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The domestic pig breeds are in danger of extinction whereas the erosion of their gene pool is a serious concern because they significantly contribute to the rich biodiversity. Overall aim of this study was to determine the protocol for preserving the semen of the Windsnyer boars for conservation. A total of 18 ejaculates (6 replications/boar) were collected from three Windsnyer boars of proven fertility with the use of hand-gloved approach method, twice per week. Boars semen were pooled and extended with Beltsville Thawing Solution [(BTS) IMV Technologies, France], held at 18°C for 3 hours and centrifuged. The sperm pellet was re-suspended with Fraction A (20% egg yolk + BTS) and cooled at 5°C for 1 hour. Following cooling, semen was divided and diluted into different cryoprotectants (ethylene glycol, glycerol, propanediol, ethylene glycol + glycerol + propanediol) at equal contribution to make the total concentrations [4, 8, 12 and 16% and the 0% (control; without cryoprotectant)] and loaded into 0.25 mL straws. Two cryopreservation methods (liquid nitrogen vapour and controlled rated) were used to cryopreserve the semen straws. Semen straws were thawed at different temperatures (5, 18, 37 and 40°C) and evaluated for sperm motility, viability, and morphology traits. Post-thawed sperm total motility (36.0±5.3) and live normal sperm (49.5±8.3) percentages were recorded to be higher in the treatment supplemented with 16% glycerol (P<0.05). The highest sperm total motility percentage was recorded at 40°C (26.8±3.2) thawing temperature for liquid nitrogen vapour treatment (P<0.05). In conclusion, 16% glycerol was found to be the suitable cryoprotectant concentration for semen cryopreserved with liquid nitrogen vapour method and thawed at 40°C.(AU)

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To date, no studies have been performed evaluating the effect of boar spermatozoa concentration in 0.5mL freezing straws, leading us to examine this question. Each sperm-rich fraction of the ejaculate (n=25) was diluted at five different sperm concentrations (100, 200, 300, 600 and 800 x 106 spermatozoa/mL), packaged in 0.5mL straws, and subsequently frozen. After thawing, the sperm from all of treatment groups were analyzed to determine motility characteristics using a sperm class analyzer (SCA-CASA), and their plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, sperm membrane lipid peroxidation and fluidity were analyzed by flow cytometry. An increase in spermatozoa concentration above 300x106 spermatozoa/mL in a 0.5mL straw impaired (p<0.05) the total and progressive motility, curvilinear velocity, straight-line velocity, linearity and beat cross frequency. However, the plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, membrane lipid peroxidation and fluidity were not influenced (p>0.05) by high spermatozoa concentrations at freezing. Therefore, to increase spermatozoa survival and total and progressive motility after thawing, boar spermatozoa should be frozen at concentrations up to 300x106 spermatozoa/mL.(AU)

Até o momento, não foram realizados estudos que avaliassem o efeito da concentração de espermatozoides/mL em palhetas (0,5mL) para a criopreservação, levando-nos a analisar esta questão. Cada fração-rica do ejaculado (n=25) foi diluída em cinco diferentes concentrações de espermatozoides (100, 200, 300, 600 e 800x106 espermatozoides/mL), envasadas em palhetas de 0,5mL e posteriormente congeladas. Após a descongelação, os espermatozoides de todos os tratamentos foram avaliados a fim de determinar as características de motilidade usando um sistema de análise computadorizada dos espermatozoides (SCA-CASA). A integridade das membranas plasmática e acrosomal, o potencial de membrana mitocondrial, a peroxidação lipídica e a fluidez da membrana foram analisadas por citometria de fluxo. O aumento na concentração de espermatozoides acima de 300x106 espermatozoides/mL diminuiu (p<0,05) a motilidade total e progressiva, velocidade curvilínea, velocidade linear, linearidade e frequência de batimento. No entanto, a integridade da membrana plasmática e acrosomal, potencial de membrana mitocondrial, peroxidação lipídica e fluidez de membrana não foram influenciados (p>0,05) por altas concentrações de espermatozoides durante a criopreservação. Portanto, a fim de melhorar a sobrevivência dos espermatozoides suínos e a motilidade total e progressiva após a descongelação, os espermatozoides suínos devem ser congelados a concentrações não superiores a 300x106 espermatozoides/mL.(AU)

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Background Sperm contains a wealth of cell surface receptors and ion channels that are required for most of its basic functions such as motility and acrosome reaction. Conversely, animal venoms are enriched in bioactive compounds that primarily target those ion channels and cell surface receptors. We hypothesized, therefore, that animal venoms should be rich enough in sperm-modulating compounds for a drug discovery program. Our objective was to demonstrate this fact by using a sperm-based phenotypic screening to identify positive modulators from the venom of Walterinnesia aegyptia. Methods Herein, as proof of concept that venoms contain interesting compounds for sperm physiology, we fractionated Walterinnesia aegyptia snake venom by RP-HPLC and screened for bioactive fractions capable of accelerating mouse sperm motility (primary screening). Next, we purified each compound from the positive fraction by cation exchange and identified the bioactive peptide by secondary screening. The peptide sequence was established by Edman sequencing of the reduced/alkylated compound combined to LC-ESI-QTOF MS/MS analyses of reduced/alkylated fragment peptides following trypsin or V8 protease digestion. Results Using this two-step purification protocol combined to cell phenotypic screening, we identified a new toxin of 7329.38 Da (actiflagelin) that activates sperm motility in vitro from OF1 male mice. Actiflagelin is 63 amino acids in length and contains five disulfide bridges along the proposed pattern of disulfide connectivity C1-C5, C2-C3, C4- C6, C7-C8 and C9-C10. Modeling of its structure suggests that it belongs to the family of three finger toxins with a noticeable homology with bucandin, a peptide from Bungarus candidus venom. Conclusions This report demonstrates the feasibility of identifying profertility compounds that may be of therapeutic potential for infertility cases where motility is an issue.

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The aim of this study was to evaluate the effect of two different extenders (Skimmed Milk Glucose - SMG or Lactose - Egg Yolk - LEY) on physical characteristics and fertility of fractionated donkey semen cooled at 5°C. For this, four Pêga donkeys were used as semen donors. The sperm rich fraction of the ejaculate was diluted preparing insemination doses containing 400 x 106 motile spermatozoa in a volume of 22 mL, cooled to 5°C and stored up to 48 hours in a container proposed by Palhares (1997). Sperm motility and vigor were assessed in fresh semen, after first semen dilution, before insemination, at 24 and 48 hours after storage. For the fertility evaluation, 44 mares were inseminated with semen stored for a period between 12 and 24 hours. The mares were inseminated on fixed days (Mondays, Wednesdays, and Fridays) after the detection of a follicle greater than a 30mm diameter in one of the ovaries through ovulation. Pregnancy diagnosis was performed on day 12 post-ovulation, using transrectal ultrasonography. Semen diluted in SMG showed superior sperm motility than LEY, at the Pre-AI evaluation (P<0.05). At 48 hours of storage, all donkeys had motility values between 45 and 53% for semen diluted in SMG, while only one donkey showed motility greater than 30% in the LEY treatment. The pregnancy rate/cycle for mares inseminated with semen diluted in SMG was superior than that obtained using LEY (56.52% vs 4.76%, respectively).(AU)

