nuclear receptor. Transcriptional regulator. Sequencing. Gene silencing. Luteal cell. Dog.

Tecnologia de Phage Display no mapeamento de Mimetopos de Haemonchus contortus e uso de RNA de interferência no silenciamento do Gene codificante da protéina Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) do parasita

Haemonchus contortus é um nematoda hematófago de pequenos ruminantes, extremamente importante em escala mundial, sendo responsável por muitos danos à saúde dos animais, além de perdas produtivas e econômicas aos criadores. O panorama atual é de resistência do parasita à maioria das classes de anti-helmínticos disponíveis no mercado, o que demonstra necessidade urgente de métodos alternativos de controle. Portanto, os objetivos deste estudo foram selecionar mimetopos de H. contortus e avaliar o uso de RNA de interferência no silenciamento do gene codificante da proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) do parasita. A presente tese está dividida em 3 capítulos apresentados na forma de introdução geral e 2 manuscritos. O manuscrito 1 consistiu no uso de anticorpo policlonal de ovinos para mapear mimetopos de H. contortus usando a biblioteca de phage display. O clone 6 mimetopo de GAPDH e clone 17 - mimetopo da família do músculo desorganizado (Dim 1) foram selecionados para ensaio de imunização de ovinos. Peptídeos mimetopos (sintéticos) foram avaliados como moléculas antigênicas por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA). No ensaio de imunização constatou-se aumento dos títulos de IgG anti-fago M13, mas não ocorreu aumento de IgG anti-peptídeos mimetopos. Os peptídeos mimetopos sintéticos foram reconhecidos por IgG de ovinos naturalmente infectados por H. contortus. Este é o primeiro relato de uso bem sucedido da biblioteca de phage display para a identificação de mimetopos de H. contortus. O manuscrito 2 teve o objetivo de avaliar o uso de RNA de interferência (RNAi) para silenciamento do gene codificante da proteína GAPDH de H. contortus. Larvas infectantes foram incubadas com RNAi por 3; 6; 24 e 48h. Os resultados revelaram ausência de transcrição gênica em todas os períodos avaliados. Este estudo relata pela primeira vez o silenciamento de GAPDH em H. contortus, confirmando o gene como passível ao silenciamento por RNAi. Os dados expostos nesta tese apontam resultados promissores para uso em novas pesquisas voltadas ao desenvolvimento de terapias para o controle de H. contortus.

Haemonchus contortus is a hematophagous nematoda of small ruminants, extremely important on a worldwide scale, being responsible for severe impact to the animals health, besides productive and economic losses to the breeders. The current panorama is parasite resistance to the most anthelminthics classes commercially available for its control. This demonstrates the urgent need of alternative control methods. Therefore, the goals of this study were to select mimotopes from H. contortus and to evaluate the use of RNA interference (RNAi) to silence the gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) of the parasite. This thesis is divided into 3 chapters presented as 1 general introduction and 2 manuscripts. The goal of the first manuscript was to evaluate polyclonal antibody to map H. contortus mimetopos using the phage display library. Clone 6 - GAPDH mimetope and clone 17 - mimetope from the disorganized muscle family (Dim 1) were selected for sheep an immunization assay. Peptide mimotopes (synthetic) were evaluated as antigenic molecules by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In the immunization assay, IgG titers anti-phage M13 showed increase, but IgG anti-peptide mimotopes did not increased. Peptide mimotopes (synthetic) were recognized by IgG from sheep naturally infected by H. contortus. This is the first report of successful use of the phage display library for identification of H. contortus mimotopes. The aim of the manuscript 2 was to evaluate the RNAi to silence the GAPDH gene of H. contortus. Infective larvae were incubated with RNAi for 3; 6; 24 and 48h. The results showed absence of gene transcription in all evaluated periods. This study reports for the first time the silencing of GAPDH gene in H. contortus, confirming the gene as susceptible to silencing by RNAi. The data presented in this thesis point out promising results for use in new researches to development H. contortus control therapies.

