Padronização do Sperm Class Analyzer® (SCA®) para avaliação de espermatozoides equinos criopreservados / [Standardization of the Sperm Class Analyzer® (SCA®) for the evaluation of cryopreserved equine sperm]

Objetivou-se, no primeiro experimento, avaliar o efeito da velocidade de captura de imagens de 25Hz, 30Hz e 50Hz na cinética dos espermatozoides equinos criopreservados. Todas as velocidades mostraram-se adequadas para capturar o movimento espermático (P>0,05). No segundo experimento, objetivou-se avaliar o efeito da deposição de sêmen em lâmina sob lamínula, Leja®10 e 20, na cinética espermática. O uso de lâmina e lamínula foi superior às lejas para manter a LIN e o WOB (P<0,05). No terceiro experimento, objetivou-se avaliar o efeito das concentrações de 25, 50 e 100x106 na cinética espermática. As concentrações de 25 e 50 x106 foram superiores a 100x106 para preservar a LIN, a STR e a BCF e não afetar negativamente a motilidade (P<0,05). No quarto experimento, objetivou-se avaliar o efeito dos diluidores BotuCrio®, BotuSêmen®, TALP sperm e da solução fisiológica na cinética espermática. O BotuCrio® foi superior a todos os diluidores em preservar a BCF e os hiperativos (P<0,05). Conclui-se que o emprego da velocidade de captura entre 25 e 50Hz, a deposição do sêmen entre lâmina e lamínula e a rediluição em diluidor de congelação para atingir 25 a 50x106 de espermatozoides/mL são ideais para o SCA® avaliar, de forma fidedigna, o sêmen equino criopreservado.(AU)

The objective of the first experiment was to evaluate the effect of 25, 30 and 50Hz frame acquisition rate on equine cryopreserved sperm. All frame acquisition rates tested were adequate to capture the sperm movement (P>0.05). The aim of the second experiment was to evaluate the effect of chambers, slide-coverslip, Leja®10 and 20 on sperm movement. The use of slide-coverslip was superior to maintain LIN and WOB (P<0.05). The aim of the third experiment was to evaluate the effect of 25, 50 and 100x106 sperm/mL concentration on sperm movement. Concentrations of 25 and 50x106 sperm/mL were greater than 100x106 to preserve LIN, STR and BCF and did not adversely affect motility (P<0.05). The aim of the fourth experiment was to evaluate the effect of BotuCrio®, BotuSêmen®, TALP sperm and physiological solution on sperm movement. BotuCrio® was superior among other extenders in preserving BCF and hyperactive (P<0.05). It is concluded that the use of the frame acquisition rate between 25 and 50 Hz; the deposition of semen between slide and coverslip and new dilution in the freezing extender to 25-50x106 of sperm/mL is ideal to reliably evaluate cryopreserved equine semen by SCA®.(AU)

Padronização do Sperm Class Analyzer® (SCA®) para avaliação de espermatozoides equinos criopreservados / [Standardization of the Sperm Class Analyzer® (SCA®) for the evaluation of cryopreserved equine sperm]

Objetivou-se, no primeiro experimento, avaliar o efeito da velocidade de captura de imagens de 25Hz, 30Hz e 50Hz na cinética dos espermatozoides equinos criopreservados. Todas as velocidades mostraram-se adequadas para capturar o movimento espermático (P>0,05). No segundo experimento, objetivou-se avaliar o efeito da deposição de sêmen em lâmina sob lamínula, Leja®10 e 20, na cinética espermática. O uso de lâmina e lamínula foi superior às lejas para manter a LIN e o WOB (P<0,05). No terceiro experimento, objetivou-se avaliar o efeito das concentrações de 25, 50 e 100x106 na cinética espermática. As concentrações de 25 e 50 x106 foram superiores a 100x106 para preservar a LIN, a STR e a BCF e não afetar negativamente a motilidade (P<0,05). No quarto experimento, objetivou-se avaliar o efeito dos diluidores BotuCrio®, BotuSêmen®, TALP sperm e da solução fisiológica na cinética espermática. O BotuCrio® foi superior a todos os diluidores em preservar a BCF e os hiperativos (P<0,05). Conclui-se que o emprego da velocidade de captura entre 25 e 50Hz, a deposição do sêmen entre lâmina e lamínula e a rediluição em diluidor de congelação para atingir 25 a 50x106 de espermatozoides/mL são ideais para o SCA® avaliar, de forma fidedigna, o sêmen equino criopreservado.(AU)

The objective of the first experiment was to evaluate the effect of 25, 30 and 50Hz frame acquisition rate on equine cryopreserved sperm. All frame acquisition rates tested were adequate to capture the sperm movement (P>0.05). The aim of the second experiment was to evaluate the effect of chambers, slide-coverslip, Leja®10 and 20 on sperm movement. The use of slide-coverslip was superior to maintain LIN and WOB (P<0.05). The aim of the third experiment was to evaluate the effect of 25, 50 and 100x106 sperm/mL concentration on sperm movement. Concentrations of 25 and 50x106 sperm/mL were greater than 100x106 to preserve LIN, STR and BCF and did not adversely affect motility (P<0.05). The aim of the fourth experiment was to evaluate the effect of BotuCrio®, BotuSêmen®, TALP sperm and physiological solution on sperm movement. BotuCrio® was superior among other extenders in preserving BCF and hyperactive (P<0.05). It is concluded that the use of the frame acquisition rate between 25 and 50 Hz; the deposition of semen between slide and coverslip and new dilution in the freezing extender to 25-50x106 of sperm/mL is ideal to reliably evaluate cryopreserved equine semen by SCA®.(AU)

Aspectos econômicos e avaliação do período de viabilidade de espermatozoides ovino imunossexados e diluídos em meio de conservação à base de água de coco em pó (ACP-102c) / Economic aspects and evaluation of the viability period of immunosexed and diluted ram sperm in powdered coconut water conservation extender (ACP-102c)

Background: Sperm sexing is increasing in use because pre-determining the sex of the calf allows greater profitability and promotes significant gains in the productive systems that utilize the technique. Deployment of a low-cost and practical preservation methodol-ogy may further favor the cost-benefit ratio. Flow cytometry, the most commonly used sexing technique, has high costs and is very restricted. As an alternative, immunosexing has been studied, which uses sex-specific monoclonal antibodies. Thus, the objective of this study was to evaluate the immunosexing technique in conjunction with cryopreservation in ACP-102c and examine its economic aspects with regard to ram semen.Materials, Methods & Results: Ejaculates from two ram individuals were collected with the aid of an artificial vagina, evaluated, and submitted to the immunosexing protocol, according to the manufacturer’s recommendations, using the Monoclonal Antibody Kit specific for mammalian sperm with “Y” chromosomes (HY; HY Biotechnology, Rio de Janeiro-RJ, Brazil). After sexing, the supernatant was resuspended in the cryopreservation diluent: ACP (ACP-102c + 20% egg yolk + 7% glycerol), packaged in 0.25 mL straws, refrigerated to 4°C, stabilized for 30 min, frozen in liquid nitrogen vapors (-60°C) for 15 min, immersed in liquid nitrogen, and stored in cryogenic cylinders. The samples were thawed and evaluated for sperm kinetics both by using computerized semen analysis with SCA® software (Sperm Class Analyzer version 5.0) and subjectively comparing specimens from the two animals using conventional microscopy (40x). Plasma membrane integrity (IMP) and sperm cell morphology were evaluated by the smear staining technique...

