Validation of a one-tube nested real-time PCR assay for the detection of Cryptosporidium spp. in avian fecal samples / Validação da nested PCR em tempo real em um tubo para detecção de Cryptosporidium spp. em amostras fecais de aves

Abstract The aim of this study was to validate a one-tube nested real-time PCR assay followed by genetic sequencing to detect and identify Cryptosporidium species and genotypes in birds. A total of 443 genomic DNA extracted from avian fecal samples were analyzed by one-tube nested real-time PCR and conventional nested PCR. By one-tube nested real-time PCR, 90/443 (20.3%) samples were positive for Cryptosporidium spp. In contrast, 36/443 (8.1%) samples were positive for Cryptosporidium spp. by conventional nested PCR. The analytical sensitivity test showed that one-tube nested real-time PCR detects approximately 0.5 oocyst (2 sporozoites) per reaction. An evaluation of analytical specificity did not reveal amplification of microorganisms that commonly present nonspecific amplification with primers used for the diagnosis of Cryptosporidium spp. The repeatability analysis showed the same result in 27 out of 30 samples (90%). As for the reproducibility of one-tube nested real-time PCR, 24 of the 30 samples examined (80%) showed the same result. All the 90 samples amplified by one-tube real-time nested PCR were successfully sequenced, leading to the identification of C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi, and Cryptosporidium avian genotype I. Genetic sequencing of conventional nested PCR amplicons was successful in 10/36 (27.8%) of positive samples.

Resumo O objetivo deste trabalho foi validar um protocolo de nested PCR em tempo real em um tubo (nPCR-TR-1T) seguida de sequenciamento genético para detectar e caracterizar as espécies e genótipos de Cryptosporidium em aves. Um total de 443 amostras de DNA genômico, extraído de amostras fecais de aves, foi analisado pela nPCR-TR-1T e pela nested PCR convencional. Pela nPCR-TR-1T, foi observada positividade para Cryptosporidium spp. de 20,3% (90/443), em contraste com a nested PCR convencional, que apresentou positividade de 8,1% (36/443). O teste de sensibilidade analítica mostrou que a nPCR-TR-1T detecta aproximadamente 0,5 oocisto (2 esporozoítos) por reação. A avaliação da especificidade analítica não revelou amplificação de microrganismos que comumente apresentam amplificação inespecífica com primers utilizados para o diagnóstico de Cryptosporidium spp. O cálculo da repetibilidade evidenciou o mesmo resultado em 27 de 30 amostras (90%). Em relação à reprodutibilidade da nPCR-TR-1T, foi observado o mesmo resultado em 80% (24/30) das amostras examinadas. Foi possível realizar o sequenciamento em todas as 90 amostras amplificadas pela nPCR-TR-1T, com identificação de C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi e Cryptosporidium genótipo I em aves. O sequenciamento dos fragmentos amplificados pela nested PCR convencional foi possível em 10/36 (27,8%) das amostras positivas.

Immunohaematological and rheological parameters in canine visceral leishmaniasis / Parâmetros reológicos e imunohematológicos na leishmaniose visceral canina

The aim of this study was to find correlations between haematological and rheological parameters in canine visceral leishmaniasis (CLV). Enrolled dogs with CVL (n=31) had a confirmed diagnosis using the rapid test Dual Path Platform (TR DPP®) kit and Polymerase Chain Reaction (PCR) assay. A control group (n=31) comprised healthy dogs with negative results for the TR DPP® kit and PCR assay. Haematological parameters and total protein, albumin, globulin, and antibody were assessed. The rheological properties of the blood samples were also determined. Erythrocytes, haematocrit and platelet values of dogs in the CVL group were found to be lower than those of the control group. The total protein, globulin and IgG concentrations were higher in serum samples from the CVL group. The blood flow curve demonstrated increased shear rates in the CVL group. The viscosity of the blood from the infected animals was lower than in the healthy dogs. A positive correlation was found between erythrocyte numbers and blood viscosity. These data suggest that changes in the flow curve and viscosity of blood as well as the erythrocyte values may be a viable low-cost alternative for the monitoring of dogs with visceral leishmaniasis.(AU)

O objetivo deste estudo foi encontrar correlações entre parâmetros hematológicos e reológicos na leishmaniose visceral canina (LVC). Cães com LVC (n=31) tiveram diagnóstico confirmado de LVC pelo teste rápido imunocromatográfico (TR DPP®) e o ensaio de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Cães saudáveis negativos para o TR DPP® e PCR foram alocados no grupo controle (n=31). Foram avaliados parâmetros hematológicos, proteínas totais, albumina, globulina, anticorpos e as propriedades reológicas do sangue. Os valores de eritrócitos, hematócrito e plaquetas de cães do grupo LVC foram menores do que os encontrados no grupo controle. As concentrações de proteína total, globulina e imunoglobulina G (IgG) foram maiores em amostras de soro do grupo LVC. A curva do fluxo sanguíneo apresentou maior taxa de cisalhamento no grupo LVC. A viscosidade sanguínea dos animais infectados foi menor do que a viscosidade do sangue dos animais do grupo controle. Uma correlação positiva foi encontrada entre o número de eritrócitos e a viscosidade do sangue. Esses dados sugerem que as mudanças na curva de fluxo e viscosidade do sangue, bem como os valores de eritrócitos, podem ser uma alternativa viável e de baixo custo para o monitoramento de cães com leishmaniose visceral.(AU)

Validação de um protocolo de nested PCR em tempo real em um tubo e sequenciamento genético para detecção e caracterização de espécies e genótipos de Cryptosporidium em amostras fecais de aves

Protozoários do gênero Cryptosporidium infectam o trato gastrintestinal e, ocasionalmente, os tratos respiratório, biliar e urinário, causando doença clínica e subclínica em aves. O diagnóstico espécie-específico da criptosporidiose é comumente realizado pela nested PCR convencional seguida de sequenciamento genético. O objetivo deste trabalho foi validar um protocolo de nested PCR em tempo real em um tubo (nPCR-TR-1T) seguida da análise da curva de dissociação e de sequenciamento genético para detectar e caracterizar as espécies e genótipos de Cryptosporidium em aves. A reação foi padronizada com utilização do SsoFast® EvaGreen Supermix (Bio-Rad) e do equipamento para PCR em tempo real CFX96 (Bio-Rad). Um total de 443 amostras de DNA genômico de aves foi analisado pela nested PCR convencional e pela nPCR-TR-1. Após a validação, a nPCR-TR-1T foi utilizada para determinar a ocorrência de Cryptosporidium spp. em frangos de corte em 64 núcleos comerciais de frangos de corte (NCFC) na região oeste do estado de Santa Catarina. Pela nested PCR convencional, foi observada positividade para Cryptosporidium spp. em 36/443 (8,1%), em contraste com a nPCR-TR-1T, que apresentou 90/443 (20,3%) amostras positivas para Cryptosporidium spp. O teste de sensibilidade analítica mostrou que a nPCR-TR-1T detecta aproximadamente 0,5 oocisto (2 esporozoítos) por reação. A avaliação da especificidade analítica não revelou amplificação de microrganismos que comumente apresentam amplificação inespecífica com primers utilizados para diagnóstico de Cryptosporidium spp. O cálculo da repetibilidade evidenciou o mesmo resultado em 27 de 30 amostras (90%). Em relação à reprodutibilidade da nPCR-TR-1T, foi observado o mesmo resultado em 24 das 30 amostras examinadas (80%). Foi possível realizar o sequenciamento em todas as 90 amostras amplificadas pela nPCR-TR-1T. As seguintes espécies foram identificadas: C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi e Cryptosporidium genótipo I emaves. O sequenciamento dos fragmentos amplificados pela nested PCR convencional foi possível em 10/38 (26,3%) das amostras positivas, com identificação das mesmas espécies identificadas pela nPCR-TR-1T. A ocorrência observada nos NCFC foi de 0,2% (1/64), com identificação de C. baileyi em uma amostra. Os resultados observados demonstram que a nPCR-TR-1T, em comparação com a nested PCR convencional, apresenta mais rapidez para obtenção dos resultados, menor possibilidade de contaminação com produtos amplificados e menor consumo de reagentes, pois ela é realizada em somente uma etapa e os resultados são obtidos em tempo real, sem necessidade de eletroforese em gel de agarose.