Objetivou-se com o presente experimento avaliar o efeito de dois diferentes diluidores (leite em pó desnatado glicose - SMG ou lactose gema de ovo - LEY) sobre as características físicas e a fertilidade do sêmen asinino coletado de forma fracionada e resfriado a 5ºC. Para isso, quatro jumentos da raça Pêga foram utilizados como doadores de sêmen. A fração espermática rica do ejaculado foi diluída preparando-se doses inseminantes contendo 400 x 106 espermatozoides móveis em um volume de 22 mL, resfriadas a 5ºC e armazenadas por até 48 horas em contêiner proposto por Palhares (1997). A motilidade e o vigor espermáticos foram avaliados no sêmen fresco, após a pré-diluição, antes das inseminações, às 24 e 48 horas de armazenamento. Para avaliação de fertilidade, 44 éguas foram inseminadas com sêmen armazenado por um período entre 12 e 24 horas, em dias fixos (segundas, quartas e sextas-feiras), após a detecção de um folículo de diâmetro maior ou igual a 30mm em um dos ovários, até a ovulação. O diagnóstico de gestação foi realizado a partir de 12 dias após a ovulação, por meio de ultrassonografia transretal. O sêmen diluído em SMG apresentou motilidade espermática superior à do LEY, já a partir do tempo pré-IA. Às 48 horas de armazenamento, todos os jumentos apresentaram valores de motilidade entre 45% e 53%, quando o sêmen foi diluído em SMG, enquanto apenas um jumento apresentou motilidade superior a 30% no tratamento utilizando LEY. A taxa de concepção/ciclo das éguas inseminadas também foi superior para o sêmen diluído em SMG em relação ao diluído em LEY (56,52% versus 4,76%, respectivamente).(AU)

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The aim of this study was to evaluate the physical and morphological characteristics of the sperm-rich fraction of jackass semen. To this end, 130 ejaculates from five Pêga jackasses were collected using an open model artificial vagina. The sperm-rich fraction was collected using the split-ejaculate method and assessed for the number of mounts/ejaculate, for physical and morphological characteristics of the semen and number of doses produced/ejaculate. It was observed that all characteristics evaluated differed among the five jackasses, except for the head defect rates. The mean values obtained for the jackass sperm-rich fraction collected were: number of mounts/ejaculate - 1.27; semen volume - 20.21mL; motility - 84.53%; vigor - 4.46; motility after dilution - 80.10%; sperm concentration/mL - 894.38 x 10 6; total sperm/ejaculate - 16.14 x 10 9; number of insemination doses/ejaculate (400x10 6 motile sptz) - 33.39; number of insemination doses/ejaculate (800 x 10 6 motile sptz) - 16.69; and percentage of normal sperm - 90.46%. Thus, in the present experiment the split-ejaculate method using an open artificial vagina worked well with the jackasses, and the sperm-rich fraction of the ejaculate of Pêga jackasses had high quality and sperm concentration, allowing its use for semen processing without reducing the number of insemination doses produced per ejaculate.(AU)

Foram coletados 130 ejaculados de cinco jumentos da raça Pêga, utilizando-se vagina artificial modelo aberta, com o objetivo de se avaliar as características físicas e morfológicas da fração rica em espermatozoides do ejaculado de asininos. Para tal, a fração rica em espermatozoides, composta pelos três primeiros jatos ejaculados, foi coletada e avaliada quanto ao número de montas/ejaculado, quanto às características físicas e morfológicas do sêmen, bem como quanto ao número de doses inseminantes produzidas/ejaculado. Observou-se que todas as características avaliadas diferiram entre os cinco reprodutores avaliados, com exceção do percentual de defeitos de cabeça. Os valores médios obtidos da coleta da fração rica do ejaculado de jumentos foram: número de montas/ejaculado - 1,27; volume de sêmen - 20,21mL; motilidade - 84,53%; vigor - 4,46; motilidade pós-diluição - 80,10%; espermatozoides/mL - 894,38 x 10 6; espermatozoides/ejaculado - 16,14 x 10 9; número de doses inseminantes/ejaculado (400x10 6 sptz móveis) - 33,39; doses inseminantes/ejaculado (800 x 10 6 sptz/móveis) - 16,69; e percentual de espermatozoides normais - 90,46%. Assim, no presente experimento, observou-se boa aceitação dos reprodutores à coleta fracionada utilizando-se a vagina artificial aberta, sendo a fração rica do ejaculado de jumentos da raça Pêga caracterizada por alta qualidade e concentração espermática, o que viabilizou sua utilização para o processamento do sêmen, sem prejuízos quanto ao número de doses inseminantes produzidas/ejaculado.(AU)

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The first three jets of the sperm-rich fraction of Pêga jackasses were collected and assessed separately. Five fertile Pêga jackasses were used as semen donors and underwent fractionated semen collection, using an open model artificial vagina. The first three jets of the semen were collected separately and assessed for volume, sperm motility, vigor, concentration/mL of semen, and sperm morphology. These characteristics were compared between first, second and third jets and between jackasses. It was observed that the jet volume differed (P<0.05) between jackasses, although it was similar (P>0.05) between first, second and third jets. Sperm motility did not differ (P>0.05) between jets and jackasses. Vigor was similar (P>0.05) between jets of the same jackass, and only the first jet differed (P<0.05) between jackasses. The first, second and third jets of the sperm-rich fraction had decreased sperm concentrations (P<0.05) of 955.56, 725.56 and 280.56x 106 sperm/mL of semen, respectively. Sperm morphology differed between the first three jets only for the incidence of mid-piece defect, higher in the third one (4.26%), compared to the first (3.36%) and second (3.38%) ones. When comparing the morphological characteristics of the sperm-rich fraction between five jackasses, regardless of the jet, there were differences in the percentage of normal sperm, proximal cytoplasmic droplet, mid-piece and head defects.(AU)

Objetivou-se, no presente experimento, caracterizar os três primeiros jatos da fração rica do ejaculado de jumentos da raça Pêga. Para tal, cinco jumentos foram submetidos à coleta fracionada do sêmen, utilizando-se vagina artificial modelo aberta. Os três primeiros jatos da fração rica do ejaculado foram coletados separadamente e avaliados quanto ao volume, à motilidade e ao vigor espermáticos, à concentração espermática/mL de sêmen e à morfologia espermática. Comparações foram realizadas entre jatos e entre jumentos. Observou-se que o volume do jato diferiu (P<0,05) entre os jumentos, embora fosse similar (P>0,05) entre os jatos. A motilidade espermática não diferiu (P>0,05) entre jatos nem entre jumentos. O vigor espermático foi similar (P>0,05) entre os jatos de um mesmo jumento, e apenas o vigor do jato 1 diferiu (P<0,05) entre os jumentos. Independentemente do jumento, a fração rica do ejaculado foi composta por três jatos apresentando concentrações espermáticas decrescentes (P<0,05), com 955,56; 725,56 e 280,56 x 106 espermatozoides/mL de sêmen. A morfologia espermática diferiu entre os três jatos avaliados apenas para a incidência de defeitos de peça intermediária, sendo maior no jato três (4,26%), em relação aos jatos um (3,36%) e dois (3,38%). Comparando-se as características morfológicas do sêmen entre os cinco jumentos avaliados, independentemente do jato, observaram-se diferenças entre os reprodutores quanto ao percentual de espermatozoides normais, com gota citoplasmática proximal, com defeitos de peça intermediária e de cabeça.(AU)