Cryopreservation of boar semen in 0. 5 mL straws at low spermatozoa concentration is better than high concentration to maintain sperm viability / A manutenção da viabilidade do sêmen suíno criopreservado em palhetas de 0, 5 mL em baixas concentrações espermáticas é melhor do que em altas concentrações

To date, no studies have been performed evaluating the effect of boar spermatozoa concentration in 0.5mL freezing straws, leading us to examine this question. Each sperm-rich fraction of the ejaculate (n=25) was diluted at five different sperm concentrations (100, 200, 300, 600 and 800 x 106 spermatozoa/mL), packaged in 0.5mL straws, and subsequently frozen. After thawing, the sperm from all of treatment groups were analyzed to determine motility characteristics using a sperm class analyzer (SCA-CASA), and their plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, sperm membrane lipid peroxidation and fluidity were analyzed by flow cytometry. An increase in spermatozoa concentration above 300x106 spermatozoa/mL in a 0.5mL straw impaired (p<0.05) the total and progressive motility, curvilinear velocity, straight-line velocity, linearity and beat cross frequency. However, the plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, membrane lipid peroxidation and fluidity were not influenced (p>0.05) by high spermatozoa concentrations at freezing. Therefore, to increase spermatozoa survival and total and progressive motility after thawing, boar spermatozoa should be frozen at concentrations up to 300x106 spermatozoa/mL.(AU)

Até o momento, não foram realizados estudos que avaliassem o efeito da concentração de espermatozoides/mL em palhetas (0,5mL) para a criopreservação, levando-nos a analisar esta questão. Cada fração-rica do ejaculado (n=25) foi diluída em cinco diferentes concentrações de espermatozoides (100, 200, 300, 600 e 800x106 espermatozoides/mL), envasadas em palhetas de 0,5mL e posteriormente congeladas. Após a descongelação, os espermatozoides de todos os tratamentos foram avaliados a fim de determinar as características de motilidade usando um sistema de análise computadorizada dos espermatozoides (SCA-CASA). A integridade das membranas plasmática e acrosomal, o potencial de membrana mitocondrial, a peroxidação lipídica e a fluidez da membrana foram analisadas por citometria de fluxo. O aumento na concentração de espermatozoides acima de 300x106 espermatozoides/mL diminuiu (p<0,05) a motilidade total e progressiva, velocidade curvilínea, velocidade linear, linearidade e frequência de batimento. No entanto, a integridade da membrana plasmática e acrosomal, potencial de membrana mitocondrial, peroxidação lipídica e fluidez de membrana não foram influenciados (p>0,05) por altas concentrações de espermatozoides durante a criopreservação. Portanto, a fim de melhorar a sobrevivência dos espermatozoides suínos e a motilidade total e progressiva após a descongelação, os espermatozoides suínos devem ser congelados a concentrações não superiores a 300x106 espermatozoides/mL.(AU)

Cryopreservation of boar semen in 0. 5 mL straws at low spermatozoa concentration is better than high concentration to maintain sperm viability / A manutenção da viabilidade do sêmen suíno criopreservado em palhetas de 0, 5 mL em baixas concentrações espermáticas é melhor do que em altas concentrações

To date, no studies have been performed evaluating the effect of boar spermatozoa concentration in 0.5mL freezing straws, leading us to examine this question. Each sperm-rich fraction of the ejaculate (n=25) was diluted at five different sperm concentrations (100, 200, 300, 600 and 800 x 106 spermatozoa/mL), packaged in 0.5mL straws, and subsequently frozen. After thawing, the sperm from all of treatment groups were analyzed to determine motility characteristics using a sperm class analyzer (SCA-CASA), and their plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, sperm membrane lipid peroxidation and fluidity were analyzed by flow cytometry. An increase in spermatozoa concentration above 300x106 spermatozoa/mL in a 0.5mL straw impaired (p<0.05) the total and progressive motility, curvilinear velocity, straight-line velocity, linearity and beat cross frequency. However, the plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, membrane lipid peroxidation and fluidity were not influenced (p>0.05) by high spermatozoa concentrations at freezing. Therefore, to increase spermatozoa survival and total and progressive motility after thawing, boar spermatozoa should be frozen at concentrations up to 300x106 spermatozoa/mL.(AU)

Até o momento, não foram realizados estudos que avaliassem o efeito da concentração de espermatozoides/mL em palhetas (0,5mL) para a criopreservação, levando-nos a analisar esta questão. Cada fração-rica do ejaculado (n=25) foi diluída em cinco diferentes concentrações de espermatozoides (100, 200, 300, 600 e 800x106 espermatozoides/mL), envasadas em palhetas de 0,5mL e posteriormente congeladas. Após a descongelação, os espermatozoides de todos os tratamentos foram avaliados a fim de determinar as características de motilidade usando um sistema de análise computadorizada dos espermatozoides (SCA-CASA). A integridade das membranas plasmática e acrosomal, o potencial de membrana mitocondrial, a peroxidação lipídica e a fluidez da membrana foram analisadas por citometria de fluxo. O aumento na concentração de espermatozoides acima de 300x106 espermatozoides/mL diminuiu (p<0,05) a motilidade total e progressiva, velocidade curvilínea, velocidade linear, linearidade e frequência de batimento. No entanto, a integridade da membrana plasmática e acrosomal, potencial de membrana mitocondrial, peroxidação lipídica e fluidez de membrana não foram influenciados (p>0,05) por altas concentrações de espermatozoides durante a criopreservação. Portanto, a fim de melhorar a sobrevivência dos espermatozoides suínos e a motilidade total e progressiva após a descongelação, os espermatozoides suínos devem ser congelados a concentrações não superiores a 300x106 espermatozoides/mL.(AU)

Cryopreservation of tambaqui semen using a dry shipper and a programmed freezing machine / Criopreservação do sêmen de tambaqui utilizando dry shipper e máquina de congelação programada

Tambaqui (Colossoma macropomum) is a native freshwater fish that is of great importance for Brazilian aquaculture. Because of this importance, several techniques have been developed to improve the reproduction of this species in captivity. One of these techniques is the cryopreservation of sperm. In an effort to increase the efficiency of cryopreservation protocols, researchers have tried to determine suitable diluting solutions and freezing methods, which will provide a better post-thaw sperm quality. Thus, this study aimed to evaluate the efficiency of different diluents and freezing methods for the cryopreservation of tambaqui (C. macropomum) sperm. Samples of fresh semen were diluted in different treatments (Glucose 5% + 10% Dimethyl sulfoxide DMSO, Glucose 5% + 10% Methyl glycol MG, BTS + 10% DMSO and BTS + 10% MG) at a 1:9 dilution rate and frozen in a programmed freezing machine and a dry shipper. The semen samples were thawed and evaluated for vitality, sperm morphology and kinetics. Cryopreserved semen with DMSO and using the programmed freezing machine provided a greater percentage of motile sperm (15.44 ± 1.04%) after thawing compared to the dry shipper (3.99 ± 0.55%), regardless of the diluent. Additionally, DMSO showed better sperm velocities than MG regardless of the freezing method and the extender employed. A higher percentage of living spermatozoa was obser

O tambaqui (Colossoma macropomum) é uma espécie nativa de peixe de água doce de grande importância para aquicultura brasileira. Devido a isso, diversas técnicas têm sido desenvolvidas para aperfeiçoar a reprodução desta espécie em cativeiro, dentre elas a criopreservação de sêmen de peixe. Como uma forma de melhorar os protocolos de criopreservação, tem-se buscado utilizar soluções diluidoras e métodos de congelação adequados, proporcionando uma boa qualidade seminal pós-descongelação. Dessa forma, este estudo objetivou avaliar a eficiência de diferentes diluidores e métodos de congelação na criopreservação do sêmen de tambaqui (C. macropomum). As amostras de sêmen fresco foram diluídas em diferentes tratamentos (Glicose 5% + 10% Dimetilsufóxido DMSO; Glicose 5% + 10% Metil glicol MG; Beltsville Thawing Solution BTS + 10% DMSO e BTS + 10% MG) na proporção 1:9 e congeladas em máquina de congelação programada e em Dry shipper. As amostras seminais foram descongeladas e avaliadas para vitalidade, morfologia e cinética espermáticas. O sêmen criopreservado com DMSO utilizando a máquina de congelação programada proporcionou maiores percentuais de espermatozoides móveis (15,44 ± 1,04%) após a descongelação em relação ao Dry shipper (3,99 ± 0,55%), independente do diluente utilizado. Além disso, DMSO proporcionou as melhores velocidades espermáticas em relação ao MG, independente