In vitro and in vivo inhibition of rabies virus replication by RNA interference

Rabies is a zoonotic disease that affects all mammals and leads to more than 55,000 human deaths every year, caused by rabies virus (RABV) (Mononegavirales: Rhabdoviridae: Lyssavirus). Currently, human rabies treatment is based on the Milwaukee Protocol which consists on the induction of coma and massive antiviral therapy. The aim of this study was to assess the decrease in the titer of rabies virus both in vitro and in vivo using short-interfering RNAs. To this end, three siRNAs were used with antisense strands complementary to rabies virus nucleoprotein (N) mRNA. BHK-21 cells monolayers were infected with 1000 to 0.1 TCID50 of PV and after 2 hours the cells were transfected with each of tree RNAs in separate using Lipofectamine-2000. All three siRNAs reduced the titer of PV strain in a least 0.72 logTCID50/mL and no cytotoxic effect was observed in the monolayers treated with Lipofectamine-2000. Swiss albino mice infected with 10.000 to 1 LD of PV strain by the intracerebral route were also transfected after two hours of infection with a pool 3 siRNAs with Lipofectamine-2000 by the intracerebral route, resulting in a survival rate of 30% in mice inoculated with 100 LD50, while the same dose led to 100% mortality in untreated animals. Lipofectamine-2000 showed no toxic effect in control mice. These results suggest that intracerebral administration of siRNAs might be an effective antiviral strategy for rabies.(AU)

Efficient RNAi-induced protein knockdown in somatic cells using diced or chemically produced small interfering RNAs (siRNA) / Efficient RNAi-induced protein knockdown in somatic cells using diced or chemically produced small interfering RNAs (siRNA)

Background: RNA interference (RNAi) is a post-transcriptional gene silencing process in which double-stranded RNA (dsRNA) directs the degradation of a specifi c corresponding target mRNA. The mediators of this process are small dsRNAs of approximately 21 to 23 bp in length, called small interfering RNAs (siRNAs), which can be prepared in vitro and used to direct the degradation of specifi c mRNAs inside cells. Hence, siRNAs represent a powerful tool to study and control gene and cell function. Rapid progress has been made in the use of siRNA as a means to attenuate the expression of any protein for which the cDNA sequence is known. Individual siRNAs can be chemically synthesized, in vitro-transcribed, or expressed in cells from siRNA expression vectors. However, screening for the most effi cient siRNAs for post-transcriptional gene silencing in cells in culture is a laborious and expensive process. In this study, the effectiveness of two siRNA production strategies for the attenuation of abundant proteins for DNA repair were compared in human cells: (a) the in vitro production of siRNA mixtures by the Dicer enzyme (Diced siRNAs); and (b) the chemical synthesis of very specifi c and unique siRNA sequences (Stealth RNaiTM).Dicing to create mixtures of siRNAs. The Diced fragments of siRNA for each gene sequence were pooled and stored at -80o C. Alternatively, chemically synthesiz

Background: RNA interference (RNAi) is a post-transcriptional gene silencing process in which double-stranded RNA (dsRNA) directs the degradation of a specifi c corresponding target mRNA. The mediators of this process are small dsRNAs of approximately 21 to 23 bp in length, called small interfering RNAs (siRNAs), which can be prepared in vitro and used to direct the degradation of specifi c mRNAs inside cells. Hence, siRNAs represent a powerful tool to study and control gene and cell function. Rapid progress has been made in the use of siRNA as a means to attenuate the expression of any protein for which the cDNA sequence is known. Individual siRNAs can be chemically synthesized, in vitro-transcribed, or expressed in cells from siRNA expression vectors. However, screening for the most effi cient siRNAs for post-transcriptional gene silencing in cells in culture is a laborious and expensive process. In this study, the effectiveness of two siRNA production strategies for the attenuation of abundant proteins for DNA repair were compared in human cells: (a) the in vitro production of siRNA mixtures by the Dicer enzyme (Diced siRNAs); and (b) the chemical synthesis of very specifi c and unique siRNA sequences (Stealth RNaiTM).Materials, Methods & Results: For in vitro-produced siRNAs, two segments of the human Ku70 (167 bp in exon 5; and 249 bp in exon 13; NM001469) and Xrcc4 (1

Efficient RNAi-induced protein knockdown in somatic cells using diced or chemically produced small interfering RNAs (siRNA)