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Com o objetivo de se estudar o efeito do tipo de envase sobre a criopreservação do sêmen asinino, coletado de forma fracionada, utilizou-se o sêmen de cinco jumentos da raça Pêga, submetido a um protocolo de congelamento envolvendo um diluidor e duas formas de envase, flatpacks ou palhetas de 0,55mL, tendo como ponto final a avaliação dos parâmetros seminais in vitro após o descongelamento do sêmen. Os resultados de motilidade espermática para as amostras envasadas em flatpacks ou em palhetas foram de 24,67% e 35,34%, no momento do descongelamento; de 13,39% e 25,83%, 60 minutos após o descongelamento; e de 7,86% e 13,33%, aos 120 minutos após o descongelamento, respectivamente. Já os valores para o vigor espermático foram de 2,55 e 3,33, no momento do descongelamento; de 1,57 e 2,48, após 60 minutos do descongelamento; e de 1,11 e 1,67, após 120 minutos do descongelamento, na mesma ordem anterior. As características seminais diferiram entre os jumentos, evidenciando uma grande variação individual. O percentual de ejaculados aprovados (motilidade ≥30%, vigor ≥3) foi influenciado pelo reprodutor e pelo tipo de envasamento, estando o melhor resultado (P<0,05), de 86,21%, associado ao sêmen envasado em palhetas, quando comparado ao valor de 56,67%, obtido para o sêmen envasado em flatpacks.

The effect of the type of package on the cryopreservation of jackass semen was studied, using the sperm-rich fraction of five jackasses and a special cryopreservation semen protocol, related to one extender and two different packages, FlatPacks or straws. The characteristics of the in vitro semen were evaluated after thawing. The motility results were 24.67% and 35.34% after thawing; 13.39% and 25.83% 60 minutes after thawing and 7.86% and 13.33%, 120 minutes after thawing. The vigor results were 2.55 and 3.33 after thawing, 1.57 and 2.48 60 minutes after thawing and 1.11 and 1.67 120 minutes after thawing, for FlatPacks or straws packages, respectively. The jackasses used were different regarding seminal characteristics, with great individual variation. The approved post-thaw viability (motility ≥ 30%, vigor ≥ 3) was affected by jackass and type of package, with the best results (P<0.05) for semen packed in straws (86.21%), compared to semen packed in FlatPacks (56.67%).

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The aim of this study was to evaluate the use of low concentrations of natural and lyophilized low density lipoprotein (LDL) from hen's egg yolk for cryopreservation of canine semen. Different ammonium sulphate concentrations were tested to extract LDL from egg yolk. The yolk was centrifuged, and LDL was isolated using 10, 20, 40, 45, or 50 percent ammonium sulphate solution (ASS). The LDL-rich floating fraction was collected for chemical characterization. Dry matter content was lowest (P<0.05) in the LDL extracted with the 50 percent ASS. The purification of LDL increased in association with increasing ammonium sulphate concentrations. SDS-PAGE showed that the 50 percent ASS solution yielded a purer fraction of LDL from egg yolk. For semen cryopreservation, TRIS extender was used replacing 20 percent egg yolk (control) by natural or lyophilized LDL using 1, 2, and 3 percent (w/v). Semen was centrifuged (755Xg for 7 min), diluted with one of the extenders, packed into 0.5mL straws (100x106 sperm/mL), and placed in a programmable cryopreservation machine. Thawed semen (37°C/ 30s) was analyzed for sperm motility, morphology, and by the hypoosmotic and epifluorescence tests (CFDA/ PI). Natural LDL extracted with 50 percent ASS was as effective as whole egg yolk to preserve canine frozen sperm when using low concentrations. The lyophilized LDL, mainly in the two higher concentrations tested (2 and 3 percent), was unsuitable to maintain the effectiveness of the LDL cryoprotective effect on dog sperm...

O objetivo deste estudo foi avaliar o uso de baixas concentrações da lipoproteína de baixa densidade (LBD) extraída da gema do ovo de galinha, nas formas natural e liofilizada, na criopreservado do sêmen canino. Diferentes concentrações de sulfato de amônio também foram testadas na extrato da LBD da gema do ovo. A gema foi centrifugada, sendo a LBD isolada usando-se soluto saturada de sulfato de amônio (SSA) nas concentrações de 10, 20, 40, 45 e 50 por cento. A frado rica em LBD foi coletada para caracterizado química. O conteœdo de matéria seca foi menor (P<0,05) na LBD extraída com SSA 50 por cento. A pureza da LBD melhorou medida que se aumentou a concentrado de SSA utilizada. SDS-PAGE mostrou que a SSA 50 por cento produziu uma frado mais pura de LBD oriunda da gema do ovo. Para o congelamento de sêmen, o meio diluidor TRIS teve a gema do ovo a 20 por cento (controle) substituída pela LBD a 1, 2 e 3 por cento (p/v), nas formas natural e liofilizada. O sêmen foi centrifugado (755xg por 7min), diluído em um dos meios diluidores em teste e envasado em palhetas de 0,5mL (100x106 sptz/mL), sendo congelado em máquina de congelamento programável. O sêmen descongelado (37°C/30s) foi analisado quanto motilidade e morfologia espermática e nos testes hiposm-tico e de epifluorescência (DACF/IP). A LBD natural extraída com SSA 50 por cento foi tão eficiente quanto a gema do ovo na preservado do espermatozoide canino congelado nas baixas concentrações testadas. A LBD liofilizada, principalmente as duas maiores concentrações (2 e 3 por cento), não foi adequada para manter o efeito crioprotetor da LBD sobre o espermatozoide canino...