EFEITO PREVENTIVO DO ÁCIDO ALFA-LIPÓICO NA DEGENERAÇÃO TESTICULAR POR CHOQUE TÉRMICO AGUDO EM CAMUNDONGOS

A temperatura testicular em mamíferos deve ser inferior à temperatura corpórea para manter as funções de produção espermática adequada. O aumento da temperatura intratesticular pode ocasionar a degeneração testicular que culmina na queda da fertilidade e pode ter impacto negativo na produção de testosterona, em decorrência da apoptose nas células de Leydig e maior liberação de ROS, compondo um quadro associado de estresse oxidativo. Para combater esse efeito negativo existem fisiologicamente antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, porém, a depender da intensidade e continuidade da agressão, esses nem sempre conseguem cumprir sua tarefa antioxidativa. O ácido alfa-lipóico (ALA) vem conquistando espaço e bons resultados como suplemento antioxidante capaz de tratar, atenuar e até prevenir diversas alterações no organismo. Seus efeitos na reprodução animal já foram descritos para melhoria da motilidade, viabilidade, concentração espermática em casos de varicocele, isquemia/reperfusão, criopreservação e aumento na taxa de prenhez. Portanto, objetivou-se avaliar a capacidade preventiva do ALA na degeneração testicular induzida por choque térmico em camundongos maduros sexualmente. Para isso, 36 camundongos foram divididos nos seguintes grupos: Controle Negativo (CN; n = 6) como parâmetro local do biotério; Controle Positivo (CP; n = 10) que foram suplementados com placebo; ALA 200mg (A2P; n = 10) que foram suplementados com 200mg/Kg/dia; ALA 400mg (A4P; n = 10) que foram suplementados com o dobro da dose anterior. Excetuando o CN, os demais grupos foram suplementados durante 30 dias, foram submetidos ao esgotamento das reservas epididimárias com fêmeas por, no mínimo, 8 dias e, então, foram levados ao choque térmico testicular para induzir a degeneração testicular, sendo eutanasiados 48h depois. Os indivíduos passaram por biometria testicular (LET), passaram por avaliação macroscópica post morten, coleta das gônadas e glândulas sexuais acessórias para avaliação geral dos efeitos do ALA nos indivíduos, avaliação do sêmen pelo Sperm Class Analyser® e demais parâmetros que avaliam morfologia, concentração, integridade funcional e estrutural das membranas espermáticas, oIX comportamento da condensação da cromatina, e a análise histológica e histomorfometria em lâminas coradas em H&E. Nesse estudo observou-se a capacidade anti-inflamatória do ALA ao detectar edema na bolsa escrotal apenas no CP. Quanto a estrutura histológica, geralmente a dose do grupo A4P mostrou uma melhor capacidade de preservá-la, acentuando seu potencial preventivo em lesões teciduais severas no parênquima testicular. Por outro lado, os grupos que receberam ALA apresentaram taxa de mortalidade de 35% em média, enquanto os demais resultados não demonstraram relevância. Diante da potencial capacidade preventiva do ALA em caso de degeneração causada por choque térmico agudo, faz-se necessário investigar sua capacidade de reverter os danos teciduais.

The testicular temperature in mammals must be lower than the body temperature to maintain proper sperm production functions. The increase in intratesticular temperature can cause testicular degeneration that culminates in the fall of fertility and can have a negative impact on the production of testosterone, due to apoptosis in Leydig cells and greater release of ROS, composing an associated picture of oxidative stress. To combat this negative effect there are physiologically enzymatic and nonenzymatic antioxidants, however, depending on the intensity and continuity of the aggression, they are not always able to fulfill their antioxidative task. Alpha-lipoic acid (ALA) has been reaching space and good results as an antioxidant supplement capable of treating, attenuating and even preventing various changes in the organism. Its effects on animal reproduction have already been described to improve motility, viability, sperm concentration in cases of varicocele, ischemia / reperfusion, cryopreservation and increased pregnancy rate. Therefore, the objective was to evaluate the preventive capacity of ALA in testicular degeneration induced by thermal shock in sexually mature mice. For this, 36 mice were placed into the following groups: Negative Control (CN; n = 6) as a local parameter of the vivarium; Positive Control (CP; n = 10) supplemented with placebo; 200mg ALA (A2P; n = 10) supplemented with 200mg / kg / day; ALA 400mg (A4P; n = 10) supplemented with twice the previous dose. Except for the CN, the other groups were supplemented for 30 days, underwent depletion of epididymal reserves with females for at least 8 days, and then they were taken to testicular thermal shock to induce testicular degeneration, being euthanized 48h later. Individuals underwent testicular biometry (LET), underwent macroscopic post morten evaluation, collection of gonads and accessory sexual glands for general evaluation of ALA effects on individuals, semen evaluation by Sperm Class Analyzer® and other parameters that evaluate morphology, concentration , functional and structural integrity of sperm membranes, chromatin condensation behavior, and histological analysis and histomorphometry in slides stained in H&E. In this study, the anti-inflammatory capacity of ALA was observed by detecting edema in the scrotum ofXI CP, only. As for the histological structure, the A4P group dose generally showed a better ability to preserve it, accentuating its preventive potential in severe tissue lesions in the testicular parenchyma. On the other hand, the groups that received ALA had an average mortality rate of 35%, while the other results did not demonstrate relevance. In view of the potential preventive capacity of ALA in the degeneration event caused by acute thermal shock, it is necessary to investigate its ability to reverse tissue damage.

RETORNO REPRODUTIVO DE FÊMEAS DE TAMBAQUI E QUALIDADE ESPERMÁTICA DE MACHOS ENDOGÂMICOS DE TILÁPIA-DO-NILO

O tambaqui é uma espécie reofílica, sendo que em seu ambiente natural precisa realizar piracema para que sua reprodução ocorra, enquanto na piscicultura para que a reprodução ocorra é necessário a utilização de indutores. A tilápia-do-Nilo possui vantagens reprodutivas quando relacionada a outras espécies de peixes, por apresentar maturação sexual precoce e capacidade de se reproduzir durante todo o ano em condições ambientais favoráveis. O objetivo do estudo foi avaliar a reprodução induzida de fêmeas de Colossoma macropomum no início do período reprodutivo e após 75 dias da primeira desova, e comparar as características espermáticas de diferentes grupos genéticos de tilápias-do-Nilo em três coletas com intervalo de 30 dias. Experimento 1: Foram utilizadas oito fêmeas com médias de peso de 6,7 kg e quatro anos de idade. Foi realizada uma indução hormonal no início do período reprodutivo (outubro) e outra após 75 dias da primeira desova (dezembro), sendo avaliados as características reprodutivas das fêmeas nestes dois momentos. Das oito fêmeas que desovaram na primeira indução reprodutiva, três fêmeas (37,5%) desovaram novamente após 75 dias. Todas as características avaliadas foram semelhantes nas duas desovas, exceto a taxa de fertilização que foi menor (P<0,05) na segunda desova. A maioria das fêmeas (66,7%) que desovaram novamente (2ª vez) após 75 dias apresentaram valores superiores à primeira indução hormonal para todas as características avaliadas, exceto para taxa de fertilização. Concluímos que é possível obter retorno reprodutivo de fêmeas de C. macropomum após 75 dias da primeira desova induzida. Experimento 2: Foram utilizados 30 exemplares de tilápia-do-Nilo (500 g), divididos em três grupos, sendo: (i) grupo com 10 peixes endogâmicos (AquaAmérica irmãos completos, consanguinidade de 25% dos pais); (ii) grupo com 10 peixes não endogâmicos (AquaAmérica sem ancestrais comuns até a terceira geração), com consanguinidade no máximo igual a 2%, sem nenhum bisavô comum dos pais; (iii) grupo com 10 peixes heterose (AquaAmérica X GIFT) cruzamento dos pais. Foram avaliadas as características seminais pelo sistema computadorizado (Sperm Class Analyzer), integridade de membrana e atividade mitocondrial. Não houve diferença significativa entre as características espermática entre os grupos genéticos nas diferentes coletas, exceto para a frequência de batimento cruzado (BCF) na primeira coleta. Na comparação de das coletas de cada grupo genético, apenas BCF no grupo AquaAmérica endogâmico diferiu significativamente (P<0,05), com maior valor na coleta 3 (7,7 Hz) em relação a coleta 2 (6,86 Hz). Com relação a integridade da membrana e atividade mitocondrial, apenas a porcentagem de membrana plasmática lesada com alto potencial mitocondrial no grupo genético AquaAmérica endogâmica foi menor (P<0,05) na coleta 2 (0,29%) em relação as coletas 1 (8,34%) e 3 (8,72%); a membrana plasmática integra com alto potencial mitocondrial no grupo AquaAmérica não endogâmica que foi maior (P<0,05) na coleta 2 (27,1%) em relação a coleta 1 (2,97) e 3 (1,72) e no grupo AquaAmérica x GIFT que foi maior (P<0,05) na coleta 2 (68,02%) em relação as coletas 1 (6,19%) e 3 (5,79%). Conclui-se que a variedade AquaAmérica não endogâmica apresenta melhores valores para a variável BCF na primeira coleta, variável que apresenta comportamento distinto entre o grau de endogamia da variedade AquaAmérica ao logo das coletas, inclusive com grande contraste entre a integridade da membrana e atividade mitocondrial entre as coletas.