Background: RNA interference (RNAi) is a post-transcriptional gene silencing process in which double-stranded RNA (dsRNA) directs the degradation of a specific corresponding target mRNA. The mediators of this process are small dsRNAs of approximately 21 to 23 bp in length, called small interfering RNAs (siRNAs), which can be prepared in vitro and used to direct the degradation of specific mRNAs inside cells. Hence, siRNAs represent a powerful tool to study and control gene and cell function. Rapid progress has been made in the use of siRNA as a means to attenuate the expression of any protein for which the cDNA sequence is known. Individual siRNAs can be chemically synthesized, in vitro-transcribed, or expressed in cells from siRNA expression vectors. However, screening for the most efficient siRNAs for post-transcriptional gene silencing in cells in culture is a laborious and expensive process. In this study, the effectiveness of two siRNA production strategies for the attenuation of abundant proteins for DNA repair were compared in human cells: (a) the in vitro production of siRNA mixtures by the Dicer enzyme (Diced siRNAs); and (b) the chemical synthesis of very specific and unique siRNA sequences (Stealth RNaiTM). Materials, Methods & Results: For in vitro-produced siRNAs, two segments of the human Ku70 (167 bp in exon 5; and 249 bp in exon 13; NM001469) and Xrcc4 (172 bp in exon 2; and 108 bp in exon 6; NM003401) genes were chosen to generate dsRNA for subsequent "Dicing" to create mixtures of siRNAs. The Diced fragments of siRNA for each gene sequence were pooled and stored at -80ºC. Alternatively, chemically synthesized Stealth siRNAs were designed and generated to match two very specific gene sequence regions for each target gene of interest (Ku70 and Xrcc4). HCT116 cells were plated at 30% confluence in 24- or 6-well culture plates. The next day, cells were transfected by lipofection with either Diced or Stealth siRNAs for Ku70 or Xrcc4, in duplicate, at various doses, with blank and sham transfections used as controls. Cells were harvested at 0, 24, 48, 72 and 96 h post-transfection for protein determination. The knockdown of specific targeted gene products was quantified by Western blot using GAPDH as control. Transfection of gene-specific siRNA to either Ku70 or Xrcc4 with both Diced and Stealth siRNAs resulted in a down regulation of the targeted proteins to approximately 10 to 20% of control levels 48 h after transfection, with recovery to pre-treatment levels by 96 h. Discussion: By transfecting cells with Diced or chemically synthesized Stealth siRNAs, Ku70 and Xrcc4, two highly expressed proteins in cells, were effectively attenuated, demonstrating the great potential for the use of both siRNA production strategies as tools to perform loss of function experiments in mammalian cells. In fact, down-regulation of Ku70 and Xrcc4 has been shown to reduce the activity of the non-homologous end joining DNA pathway, a very desirable approach for the use of homologous recombination technology for gene targeting or knockout studies. Stealth RNAiTM was developed to achieve high specificity and greater stability when compared with mixtures of enzymatically-produced (Diced) siRNA fragments. In this study, both siRNA approaches inhibited the expression of Ku70 and Xrcc4 gene products, with no detectable toxic effects to the cells in culture. However, similar knockdown effects using Diced siRNAs were only attained at concentrations 10-fold higher than with Stealth siRNAs. The application of RNAi technology will expand and continue to provide new insights into gene regulation and as potential applications for new therapies, transgenic animal production and basic research.

Biologia do glioblastoma multiforme da dinâmica de ativação microglial ao papel do canal de potássio Kv 10.1

O glioblastoma multiforme é o tumor cerebral mais agressivo. Já a micróglia representa 30% da massa tumoral e desempenha um importante papel na tumorigênese. Este trabalho buscou estudar o padrão de infiltração e alteração morfológica da micróglia no tecido tumoral formado por células da linhagem GL261mCherry implantadas ortotopicamente. Além disto, buscou-se examinar o papel do canal de potássio Kv 10.1, correlacionado ao crescimento tumoral, primeiro na interação da micróglia com as células tumorais e, segundo, frente à lesão celular causada pelo fármaco de escolha ao tratamento do glioma, a temozolomida. Camundongos CX3CR1-EGFP receberam injeções intracorticais de células de glioblastoma multiforme capazes de expressar a proteína fluorescente mCherry. Microscopia de epifluorescência e confocal foram empregadas nas análises morfométricas, ao passo que a microscopia do tipo 2-photon (2P-LSM) foi usada para visualizar as células tumorais e microgliais no cérebro de animais vivos. Os resultados deste estudo revelaram uma microgliose intensa em áreas cerebrais logo após a implantação do tumor, isto é, aos 30 minutos. Nos primeiros três dias, a micróglia tende a formar aglomerados de células em torno dos tumores. Para, em seguida, infiltrar no centro tumoral, onde permanece durante todos os pontos de tempo estudados, de 6 a 18 dias. Com o aumento da massa tumoral, as células tumorais perdem progressivamente a sua forma original, assumindo uma morfologia heterogênea e difusa; o tamanho do corpo celular (perímetro) passou de 10 µm, três dias após o implante, para 52 µm aos 18 dias. Em contato com o glioma, a micróglia também muda sua morfologia. A forma tornou-se amebóide, com corpos celulares alargados. O corpo celular (área) cresceu de 366±0.0 µm2, na micróglia em vigilância, para 1310±146.0 µm2 e ramificações curtas, ou mesmo ausência de ramificações no fenótipo ativado. Aos 12 dias após o implante, foi notada a presença de células multinucleadas de glioma, os policariócitos, em contato íntimo com a micróglia ativada. Sobre o canal Kv-10.1, este foi expresso em células cultivadas de glioma, de micróglia (linhagem BV-2) e também em tecido tumoral de camundongos implantados com o tumor. A supressão deste canal, em células de glioma, potencializou a injúria por TMZ em 29%, conforme ensaio de MTT. Em conclusão, a micróglia apresentou um padrão espaço-temporal de infiltração no glioma, o que favorece influências recíprocas e pró-tumorigênicas. Já o canal Kv-10.1, pode tanto representar uma via de comunicação entre estes tipos celulares, quanto ser um potencial alvo para a terapêutica do glioma, já que foi capaz de potencializar os efeitos da temozolomida na morte celular de linhagens de glioma.