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Com o aprimoramento das biotecnologias da reprodução na equinocultura, está sendo possível obter bons resultados reprodutivos. A inseminação artificial na espécie equina pode ser realizada tanto com sêmen à fresco, resfriado ou congelado/descongelado. A preparação do ejaculado para a criopreservação envolve várias etapas desde a remoção do plasma seminal, que é a fonte predominante da proteção antioxidante espermática. Durante o congelamento e descongelamento dos espermatozoides ocorre uma diminuição no potencial de fertilização que está associado ao dano celular em decorrência do aumento na produção de espécies reativas ao oxigênio (EROs). As EROs, causam peroxidação lipídica nas membranas espermáticas e fragmentação do DNA, consequentemente afetando a viabilidade espermática. A melatonina é um potente antioxidante endógeno que auxilia na proteção do organismo contra os danos causados pelas EROs. A presença de receptores de melatonina nos espermatozoides, sugere uma possível ação sobre a função espermática, exercendo algum tipo de regulação sobre os mecanismos de defesa antioxidante. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações da melatonina sobre a motilidade, geração de EROs e a integridade das membranas acrossomal e plasmática de sêmen criopreservado de equinos da raça Crioula. Para isso, a fração rica de 3 ejaculados de 5 equinos foi diluída em diluente comercial de resfriamento com uma concentração entre 50 x 106 spz/ml. As amostras foram centrifugadas (600g x12min) e o pellet ressuspendido em diluente comercial de congelamento a uma concentração final de 200 x 106 spz/ml. A melatonina foi então adicionada ao diluente de congelamento com as células espermáticas, em diferentes concentrações (0; 1,25; 2,5 e 5 mM), sendo imediatamente realizado o envase em palhetas de 0,5 ml, que foram seladas e submetidas ao processo de criopreservação. As amostras foram descongeladas a 37ºC por 30 segundos e avaliadas quanto a motilidade em microscópio de contraste de fase e a geração de EROs e a integridade da membrana acrossomal e membrana plasmática avaliadas por citometria de fluxo com as sondas DCF-DA, FITC PNA, e PI, respectivamente. Em relação a motilidade o grupo sem melatonina e o grupo com a dose de 1,25 não apresentaram diferença (P=0.80), sendo 52,0% ± 2,42 (0) e 50,00% ± 2,18 (1,25mM). Porém o grupo com 2,5 e 5 mM apresentaram uma redução da motilidade (42,6% ± 2,28 (2,5 mM) e 33,0% ± 3,00 (5 mM)) (P<0.0004). Este mesmo padrão foi observado para o efeito da integridade de acrossoma sendo 75,48% ± 3,24 (0); 80,49% ± 1,62 (1,25 mM); 82,94% ± 1,42 (2,5 mM) e 84,90% ± 1,51 (5 mM) e de membrana plasmática 66,85% ± 3,13 (0); 66,0% ± 2,42 (1,25 mM); 70,07% ± 2,72 (2,5 mM) e 74,92% ± 1,98 (5 mM). Em relação a geração de EROs os nossos tratamentos não apresentaram diferença estatística (P>0.05). Sendo 86,5% ± 2,16 (0), 89,1% ± 1,26 (1,25mM), 89,3% ± 1,04 (2,5mM), 89,4% ± 1,03 (5mM). Conclui-se que a adição de melatonina ao meio diluidor de congelamento, nas concentrações testadas, não promoveu um efeito benéfico sobre a viabilidade espermática do espermatozoide equino criopreservado.

With the improvement of the biotechnologies in equine reproduction, it is possible to obtain good reproductive results. Artificial insemination in equine species can be performed either with fresh, cooled or frozen/thawed semen. The preparation of ejaculate for cryopreservation involves several steps since the removal of seminal plasma, which is the predominant source of sperm antioxidant protection. During sperm freezing and thawing, a decrease in the fertilization potential occurs, which is associated with cell damage as a result of increased production of oxygen reactive species (ROS). EROs cause lipid peroxidation in sperm membranes and DNA fragmentation, consequently affecting sperm viability. Melatonin is a potent endogenous antioxidant that helps protect the body against damage from ROS. The presence of melatonin receptors in spermatozoa suggests a possible action over sperm function, exerting some type of regulation on the mechanisms of antioxidant defense. Thus, the aim of this study was to evaluate different concentrations of melatonin on motility, ROS generation, integrity of acrosomal and plasma membranes of cryopreserved semen of Crioulo horses. For this, the rich fraction of 3 ejaculates of 5 stallions was diluted in commercial cooling extender at a concentration between 50 x 106 spz/ml. The samples were centrifuged (600g x 12min) and the pellet resuspended in commercial freezing extender at a final concentration of 200x106 spz/ml. Melatonin was added to the freezing extender with the sperm cells at different concentrations (0; 1,25; 2,5 e 5mM), and immediately filled in 0.5ml straws, sealed and submitted to the cryopreservation process. Samples were thawed at 37°C for 30 seconds and evaluated for motility in a phase contrast microscope, generation of EROs and integrity of acrosomal and plasma membrane by flow cytometry with DCF-DA, FITC-PNA and PI probes respectively. In relation to sperm motility, the group without melatonin and the group with the dose of 1.25mM did not presented difference (P=0.80), being 52.0% ± 2.42 (0) and 50.00% ± 2.18 (1.25mM). However, the groups 2.5 and 5mM had a reduction in motility (42.6% ± 2.28 (2.5mM) and 33.0% ±3.00 (5mM)) (P<0.0004). This same pattern was observed for the effect of acrosome integrity being 75.48% ± 3.24 (0); 80.49% ± 1.62 (1.25mM); 82.94% ± 1.42 (2.5mM) and 84.90% ± 1.51 (5mM) and plasma membrane 66.85% ± 3.13 (0); 66.0% ± 2.42 (1.25mM); 70.07% ± 2.72 (2.5mM) and 74.92% ± 1.98 (5mM). Concerning the generation of ROS, our treatments presented no statistical difference (P>0.05). They were 86.5% ± 2.16 (0); 89.1% ± 1.26 (1.25mM); 89.3% ± 1.04 (2.5mM), 89.4% ± 1.03 (5mM). In conclusion, the addition of melatonin to the freezing extender, in the concentrations tested, did not provide beneficial effect on sperm viability of cryopreserved equine semen.

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Background: The establishment of an in vitro production (IVP) of embryo in swine allows the generation of embryos with the same quality as in vivo produced embryos with less costs and time. In order to achieve successful fertilization under normal circumstances in vivo, mammalian spermatozoa must first undergo capacitation and then acrosome reaction. The purpose of this study was compared the efficacious of IP/CFDA fluorescence and Coomassie Blue G (CB) staining to detect capacitated sperm cells in refrigerated and fresh semen. Morever, it was investigated the efficacious of caffeine and chondroitin sulphate to promote in vitro sperm capacitation and in vitro embryo produced (IVP) of swine embryos. Materials, Methods & Results: A sperm-rich fraction from ejaculate was obtained using the gloved-hand method and the gel- free fraction was separated using sterile gauze. The semen was diluted in BTS at a final concentration of 1.5 x 10 8 cells/mL. The sperm suspension was incubated for 2 h at 25°C, refrigerated and maintained for 1 h at 15-18°C (refrigerated group) or used immediately (fresh group). Sperm capacitation was assessed by IP/CFDA fluorescence and CB staining for both fresh and refrigerated semen. For PI/CFDA evaluation, a final solution containing 1.7 mM formaldehyde, 7.3 mM PI and 20 mM CFDA in 950 μL saline was prepared. In the dark, 40 μL PI/CFDA final solution was added to 10 μL semen and after 8 min, slides were analyze d on epifluorescence microscopy. For CB evaluation, sperm cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 10 min and centrifuged twice at 320 x g in ammonium acetate pH 9 for 8 min. A smear was made and stained with 2.75 mg/mL CB in solution containing 12.5% methanol, 25% glacial acetic acid and 62.5% water, for 2 min. The smear was washed in running water, air dried and sealed with Permount ® , diluted 2:1 in xilol to avoid staining oxidation. (...)