The tambaqui is a rheophilic species that must perform the piracema (swimming upstream to lay eggs) to reproduce, when in its natural environment. In fish farming, however, inducers must be used for its reproduction to occur. Compared to other fish species, Nile tilapia has reproductive advantages provided by its early sexual maturation and ability to reproduce throughout the year in favorable environmental conditions. The objective of this study was to examine the induced reproduction of Colossoma macropomum females at the beginning of the reproductive period and 75 days after the first spawning, as well as to compare the sperm characteristics of different genetic groups of Nile tilapia in three collections spaced 30 days apart. Experiment 1: eight 4-year-old females with an average weight of 6.7 kg underwent hormonal induction at the beginning of the reproductive period (October) and again 75 days after the first spawning (December). Reproductive traits of the females were evaluated on these two occasions. Of the eight females that spawned in the first reproductive induction, three (37.5%) spawned again after 75 days. All evaluated traits were similar in both spawns, except fertilization rate, which was lower (P<0.05) in the second spawn. Most females (66.7%) that spawned again (2nd time) after 75 days showed higher values than in the first hormonal induction for all evaluated traits, except fertilization rate. We concluded that return to reproduction in C. macropomum females can be achieved 75 days after the first induced spawning. Experiment 2: thirty specimens of Nile tilapia (500 g) were divided into three groups: (i) 10 inbred fish (AquaAmérica full-sibs, 25% inbreeding from parents); (ii) 10 non-inbred fish (AquaAmérica with no common ancestors up to the third generation, with inbreeding of at most 2%, without any common great-grandparent between parents); and (iii) 10 heterozygous fish (AquaAmérica × GIFT parents). Semen characteristics were evaluated in a computerized system (Sperm Class Analyzer) and membrane integrity and mitochondrial activity were analyzed. There was no significant difference in sperm characteristics between the genetic groups in the different collections, except for beat-cross frequency (BCF) in the first collection. When the collections of each genetic group were compared, only BCF in the inbred AquaAmérica group differed significantly (P<0.05), with a higher value observed in collection 3 (7.7 Hz) than in collection 2 (6.86 Hz). As regards membrane integrity and mitochondrial activity, only the percentage of damaged plasma membrane with high mitochondrial potential in the inbred AquaAmérica genetic group was lower (P<0.05) in collection 2 (0.29%) than in collections 1 (8.34%) and 3 (8.72%). Likewise, intact plasma membrane with high mitochondrial potential in the non-inbred AquaAmérica group was higher (P<0.05) in collection 2 (27.1%) than collections 1 (2.97) and 3 (1.72), whereas in the AquaAmérica × GIFT group, it was higher (P<0.05) in collection 2 (68.02%) than collections 1 (6.19%) and 3 (5.79%). In conclusion, BCF values in the non-inbred AquaAmérica variety are better in the first collection. This variable behaves differently according to the degree of inbreeding in the AquaAmérica variety throughout collections, with a marked contrast between membrane integrity and mitochondrial activity between collections.

Sperm motility and velocities of Characiformes fishes in different times post-activation / Motilidade e velocidades espermáticas de peixes Characiformes em diferentes tempos pós ativação

The objective of the current study was to observe the performance kinetics (motilities and velocities) of the spermatozoa from Prochilodus brevis (curimatã), Colossoma macropomum (tambaqui) and Piaractus brachypomus (pirapitinga) species in different times post-activation. The sperm of P. brevis, C. macropomum and P. brachypomus species were collected after hormonal induction with carp pituitary extract. The samples with not contamination with water, urine or feces had motility subjective, morphology, osmolality and concentration analyzed. The samples selected were analyzed with Sperm Class Analyzer. Spermatozoa motility and velocities were captured at 10, 30, 60 and 120 s postactivation. No significant differences in total motility of P. brevis spermatozoa were observed between 10 s and 30 s post-activation. However, significant reduction was observed in 60 s. This reduction was more accentuated after 120 s. The same pattern of spermatozoa motility decline happened for C. macropomum and P. brachypomus. Velocities also followed the same pattern for the three species. There was significant reduction in velocities after 30 s; this reduction was more significant after 60 s. There was no significance difference between 60 s and 120 s post-activation. Sperm of C. macropomum and P. brachypomus show satisfactory sperm quality up to 60 s after activation. On the other hand, sperm of P. brevis up to 120 s after activation. These findings show that the rate of sperm motility in different times post activation is change for each species tested.(AU)

O objetivo do presente trabalho foi investigar o desempenho cinético (motilidade e velocidades espermáticas) de Prochilodus brevis (curimatã), Colossoma macropomum (tambaqui) e Piaractus brachypomus (pirapitinga) em diferentes tempos pós ativação. O sêmen de P. brevis, C. macropomum e P. brachypomus foi coletado após indução hormonal com extrato hipofisário de carpa. As amostras não contaminadas com sangue, fezes ou urina tiveram motilidade subjetiva, morfologia, osmolaridade e concentração analisadas. As amostras selecionadas foram analisadas com o Sperm Class Analyzer. A motilidade e velocidade dos espermatozoides foram mensuradas a 10, 30, 60 e 120 s pós ativação. Nenhuma diferença significativa na motilidade total do sêmen de P. brevis foi observada entre 10 s e 30 s pós ativação. No entanto, uma redução significativa foi observada aos 60 s. Essa redução foi mais acentuada após 120 s. O mesmo padrão de declínio da motilidade espermática ocorreu para C. macropomum e P. brachypomus. As velocidades espermáticas seguiram o mesmo padrão para as três espécies. Houve redução significativa nas velocidades após 30 s; essa redução foi mais significativa após 60 s. Não houve diferença significativa entre 60 s e 120 s pós ativação. Os espermatozoides de C. macropomum e P. brachypomus apresentam satisfatotia qualidade espermática até 60 s pós ativação. Por outro lado, os espermatozoides de P. brevis apresentam satisfatória qualidade espermática até 120 s pós ativação. Esses achados mostram que a taxa de motilidade espermática em diferentes tempos pós ativação muda para cada espécie testada.(AU)

Efeito da radiação vermelha de baixa intensidade sobre o sêmen canino criopreservado / Effect of low intensity red light on the canine semen cryopreservation

O objetivo geral deste trabalho foi analisar o efeito da radiação vermelha de baixa intensidade sobre alguns parâmetros cinéticos do espermatozoide canino criopreservado. Ejaculados de oito cães adultos foram centrifugados, rediluídos em meio tris-gema de ovo com 6% de glicerol, e, posteriormente, fracionados em: T1: incidência de radiação vermelha (660 NM) (Fisioled - Mmoptics - 100mW) por 60 segundos, antes do resfriamento e após a descongelação, T2: incidência somente antes do resfriamento, T3: incidência somente após a descongelação, e T4: sem incidência. Após a descongelação, as amostras foram submetidas ao TTR utilizando-se Sperm Class Analyzer(r). No TTR0, TTR60 e TTR90, não houve diferença entre as variáveis analisadas pelo CASA. Somente no TTR30 os efeitos da incidência da radiação vermelha foram evidentes e significativos em T1 e T2, T1 resultou em baixa MT (12,5 + 10,6%) e T2 determinou o melhor resultado de MT 40,3 + 26,1%. De forma similar T1 apresentou maior número de espermatozoides estáticos (77,5±28,9%) em relação ao T2 (50,6±28%). Concluiu-se que a dupla incidência de radiação vermelha de baixa intensidade antes do resfriamento e após a descongelação teve efeito deletério sobre a motilidade do espermatozoide canino, expressa principalmente aos 30 minutos após descongelação.(AU)

The aim of this study was to analyze the effect of low intensity red light on some kinetic parameters of cryopreserved canine sperm. Ejaculates from 08 adult dogs were centrifuged, diluted in Tris-egg yolk with 6% glycerol, and subsequently separated into: T1: incidence of red light (660 nm) (Fisioled -MMOptics - 100mW) for 60 seconds before the cooling and after thawing, T2: just before cooling, T3: only after thawing, and T4: no incidence. After thawing the samples were subjected to TTR using Sperm analyzer(r). In TTR0, TTR60 and TTR90 there were no differences between the variables analyzed by CASA. Only in TTR30 the effects of the incidence of red light were visible and significant in T1 and T2. T1 resulted in low MT (12.5 ±10.6%) and T2 determined the best result of MT 26.1%±40.3. Similarly T1 showed a higher number of static spermatozoa (77.5±28.9%) compared to T2 (50.6±28%). We concluded that the double incidence of low intensity red light, before cooling and after thawing, had a deleterious effect on canine sperm motility expressed at 30 minutes after thawing.(AU)