Glioblastoma multiforme is the most aggressive brain tumor. Microglia represents 30% of the tumor mass, and plays a role in tumorigenesis. This work studied the pattern of microglial growth into brain tumor tissue formed by orthotopically implanted glioma cells of the established GL261 cell line. In addition, we examined the expression of the Kv 10.1 potassium channel that frequently correlates with tumor growth. CX3CR1-EGFP mice received intracortical injections of GL261 tumor cells with stable expression of the red fluorescent protein mCherry. Epifluorescence - and confocal laser-scanning microscopy were employed in the analysis of tissue sections, whereas two-photon laser-scanning microscopy (2P-LSM) was used to visualize tumor cells and microglia in the brain of living animals. Our results revealed an intense microgliosis in brain areas already shortly after tumor implantation, i.e. at 30 minutes. In the first three days, microglia formed clusters of cells around tumors mass. Then cells infiltrated the tumor area, where they remained during all the time points studied, from 6 to 18 days. As tumor increased in size, GL261 cells progressively lost their original shape, assuming a heterogeneous and diffuse morphology. Soma size increased from 10 to 52 µm. In contact with the glioma, microglia also changed its morphology. Cell bodies enlarged from 366±0.0 µm2, in quiescent microglia, to 1310±146.0 µm2. The shape became amoeboid, with enlarged cell bodies and short processes (or even absence of them). Remarkably, we found microglial processes that closely surrounded glioma cells. Microglia also grew around multinucleated polycariocytes, found in tumors at 12 days. The Kv 10.1 channel was expressed in cultured GL261 cells, microglia cell line (BV-2) and also in mouse tumors. Suppression of Kv10.1 caused a 29% decrease in the viability of glioma cells injured by TMZ. In conclusion, microglia presented a temporal and spatial pattern of infiltration in glioma tumors, which favors reciprocal and protumorigenic influences. Kv 10.1 expressed by glioma cells in close contact with microglia may represent a communication pathway between microglia and cancer cells and, could be a potential target for antiglioma gene therapy, since it potentiated the effects of temozolomide in glioma cell lines.

GENE TRERAPY AND THIOPURINE DRUG APPROACHES AGAINST CANINE DISTEMPER VIRUS

Canine distemper virus (CDV) causa uma doença altamente contagiosa e que afeta mundialmente uma ampla variedade de carnívoros. A infecção sistêmica pelo CDV cursa com imunossupressão, sinais respiratórios e gastrointestinais frequentemente seguidos de complicações neurológicas e altas taxas de mortalidade. Além da elevada prevalência na população canina, vários surtos de cinomose canina são relatados em animais selvagens, incluindo espécies ameaçadas de extinção. Há uma necessidade urgente de opções terapêuticas para promover o controle de surtos e reduzir a mortalidade nas espécies alvo. Neste estudo, nós demonstramos duas abordagens terapêuticas diferentes contra a replicação do CDV. Uma vez que o RNA de interferência vem mostrando um grande potencial terapêutico contra infecções virais, nós construímos vetores plasmidiais expressando short hairpin RNAs (shRNAs) e um vetor adenoviral com cassete múltiplo de shRNAs direcionados para diferentes regiões altamente preservadas do genoma do CDV. Enquanto as construções plasmidiais alvejando o gene da RNA polimerase (L) viral apresentaram uma inibição pouco expressiva, os vetores plasmidiais com shRNAs contra o gene da nucleoproteína (N) viral reduziram acima de 99% os níveis de RNA do gene N e inibiram completamente o rendimento viral. O tratamento com o vetor adenoviral com cassete múltiplo de shRNAs também exibiu uma alta eficiência de silenciamento contra a replicação do CDV. Nós também avaliamos os efeitos anti-CDV do 6-metilmercaptopurina ribosídeo (6MMPr), um análogo de nucleosídeo da classe tiopurina. O tratamento com 6MMPr mostrou uma redução acentuada dos níveis de RNA viral e inibiu a produção de partículas infecciosas do CDV durante o ciclo replicativo. No geral, nossos resultados demonstraram que ambas as abordagens bloquearam o CDV in vitro e dessa forma, apresentaram potencial para o desenvolvimento de estratégicas terapêuticas contra a infecção pelo CDV.