Protozoa of the genus Cryptosporidium infect the gastrointestinal tract and occasionally the respiratory, biliary, and urinary tracts, causing clinical and subclinical disease in birds. Species-specific diagnosis of cryptosporidiosis is commonly performed by conventional nested PCR followed by genetic sequencing. The objective of this study was to validate a one-tube real-time nested PCR protocol followed by melting curve analysis and genetic sequencing to detect and characterize Cryptosporidium species and genotypes in birds. The reaction was standardized using the SsoFast® EvaGreen Supermix (Bio-Rad) and the CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad). A total of 443 avian genomic DNA samples were analyzed by conventional nested PCR and one-tube nested real-time PCR. After validation one-tube real-time nested PCR was used to determine the prevalence of Cryptosporidium spp. in 64 commercial broiler flocks in the western region of the state of Santa Catarina. By conventional nested PCR, 36/443 (8.1%) samples were positive for Cryptosporidium spp. In contrast, one-tube nested real-time PCR showed 90/443 (20.3%) positive samples for Cryptosporidium spp. The analytical sensitivity test showed that one-tube nested real-time PCR detects approximately 0.5 oocyst (2 sporozoites) per reaction. Analytical specificity evaluation did not reveal amplification of microorganisms that commonly present nonspecific amplification with primers used for the diagnosis of Cryptosporidium spp. The repeatability calculation showed the same result in 27 out of 30 samples (90%). Regarding the reproducibility of nPCR-TR-1T, the same result was observed in 24 of the 30 samples examined (80%). It was possible to perform sequencing on all 90 samples amplified by one-tube real-time nested PCR. The following species were identified: C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi, and Cryptosporidium genotype I in birds. Genetic sequencing of conventional nested PCR amplicons was possible in 10/36 (27.8%) of positive samples, with identificationof the same species identified by one-tube real-time nested PCR. Cryptosporidium spp. prevalence in broiler flocks was 0.2% (1/64), with identification of C. baileyi in one sample. The results of this study demonstrated that one-tube nested real-time PCR, in comparison with conventional nested PCR, presents faster results, less possibility of contamination with amplicons, and lower consumption of reagents, since it is performed in only one step and the results are obtained in real time, without the need for agarose gel electrophoresis.

Evaluation of immunohistochemical technique for the diagnosis of Leishmania spp. in canine tissues samples / Avaliação do exame imuno-histoquímico para o diagnóstico de Leishmania spp. em amostras de tecidos caninos

In Brazil, leishmaniasis represents a major public health problem due to its high incidence, wide distribution and remarkable increase in transmission associated with the disease urbanization. Dogs are considered as the main reservoirs of visceral leishmaniasis (VL) in the urban environment and diagnosis improvement was fundamental in this species. This study aimed at evaluating the immunohistochemical technique (IHC) for diagnosing Leishmania spp. in differents tissues samples collected from dogs. This investigation was performed at the Quantitative Pathology Center of the Institute Adolfo Lutz (NPQ-IAL). Tissue samples collected from 134 dogs, derived from municipalities of São Paulo State, positive for VL by rapid testing (TR DPP® - Bio-Manguinhos), enzyme-linked immunosorbent assay (EIA/ELISA - Bio-Manguinhos), and polymerase chain reaction, were analyzed by specific IHC in duplicate. These dogs were previously diagnosed as VL. IHC showed sensitivity of 98.51 %, specificity of 100.00 %, positive predictive value of 100.00 %, negative predictive value of 83.33 % and accuracy of 98.61 %. The major positivity was detected in spleen samples. Kappa index between the tissues duplicate results was of 0.84. IHC technique, standardized and implemented at NPQ-IAL, showed to be suitable to be used as routine test for diagnosing canine leishmaniasis effectivelly.

No Brasil, as leishmanioses representam um importante problema de saúde pública pela sua elevada incidência, ampla distribuição geográfica e marcante aumento na transmissão associados à urbanização da doença. Cães são considerados os principais reservatórios da leishmaniose visceral (LV) no ambiente urbano, tornando-se fundamental o aprimoramento do diagnóstico da doença nessa espécie. Este estudo objetivou a avaliação da técnica de imuno-histoquímica (IHQ) para o diagnóstico de Leishmania spp. em amostras de diferentes tecidos de cães recebidas no Núcleo de Patologia Quantitativa do Instituto Adolfo Lutz (NPQ-IAL). Amostras de tecidos coletadas de 134 cães, provenientes de municípios do Estado de São Paulo, positivos para LV por teste rápido (TR DPP®-Bio-Manguinhos), ensaio imunoenzimático-EIE/Elisa (Bio-Manguinhos) e pela reação em cadeia de polimerase, foram submetidas a marcação IHQ específica, em duplicata. A reação de IHQ apresentou sensibilidade de 98,51 %, especificidade de 100,00 % e acurácia de 98,61 %. A maior positividade foi detectada nas amostras de baço. O índice Kappa foi de 0,84 entre os resultados da análise dos tecidos em duplicata. A técnica de IHQ pode ser utilizada como uma técnica rotineira para o diagnóstico das leishmanioses caninas, sendo padronizada e implantada no NPQ-IAL.

Evaluation of immunohistochemical technique for the diagnosis of Leishmania spp. in canine tissues samples / Avaliação do exame imuno-histoquímico para o diagnóstico de Leishmania spp. em amostras de tecidos caninos

In Brazil, leishmaniasis represents a major public health problem due to its high incidence, wide distribution and remarkable increase in transmission associated with the disease urbanization. Dogs are considered as the main reservoirs of visceral leishmaniasis (VL) in the urban environment and diagnosis improvement was fundamental in this species. This study aimed at evaluating the immunohistochemical technique (IHC) for diagnosing Leishmania spp. in differents tissues samples collected from dogs. This investigation was performed at the Quantitative Pathology Center of the Institute Adolfo Lutz (NPQ-IAL). Tissue samples collected from 134 dogs, derived from municipalities of São Paulo State, positive for VL by rapid testing (TR DPP® - Bio-Manguinhos), enzyme-linked immunosorbent assay (EIA/ELISA - Bio-Manguinhos), and polymerase chain reaction, were analyzed by specific IHC in duplicate. These dogs were previously diagnosed as VL. IHC showed sensitivity of 98.51 %, specificity of 100.00 %, positive predictive value of 100.00 %, negative predictive value of 83.33 % and accuracy of 98.61 %. The major positivity was detected in spleen samples. Kappa index between the tissues duplicate results was of 0.84. IHC technique, standardized and implemented at NPQ-IAL, showed to be suitable to be used as routine test for diagnosing canine leishmaniasis effectivelly.(AU)