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O pênis é o órgão copulador e no garanhão é classificado como sendo músculo cavernoso, em que os espaços cavernosos são preenchidos de sangue durante a ereção. Nos testículos que ocorre a produção espermática, que são transportados pela rete testis até o epidídimo, onde sofrerão maturação, capacidade fertilizante e armazenados até a ejaculação. As glândulas sexuais acessórias são responsáveis pelos fluidos expelidos durante a ejaculação, denominado de plasma seminal, que se misturam às células espermáticas e formam o ejaculado. Cada uma dessas glândulas são responsáveis por uma determinada secreção que vai direcionar o ejaculado equino a ser dividido em três distintas frações: fração pré-espermática, produzida pelas glândulas bulbouretrais e próstata; fração rica em espermatozoides, produzida pelas secreções do epidídimo e por líquidos das ampolas dos ductos deferentes; fração pós-espermática ou fração pobre, formada por espermatozoides remanescentes no canal uretral e líquidos produzidos pelas vesículas seminais, o gel. Durante o processo fisiológico de cópula, ocorrem vários eventos denominados de ereção, em que o garanhão se excita por estímulos, emissão que caracteriza-se pela liberação de espermatozoides dentro da uretra pélvica, seguido da ejaculação com a expulsão do sêmen, o relaxamento e recolhimento do pênis. Normalmente, as colheitas de sêmen equino são realizadas de forma convencional, com vagina artificial fechada, em que todas as frações se misturam. Cada garanhão possui características individuais com relação à manutenção das células espermáticas durante a criopreservação, essas características podem estar relacionadas à produção do plasma seminal, assim como os vários componentes que os compõem. Sabe-se que existe um efeito deletério desempenhado pelos componentes do plasma seminal produzido principalmente pelas vesículas seminais, aos espermatozoides durante o processo de criopreservação, porém, esses fatores ainda são desconhecidos. Várias hipóteses são sugeridas, tais como, a redução na produção de lipídeos e os tipos de proteínas e íons presentes em cada uma das frações do ejaculado. Sabendo disso, a colheita fracionada pode trazer benefícios aos espermatozoides, de forma que as primeiras frações não tenham contato com o plasma seminal produzido pelas vesículas seminais. O presente trabalho objetiva revisar a colheita fracionada de sêmen em garanhões, assim como, seus benefícios para as células espermáticas que serão submetidas à criopreservação.

The penis is the copulatory organ and in the stallion it is classified as cavernous muscle and the cavernous spaces are filled with blood during erection. In the testicles occurs sperm production, that are transported through the rete testis to the epididymis, where they will suffer maturation, fertilizer capacity and will be stored until ejaculation. The accessory sex glands are responsible for the expelled fluids during ejaculation, named seminal plasma that are mixed with sperm cells and form the ejaculate. Each of these glands are responsible for a certain secretion that will divide equine semen into three distinct fractions: pre-sperm fraction, produced by the prostate and bulbourethral glands; rich fraction in sperm, produced by epididymal secretions and liquids from ampoules of the vas deferens; post-sperm fraction or poor fraction, consisting of sperm remaining in the urethral canal and liquids produced by the seminal vesicles, the gel. During the physiological process of mating, several events occur named erection, in which the stud is excited by stimuli emission which is characterized by the release of sperm into the pelvic urethra followed by ejaculation with the expulsion of semen, relaxation and gathering the penis. Typically, horse semen collections are performed in the conventional way, with a closed artificial vagina, where all the fractions are mixed. Each stud has individual characteristics related to the maintenance of sperm cells during the cryopreservation, these characteristics may be related to production of seminal plasma and to the components that form it as well. What is known is that there is a negative effect played by the seminal plasma components mainly produced by the seminal vesicles, to the sperm during cryopreservation process, however, these factors are still unknown. Several hypotheses are suggested such as the productions reduction of lipids and proteins and the types of ions present in each fraction of the ejaculate. Knowing this, the fractional collection may be beneficial to sperm, considering that the first fractions do not have contact with seminal plasma produced by the seminal vesicles. This work aims to review the semen fraction harvest in stallions, as well as its benefits for the sperm cells to be submitted to cryopreservation.

Resumo

O plasma seminal é o constituintes não celular do sêmen suíno e contém uma série de componentes orgânicos e inorgânico que desempenham ações variadas tanto no trato reprodutivo masculino como no feminino. No entanto, este fluido de constituição complexa, exerce ações ambiguas sobre os espermatozoides suínos, pois pode atuar ao mesmo tempo de forma benéfica ou deletéria sobre a viabilidade destas células. Nesse sentido, alguns estudos sugerem que este não é o melhor meio para a conservação de espermatozoides. Desta forma o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do plasma seminal sobre a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial do espermatozoide suíno armazenado sob refrigeração a 17°C por 72 horas. Para tanto, foram obtidos 4 ejaculados de 6 cachaços. Em seguida o sêmen in natura foi avaliado quanto às características da motilidade pelo sistema computadorizado de análise do sêmen, morfologia espermática por contraste de interferência diferencial e concentração espermática. Após essa primeira avaliação, os ejaculados foram acondicionados em tubos cônicos de 50 mL para serem divididos em três tratamentos, a saber: não centrifugado (NC), centrifugado e com o plasma seminal retirado pós-centrifugação (CS) e centrifugado resuspendido (CR). A força de centrifugação utilizada foi de 500xg por 10 minutos. Todos os tratamentos foram submetidos à diluição em meio BTS para que se obtenha uma concentração de 30 x 106 espermatozoides por mililitro (mL). Em seguida, as amostras permaneceram por 90 minutos em temperatura ambiente e protegidas da luz antes de serem armazenadas. As doses com os diferentes tratamentos foram acondicionadas à temperatura de 17°C e foram avaliadas nos intervalos 0 (90 min pós-diluição), 24, 48 e 72 horas para os seguintes parâmetros: características da motilidade (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal, estabilidade da membrana plasmática e peroxidação das membranas espermáticas (citometria de fluxo). Os tratamentos foram submetidos à análise de variância (PROC GLM), empregando-se o programa SAS (1998). Quando o principal efeito foi significativo, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey-kramer ao nível de 5% de significância. Os resultados do presente estudo mostram que a ausência do plasma seminal foi deletéria para algumas características de motilidade, o mesmo ocorreu para a integridade das membranas plasmática e acrossomal uma vez que houve diminuição na percentagem de celulás espermáticas com membrana plasmatica integra e acrossomo integro no tratamento sem plasma seminal. A peroxidação lipídica das membranas e a manutenção da estabilidade da membrana plasmática não foram influenciadas pelo tratamento. Assim, conclui-se que a presença do plasma seminal em doses inseminantes refrigeradas por 72 h é importante para a manutenção das características de motilidade e para a integridade das membranas plasmáticas e acrossomal.