ANÁLISE PROTEÔMICA E BIOQUÍMICA DO PLASMA SEMINAL DE TOUROS DA RAÇA NELORE CLASSIFICADOS COMO APTOS E INAPTOS À REPRODUÇÃO

Este estudo foi realizado como o objetivo de determinar o perfil proteômico e bioquímico do plasma seminal de touros jovens da raça Nelore e sua relação com as características físicas e morfologicoas do sêmen. Foram usados 20 touros com idades compreendidas entre os 19,8 e 22,7 meses. Todos os touros foram submetidos a avaliação andrológicas e classificados segundo suas características reprodutivas em touros aptos e inaptos à reprodução. Foi coletada uma amostra de sêmen de cada touro pelo do método de eletroejaculação e foram avaliados os aspectos físicos e morfológicos dos ejaculado por meio de microscopia optica convencional e de contraste de fase. Depois das análises, os ejaculados foram centrifugados e os sobrenadantes (plasma seminal), foram usados para determinar as concentrações de glicose, albumina, proteínas totais, triglicerídeos, colesterol, HLD, LDL, ureia, cálcio, fósforo, cloreto, ferro, sódio e potássio por meio de um analisador bioquímico e fotômetria de chama. Depois da centrifugação, as proteínas do plasma seminal foram quantificadas pelo método de Bradford e análisadas por meio de eletroforese (SDS-PAGE e 2-D SDS-PAGE) e espectrometria de massas (MALDI TOF/TOF e LC-MS/MS). As proteínas foram identificadas pelo MASCOT (versão 2.4.0) e validadas estatisticamente usando o software SCAFFOLD Q+ (versão 4.0). As proteínas foram classificadas de acordo a suas classes e processos biológicos pelo o PANTHER (versão 10.0) usando os termos de ontologia gênica depositados no banco de dados UniprotKB. As proteínas diferencialmente abundantes foram quantificadas pelo método emPAI considerando unicamente aquelas proteínas com foldchange superior a 1,5 vezes. As redes de interação entre as proteínas identificadas no plasma seminal foram obtidas por meio do STRING (versão 10.5). Os dados foram analisados pelo o software estatístico SAEG - UFV (versão 9.1), e foram usadas as correlações de Pearson para estudar a relação entre as características estudadas. Não foram obsevadas diferenças (p>0,05) nos valores medios das características do aspecto físico do sêmen e perímetro escrotal entre os grupos de animais. A porcentagem de defeitos espermáticos apresentou diferença (p<0,05) entre os dois grupos de touros sendo maior no grupo de reprodutores classificados como inaptos à reprodução. Tambem foram observadas diferenças nas concentrações de colesterol, triglicerídeos e ferro (p<0,05) sendo maiores para os animais classificados como aptos à reprodução. Foram observadas correlações medias, positivas e negativas entre os componentes do perfil bioquímico do plasma seminal. Usando LC-MS/MS foram identificadas 298 proteínas com pelo menos dois peptídeos validados. A Spermahesin 1 foi a proteína mais abundante representando 39,6 % do total das proteínas identificadas no plasma seminal, seguida pela BSP PDC-109 (4,6 %) e Serine protease inhibitor clade E member 2 (4,0 %). De acordo com a classificação dos processos biológicos 94 proteinas apresentaram atividade realacionadas com processos celulares, 85 com processos metabólicos e 39 com resposta a estímulos, sendo as categorias com maior numero de proteínas classificadas. As proteínas do plasma seminal foram categorizadas em 21 classes de proteínas diferentes, onde classe hidrilase (49) e modulares enzimáticos (29) foram os grupos com maior numero de proteínas enquadradas. Das 298 proteinas identificadas, 34 foram diferencialmente abundantes, e delas 26 apresentaram mais abundantes no grupo de touros classificados como aptos à reprodução e 8 no grupo de touros classificados inaptos à reprodução.

This study was carried out as the objective of determining the proteomic and biochemical profile of the seminal plasma of young bulls of the Nelore breed and its relation with the physical and morphological characteristics of the semen. Twenty bulls were used between 19.8 and 22.7 months. All bulls were submitted to andrological evaluation and classified according to their reproductive characteristics in bulls fit and unfit for breeding. A semen sample was collected from each bull by the electroejaculation method and the physical and morphological aspects of the ejaculate were evaluated by means of conventional optical and phase contrast microscopy. After the analyzes, the ejaculates were centrifuged and the supernatants (seminal plasma) were used to determine the concentrations of glucose, albumin, total proteins, triglycerides, cholesterol, HLD, LDL, urea, calcium, phosphorus, chloride, iron, sodium and potassium by means of a biochemical analyzer and flame photometry. After centrifugation, seminal plasma proteins were quantified by the Bradford method and analyzed by electrophoresis (SDS-PAGE and 2-D SDS-PAGE) and mass spectrometry (MALDI TOF / TOF and LC-MS / MS). The proteins were identified by MASCOT (version 2.4.0) and statistically validated using SCAFFOLD Q + software (version 4.0). Proteins were classified according to their classes and biological processes by the PANTHER (version 10.0) using the terms of gene ontology deposited in the database UniprotKB. Differentially abundant proteins were quantified by the ipPA method considering only those proteins with foldchange greater than 1.5 times. The interaction networks between the proteins identified in the seminal plasma were obtained through STRING (version 10.5). The data were analyzed by the statistical software SAEG - UFV (version 9.1), and the Pearson correlations were used to study the relationship between the characteristics studied. No differences (p> 0.05) were observed in the mean values of the physical appearance characteristics of the semen and scrotal circumference among the groups of animals. The percentage of sperm defects presented a difference (p <0.05) between the two groups of bulls being higher in the group of reproducers classified as unfit for reproduction. Differences in cholesterol, triglyceride and iron concentrations (p <0.05) were also observed, being higher for the animals classified as suitable for reproduction. Mean, positive and negative correlations were observed between the components of the biochemical profile of the seminal plasma. Using LC-MS / MS, 298 proteins with at least two validated peptides were identified. Spermahesin 1 was the most abundant protein representing 39.6% of the total proteins identified in seminal plasma, followed by BSP PDC-109 (4.6%) and Serine protease inhibitor clade E member 2 (4.0%). According to the classification of the biological processes, 94 proteins showed activity with cellular processes, 85 with metabolic processes and 39 with response to stimuli, being the categories with the highest number of proteins classified. Seminal plasma proteins were categorized into 21 classes of different proteins, where class hydroxylase (49) and enzymatic modulators (29) were the groups with the highest number of framed proteins. Of the 298 proteins identified, 34 were differentially abundant, of which 26 were more abundant in the group of bulls classified as fit for breeding and 8 in the group of bulls classified as being unfit for breeding.

Sêmen refrigerado bovino reduz os danos espermáticos e aumenta a taxa de prenhez na IATF?