No Brasil, as leishmanioses representam um importante problema de saúde pública pela sua elevada incidência, ampla distribuição geográfica e marcante aumento na transmissão associados à urbanização da doença. Cães são considerados os principais reservatórios da leishmaniose visceral (LV) no ambiente urbano, tornando-se fundamental o aprimoramento do diagnóstico da doença nessa espécie. Este estudo objetivou a avaliação da técnica de imuno-histoquímica (IHQ) para o diagnóstico de Leishmania spp. em amostras de diferentes tecidos de cães recebidas no Núcleo de Patologia Quantitativa do Instituto Adolfo Lutz (NPQ-IAL). Amostras de tecidos coletadas de 134 cães, provenientes de municípios do Estado de São Paulo, positivos para LV por teste rápido (TR DPP®-Bio-Manguinhos), ensaio imunoenzimático-EIE/Elisa (Bio-Manguinhos) e pela reação em cadeia de polimerase, foram submetidas a marcação IHQ específica, em duplicata. A reação de IHQ apresentou sensibilidade de 98,51 %, especificidade de 100,00 % e acurácia de 98,61 %. A maior positividade foi detectada nas amostras de baço. O índice Kappa foi de 0,84 entre os resultados da análise dos tecidos em duplicata. A técnica de IHQ pode ser utilizada como uma técnica rotineira para o diagnóstico das leishmanioses caninas, sendo padronizada e implantada no NPQ-IAL.(AU)

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE LEISHMANIA SPP. EM CÃES ORIUNDOS DE ABRIGOS DA REGIÃO METROPOLITANA DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

Leishmaniose é uma doença causada por protozoários do gênero Leishmania e transmitida pelos vetores flebotomíneos hematófagos do gênero Lutzomyia que infectam uma ampla variedade de hospedeiros mamíferos, incluindo cães e humanos. Sendo considerada uma antropozoonose re-emergente e um grande problema de saúde pública, representa um complexo de doenças com importante espectro clínico e diversidade epidemiológica. A importância do reservatório canino deriva do contato próximo e frequente entre cães e seres humanos, e o fato de que os animais podem apresentar infecção assintomática, apesar de um alto grau de parasitismo na pele sã e vísceras. O objetivo do presente estudo foi avaliar as alterações hematológicas, bioquímicas e clínicas na infecção por Leishmania spp. em cães sorologicamente e molecularmente positivos. Amostras de sangue de 166 cães, oriundos de abrigos da Região Metropolitana do Rio de Janeiro, foram coletadas. Realizou-se análise hematológica e bioquímica-sérica dos animais, bem como a pesquisa de anticorpos IgG anti-Leishmania spp. pelo teste rápido imunocromatográfico de duplo percurso TR DDP - (Fiocruz®) e Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI). Ademais, os animais sorologicamente positivos, foram avaliados molecularmente pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Os resultados demonstraram que (18/166) 10,84% dos cães apresentaram sororreatividade por meio do TR DDP, sendo essas amostras submetidas também a RIFI, na qual 100% (18/18) dos animais foram sororeagentes. Na PCR, baseada na porção do gene v7-v8 18S SSU rRNA, 16,66% (3/18) dos cães de abrigos apresentaram positividade. Não foram observadas correlações hematológicas, bioquímicas e alterações clínicas com a infecção. Os resultados denotam a importância do monitoramento da leishmnaniose canina, especialmente, em cães de abrigos a fim de que estratégias de controle e prevenção possam ser implementadas adequadamente, minimizando os efeitos deletérios desta zoonose.

Leishmaniasis is a disease caused by protozoa of the genus Leishmania and transmitted by hematophagous sandfly vectors of the genus Lutzomyia that infect a wide variety of mammalian hosts, including dogs and humans. Being considered a reemerging anthropozoonosis and a major public health problem, it represents a complex of diseases with important clinical spectrum and epidemiological diversity. The importance of the canine reservoir derives from the close and frequent contact between dogs and humans, and the fact that animals may present asymptomatic infection despite a high degree of parasitism on healthy skin and viscera. The aim of the present study was to evaluate hematological, biochemical and clinical changes in dogs positive for Leishmania spp. by serological and molecular methods. Blood samples from 166 shelters dogs in the metropolitan region of Rio de Janeiro were collected. Hematological and serum biochemical analysis of the animals, as well as the detection of antibodies anti-Leishmania spp. by double-path immunochromatographic rapid test TR DDP - (Fiocruz®) and Indirect Immunofluorescence Reaction (RIFI) were performed. In addition, serologically positive animals were molecularly evaluated by polymerase chain reaction (PCR). The results showed that (18/166) 10,84% of the dogs presented seroreactivity by TR DDP, and these samples also underwent IFAT, in which 100% (18/18) of the animals were seroreagent. In PCR, based on the portion of the v7-v8 18S SSU rRNA gene, 16,66% (3/18) of shelter dogs were positive. No hematological, biochemical and clinical alterations were observed with the infection. The results show the importance of monitoring canine leishmaniasis, especially in shelter dogs so that control and prevention strategies can be implemented properly, minimizing the deleterious effects of this zoonosis.

DETECÇÃO DE INFECÇÃO POR Leishmania infantum EM FELINOS DOMÉSTICOS NO ESTADO DA BAHIA

RESUMO SANTOS, N. S. Detecção de infecção por Leishmania infantum em felinos domésticos no Estado da Bahia. 2020. 97p. Dissertação (Mestre em Ciência Animal nos Trópicos) Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia Universidade Federal da Bahia, 2019. As leishmanioses apresentam um ciclo epidemiológico complexo com a participação de hospedeiros diversos, o que torna necessário investigar e ampliar o conhecimento sobre a infecção em animais que vivem em áreas endêmicas. Assim, o objetivo deste estudo foi determinar a ocorrência da infecção por Leishmania infantum em gatos domésticos oriundos de regiões endêmicas para leishmaniose zoonótica do estado da Bahia, além de caracterizar os casos positivos segundo aspectos clínicos, sorologia para anticorpos anti-Leishmania e presença de coinfecções comuns em felinos. Realizou-se, por meio de busca ativa nos municípios baianos de Muritiba, São Félix, Simões Filho, Camaçari e Feira de Santana, a avaliação clínica de 104 gatos e a colheita de amostras biológicas (sangue periférico e aspirados de medula óssea) para realização de teste sorológico imunocromatográfico TR-DPP® (Biomanguinhos), exame citológico para investigação de formas amastigotas de Leishmania sp., PCR convencional qualitativa para detecção de DNA de Leishmania infantum, FIV (Vírus da Imunodeficiência Felina), FeLV (Vírus da Leucemia Felina) e Mycoplasma sp. e exames de patologia clínica. Dos 104 gatos avaliados, 14 foram excluídos do estudo. As análises das amostras de 90 gatos revelaram que a infecção por L. infantum foi confirmada em 7,8% (7/90) dos gatos examinados pela PCR, três residentes no município de Muritiba, dois no município de Camaçari e dois no município de São Félix. Um (01) gato apresentou-se positivo à PCR para L. infantum, à pesquisa de formas amastigotas em exame citológico de aspirados de medula óssea e ao TR-DPP®, simultaneamente, embora tenha se apresentado sem alterações ao exame físico à primeira colheita (T1) e com exames hematológicos e bioquímicos dentro da faixa de normalidade na segunda colheita (T2), 22 dias após T1. Entretanto, aos 82 dias após T2 (T3) esse gato desenvolveu leishmaniose felina (LFe), caracterizada por linfadenomegalia, conjuntivite, e afta em cavidade oral, associadas a linfocitose, hiperproteinemia com hiperglobulinemia e elevação da fosfatase alcalina no soro, além de presença abundante de amastigotas em citologia de linfonodos e conjuntivas palpebrais; entretanto, o teste TR-DPP® resultou negativo em T3. Dos sete gatos positivos à PCR, apenas um apresentou positividade no teste TR-DPP®, perfazendo 1,1% de soropositividade confirmada. As alterações clínicas encontradas nos gatos positivos à PCR foram emagrecimento, desidratação, lesões crostosas em pontas de orelhas, alopecia, linfadenomegalia, espirros e complexo gengivite-estomatite. Houve apenas um gato 1,1% (1/90) coinfectado com L. infantum e FeLV, apresentando leve desidratação e áreas de alopecia circulares em região cervical ventral. Com base nos dados obtidos, podemos afirmar que infecção por L. infantum ocorre também em gatos nos municípios baianos Muritiba, São Félix e Camaçari. Os gatos infectados por L. infantum no presente estudo foram classificados como portadores de doença discreta. Mais estudos são necessários para um dimensionamento abrangente do número de gatos acometidos e estabelecimento da caracterização clínica e fisiopatológica desses hospedeiros em outros municípios do Estado da Bahia. Palavras-Chave: Citologia; Gatos; Leishmaniose felina; PCR; Sorologia.