The present study aimed to evaluate the effects of seminal plasma, from the rich fraction of the ejaculate, on kinetics, plasma and acrosome membrane integrity, lipid peroxidation and capacitation of extended liquid boar semen stored under refrigeration at 17° C for 72 hours. For this purpose, four ejaculates from each of six boars were used. Shortly after collection and raw semen evaluation, ejaculates were extended in BTS medium and then assigned to one of three treatments, as follows: non-washed seminal plasma (NWSP), washed-seminal plasma (WSP) centrifuged with own seminal plasma suspended (CWSSP). All treatments were evaluated for sperm motility parameters by the sperm class analyzer (SCA). Plasma and acrosome membrane integrity, lipid peroxidation and sperm capacitation were evaluated by flow cytometry at 0, 24, 48 and 72 hours post dilution. The mean percentage of sperm motility (total and progressive) were lower (p0.05) in the WSP treatment. There was an increase (p0.05) in the percentage of sperm with damaged acrosome and damage plasma membrane in the WSP treatment. Membrane lipid peroxidation did not differ (p0.05) irrespective of treatment nor did sperm capacitation, which was similar (p0.05) among treatments. Our results show that seminal plasma from the sperm rich fraction is important to maintain adequate structural and functional characteristics of extended liquid boar and should be present in seminal doses throughout the period of store.

Resumo

Duas porções do ejaculado suíno - primeiros 15mL da fração espermática rica (P1) e o restante do ejaculado (P2) - foram coletadas semanalmente de cinco varrões e submetidas a dois protocolos de resfriamento, diluição no diluidor MR-A® e conservação a 17°C (T1) ou no diluidor glicina-gema de ovo e conservação a 5°C (T2). As doses foram avaliadas no que se refere à motilidade, ao vigor e à morfologia espermáticas no sêmen a fresco e em diferentes tempos de estocagem. Todos os tratamentos mantiveram uma motilidade aceitável, superior a 50 por cento, nas primeiras 24 horas de armazenamento. O grupo P2T2 manteve uma motilidade similar (P>0,05) ao longo de todo o período de resfriamento (72 horas), sendo inclusive superior aos demais neste período, enquanto os outros tratamentos apresentaram uma redução da motilidade no decorrer do tempo de armazenamento. Com relação às características morfológicas do sêmen, não se observaram diferenças (P>0,05) quanto às porcentagens de espermatozoides normais entre as duas frações do ejaculado fresco. Ainda, todos os tratamentos mantiveram-se dentro dos limites aceitáveis, independentemente do tempo de armazenamento. A P1 parece ser mais adequada à produção de doses para o transporte em virtude de seu pequeno volume e alta concentração, enquanto o restante do ejaculado (P2) pode ser utilizado com eficiência dentro da própria granja.

Two portions of boar ejaculate - first 15mL of the sperm rich fraction (P1) and the rest of the ejaculate (P2) - were collected weekly from 5 mature boars and submitted to two cooling methods, extended in MR-A® and cooled at 17°C (T1) or extended in glycine-egg yolk and cooled at 5°C (T2). Spermatozoa motility, vigor, and morphological characteristics were evaluated immediately after collection and in different storage times. All treatments kept an acceptable motility, higher than 50 percent, in the first 24h of storage. The P2T2 maintained a similar motility (P>0.05) throughout the cooling storage (72h) and was superior in that period, while the other treatments presented a decrease in motility related to time. There was no difference between the two portions regarding the total number of normal spermatozoa in the fresh semen (P>0.05). All treatments showed morphological abnormalities within the acceptable thresholds, irrespectively of the storage time. Thus, due to low volume and high concentration, P1 seems to be more adequate for sperm dose transportation. Furthermore, this methodology will allow the development of new proposals concerning the transportation of swine semen, while the rest of the ejaculate could be used in farm routines to produce conventional liquid semen doses.

Resumo

A criopreservação do sêmen suíno ainda é um desafio devido a extensão dos danos causados pelo choque-frio. Os espermatozoides oriundos da fração rica do ejaculado suíno possuem a membrana plasmática mais estável, são mais resistentes ao choque-frio e a reação acrossomal precoce do que aqueles oriundo da fração total do ejaculado. Com isso, o uso do plasma seminal oriundo dessa fração do ejaculado suíno também poderia aumentar a criotolerância dos espermatozoides suínos e/ou reverter os danos oriundo da criopreservação. Entretanto, a grande maioria das técnicas de avaliação espermática inclui apenas um parâmetro de funcionalidade espermática. Por outro lado, quanto mais características espermáticas analisadas, mais fiel se torna a avaliação quanto ao potencial fertilizante da amostra. Nesse contexto, esse trabalho objetivou a validação de uma técnica de análise espermática por citometria de fluxo para a avaliação simultânea da integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial. Além de avaliar os efeitos da adição/manutenção do plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno sobre a cinética espermática, integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial, fluidez e peroxidação das membranas espermáticas, fosforilação do aminoácido tirosina, taxa de fertilidade e de prenhez precoce. A técnica sugerida em nosso trabalho é capaz de detectar (R2 = 0,9356; p < 0,01) simultaneamente os espermatozoides com a membrana plasmática e acrossomal integras e alto potencial de membrana mitocondrial (PIAIA). O plasma seminal da fração rica do ejaculado suíno gera benefícios para a cinética espermática melhorando a motilidade total e progressiva dos espermatozoides descongelados (p < 0,05). Por outro lado, a manutenção/adição de plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno, não é capaz de alterar (p > 0,05) os espermatozoides PIAIA, a fosforilação do aminoácido tirosina, a fluidez e a peroxidação das membranas espermáticas. Entretanto, essas características devem ser cuidadosamente interpretadas, uma vez que, a fluidez e a peroxidação das membranas espermáticas são alteradas (p < 0,05) pelo processo de centrifugação. As taxas de fertilidade e de prenhez precoce também não foram influenciadas (p > 0,05) pela adição de plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno. Portanto, podemos concluir que o plasma seminal da fração rica possui efeito benéfico sobre a fisiologia dos espermatozoides pós-descongelação, melhorando a criopreservação do sêmen suíno.