Canine distemper virus (CDV) causes a highly contagious disease affecting a broad range of carnivores worldwide. Systemic CDV infection courses with immunosuppression, respiratory and gastrointestinal signs often followed by neurological complications and high mortality rates. Besides the high prevalence in dog population, several CDV outbreaks have been reported in wildlife animals, including endangered species. The development of novel therapeutics is an urgent need to achieve rapid outbreak control and reduce the mortality in target species. Here, we used two different therapeutic approaches against CDV replication. Since RNA interference (RNAi) has shown a great therapeutic potential against viral infections, we constructed plasmid-based short hairpin RNAs (shRNAs) and a multi-shRNA adenovirus vector targeting different conserved regions of CDV genome. Whereas plasmid constructs directed to large polymerase (L) gene displayed a weaker antiviral activity, plasmid-based shRNAs against CDV nucleoprotein (N) gene decreased N RNA level over 99% and completely inhibited viral growth. The multi-shRNA adenovirus vector treatment also exhibited a high silencing efficiency against CDV replication. For the second approach, we evaluated the anti-CDV effects of 6methylmercaptopurine riboside (6MMPr), a modified thiopurine nucleoside. 6MMPr treatment produced a marked decrese in viral RNA levels and inhibited the production of CDV infectious particles during virus replication. Taken together, our results demonstrate that both approaches successfully block CDV in vitro and thus contribute to the development of novel therapeutic strategies against CDV infection.

TRANSFECÇÃO DE FOLÍCULOS SECUNDÁRIOS OVINOS PARA A ATENUAÇÃO DA AQUAPORINA 3 POR RNAi E SEU EFEITO SOBRE O DESENVOLVIMENTO FOLICULAR IN VITRO

Relatos indicam que as aquaporinas (AQPs), em especial a AQP3, podem estar envolvidas no processo de formação do antro em folículos ovarianos, no entanto, essa informação ainda não foi completamente comprovada. Portanto, este trabalho teve como objetivo investigar a participação da AQP3 no desenvolvimento de folículos ovarianos ovinos cultivados in vitro, após o silenciamento gênico pós-transcricional (SGPT) ou knockdown para o mRNA dessa proteína. Inicialmente, foi desenvolvido um protocolo de transfecção utilizando o complexo de transfecção (CT) Lipofectamine® (volumes: 0,5; 0,75 ou 1,0 l) + o oligonucleotídio fluorescente BLOCK-iT (concentrações: 18,03; 27,12 ou 36,16 nM), por diferemtes tempos de incubação (12, 14, 16, 18 or 20 h). Os resultados mostraram que as melhores condições de transfecção foram 0,75 l de Lipofectamine® + 27,12 nM de BLOCK-iT incubando-se por 12 h. O knockdown da AQP3 foi realizado substituindo o BLOCK-iT pelo siRNA-AQP3 no CT. Folículos secundários foram distribuídos aleatoriamente em grupos: Controle não-transfectados (CD3 e CD6), transfectados com siRNA inespecífico (Negative Control Transfection - tNEG) ou com siRNA-AQP3 nos dias 0 (t0D3 ou t0D6), 3 (t3D6) ou 0 e 3 (t0/3D6) e então cultivados in vitro por 3 ou 6 dias. Após o cultivo, os folículos foram submetidos às avaliações: expressão gênica e proteica, integridade e extrusão e ainda o desenvolvimento folicular (crescimento, diâmetro e formação da cavidade antral). A AQP3 foi imunolocalizada em todas as estruturas foliculares, embora a expressão gênica em folículos transfectados e cultivados tenha sido menor que a de folículos antrais obtido in vivo. As taxas de folículos íntegros (t3D6 e t0/3D6) e formação de antro (t0/3D6) foram maiores em folículos transfectados do que a de folículos não transfectados. A taxa de folículos extrusos foi maior nos tratamentos CD6 e t0D6, enquanto que o tratamento t3D6 apresentou maior taxa de crescimento diário. Além disso, folículos dos tratamentos transfectados t3D6 e t0/3D6 apresentaram maior velocidade de crescimento folicular. Em conclusão, esse trabalho mostrou que é possível transfectar com sucesso, folículos secundários ovinos usando a técnica de siRNA e que essa técnica reduz a taxa de formação do antro em folículos secundários cultivados in vitro. Essa é maius uma evidência de que a AQP3 tem participação na formação da cavidade antral.