O objetivo do presente estudo foi avaliar a viabilidade da refrigeração do sêmen bovino comparada com a criopreservação. Este estudo foi realizado em dois experimentos. No primeiro experimento foram comparados os efeitos in vitro do sêmen refrigerado em três meios diluidores comerciais a 5°C por até 48 horas, e criopreservado em dois meios. Para este experimento foram utilizados ejaculados de 10 touros da raça Nelore. Cada ejaculado foi dividido em três alíquotas, sendo diluídas nos meios Botubov®, Steridyl® e Bovidyl®. Após a diluição o sêmen foi envasado em palhetas e refrigerado nos três diluidores e criopreservado utilizando somente os meios Botubov® e Steridyl®. A refrigeração do sêmen foi realizada a 5º C por até 48 horas em sistema passivo de refrigeração BotuFlex® e a criopreservação realizada em sistema automatizado TK 4.000®. O sêmen foi avaliado nos tempos 0, 24, 36 e 48 horas após a refrigeração e após a descongelação, para cada diluidor. Foram realizadas análises dos padrões de cinética espermática pelo sistema computadorizado de análise espermática (CASA, programa SCA - Sperm Class Analyser), integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial e estresse oxidativo por sondas fluorescentes, sob microscopia de epifluorescência e morfologia espermática por microspcopia de contraste de interferência diferencial (DIC). Notou-se efeito de tempo de refrigeração para os três diluidores para de 0 para 24h, se mantendo semelhante até 48 h. Os diluiores Botubov® e Steridyl® preservaram as características espermáticas de forma semelhante até 48 horas de refrigeração diferindo apenas na variável de velocidade curvilianear; no entanto, ambos foram superiores ao diluidor Bovidyl®, para as variáveis, motilidade total, motilidade progressiva, células rápidas, velocidade curvilinear, velocidade progressiva, velocidade do trajeto, retilinearidade, integridade da membrana plasmática, alto potencial de mitocondrial e espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal íntegras e alto potencial mitocondrial. O segundo experimento foi realizado, baseado nos resultados do primeiro experimento, para avaliar os efeitos da refrigeração e da criopreservação do sêmen sobre a fertilidade in vivo. Foram utilizados ejaculados de três touros das raças Brangus, Braford e Angus, com idade entre 5 e 7 anos. O sêmen foi colhido por meio de vagina artificial, o ejaculado foi dividido em três alíquotas, sendo duas alíquotas para refrigeração e uma para criopreservação. Para a refrigeração o sêmen foi diluído nas concentrações de 15x106 (R15) e 30x106 (R30) espermatozoides/palheta e para a criopreservação diluído na concentração de 30x106 espermatozoides/palheta (CRIO). Para todas as diluições foi utilizado o meio Botubov® e o sêmen armazenado em palhetas de 0,5 mL. A refrigeração foi realizada a temperatura de 5º C por 48 horas em sistema passivo de refrigeração BotuFlex® e a criopreservação em sistema automatizado TK®. Foram sincronizadas 552 vacas da raça Brangus em programas de inseminação artificial em tempo fixo. Os resultados da taxa de prenhez para os grupos de vacas inseminadas foram de 49,4% para R15, 43,38% para R30 e 47,59% para o sêmen criopreservado. Pode-se concluir que a refrigeração do sêmen a 5º C por 48 horas resulta em taxa de prenhez semelhante às obtidas com o sêmen criopreservado, sendo que esses resultados indicam que a refrigeração por até 48 horas pode ser uma opção de uso para IATF.

The objective of the present study was to evaluate the viability of cooling bovine semen compared to cryopreservation. This study was carried out in two experiments. In the first experiment, the in vitro effects of cooled semen were compared in three commercial extenders at 5°C for up to 48 hours, and cryopreserved in two extender. For this experiment were used ejaculates of 10 Nellore bulls. Each ejaculate was divided into three aliquots, being diluted in the Botubov®, Steridyl® and Bovidyl® extenders. After dilution, the semen was cooled into three extenders and cryopreserved using the Botubov® and Steridyl®. Semen refrigeration was performed at 5°C for up to 48 hours in BotuFlex® passive refrigeration system and cryopreservation performed in TK 3.000® automated system. Semen was evaluated at 0, 24, 36 and 48 hours after refrigeration and after thawing, for each diluent. The sperm kinetics of the spermatic kinetics (CASA, SCA - Sperm Class Analyzer), plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential and oxidative stress by fluorescent probes were analyzed under epifluorescence microscopy and sperm morphology By Differential Interference Contrast Microscopy (DIC). The Botubov® and Steridyl® diluents were very similar after 48 hours of cooling differing significantly only in the Curvilianear Velocity (VCL) 106.04 m/s and 124.56 m/s. The Bovidyl® diluent yielded results significantly lower than the 48 hours of refrigeration for the variables: total motility (MT), progressive motility (MPRO), fast cells (RAP), curvilinear velocity (VCL), progressive velocity (AP), plasma membrane integrity (PI), high mitochondrial potential (AP), and spermatozoa with intact plasma and acrosomal membranes and high mitochondrial potential (PIAIA). The second experiment was carried out, based on the results of the first experiment I, to evaluate the effects of cooled and cryopreservation of semen on in vivo fertility. We used ejaculates of three bulls of the Brangus, Braford and Angus breeds of a IA center, aged between 5 and 7 years. The semen was collected by artificial vagina, the ejaculate was divided into three aliquots, two aliquots for refrigeration and one for cryopreservation. For cooling, the semen was diluted in the concentrations of 15x106 (R15) and 30x106 (R30) spermatozoa/straw, for cryopreservation diluted in the concentration of 30x106 spermatozoa / vane (CRIO). For all dilutions, the Botubov® medium and the semen stored in 0.5 mL vial were used. Refrigeration was carried out at a temperature of 5 ° C for 48 hours in BotuFlex® passive refrigeration system and cryopreservation in an automated TK® system. 552 Brangus cows were synchronized in fixed-time artificial insemination programs. The results of the pregnancy rate for the groups of inseminated cows were 49.4% for R15, 43.38% for R30 and 47.59% for cryopreserved semen. It can be concluded that the cooling of the semen at 5º C for 48 hours results in pregnancy rate similar to those obtained with cryopreserved semen, and these results indicate that refrigeration for up to 48 hours may be an option of use for FTAI.

Influência do plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado sobre as características estruturais e na cinética do espermatozoide suíno conservado sob refrigeração a 170C por 72 horas

O plasma seminal é o constituintes não celular do sêmen suíno e contém uma série de componentes orgânicos e inorgânico que desempenham ações variadas tanto no trato reprodutivo masculino como no feminino. No entanto, este fluido de constituição complexa, exerce ações ambiguas sobre os espermatozoides suínos, pois pode atuar ao mesmo tempo de forma benéfica ou deletéria sobre a viabilidade destas células. Nesse sentido, alguns estudos sugerem que este não é o melhor meio para a conservação de espermatozoides. Desta forma o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do plasma seminal sobre a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial do espermatozoide suíno armazenado sob refrigeração a 17°C por 72 horas. Para tanto, foram obtidos 4 ejaculados de 6 cachaços. Em seguida o sêmen in natura foi avaliado quanto às características da motilidade pelo sistema computadorizado de análise do sêmen, morfologia espermática por contraste de interferência diferencial e concentração espermática. Após essa primeira avaliação, os ejaculados foram acondicionados em tubos cônicos de 50 mL para serem divididos em três tratamentos, a saber: não centrifugado (NC), centrifugado e com o plasma seminal retirado pós-centrifugação (CS) e centrifugado resuspendido (CR). A força de centrifugação utilizada foi de 500xg por 10 minutos. Todos os tratamentos foram submetidos à diluição em meio BTS para que se obtenha uma concentração de 30 x 106 espermatozoides por mililitro (mL). Em seguida, as amostras permaneceram por 90 minutos em temperatura ambiente e protegidas da luz antes de serem armazenadas. As doses com os diferentes tratamentos foram acondicionadas à temperatura de 17°C e foram avaliadas nos intervalos 0 (90 min pós-diluição), 24, 48 e 72 horas para os seguintes parâmetros: características da motilidade (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal, estabilidade da membrana plasmática e peroxidação das membranas espermáticas (citometria de fluxo). Os tratamentos foram submetidos à análise de variância (PROC GLM), empregando-se o programa SAS (1998). Quando o principal efeito foi significativo, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey-kramer ao nível de 5% de significância. Os resultados do presente estudo mostram que a ausência do plasma seminal foi deletéria para algumas características de motilidade, o mesmo ocorreu para a integridade das membranas plasmática e acrossomal uma vez que houve diminuição na percentagem de celulás espermáticas com membrana plasmatica integra e acrossomo integro no tratamento sem plasma seminal. A peroxidação lipídica das membranas e a manutenção da estabilidade da membrana plasmática não foram influenciadas pelo tratamento. Assim, conclui-se que a presença do plasma seminal em doses inseminantes refrigeradas por 72 h é importante para a manutenção das características de motilidade e para a integridade das membranas plasmáticas e acrossomal.

The present study aimed to evaluate the effects of seminal plasma, from the rich fraction of the ejaculate, on kinetics, plasma and acrosome membrane integrity, lipid peroxidation and capacitation of extended liquid boar semen stored under refrigeration at 17° C for 72 hours. For this purpose, four ejaculates from each of six boars were used. Shortly after collection and raw semen evaluation, ejaculates were extended in BTS medium and then assigned to one of three treatments, as follows: non-washed seminal plasma (NWSP), washed-seminal plasma (WSP) centrifuged with own seminal plasma suspended (CWSSP). All treatments were evaluated for sperm motility parameters by the sperm class analyzer (SCA). Plasma and acrosome membrane integrity, lipid peroxidation and sperm capacitation were evaluated by flow cytometry at 0, 24, 48 and 72 hours post dilution. The mean percentage of sperm motility (total and progressive) were lower (p0.05) in the WSP treatment. There was an increase (p0.05) in the percentage of sperm with damaged acrosome and damage plasma membrane in the WSP treatment. Membrane lipid peroxidation did not differ (p0.05) irrespective of treatment nor did sperm capacitation, which was similar (p0.05) among treatments. Our results show that seminal plasma from the sperm rich fraction is important to maintain adequate structural and functional characteristics of extended liquid boar and should be present in seminal doses throughout the period of store.