ABSTRACT SANTOS, N. S. Detection of Leishmania infantum infection in domestic cats in the state of Bahia. 2020. 97p. Dissertação (Mestre em Ciência Animal nos Trópicos) Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia Universidade Federal da Bahia, 2020. Leishmaniasis has a complex epidemiological cycle with participation of different hosts, reason why it is necessary to investigate and increase knowledge about animalss infections living in endemic areas. Thus, the objective of this study was to determine the occurrence of infection by Leishmania infantum in domestic cats from endemic regions for zoonotic leishmaniasis in the state of Bahia, in addition characterize positive cases according to clinical aspects, serology for anti-Leishmania antibodies and the presence of common co-infections in felines. An active search was conducted in cities of Muritiba, São Félix, Simões Filho, Camaçari and Feira de Santana, also clinical evaluation of 104 cats and the collection of biological samples (peripheral blood and bone marrow aspirates), immunochromatographic serological test TR-DPP® (Biomanguinhos), cytological examination to investigate amastigote forms of Leishmania sp., qualitative conventional PCR for DNA detection of Leishmania infantum, FIV (Feline Immunodeficiency Virus), FeLV (Feline Leukemia Virus) and Mycoplasma sp. and clinical pathology exams were performed. Of the 104 cats evaluated, 14 were excluded from this study. Analyzes of samples from 90 cats revealed that L. infantum infection was confirmed in 7.8% (7/90) of the cats examined by PCR, three of them were residents in Muritiba, two in Camaçari and two in São Félix. One cat that was positive for PCR for L. infantum, also presence of amastigote forms detection in cytological examination of bone marrow aspirates and for TR-DPP®. Interesting, this cat did not present any alterations in physical examination at the first clinical exam (T1), as well as hematological and biochemical laboratorial tests were in the normal range at the second clinical exam (T2), 22 days after T1. However, 82 days after T2 (T3) the cat developed feline leishmaniasis (LFe), characterized by lymphadenomegaly, conjunctivitis, and ulcers located in oral cavity, associated with lymphocytosis, hyperproteinemia with hyperglobulinemia and elevated serum alkaline phosphatase, in addition to abundant presence of amastigotes in lymph node and eyelid conjunctiva cytology; however, the TR-DPP® test performed was negative at T3. Of the seven cats positive for PCR, only one was positive for TR-DPP® test, confirming 1.1% seropositivity. The clinical observations found in cats positive for PCR were weight loss, dehydration, crusted lesions on the tips of ears, alopecia, lymphadenomegaly, sneezing and gingivitis-stomatitis complex. There was only one 1.1% cat (1/90) co-infected with L. infantum and FeLV, it showed mild dehydration and circular alopecia areas at ventral cervical region. Based on the data obtained, we can say that infection by L. infantum also occurs in cats at Muritiba, São Félix and Camaçari cities. Cats infected with L. infantum at the present study were classified as showing mild disease. Further studies are necessary for a comprehensive dimensioning of the number of affected cats and establishment of the clinical and pathophysiological characterization of these hosts in other cities at the State of Bahia. Keywords: Cats; Cytology; Feline leishmaniasis; PCR; Sorology.

Morphological and immunohistochemical characterization of angiogenic and apoptotic factors and the expression of thyroid receptors in the ovary of tilapia Oreochromis niloticus in captivity / Caracterização morfológica e imuno-histoquímica de fatores angiogênicos e apoptóticos e da expressão de receptores tireoidianos no ovário de tilápia Oreochromis niloticus em cativeiro

Morphological and immunohistochemical characterization of angiogenic and apoptotic factors and the expression of thyroid receptors in the ovary of tilapia Oreochromis niloticus in captivity were studied. The morphological evaluation of the ovaries was performed by histological paraffin embedded and stained with HE. The immunohistochemical expressions of CDC47, VEGF, Flk-1, angiopoietin, Tie-2 and thyroid receptor (TRα) were performed by the technique of streptavidein-biotin-peroxidase. Apoptosis was assessed using the TUNEL kit. The relative expression of thyroid hormone receptors (TRα and TRβ) was assessed by RT-PCR real time. The nuclear expression of CDC47 increased with the stage of maturation of the oocyte and was observed in the follicle cells. Apoptotic bodies were observed in the follicular cells of atretic follicles and postovulatory follicles from the ovaries of 150g and 350g fish. Expression of VEGF and its receptor Flk-1 was also observed in the follicular cells, and the expression of both increased with the maturity of the oocyte, with a higher intensity observed in the full-grown follicle. The expression of angiopoietin and of its receptor (Tie 2) was discrete and moderate respectively. TRα expression was independent of follicular development. However, the 350 g tilapia exhibited higher expression of TRβ compared with the 50 g tilapia. We conclude that the proliferative activity and the expression of VEGF and its receptor increase with follicular maturation and that the TRs expression increases with ovarian maturity in tilapia (Oreochromis niloticus).(AU)

Foram estudadas as caracterizações morfológica e imuno-histoquímica de fatores angiogênicos e apoptóticos e a expressão de receptores tireoidianos no ovário de tilápia Oreochromis niloticus de cativeiro. A avaliação morfológica dos ovários foi realizada por cortes histológicos incluídos em parafina e corados por HE. As expressões imuno-histoquímicas de CDC47, VEGF e seu receptor Flk-1, angiopoetina e seu receptor Tie-2 e recertor tireoidiano (TRα) foram realizadas pela técnica de estreptavideina-biotina-peroxidade. A apoptose foi avaliada utilizando-se kit de TUNEL. A expressão relativa dos receptores de hormônios tireoidianos (TRα e TRβ) foi avaliada pela técnica de RT-PCR tempo real. A expressão nuclear de CDC47 aumentou com a fase de maturação do oócito e foi observada nas células foliculares. Corpos apoptóticos foram observados nas células foliculares de folículos atrésicos e folículos pós-ovulatórios de ovários de peixes com 150g e 350g. A expressão de VEGF e do seu receptor Flk-1 foi também observada nas células foliculares , e a expressão de ambos aumentou com a maturidade do oócito , com uma maior intensidade no folículo maduro. A expressão de angiopoietina e do seu receptor (Tie 2) foi discreta e moderada, respectivamente. A expressão de TRα foi independente do desenvolvimento folicular. No entanto, a tilápia de 350g apresentou maior expressão de TRβ em comparação com a tilápia de 50g. Conclui-se que a atividade proliferativa e a expressão de VEGF e de seu receptor aumenta com a maturação folicular e que a expressão dos TRs aumenta com a maturidade do ovário em tilápia (Oreochromis niloticus).(AU)