Reports indicate that aquaporins (AQPs), in particular AQP3 may be involved in the training event antral follicles cavity. However, the participation of this protein has not been fully elucidated. Techniques for post-transcriptional gene silencing (knockdown) are important tools and have been used to elucidate the function of proteins during folliculogenesis. Therefore, this study investigated the participation of AQP3 in the development of secondary follicles sheep after the knockdown in vitro culture. First transfection tests were performed with Lipofectamine® and BLOCK-iT fluorescent oligonucleotídio complex (transfection complex) in three different volumes (0.5, 0.75 or 1.0 l) and concentrations (18.03, 27.12 or 36.16 nM), respectively, and incubation times (12, 14, 16, 18 or 20 h). Tests showed that the best conditions for transfection were 0.75 l of Lipofectamine®, 27.12 nM BLOCK-iT and incubated for 12 h. The knockdown AQP3 occurred replacing the BLOCK-iT by siRNA-AQP3. Follicles side sheep were randomly allocated to non-transfected groups (CD3 and CD6) or transfected groups on days 0 (tNEG, t0D3, t0D6), 3 (t3D6) or 0 3 (t0/3D6) and cultured in vitro over 3 or 6 days. The follicles were evaluated by quantitative PCR techniques, immunohistochemistry, western blotting and the integrity analyzes, antrum formation and follicular growth. The test results showed that it is possible to successfully transfect secondary follicles sheep, and the transfection complex can cross the basement membrane barrier, granulosa cells and oocyte reach, according to the fluorescence emission by the follicles. The AQP3 was imunolocalized in all follicular structures although gene expression in transfected and cultured follicles was lower than the in vivo antral follicles. Protein expression was not detected in any treatment. The rates of intact follicles (t3D6 and t0/3D6) and antrum formation (t0/3D6) were higher in transfected follicles, the extruded follicles was higher in treatments (CD6 and t0D6) and t3D6 treatment showed the highest daily growth. In addition, treatments follicles transfected t3D6 and t0/3D6 showed a higher rate of follicular growth. In conclusion, this study showed more evidence that AQP3 possibly participates in the formation of antral cavity.

Silenciamento gênico pós-transicional por interferência por RNA (RNAi) com terapia antiviral para a raiva