Uso da melatonina e do ácido ferúlico como promotores da função do espermatozoide equino criopreservado

As espécies reativas de oxigênio podem ser responsáveis por causar danos às membranas dos espermatozoides, fragmentação de DNA, entre outros fatores, influenciando assim na fertilidade principalmente no processo de criopreservação do sêmen. A melatonina (MEL) é um potente antioxidante anfifílico (hidro e lipossolúvel), o que a torna capaz de penetrar qualquer compartimento celular. O ácido ferúlico (AF) é um composto fenólico que exibe uma ampla gama de efeitos terapêuticos contra diversas doenças devido à sua potente ação antioxidante. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito dos antioxidantes AF e MEL na criopreservação do sêmen equino. Foram utilizados 5 ejaculados de 4 garanhões. Dentre os tratamentos aplicados, foram utilizadas duas concentrações de cada antioxidante (AF 0,5mM, AF 1,2mM, MEL 2mM e MEL 1µM) além do controle (diluidor de congelação convencional BotuCrio®), totalizando 5 tratamentos. As variáveis analisadas foram cinética espermática através do sistema CASA (programa SCA - Sperm Class Analyser), morfologia, integridade de membranas plasmática, acrossomal e potencial de membrana mitocondrial, com o uso das sondas fluorescentes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA e JC-1 além da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) pelo espermatozoide com a sonda fluorescente CellRox Deep Red® nunca anteriormente utilizada em espermatozoides equinos. Comparações entre os tratamentos foram realizadas pelo modelo linear generalizado (PROC GLM) do SAS (Versão 9.3) e as diferenças entre eles foram localizadas através do teste de Duncan. A probabilidade de P0,05 foi considerada como diferença significativa. Os resultados para características da motilidade tiveram diferença significativa em alguns aspectos, porém nenhum tratamento foi superior ao controle. A avaliação da morfologia espermática apresentou uma diminuição nos defeitos maiores nas amostras tratadas com AF 1,2mM, MEL 2mM e MEL 1µM. No que diz respeito às integridades de membrana, o tratamento MEL 1µM apresentou porcentagens significativamente melhores nas células inteiramente íntegras (membrana plasmática intacta, acrossomo intacto e alto potencial de membrana mitocondrial). As células em estresse oxidativo não se diferenciaram entre os tratamentos. Previamente a este trabalho, foi realizado outro experimento para a validação da sonda fluorescente CellRox Deep Red® em espermatozoides de equinos. Foram utilizados 4 ejaculados de 4 garanhões aos quais eram submetidos aos tratamentos T0 (fração do ejaculado não submetida à indução do estresse oxidativo), T50 (50% da amostra não induzida e 50% induzida ao estresse oxidativo) e T100 (amostra induzida ao estresse oxidativo). Os dados de porcentagem de células positivas (com estresse oxidativo) foram submetidos à análise de regressão polinomial pelo modelo linear generalizado (PROC GLM) do SAS (Versão 9.3). O valor do coeficiente de determinação (R2) foi igual a 0,88 e a probabilidade de P0,05 foi considerada significativa. Diante dos dois trabalhos citados acima e baseados nas análises realizadas, pode-se concluir que o tratamento MEL 1µM melhora a integridade de membranas espermáticas no processo de criopreservação do sêmen equino e que a sonda fluorescente CellRox Deep Red® é eficiente na detecção de espécies reativas de oxigênio no espermatozoide de garanhões.

Reactive oxygen species can be responsible for causing damage to the membranes of sperm, DNA fragmentation, among other factors influencing fertility especially in cryopreservation. Melatonin (MEL) is a potent antioxidant amphiphilic (hydro and fat soluble), which makes it able to penetrate any cell compartment. The ferulic acid (FA) is a phenolic compound that exhibits a wide range of therapeutic effects against various diseases due to their potent antioxidant effect. This study aimed to evaluate the effect of antioxidants AF and MEL in cryopreservation of equine semen. Five ejaculates from four stallions were used. Among the treatments, we used two concentrations of each antioxidant (AF 0.5mM, AF 1.2mM, MEL 2 mM and MEL 1M) beyond the control (conventional freezing extender BotuCrio®), totaling five treatments. The parameters analyzed were sperm kinetics with the CASA system (SCA program - Sperm Class Analyzer), morphology, plasma and acrossomal membrane integrity mitochondrial membrane potential, using fluorescent probes PI, Hoechst 33342, FITC-PSA and JC- 1 over production of reactive oxygen species (ROS) by the sperm with the fluorescent probe CellRox Deep Red® never previously used in equine spermatozoa. Comparisons between treatments were performed by generalized linear model (PROC GLM) of SAS (version 9.3) and the differences between them were located with the Duncan test. The probability of P0.05 was considered significant. The results for the motility characteristics were significant differences in some aspects, but no treatment was superior to the control. The evaluation of sperm morphology showed a decrease in major defects in the samples treated with AF 1.2mM, MEL 2 mM and MEL 1M. Regarding to membrane integrity, treatment MEL 1M showed significantly better in percentages of intact cells (intact plasma membrane, intact acrosome and high mitochondrial membrane potential). Cells with oxidative stress not differ between treatments. Previously to this study, we performed another experiment to validate the fluorescent probe CellRox Deep Red® in equine sperm. Was used ejaculates of 4 stallion which were subjected to the treatments T0 (fraction of the ejaculate not subjected to induction of oxidative stress), T50 (50% sample uninduced and 50% induced to oxidative stress) and T100 (sample induced to oxidative stress). The data of percentage of positive cells (with oxidative stress) were submitted to polynomial regression analysis based on generalized linear model (GLM PROC) of SAS (version 9.3). The value of the coefficient of determination (R2) was 0.88 and a probability of P0.05 was considered significant. Considering the two studies cited above, and based on the analyzes, it is possible to conclude that the treatment MEL 1M improves sperm membrane integrity in the equine sperm cryopreservation process and the fluorescent probe CellRox Deep Red® is efficient in the detection of reactive oxygen species in stallions sperm.

CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE TAMBAQUI: DILUIDORES E MÉTODOS DE CONGELAÇÃO

O tambaqui (Colossoma macropomum, Curvier 1818) é uma espécie nativa que representa a maior produção na aquicultura brasileira, despertando assim o interesse nos pesquisadores para criopreservação do sêmen dessa espécie. Porém para o emprego desta biotecnologia, é necessário que haja diluidores e equipamentos adequados no congelamento seminal. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência de diferentes diluidores e métodos de congelação na criopreservação do sêmen de C. macropomum. Machos de tambaqui foram induzidos hormonalmente a espermiação. Após 14h da indução, foi realizada a coleta de sêmen e a análise da motilidade do sêmen, em seguida realizada a criopreservação. O sêmen de cada animal foi diluído em quatro diferentes tratamentos (Glicose + Dimetilsulfóxido -DMSO, Glicose + Metil glicol- MG, Beltsville Thawing Solution- BTS + DMSO e BTS + MG), envasados em palhetas de 0,25 mL e submetidos a dois diferentes equipamentos de congelação: máquina de congelação programada e Dry shipper. Após 10 dias, as amostras seminais foram descongeladas (45 ºC/ 8s) e avaliadas quanto à cinética, vitalidade e a morfologia espermáticas com auxílio do software SCA. O sêmen criopreservado com DMSO utilizando a máquina de congelação programada proporcionou maiores percentuais de espermatozoides móveis (15,44±1,04%) após a descongelação em relação ao Dry shipper (3,99±0,55%), independente do diluente utilizado. Além disso, DMSO proporcionou as melhores velocidades espermáticas em relação ao MG, independente do método de congelação e diluente empregado. Um maior percentual de espermatozoides vivos foi observado quando se utilizou Glicose (37,28±1,32%) como diluente, e DMSO (37,98±1,25%) em máquina de congelação programada. Para a morfologia espermática, uma maior quantidade de espermatozoides normais (46,10±1,82%) foi observada quando o sêmen foi criopreservado usando a máquina de congelação programada com o DMSO, para os crioprotetores, Glicose e BTS (38,16±1,9%; 39,26±1,87%, respectivamente), para os diluentes. Conclui-se que pode ser utilizado o crioprotetor DMSO 10% associado ao diluente Glicose 5% em Máquina de Congelação Programada, para a criopreservação do sêmen de C. macropomum.