INQUÉRITO EPIDEMIOLÓGICO DE LEISHMANIOSE CANINA EM UM MUNICÍPIO DA REGIÃO DO RECÔNCAVO BAIANO

RESUMO VARJÃO, B. M. Inquérito epidemiológico de leishmaniose canina em um município da região do Recôncavo Baiano. 2020. 73 f. Dissertação (Mestre em Ciência Animal nos Trópicos) Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia Universidade Federal da Bahia, 2020. O estado da Bahia apresenta casos de leishmaniose visceral humana (LVH) causada por Leishmania infantum, assim como relatos de infecção em animais. O Recôncavo Baiano, onde a doença é conhecidamente endêmica em humanos, até o presente momento não apresenta quantidade de estudos suficientes quanto a real situação da leishmaniose canina causada por L. infantum (LCan). Objetivou-se investigar a situação epidemiológica da doença canina no município de Muritiba, localizado no recôncavo, onde a LVH é considerada de ocorrência esporádica. Foram examinados 351 cães clinicamente e por meio de diagnóstico sorológico e molecular (PCR) a partir de amostras de aspirado de medula óssea; aspectos ambientais foram levantados e as localidades que tinham cães soropositivos registradas por georreferenciamento. Com base nos critérios do Ministério da Saúde foi considerado infectado o cão com resultados positivos no teste de triagem (TR-DPP) e no teste confirmatório (ELISA), encontrando-se uma soroprevalência de 15,7% (55/351). Nenhuma associação foi encontrada entre a soropositividade para LCan e o sexo, raça, idade e se os cães eram domiciliados. Quanto à caracterização clínica dos cães soropositivos, 72,7% (40/55) apresentavam algum sinal clínico sugestivo de LCan, como alopecia (p<0,0001), úlceras na pele (p<0,0001), onicogrifose (p<0,0001), despigmentação do focinho (p<0,0001), crostas na pele (p=0,0051) e hiperqueratose (p<0,0001), alterações oculares (p=0,0117), apatia (p=0,0007), emagrecimento (p<0,0001), mucosas hipocoradas (p=0,0015), linfonodos aumentados (p=0,0139) e esplenomegalia (p<0,0001). O método de PCR em amostras de medula óssea, realizado em 36 cães soropositivos, confirmou a presença de DNA de L. infantum em 88,8% (32/36) desses cães. Verificou-se ainda que os animais positivos não estão distribuídos uniformemente no município e que os aspectos ambientais como criação de aves e falta de saneamento básico adequado podem facilitar a manutenção do vetor na região, o que com a presença do agente oferece um risco de transmissão para os seres humanos e manutenção da infecção entre os animais gerando um potencial para endemicidade na área estudada. Os dados confirmam a ocorrência de infecção e doença canina causada por L. infantum no município de Muritiba. Palavras-Chave: Georreferenciamento. Leishmania infantum. Saúde Única. Zoonose.

ABSTRACT VARJÃO, B. M. Canine leishmaniasis epidemiological survey in a city from Recôncavo Baiano region. 2020. 73 f. Dissertation (Master in Animal Science in the Tropics) - School of Veterinary Medicine and Animal Science - Federal University of Bahia, 2020. Bahia state presents cases of human visceral leishmaniasis (LVH) caused by Leishmania infantum, as well as reports of infection in animals. Recôncavo Baiano, where the disease is known to be endemic in humans, has not yet been studied for canine leishmaniasis caused by L. infantum (LCan). The objective was to investigate an epidemiological situation of the disease in the municipality of Muritiba, located in the recôncavo, where an LVH is considered a sporadic occurrence. 351 dogs were examined clinically and by serological and molecular diagnosis (PCR) from samples of bone marrow aspirate; environmental aspects were raised and as places that had seropositive dogs registered by georeferencing. Based on the requirements of Ministry of Health, the dog with positive results in serology a screening test (TR-DPP) and a confirmatory test (ELISA) was considered positive, found a seroprevalence of 15.7% (55/351). No association was found between seropositivity for LCan and sex, race, age and whether the dogs were domiciled. Regarding the clinical characterization of seropositive dogs, 72.7% (40/55) presented some clinical sign suggestive of LCan, such as alopecia (p <0.0001), skin ulcers (p <0.0001), onychoglyphosis (p < 0.0001), depigmentation of the dog's snout (p <0.0001), crusts on the skin (p = 0.0051) and hyperkeratosis (p <0.0001), eye changes (p = 0.0117), apathy (p = 0.0007), weight loss (p <0.0001), pale mucous membranes (p = 0.0015), enlarged lymph nodes (p = 0.0139) and splenomegaly (p <0.0001). Bone marrow PCR method performed in 36 seropositive dogs confirmed the presence of L. infantum DNA in 88.8% (32/36) of these dogs. It was also found that positive animals are not evenly distributed in the municipality and that environmental aspects such as poultry farming and the lack of basic sanitation are adequate to allow the maintenance of vectors in the region, or the presence of agents that offer a risk of transmission to humans and maintenance of infection among animals that generate an endemic potential in the studied area. The data confirm an occurrence of infection and canine disease caused by L. infantum in the municipality of Muritiba. Keywords: Georeferencing. Leishmania infantum. Single Health. Zoonosis.

Morphological and immunohistochemical characterization of angiogenic and apoptotic factors and the expression of thyroid receptors in the ovary of tilapia Oreochromis niloticus in captivity / Caracterização morfológica e imuno-histoquímica de fatores angiogênicos e apoptóticos e da expressão de receptores tireoidianos no ovário de tilápia Oreochromis niloticus em cativeiro

Morphological and immunohistochemical characterization of angiogenic and apoptotic factors and the expression of thyroid receptors in the ovary of tilapia Oreochromis niloticus in captivity were studied. The morphological evaluation of the ovaries was performed by histological paraffin embedded and stained with HE. The immunohistochemical expressions of CDC47, VEGF, Flk-1, angiopoietin, Tie-2 and thyroid receptor (TRα) were performed by the technique of streptavidein-biotin-peroxidase. Apoptosis was assessed using the TUNEL kit. The relative expression of thyroid hormone receptors (TRα and TRß) was assessed by RT-PCR real time. The nuclear expression of CDC47 increased with the stage of maturation of the oocyte and was observed in the follicle cells. Apoptotic bodies were observed in the follicular cells of atretic follicles and postovulatory follicles from the ovaries of 150g and 350g fish. Expression of VEGF and its receptor Flk-1 was also observed in the follicular cells, and the expression of both increased with the maturity of the oocyte, with a higher intensity observed in the full-grown follicle. The expression of angiopoietin and of its receptor (Tie 2) was discrete and moderate respectively. TRα expression was independent of follicular development. However, the 350 g tilapia exhibited higher expression of TRß compared with the 50 g tilapia. We conclude that the proliferative activity and the expression of VEGF and its receptor increase with follicular maturation and that the TRs expression increases with ovarian maturity in tilapia (Oreochromis niloticus).(AU)

Foram estudadas as caracterizações morfológica e imuno-histoquímica de fatores angiogênicos e apoptóticos e a expressão de receptores tireoidianos no ovário de tilápia Oreochromis niloticus de cativeiro. A avaliação morfológica dos ovários foi realizada por cortes histológicos incluídos em parafina e corados por HE. As expressões imuno-histoquímicas de CDC47, VEGF e seu receptor Flk-1, angiopoetina e seu receptor Tie-2 e recertor tireoidiano (TRα) foram realizadas pela técnica de estreptavideina-biotina-peroxidade. A apoptose foi avaliada utilizando-se kit de TUNEL. A expressão relativa dos receptores de hormônios tireoidianos (TRα e TRß) foi avaliada pela técnica de RT-PCR tempo real. A expressão nuclear de CDC47 aumentou com a fase de maturação do oócito e foi observada nas células foliculares. Corpos apoptóticos foram observados nas células foliculares de folículos atrésicos e folículos pós-ovulatórios de ovários de peixes com 150g e 350g. A expressão de VEGF e do seu receptor Flk-1 foi também observada nas células foliculares , e a expressão de ambos aumentou com a maturidade do oócito , com uma maior intensidade no folículo maduro. A expressão de angiopoietina e do seu receptor (Tie 2) foi discreta e moderada, respectivamente. A expressão de TRα foi independente do desenvolvimento folicular. No entanto, a tilápia de 350g apresentou maior expressão de TRß em comparação com a tilápia de 50g. Conclui-se que a atividade proliferativa e a expressão de VEGF e de seu receptor aumenta com a maturação folicular e que a expressão dos TRs aumenta com a maturidade do ovário em tilápia (Oreochromis niloticus).(AU)

ELISA PLASMÔNICA NA DETECÇÃO DE ANTICORPOS IgG anti-Leishmania sp.