Boar semen cryopreservation is still a challenge due to the extension of cold shock damage. Boar spermatozoa arising from sperm-rich ejaculate fraction are reported to have a more stable plasma membrane, more resistant to cold shock and premature acrosome reaction than spermatozoa from the whole ejaculate. Thus, seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction can increase cryotolerance of boar spermatozoa, and in other domestic species it has the ability to reverse cryopreservation damage. However, the majority of actual sperm evaluation techniques include a single sperm parameter, which makes the sperm characterization of a single population difficult. In this context, this work was performed to validate a sperm flow cytometry fourfold coloration technique for the simultaneous evaluation of plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential. Furthermore, we evaluate the seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction effects on sperm kinetics, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential, tyrosine phosphorylation, membrane fluidity and peroxidation, fertility and early pregnancy rate. The proposed technique is able (R2 = 0.9356; p < 0.01) to simultaneous detection of plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential (IPIAH). Seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction is able to improve (p < 0.05) total and progressive motility. Furthermore, seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction maintenance/addition was not able to improve (p > 0.05) the IPIAH sperm population, tyrosine phosphorylation, membrane fluidity and peroxidation. However, these sperm characteristics need to be carefully interpreted, once, membrane fluidity and peroxidation could be influenced (p < 0.05) by centrifugation. Fertility and early pregnancy rate we not improved (p > 0.05) by seminal plasma addition. Therefore, we concluded that sperm fourfold coloration can be used to evaluate simultaneously plasma and acrosomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential and that whole sperm-rich fraction seminal plasma can be beneficial to post-thawed sperm physiology, thereby improving boar semen cryopreservation.

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The study investigated sperm membrane integrity (as a measure of sperm viability) and sperm motility in spermatozoa taken from different portions of the ejaculate, namely the first 10 ml (P1) of sperm-rich fraction (SRF) and from the rest of the ejaculate up to the appearance of gel (P2), both before and after centrifugation on a single layer of Androcoll-P-Large (SLC). Thus there were 4 treatment groups: P1, P2, SLC P1 and SLC P2. Sperm motilities were not different between the various treatment groups, except that the SLC samples had higher linear + non-linear motility than the non-SLC-selected samples. Sperm membrane integrity, in contrast, was significantly higher in P2 than in P1 (P < 0.001), and was also higher in both SLC-selected groups than in the uncentrifuged groups (P < 0.001). There was a significant correlation between membrane integrity and linear + non-linear motility (P < 0.001). These results indicate that the spermatozoa found in P2 have better membrane integrity than those in P1 when used as fresh spermatozoa, and furthermore, that SLC selects the most robust spermatozoa regardless of their origin in the ejaculate. Thus, in situations where P1 is collected separately for sperm cryopreservation purposes, the remainder of the SRF could be used for fresh AI doses, particularly where SLC can be used to select the most robust spermatozoa. These findings have practical importance for the swine insemination industry.

Resumo

A ausência de trabalhos verificando a melhor concentração de espermatozoides para se congelar o sêmen de cachaços em palhetas de 0,5mL, gerou necessidade deste estudo. O experimento propôs encontrar uma quantidade ideal, ou seja, uma concentração em que se consiga congelar o maior número de espermatozoides por palheta, sem aumentar os danos já causados pelo processo de criopreservação dos espermatozoides de cachaços. Diante disso, foram realizadas 5 coletas de 5 cachaços (n=25), utilizando apenas a fração rica do ejaculado. Estes foram divididos em cinco concentrações espermáticas diferentes, a saber: 100, 200, 300, 600 e 800x106 espermatozoides/mL e congelados em palhetas de 0,5mL. Após o processo de criopreservação, realizado por um sistema automatizado, as plalhetas foram acondicionadas em botijão criogênico. Para as análises, 2 palhetas de cada concentração foram descongeladas em banho maria (37ºC por 30 segundos) e submetido às avaliações das características de motilidade através do CASA, citometria de fluxo para a análise da integridade das membranas acrossomal e plasmática, potencial mitocondrial, peroxidação lipídica e fluidez da membrana espermática (capacitação), além da morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial de fase. As variáveis avaliadas foram submetidas à análise de variância e ao teste de média PDDIF, ao nível de 5%. O aumento da concentração espermática, na palheta de 0,5mL, afetou significativamente (p<0,05) a motilidade total e progressiva, velocidade progressiva, velocidade de trajeto, linearidade, retilinearidade, frequência de batimento flagelar e hiperativação. O aumento do número de espermartozoides na palheta não alterou (p>0,05) a porcentagem de células que apresentavam simultaneamente a integridade das membranas plasmática e acrossomal e com potencial mitocondrial (MIAIAP), o aumento não influenciou (p>0,05) as variáveis peroxidação lipídica, capacitação e morfologia espermática. Baseado nos resultados, pode-se sugerir a congelação de até 300x106 espermatozoides/mL, na palheta de 0,5 mL, sem maiores danos à motilidade e integridade das membranas espermáticas.

The lack of studies veryfing the best concentration of sperm to freeze the boar semen in 0.5 ml straws, bring forth necessity for this study. The experiment proposed to find an optimal amount, in other words a concentration that is possible to freeze the higher number of spermatozoa per straw without increasing the damage already caused by the process of cryopreservation of boar spermatozoa. Therefore, there were 5 semen collections of 5 boars (n = 25) using only the rich fraction of the ejaculate. They were divided into five different sperm concentrations, namely 100, 200, 300, 600 and 800x106 sperm / mL and frozen in 0.5 ml straw. After the cryopreservation process, carried out by an automated system, straws were placed in cryogenic cylinders. For the analysis, two straws of each concentration were thawed in water bath (37°C for 30 seconds) and subjected to evaluations of motility characteristics through CASA, flow cytometry to analyze the integrity of the acrosome and plasma membrane, mitochondrial potential, peroxidation and lipid fluidity of sperm membrane (capacitation), and the sperm morphology by phase differential interference contrast microscopy. The variables were subjected to analysis of variance and the average test PDDIF, at 5%. The increased sperm concentration, in the 0.5mL straw, affected significantly (p <0.05) total and progressive motility, progressive velocity, path velocity, linearity, straightness, flagellar beat frequency and hyperactivation. The increase in the spermatozoa number, in 0,05 mL straw, did not change (p> 0.05) the percentage of cells that simultaneously showed the integrity of plasma and acrosomal membranes and with high mitochondrial potential (MIAIHM), the increase did not affect (p> 0.05) the lipid peroxidation variables, training and sperm morphology. Based on the results, it can be suggested to freeze with 300x106 spermatozoa / ml, in 0.5 mL straw, without major damage to the integrity and motility of the sperm membrane.

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Sabe-se que a temperatura, bem como a velocidade de descongelação do sêmen, pode afetar a qualidade deste. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi testar diferentes protocolos de descongelação para o sêmen canino diluído em ACP-106® e criopreservado. Para tanto, coletaram-se dez ejaculados oriundos de oito cães, sendo a fração espermática avaliada quanto ao volume, concentração, motilidade, vigor, pH, morfologia, integridade acrossomal e teste hiposmótico. Diluiu-se o sêmen em ACP-106®, contendo 20% de gema de ovo e 6% de glicerol, sendo congelado em palhetas de 0,25 mL. Depois de uma semana, a primeira palheta foi descongelada a uma temperatura de 37°C/60s, a segunda a 55°C/5s e a terceira a 75°C/8s e reavaliaram-se os parâmetros seminais. Os protocolos apresentaram resultados semelhantes para quase todos os parâmetros avaliados, com exceção da motilidade espermática, que foi melhor preservada na descongelação a 55°C/5s por até trinta minutos, seguida do protocolo de 37°C/60s e por último o de 75°C/8s. Analisando-se estes resultados, pode-se concluir que, para o sêmen canino congelado no diluidor ACP-106®, o melhor protocolo para descongelação foi o de 55C/5s.