A raiva é uma zoonose que afeta todos os mamíferos e causa cerca de 55.000 mortes humanas por ano, causada pelo vírus da raiva. O vírus da raiva pertence à Ordem Mononegavirales, Família Rhabdoviridae e o Gênero Lyssavirus. Ultimamente, o Protocolo de Milwaukee é a base do tratamento humano, com indução do paciente ao coma e uso de massiva terapia antiviral. O protocolo, embora tenha sido utilizado duas vezes com sucesso, inclusive em um caso brasileiro, ainda requer aperfeiçoamentos. Neste sentido, a interferência por RNA (RNAi) é uma nova abordagem para terapia de doenças virais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a inibição da replicação do vírus da raiva in vitro e in vivo utilizando RNAi. Para este fim, foram utilizados três siRNAs (siRNA 360, siRNA 652, siRNA 649) com a fita antisenso complementar ao mRNA da fosfoproteína (P) e três siRNAs (Le 1, Le 2, Le 3) contra o RNA líder do vírus da raiva. Para o ensaio in vitro foram utilizadas as amostras PV e 4005 (AgV3) do vírus da raiva e as células de BHK-21 (Baby hamster kidney). As monocamadas celulares foram infectadas com as amostras PV ou 4005 e depois de 2 horas de incubação transfectadas com cada um dos siRNAs em combinação com Lipofectamine 2000. Depois de 24 e 48 horas as placas teste e controle foram submetidas à imunofluorescência direta (IFD) com conjugado globulina de coelho anti-ribonucleocapsídeo do vírus da raiva/isotiocianato de fluoresceína (Instituto Pasteur de São Paulo). Os resultados revelaram que os siRNAs contra o RNA líder do vírus não foram capazes de inibir a replicação do vírus. A utilização dos siRNAs contra mRNA P resultaram em títulos de 3,625logTCID50/ml, 3,875logTCID50/ml e 4,125logTCID50/ml para os siRNAs 360, 649 e 652, respectivamente, enquanto que, para a placa controle, o título foi 4,0logTCID50/ml nas placas infectadas com PV e período de incubação de 24h. Nas placas infectadas com a amostra 4005 e tratadas com siRNAs, a maior queda de título viral foi na placa tratada com siRNA 360, de 1,0 log, comparando-se com a placa controle de incubação de 24 para a amostra 4005. Nas placas tratadas com siRNA 649 e siRNA 652, também houve a diminuição de título viral, mas em uma escala menor (0,25log e 0,125log, respectivamente) comparando-se com o controle. Nas placas infectadas com PV e incubadas durante 48h, os títulos apresentados foram de 5,625logTCID50/ml, 4,625logTCID50/ml e 4,75logTCID50%/ml para os siRNAs 360, 649 e 652, respectivamente, enquanto que na placa controle o título foi 6,0logTCID50C%/ml. A placa com período de incubação de 48h com a amostra 4005 e tratada com siRNA 360 apresentou a maior queda de título viral entre os três siRNAs, o que resultou em 1,125log de diferença. Nas monocamadas onde foram administrados siRNA 649 e siRNA 652, observou-se também uma pequena queda de título viral igual a 0,875log e 0,295log, respectivamente, comparando-se com a placa não tratada. Para o ensaio in vivo, foram usados camundongos albino suíços de 21 dias com peso entre 11 e 14g, infectados com a cepa PV e AgV3 em 10DL50% via intracerebral. Duas horas depois da infecção, foi inoculada por via intracerebral uma solução do siRNA 360 com Lipofectamine 2000. Os animais com paralisia foram eutanasiados e aqueles sobreviventes foram observados até completar 30 dias de observação quando foram, então, eutanasiados. O sistema nervoso central de todos os animas foi recolhido e submetido a IFD. A utilização do siRNA 360 em camundongos resultou em 30% de animais sobreviventes frente amostra 4005, enquanto que a mortalidade nos animais não tratados foi de 90%. Nos animais inoculados com a amostra PV e tratados com este siRNA, a sobrevivência foi de 40%, enquanto que no grupo controle a mortalidade foi de 100%. O resultado do ensaio in vitro demonstra que os siRNAs utilizados são capazes de inibir a replicação do vírus da raiva, com eficiência mais pronunciada para o siRNA 360. In vivo, este siRNA foi capaz de induzir a proteção parcial dos animais inoculados com as duas variantes virais. Estes resultados, ainda que indiquem a necessidade de mais estudos, permitem concluir que a RNAi é uma tecnologia promissora como antiviral contra a raiva.