O cão tem sido alvo do controle da Leishmaniose Visceral (LV), pois são reservatórios potenciais de Leishmania infantum e desempenham um papel fundamental na cadeia epidemiológica da doença no homem. Portanto, o diagnóstico da leishmaniose canina (Lcan) no Brasil tem sido um desafio para os órgãos de controle de endemias, uma vez que apresentam limitações quanto à sensibilidade e especificidade em áreas endêmicas. Nesta perspectiva a presente pesquisa objetivou desenvolver e validar um ELISA plasmônica indireto rK28 (pELISA) para o diagnóstica da Lcan. Para o desenvolvimento do pELISA, foram realizados diferentes ensaios de otimização, determinação das concentrações ideais de peróxido de hidrogênio, íons ouro, anticorpo IgG anti-dog biotinilado e também do soro. Para a validação do ensaio, 170 amostras de soro de cães de área endêmica para Lcan e 26 amostras de cães saudáveis de área não endêmica para a doença foram testadas pelo pELISA e comparadas com ELISA indireto rk28 e com o teste imunocromatográfico (Dual Path Platform, TR_DPP®) usando como teste padrão-ouro o qPCR em amostras de sangue e/ou swab de subconjuntival. O ensaio foi padronizado com as concentrações de 250 M de peróxido de hidrogênio, 0,30 mM de íons ouro e a melhor diluição do conjugado de estreptavidina-catalase foi de 1/50. O TR_DPP®, ELISA indireto rK28 e pELISA apresentaram sensibilidade de 79,0%, 89,5% e 94,7% e especificidade de 90,1%, 91,4% e 100,0%, respectivamente. Os maiores valores preditivos positivos (100,0%), negativos (99,3%) e de precisão (99,4%) foram observados no pELISA. O coeficiente Kappa entre o pELISA e a qPCR mostrou excelente concordância (0,970), diferentemente do ELISA indireto rK28 e do TR_DPP®, que mostraram um boa concordância (0,645 e 0,551, respectivamente). O resultados revelaram que o pELISA melhorou a sensibilidade e apresentou alta especificidade em relação ao método oficial recomendado pelo Ministério da Saúde no Brasil e pode aumentar a praticidade do diagnóstico em países com recursos limitados, pois não requer instrumentos sofisticados para leitura, sugerindo que este método pode ser usado como uma ferramenta adicional para o diagnóstico de Lcan nessas áreas.

Dogs have been the target of control of Visceral Leishmaniasis (VL) in humans, as they are potential reservoirs of Leishmania infantum and play a key role in the epidemiological chain of the disease. Therefore, the diagnosis of Canine Leishmaniasis (CanL) in Brazil has been a challenge for endemic control organs, since they have limitations on sensitivity and specificity in endemic areas. In this perspective the present research aimed to develop and validate an indirect plasmonic ELISA rK28 (pELISA) for the diagnosis of CanL. For the development of pELISA, different concentrations of hydrogen peroxide, gold ions, biotinylated anti-dog IgG antibody and serum were tested in order to establish ideal values to each parameter. For the validation of the assay, 170 dog serum samples from endemic area to CanL and 26 healthy dog samples from an area nonendemic to the disease were tested by pELISA and compared with indirect ELISA rk28 and the imunocromatografic test (Dual Path Platform, TR_DPP®) using as gold standard assay the real-time PCR in blood samples and/or subconjunctival swab. The assay was standardized with the concentrations of 250 M hydrogen peroxide, 0.30 mM gold ions, and dilution of the streptavidin-catalase conjugate of 1/50. The TR_DPP®, indirect ELISA rK28 and pELISA presented sensitivity of 79.0%, 89.5% and 94.7% and specificity of 90.1%, 91.4% and 100%, respectively. The highest predictive positive (100%), negative (99.3%) and accuracy (99.4%) values were observed in pELISA. Kappa coefficient between pELISA with real-time PCR showed excellent agreement (0.970), differently of indirect ELISA rK28 and TR_DPP®, which showed good agreement (0.645 and 0.551 respectively). The results revealed that the pELISA improved sensitivity and presented higher specificity compared to official method recommended by the Ministry of Health in Brazil and may increasing the practicality of diagnosis in resource-constrained countries, because it does not require sophisticated instruments to read, suggesting that this method can be used as an additional tool for the diagnosis of CanL in these areas

Leishmaniose visceral em gatos domésticos (Felis catus) em área endêmica no Brasil

A leishemaniose visceral (LV) é uma zoonose parasitária causada pela espécie Leishmania infantum nas Américas. O cão doméstico é considerado o principal reservatório e, no ambiente urbano, a LV em gatos vem ganhando destaque. Entretanto, a participação destes animais no ciclo biológico da L. infantum era desconhecida. Portanto, o objetivo geral deste estudo foi avaliar a participação do gato doméstico (Felis catus) no ciclo epidemiológico da LV. Foram examinados 307 gatos, os quais foram submetidos à anamnese para verificar a ocorrência de sinais clínicos relacionados à leishmaniose, coleta de sangue para exame hematológico, quantificações bioquímicas, sorologia para retrovírus e sorologia para leishmaniose, aspirado de linfonodo poplíteo e medula óssea e raspado de pele com lesão para confirmar a infecção pelo método de pesquisa direta de Leishmania. As Leishmania isoladas dos gatos foram submetidas a estudos moleculares (PCR-RFLP e sequenciamento) para identificação das espécies, 12 dos animais infectados foram submetidos a xenodiagnóstico para verificar a capacidade de infectar o vetor e cinco foram necropsiados para estudo histopatológico de baço, fígado e rim. Um dos gatos com LV e um cão saudável foram utilizados para testar a possibilidade de transmissão da doença do gato para o cão. Os resultados deste estudo revelaram que os gatos se infectam por L. infantum e foi observada uma prevalência de 6,5% no exame parasitológico, 12,1% no ELISA e 9,1% no TR DPP®. Os gatos infectados estavam presentes em todas as zonas demográficas da cidade. As principais alterações clínicas e laboratoriais observadas nos animais com LV foram: linfadenopatia, alopecia, emagrecimento, lesão ulcerativa na pele, nódulos na pele, redução significativa nos valores de hemácias e hematócrito, presença de Leishmania em baço, hepatite, degeneração hepática e infiltrados inflamatórios em rim. Os 20 gatos positivos para LV estavam infectados pela espécie L. infantum e o sequenciamento apontou não haver diferença entre os parasitos isolados de gatos com os de cães publicados no GenBank. 67% dos animais submetidos ao xenodiagnóstico infectaram o vetor e a transmissão da LV do gato para o cão foi confirmada. Conclui-se que a LV em gatos de Teresina-PI apresenta elevada prevalência e foi demostrado que gatos infectados por L. infantum são capazes de infectar o vetor biológico Lutzomyia longipalpis e transmitir a infecção para outro indivíduo não infectado, confirmando a participação ativa destes animais no ciclo epidemiológico da LV.