It is known that temperature and thawing velocity can affect sperm quality during freeze-thawing procedures. Thus, the aim of this research was to compare different thawing protocols for canine semen extended in ACP-106® extender and cryopreserved. Ten ejaculates were collected from eight dogs and sperm rich fraction was evaluated regarding volume, concentration, motility, vigor, pH, morphology, acrosomal integrity and hyposmotic swelling test. Then, semen was extended in ACP-106® with 20% egg yolk and 6% glycerol, and frozen in 0.25 mL straws. After one week, one straw was thawed at 37°C/60s, another one at 55°C/5s and a third one at 75°C/8s, and the seminal characteristics were reevaluated. Similar results were observed for all the groups, except for sperm motility which was better preserved at 55°C/5s for up 30min than at 37°C/60s or 75°C/8s. From these results, it is concluded that canine semen extended in ACP -106® is better thawed at 55°C/5s.

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The aim of the present study was to compare the effect of glycerol addition at two temperatures on canine semen extended and frozen with powdered coconut water extender (ACP-106®). Twelve ejaculates were collected, the sperm-rich fraction was evaluated and further divided into two aliquots. The first aliquot was extended in ACP-106® with 5% egg yolk and glycerol at 27ºC (G27) and the second one was also extended in ACP-106® with 5% egg yolk, with glycerol addition at 4ºC (G4). Samples were frozen, thawed and submitted to evaluations of morphology, acrossomal integrity, hypo-osmotic swelling and alive spermatozoa. No differences were observed between groups after thawing regarding all seminal parameters. In computerized analyzes, it was also not evidenced differences between groups for total and progressive motility, percentual of spermatozoa with fast and medium velocity, and average path velocity (VAP) of spermatozoa with fast and medium velocity, being observed in G4 and G27, respectively, a total motility of 24.45 ± 3.87% and 31.65 ± 3.93% with the VAP of the fast spermatozoa of 91.24 ± 7.74µm/s and 106.25 ± 3.94µm/s. In conclusion, the glycerol temperature addition does not influence the quality of post-thawed canine semen diluted in ACP-106®.KEY WORDS: ACP-106®, cryopreservation, dog, glycerol, semen.

Objetivou-se comparar o efeito da temperatura de adição do glicerol sobre o sêmen canino diluído em água de coco na forma de pó (ACP-106®) e criopreservado. Coletaram-se doze ejaculados, para avaliação da fração espermática, dividida em duas alíquotas. A primeira foi diluída em ACP-106® com 5% de gema de ovo e 6% de glicerol a 27C (G27) e a segunda em ACP-106® com 5% de gema de ovo, com a glicerolização a 4C (G4). As amostras foram congeladas, posteriormente, descongeladas e submetidas às avaliações de morfologia, integridade acrossomal, teste hipo-osmótico e percentual de vivos. Não se observou diferença entre as temperaturas de adição do glicerol em todos os parâmetros. Na análise computadorizada, também não se evidenciou diferença entre os grupos na motilidade total e progressiva, percentual de espermatozoides com velocidade rápida e média, e velocidade média da trajetória (VAP) dos espermatozoides com velocidade rápida e média, sendo observadas, em G4 e G27, respectivamente, uma motilidade total de 24,45 ± 3,93% e 31,65 ± 3,87% e VAP dos espermatozoides rápidos de 91,24 ± 7,74µm/s e 106,25 ± 3,94µm/s. Conclui-se que a temperatura de adição do glicerol não influencia a qualidade pós-descongelação do sêmen canino diluído em ACP-106®.PALAVRAS-CHAVES: ACP-106®, cão, criopreservação, glicerol, sêmen.

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The long-term storage of frozen semen represents a tool for breeders that want to preserve the genetic potential of their sires. The aim of this experiment was to evaluate the effect of coconut water, egg yolk and glycerol on canine semen cooling and freezing. The sperm rich fraction of 12 dogs was submitted to macroscopic and microscopic evaluation. This fraction was divided into four aliquots and frozen with coconut water extender regarding the presence of egg yolk and glycerol. After cooling, there was no difference among groups. However, after thawing, coconut water plus egg yolk and glycerol (ACGG) was superior than others concerning to sperm motility, vigor and morphological abnormalities. In this group, motility (%), vigor (0-5) and abnormalities (%) were 56.7 ± 16.1, 3.4 ± 0.5 e 23.8 ± 8.4, respectivelly. In conclusion, it is necessary to add egg yolk and glycerol to the coconut water extender to improve the cryopreservation of canine semen.

A estocagem do sêmen por um longo período, permitindo o seu posterior uso representa uma importante ferramenta para criadores que desejam resguardar o potencial genético de seus reprodutores. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da água de coco, gema de ovo e glicerol sobre o resfriamento e a criopreservação de sêmen canino. A fração espermática do ejaculado de 12 cães foi avaliada macro e microscopicamente e, em seguida, dividida em quatro alíquotas, submetidas à congelação em quatro diluidores, sendo todos à base água de coco e diferindo quanto à presença ou não da gema de ovo e glicerol. Durante o resfriamento, não se observou diferença entre os grupos, entretanto, após o congelamento e descongelamento, o diluidor adicionado de gema de ovo e glicerol (ACGG) foi superior aos demais quanto à motilidade, vigor e morfologia espermática. Nesse grupo, os valores de motilidade (%), vigor (0-5) e alterações morfológicas totais (%) após a descongelação foram 56,7 ± 16,1, 3,4 ± 0,5 e 23,8 ± 8,4, respectivamente. Diante dos resultados, concluiu-se que a adição de gema de ovo e glicerol ao diluidor foi necessária para a preservação da qualidade espermática após criopreservação de sêmen canino.

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The aim of this study was to estimate the correlation between scrotal girth and spermatic concentration in German Sheepherd dogs. Thirteen German Sheepherd dogs were used and 44 semen samples were obtained by digital manipulation. The ejaculate was separated in its three fractions. The sperm rich fraction was kept for evaluation and determination of spermatic concentration by spectrofotometry. The parameters were expressed as mean and standard deviation. Spearman correlation test was used to estimate the correlation between spermatic concentration and scrotal girth. The mean spermatic concentration was 568.45±314.91x10(6) sptz/ml and the mean scrotal girth was17.6±1.6 cm and the correlation was r = 0.10. It can be conclude that scrotal girth can not be an appropriate measurement as indicative of spermatic concentration in German Sheepherd dogs