The tambaqui (Colossoma macropomum, Curvier 1818) is a native species, and is the largest production in Brazilian aquaculture, arousing interest among researchers for cryopreservation of semen that species. But for the use of this biotechnology, is necessary to have extenders and appropriate equipment in the seminal freezing. Thus, this study aimed to evaluate the efficiency of different diluents and freezing methods in the sperm cryopreservation C. macropomum on the kinetics, sperm morphology and vitality. Tambaqui males were hormonally induced to spermiation. After 14 h of induction, the semen collection and the analysis of motility of the semen was performed then held cryopreservation. The semen samples from each animal were diluted in four different treatments (Glucose + DMSO -dimethyl sulfoxide, Glucose + MG -methyl glycol, Beltsville Thawing Solution- BTS + DMSO and BTS + MG) and packaged into 0.25 mL straws. Two different types of freezing equipment were used: a programmed freezing machine and a dry shipper. After 10 days, the semen samples were thawed (45 °C / 8 s) and evaluated with regard to kinetics and sperm morphology with the aid of the Sperm Class Analyzer software. Semen cryopreservation with DMSO using the programmed freezing machine provided greater percentage of motile sperm (15.44 ± 1.04%) after thawing compared to Dry shipper (3.99 ± 0.55%), regardless of diluent . Additionally, DMSO showed better sperm velocity than MG, regardless of the freezing method and extender employed. A higher percentage of living spermatozoa was observed when glucose was used (37.28 ± 1.32%) (regardless of the freezing method and cryoprotectant), and DMSO (37.98 ± 1.25%) in programmed freezing machine. For morphology, a greater amount of normal spermatozoa (46.10 ± 1.82%) was observed when semen was cryopreserved using a freezing machine programmed with DMSO, as cryoprotectant and Glucose or BTS (± 38.16 1.9%, 39.26 ± 1.87%, respectively), as extenders. Therefore, we suggest the use of the cryoprotectant DMSO 10% associated with the extender Glucose 5% in programmed freezing machine, for cryopreservation of C. macropomum semen.

Sperm motility and velocities of Characiformes fishes in different times post-activation / Motilidade e velocidades espermáticas de peixes Characiformes em diferentes tempos pós ativação

The objective of the current study was to observe the performance kinetics (motilities and velocities) of the spermatozoa from Prochilodus brevis (curimatã), Colossoma macropomum (tambaqui) and Piaractus brachypomus (pirapitinga) species in different times post-activation. The sperm of P. brevis, C. macropomum and P. brachypomus species were collected after hormonal induction with carp pituitary extract. The samples with not contamination with water, urine or feces had motility subjective, morphology, osmolality and concentration analyzed. The samples selected were analyzed with Sperm Class Analyzer. Spermatozoa motility and velocities were captured at 10, 30, 60 and 120 s postactivation. No significant differences in total motility of P. brevis spermatozoa were observed between 10 s and 30 s post-activation. However, significant reduction was observed in 60 s. This reduction was more accentuated after 120 s. The same pattern of spermatozoa motility decline happened for C. macropomum and P. brachypomus. Velocities also followed the same pattern for the three species. There was significant reduction in velocities after 30 s; this reduction was more significant after 60 s. There was no significance difference between 60 s and 120 s post-activation. Sperm of C. macropomum and P. brachypomus show satisfactory sperm quality up to 60 s after activation. On the other hand, sperm of P. brevis up to 120 s after activation. These findings show that the rate of sperm motility in different times post activation is change for each species tested.

O objetivo do presente trabalho foi investigar o desempenho cinético (motilidade e velocidades espermáticas) de Prochilodus brevis (curimatã), Colossoma macropomum (tambaqui) e Piaractus brachypomus (pirapitinga) em diferentes tempos pós ativação. O sêmen de P. brevis, C. macropomum e P. brachypomus foi coletado após indução hormonal com extrato hipofisário de carpa. As amostras não contaminadas com sangue, fezes ou urina tiveram motilidade subjetiva, morfologia, osmolaridade e concentração analisadas. As amostras selecionadas foram analisadas com o Sperm Class Analyzer. A motilidade e velocidade dos espermatozoides foram mensuradas a 10, 30, 60 e 120 s pós ativação. Nenhuma diferença significativa na motilidade total do sêmen de P. brevis foi observada entre 10 s e 30 s pós ativação. No entanto, uma redução significativa foi observada aos 60 s. Essa redução foi mais acentuada após 120 s. O mesmo padrão de declínio da motilidade espermática ocorreu para C. macropomum e P. brachypomus. As velocidades espermáticas seguiram o mesmo padrão para as três espécies. Houve redução significativa nas velocidades após 30 s; essa redução foi mais significativa após 60 s. Não houve diferença significativa entre 60 s e 120 s pós ativação. Os espermatozoides de C. macropomum e P. brachypomus apresentam satisfatotia qualidade espermática até 60 s pós ativação. Por outro lado, os espermatozoides de P. brevis apresentam satisfatória qualidade espermática até 120 s pós ativação. Esses achados mostram que a taxa de motilidade espermática em diferentes tempos pós ativação muda para cada espécie testada.

Cryopreservation of tambaqui semen using a dry shipper and a programmed freezing machine / Criopreservação do sêmen de tambaqui utilizando dry shipper e máquina de congelação programada

Tambaqui (Colossoma macropomum) is a native freshwater fish that is of great importance for Brazilian aquaculture. Because of this importance, several techniques have been developed to improve the reproduction of this species in captivity. One of these techniques is the cryopreservation of sperm. In an effort to increase the efficiency of cryopreservation protocols, researchers have tried to determine suitable diluting solutions and freezing methods, which will provide a better post-thaw sperm quality. Thus, this study aimed to evaluate the efficiency of different diluents and freezing methods for the cryopreservation of tambaqui (C. macropomum) sperm. Samples of fresh semen were diluted in different treatments (Glucose 5% + 10% Dimethyl sulfoxide DMSO, Glucose 5% + 10% Methyl glycol MG, BTS + 10% DMSO and BTS + 10% MG) at a 1:9 dilution rate and frozen in a programmed freezing machine and a dry shipper. The semen samples were thawed and evaluated for vitality, sperm morphology and kinetics. Cryopreserved semen with DMSO and using the programmed freezing machine provided a greater percentage of motile sperm (15.44 ± 1.04%) after thawing compared to the dry shipper (3.99 ± 0.55%), regardless of the diluent. Additionally, DMSO showed better sperm velocities than MG regardless of the freezing method and the extender employed. A higher percentage of living spermatozoa was obser

O tambaqui (Colossoma macropomum) é uma espécie nativa de peixe de água doce de grande importância para aquicultura brasileira. Devido a isso, diversas técnicas têm sido desenvolvidas para aperfeiçoar a reprodução desta espécie em cativeiro, dentre elas a criopreservação de sêmen de peixe. Como uma forma de melhorar os protocolos de criopreservação, tem-se buscado utilizar soluções diluidoras e métodos de congelação adequados, proporcionando uma boa qualidade seminal pós-descongelação. Dessa forma, este estudo objetivou avaliar a eficiência de diferentes diluidores e métodos de congelação na criopreservação do sêmen de tambaqui (C. macropomum). As amostras de sêmen fresco foram diluídas em diferentes tratamentos (Glicose 5% + 10% Dimetilsufóxido DMSO; Glicose 5% + 10% Metil glicol MG; Beltsville Thawing Solution BTS + 10% DMSO e BTS + 10% MG) na proporção 1:9 e congeladas em máquina de congelação programada e em Dry shipper. As amostras seminais foram descongeladas e avaliadas para vitalidade, morfologia e cinética espermáticas. O sêmen criopreservado com DMSO utilizando a máquina de congelação programada proporcionou maiores percentuais de espermatozoides móveis (15,44 ± 1,04%) após a descongelação em relação ao Dry shipper (3,99 ± 0,55%), independente do diluente utilizado. Além disso, DMSO proporcionou as melhores velocidades espermáticas em relação ao MG, independente