Visceral leishmaniasis (LV) is a parasitic zoonosis caused by the Leishmania infantum species in the Americas. The domestic dog is considered the main reservoir and, in the urban environment, LV in cats has been gaining prominence. However, the participation of these animals in the biological cycle of L. infantum was unknown. Therefore, the general objective of this study was to evaluate the participation of the domestic cat (Felis catus) in the epidemiological cycle of VL. A total of 307 cats were examined, which were submitted to anamnesis to verify the occurrence of clinical signs related to leishmaniasis, blood collection for hematological examination, biochemical quantifications, serology for retroviruses and serology for leishmaniasis, aspiration of popliteal lymph node and bone marrow and scaling of skin scraping with lesion to confirm the infection by the direct search method of Leishmania. The isolated Leishmania of the cats were submitted to molecular studies (PCR-RFLP e sequencing) to identify the species, 12 of the infected animals were submitted to xenodiagnosis to verify the infection of the vector and five were necropsied for histopathological study of spleen, liver and kidney. One of the cats with LV and a healthy dog were used to test the possibility of transmission of cat disease to the dog. The results of this study show that the cats are infected by L. infantum and a prevalence of 6.5% was observed in parasitological examination, 12,1% in ELISA and 9.1% in TR DPP®. Infected cats were present in all demographic areas of the city. The main clinical and laboratory abnormalities observed in animals with VL were: lymphadenopathy, alopecia, weight loss, ulcerative lesions on the skin, nodules on the skin, significant reduction in red blood cell and hematocrit values, presence of Leishmania in spleen, hepatitis, liver degeneration and inflammatory infiltrates in kidney. The 20 LV-positive cats were infected by the L. infantum species and the sequencing showed no difference between the parasites isolated from cats and those from dogs published in GenBank. 67% of the animals submitted to xenodiagnosis infected the vector and the LV transmission from the cat to the dog was confirmed. It is concluded that LV in Teresina-PI cats presents high prevalence and it has been demonstrated that cats infected by L. infantum are able to infect the biological vector Lutzomyia longipalpis and transmit the infection to another uninfected individual, confirming the active participation of these animals in the epidemiological cycle of LV.

Ocorrência de resultados falso-negativos na reação de PCR em Tempo Real (PCR-TR) no diagnóstico da doença meningocócica / False-negative results in Real-Time PCR (RT-PCR) for meningococcal disease diagnosis

Factors responsible for false-negative results (F-N) in RT-PCR assay for detecting N. meningitidis in serumand CSF samples were investigated. As the meningococcal disease should be rapidly treated because ofits high mortality and epidemic potential, the F-N in diagnostic testing may cause treatment failuresand/or on disease restraint in community. Thus, it is crucial to learn the factors which cause F-N in RTPCRassays. The F-N were induced by inhibition, low quantity of target DNA in extracted samples, andinadequate temperature employed at PCR annealing procedure. As bacterial DNA concentration in samplesmight be highly variable, the ideal sample volume to be extracted could not be defined. As previouslyrecommended for N. meningitidis gene-grouping by RT-PCR assay, the annealing temperature at 60 °Cwas not suitable for B and W135 genogroups. Altogether, these factors induced F-N in 31 samples; therefore,30 % of N. meningitidis detected by RT-PCR were classified as non-genogrouped. The inhibitors and/orthe low amount of target DNA induced F-N on RT-PCR, independently of the specimen volume used forextracting DNA. However, adjustments on the PCR annealing temperature and amount of extracted DNAadded into the reaction might avoid the occurrence of the majority of F-N.(AU)

Foram investigados os fatores que causam resultados falso-negativos (RF-N) nas reações de PCR-TR nodiagnóstico de N. meningitidis em amostras de soro e LCR. Considerando-se que a doença meningocócica deva ser rapidamente tratada pela alta letalidade e potencial epidêmico, o RF-N no ensaio diagnósticopode ocasionar falhas no tratamento e/ou na contenção da doença na comunidade. Portanto, é importanteelucidar os fatores que induzem RF-N na PCR-TR. Os RF-N ocorreram em virtude de inibição, baixa quantidade de DNA-alvo nas preparações de DNA e inadequada temperatura no procedimento de anelamento. Por ser altamente variável a concentração de DNA bacteriano em amostras clínicas, não foi possível definir o volume ideal de amostra a ser extraído. A temperatura a 60 °C para anelamento,recomendada para genogrupagem de N. meningitidis por PCR-TR, não foi adequada para genogrupos B e W135. Estes fatores ocasionaram a indução de RF-N em 31 amostras; consequentemente, 30 % das bactériasdetectadas pelo PCR-TR foram classificadas como não genogrupáveis. Inibidores e/ou baixa quantidade de DNA-alvo induzem RF-N, independentemente do volume de amostra utilizada na extração de DNA;entretanto, ajustes na temperatura de anelamento e na quantidade de amostra extraída adicionada na reação podem evitar a maioria destes RF-N.(AU)

Avaliação de resultados discrepantes obtidos na execução de PCR em tempo real em amostras de pacientes com suspeita clínica de meningite bacteriana / Inconsistent results in real-time PCR in analyzing samples from patients with suspected bacterial meningitis

O princípio básico para obter resultado confiável é a compatibilidade entre as réplicas e sua reprodutibilidade. Na rotina diagnóstica por PCR em tempo real (PCR-TR), em que centenas de amostras são processadas, a obtenção de resultados com Cts tardios ou réplicas que diferem entre si por mais de três unidades, são inevitáveis. Das 3.000 amostras processadas em 2010, em duplicata, na rotina diagnóstica das meningites bacterianas por PCR-TR na pesquisa de N. meningitidis, S. pneumoniae e H. influenzae,157 (5,2 %), apresentaram inconsistência entre as réplicas (diferença entre Cts maior do que 3) e/ou altos valores de Cts; e os ensaios foram retestados. O presente trabalho investigou estes resultados obtidos, os benefícios destas repetições e as possíveis razões da ocorrência dos resultados discrepantes. Verificou-se que, apenas 18 (11 %) das amostras submetidas à repetição, apresentaram resultados positivos. Erros humanos inerentes à pipetagem, como o uso de pipetas não calibradas, a baixa concentração de DNA alvo nas amostras, a degradação da sonda ou mesmo a possível contaminação aleatória são fatores que contribuem para induzir resultados discrepantes. A realização do ensaio de PCR-TR com amostras em duplicata e a repetição de ensaios com resultados discordantes é um artifício eficiente para avaliar e definir estes resultados.(AU)

The basic principle for obtaining a reliable result is the consistency found among the replicas and its reproducibility. In a diagnostic routine by using real-time PCR (RT-PCR), when hundreds samples are processed, and results with late Cts or replicas that differ by more than three units are inevitable. Of 3,000 samples processed in 2010, in duplicate, in the diagnostic routine of bacterial meningitis by RT-PCR for detecting N. meningitidis, S. pneumoniae and H. influenzae, 157 (5.2 %) samples showed inconsistencyamong replicas (difference between Cts higher than three units) and/or high Cts values; and the samples were retested. This study assessed these results, the benefits of its repetitions and probable reasons for the occurrence of these discrepant results. Among the retested samples, 18 (11 %) only showed positive results. Human errors inherent to pipetting, use of non-calibrated pipettes, low concentration of target DNA in the analyzed samples, probe degradation or even random contamination are factors which contribute to induce the discrepant results. Performing RT-PCR assay with samples in duplicate and retesting thesamples showing discordant results constitute a device for efficiently evaluating and defining these results.(AU)