Rabies is a zoonotic disease that affects all mammals and causes more than 55.000 human deaths every year, caused by rabies virus (RABV) a virus of the Mononegavirales order, Family Rhabdoviridae and the Lyssavirus genus. After the onset of the symptoms, the illness has a fast progression and the patients feel intense physical suffering. Currently, human rabies treatment has been based on the Milwaukee Protocol which consists on the induction of coma and massive antiviral therapy. Despite this protocol has been successful in two cases, including a Brazilian one, more studies on antivirals for human rabies treatment are required. RNA interference is a new antiviral approach, which gives hope to the possibility of rabies antiviral treatment. The aim of this study was to assess the decrease in titres of rabies virus in vitro and in vivo using short-interfering RNAs. To this end, three siRNAs (siRNA 360, siRNA 652, and siRNA 649) were used with antisense strands complementary to rabies virus phosphoprotein (P) mRNA and three other (Le 1, Le 2, Le 3) to the leader RNA. Pasteur virus strain (PV) and strain 4005 (AgV3) of rabies virus and BHK-21 cells were used, and the monolayers were transfected with each of the RNAs with Lipofectamine-2000. After 22 hours, the siRNA-treated and the control plates were tested by direct fluorescent antibody test (DFAT) with anti-rabies virus nucleocapsid antibody conjugate with fluorescein isothiocianate (Pasteur Insitutte, Brazil). The plates transfected with siRNA against phosphoprotein mRNA were also incubated for 48 hours and subjected to IFD assay. Virus titres were calculated by the Spearman-Karber method. The results showed that siRNAs against virus leader RNA were not able to inhibit the replication of the virus. The use of siRNAs against P mRNA resulting titres of 3.625logTCID50/ml 3.875logTCID50/ml and 4.125logTCID50/ml for siRNAs 360, 649 and 652, respectively, while, for the control plate, the titre was 4.0logTCID50/ml in plates with PV and 24h incubation period. In plates with strain 4005 and treated with siRNAs, the highest viral titre decrease was obtained with siRNA 360, with a 1.0 log difference compared to the control plate of strain 4005 incubated for 24h. The plates treated with siRNA 649 and siRNA 652 have was also shown a decrease in viral titres, but on a smaller scale (0.25log and 0.125log, respectively) compared to the control. The plates infected with PV and incubated for 48 hours showed titre of 5.625logTCID50/ml, 4.625logTCID50/ml and 4.75logTCID50%/ml for siRNAs 360, 649 and 652, respectively, while for the control plate the titre was 6.0logTCID50C%/ml. The plate with strain 4005 and then treated with siRNA360 and incubated for a total of 48h had the highest viral titre decrease among the three siRNAs, which resulted in a 1.125log difference compared to the control plate. In monolayers treated with siRNA649 and siRNA652 there was also a discrete drop in viral titres (0.875log and 0.295log, respectively) compared to the control plate. For the in vivo assay, 21-day old Swiss albino mice weighing between 11 and 14g were intracerebrally inoculated with PV or 4005 strains (10DL50%). Two hours after inoculation, a solution of siRNA360 with Lipofectamine 2000 was also intracerebrally injected. Mice presenting paralysis and those that survived the 30 days of observation were euthanized. The central nervous system of all animals was collected and submitted to IFD. The use of siRNA360 in mice resulted in survival of 30% of animals in the group inoculated with strain 4005, whereas 90% mortality was observed in the control group. In animals inoculated with the PV strain, and treated with siRNA360, the survival rate was 40% and in the control group the mortality was 100%. The results of the in vitro assay demonstrate that the siRNAs used are effective in inhibiting the replication of rabies virus with a more intense inhibition regarding siRNA 360. In vivo, this siRNA was able to induce partial protection of animals infected with both viral variants. These results also indicate that, despite the need for further studies, RNAi is a promising technology as antiviral against rabies.

Viroides, pequenos RNAs patogênicos capazes de replicação autônoma: modelos moleculares para o estudo de interações patógeno-hospedeiro e evolução / Viroids, small pathogenic RNAs capable of autonomous replication: molecular models for the study on host-pathogen interactions and evolution

Os viroides, apesar de serem constituídos por um pequeno RNA de fita simples, fortemente estruturado, circular, que não codifica proteínas, são capazes de se replicar de maneira autônoma em plantas superiores e causar doença interagindo diretamente com fatores do hospedeiro. Nesta revisão, serão apresentados e discutidos alguns dos mais recentes trabalhos envolvendo a interação de viroides com fatores do hospedeiro, incluindo aspectos relacionados à replicação, movimento e patogênese, além de suas características evolutivas. Nos últimos anos, alguns grupos de pesquisa têm se aventurado na busca por fatores do hospedeiro e mecanismos moleculares relacionados ao ciclo infeccioso dos viroides, tentando desvendar como esses pequenos RNAs interagem com o hospedeiro induzindo sintomas. Os viroides não codificam proteínas supressoras de silenciamento e, portanto, devem garantir sua existência utilizando estratégias baseadas em sua estrutura secundária, na compartimentalização em organelas, associação com fatores do hospedeiro e eficiência na replicação. A complexidade do ciclo infeccioso desses minúsculos RNAs indica que muitas interações desses patógenos com fatores do hospedeiro ainda devem ser identificadas.

Viroids are small, single-stranded, highly structured, circular RNAs that replicate autonomously in their hosts, without messenger RNA activity. Because they do not encode for proteins, viroids have to interact directly with host factors. This review presents recent progress in understanding the possible role of recently identified viroid-binding host proteins related to replication, trafficking and pathogenesis. It also discusses some aspects on viroid evolution. In recent years, efforts to understand how viroids replicate, cause disease and induce symptoms have prompted details on molecular mechanisms related to the viroid infectious cycle. Inasmuch as viroids lack protein-encoding capacity, including suppressors of gene silencing, their existence could be ensured by their compact conformation, compartimentalization in organelles, association with host factors or by their highly efficient replication. The complexity of the infectious cycle of these tiny pathogenic RNAs indicates that several interactions with host factors remain to be identified.