DETECÇÃO DE Cryptosporidium parvum EM ÉGUAS E POTROS / DETECTION OF Cryptosporidium parvum IN MARES AND FOALS

A primeira descrição de Cryptosporidium infectando equinos ocorreu em potros árabes imunocomprometidos. A ocorrência da criptosporidiose pode variar conforme a localização geográfica, clima, manejo, população e método diagnóstico utilizado. Informações a respeito da epidemiologia molecular para investigação do potencial zoonótico da infecção pelo protozoário nesses hospedeiros ainda são escassas. Com o objetivo de caracterizar molecularmente o protozoário Cryptosporidium spp em equinos, foram examinados 92 potros (56 machos e 36 fêmeas) com idade entre três a 330 dias e 24 matrizes provenientes de 11 fazendas da região Noroeste do Estado de São Paulo, Brasil. Os animais eram das raças Quarto de Milha, Mangalarga Marchador, Paint Horse, Crioula e Pampa. Amostras fecais foram colhidas diretamente da ampola retal dos animais e congeladas para a realização da nested-PCR com amplificação de fragmentos da subunidade 18S do gene do RNA ribossômico. As amostras positivas foram submetidas ao sequenciamento para identificação das esp&a

ASPECTOS MOLECULARES DE OÓCITOS DE FÊMEAS BOS INDICUS E BOS TAURUS SUBMETIDOS AO ESTRESSE TÉRMICO

Com o objetivo de avaliar a influência do estresse térmico sobre a competência oocitária, bem como sobre parâmetros fisiológicos de fêmeas bovinas de diferentes raças, foram realizados três experimentos. No experimento I, foram avaliados complexo cumulus-oócitos (COCs) de vacas da raça Simental maturados in vitro em diferentes temperaturas (37°C, 38,5°C ou 40°C). Antes da maturação, os oócitos foram corados com Brilhante Cresilblue (BCB) e, classificados em BCB+ e BCB-. Os COCs marcados (BCB+) eram considerados de melhor qualidade. Após a maturação, foram produzidos embriões in vitro e os oócitos foram avaliados através de PCR em tempo real e imunofluorescência, para avaliação das sirtuínas, BCL11A e p53. A alteração da temperatura (±1,5°C) de maturação do oócito afetou negativamente a taxa de blastocisto após a fertilização in vitro, além de influenciar a expressão de gene importantes para a proteção celular. A expressão dos genes SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT5, BCL11a e p53 foi alterada pela temperatura de maturação, em oócitos e células da granulosa. No experimento II foram avaliados complexo cumulus-oócitos (COCs) de fêmeas da raça Nelore (Bos Taurus indicus) maturados in vitro em diferentes temperaturas (37°C, 38,5°C e 40°C). Após esse período parte dos COCs foram submetidos a fecundação e cultivo dos embriões e a outra parte, após determinação da taxa de maturação, foram fixados em paraformoldeído para análise de HSP70 e HSP90 por western blott. O estresse térmico não influenciou a taxa de maturação nuclear dos oócitos, porém influenciou a taxa de clivagem e de blastocisto. A intensidade do sinal da HSP70 foi aumentado nos oócitos submetidos a estresse, em relação ao grupo controle, além disso as células cumulus mostraram um aumento significativo da intensidade de sinal dessa proteína à 40°C. A HSP90 mostrou maior quantidade em oócitos maturados à 37°C, porém se mantendo estável nas demais temperaturas. A menor taxa de blastocistos e a ação paralela das HSP´s demonstram que a produção in vitro de embriões é afetada quando a maturação in vitro ocorre em situações de estresse crônico (24 hs de MIV; 37°C e 40°C). E no experimento III foram avaliados complexos oócitos-cumulus (COCs) recuperados através da aspiração folicular guiada por ultrassonografia (OPU), de vacas Bos taurus x Bos indicus (Girolando) e Bos taurus (Pantaneira). Parte dos COCs viáveis foram submetidos a análise de imunofluorescência sob microscopia confocal para identificação das proteínas HSP70 e HSP90. Antes da realização de cada OPU, foi aferida a temperatura retal (TR) e frequência respiratória (FR) de cada animal. O estresse térmico foi estimado pelo Indice de Temperatura do Globo e Umidade (ITGU) que foi calculado de acordo com a fórmula descrita por Buffington et al. (1981) e classificados de acordo com o National Weather Service, 90 dias antes de cada OPU. A rusticidade das raças Girolando e Pantaneira pode ser confirmada pela manutenção da TR e FR em nívies fisiológicos em ITGUs de até 94. A HSP nos oócitos foi influenciada pelo ITGUs para as duas raças, porem com comportamentos contrários. No entanto, a raça Pantaneira sofreu efeitos negativos em ITGUs <78 demonstrando estresse em temperaturas mais amenas. Por outro lado, observa-se que ITGUs >78 apresentam efeito deletério na qualidade do oócitos de vacas Girolando. Aparentemente a raça Pantaneira reage negativamente em temperaturas mais baixas, já que apresentou menor viabilidade oocitária com ITGUs <78. Por outro lado observa-se que ITGUs de >79 aos 90 dias antes da OPU apresentam um efeito deletério na qualidade do oócitos de vacas Girolando.

Aiming to evaluate the effects of in vivo and in vitro thermal stress on oocyte competence and early embryonic development as well as on physiological parameters of cows of different breeds, they were conducted three experiments. In the experiment I, the cumulus-oocyte complex (COCs) of Simmental cows matured in vitro at different temperatures (37°C, 38.5°C and 40°C) were evaluated. Before maturation the oocytes were stained with Brilliant Cresilblue (BCB) and then categorized according to staining in BCB + and BCB-. The labeled COCs (BCB +) were considered to be of better quality. After maturation, embryos were produced in vitro and oocytes were evaluated by realtime PCR and immunofluorescence, for the evaluation of sirtuins, BCL11A and p53. The change in temperature (±1,5°C) of oocyte maturation adversely affects the blastocyst rate after in vitro fertilization, in addition to influencing gene expression important for cell protection. Expression of the SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT5, BCL11a and p53 genes were influenced by the maturation temperature in oocytes and granulosa cells. In the experiment II, cumulus-oocyte complexes (COCs) of Nellore (Bos Taurus indicus) females were evaluated in vitro at different temperatures (37°C, 38,5°C and 40°C). After this period part of the COCs were submitted to embryo fertilization and culture and the other part, after determining the maturation rate, were fixed in paraformoldeído for analysis of HSP70 and HSP90 by western blot. Thermal stress did not influence the maturation rate of oocytes, but influenced the rate of cleavage and blastocyst. The signal intensity of HSP70 was increased in stressed oocytes compared to the control group, and cumulus cells showed a significant increase in the signal intensity of this protein at 40°C. HSP90 showed higher numbers in oocytes matured at 37 ° C, but remained stable in the other temperatures. The lower rate of blastocysts and the parallel action of HSPs demonstrate that the in vitro production of embryos is affected when in vitro maturation occurs in situations of chronic stress (24 hours of IVM) by cold and heat. In the experiment III, cumulative oocytes (COCs) recovered through ultrasound-guided follicular aspiration (OPU), Bos taurus x Bos indicus (Girolando) and Bos taurus (Pantaneira) cows were evaluated. Part of the viable COCs were submitted to immunofluorescence analysis under confocal microscopy for identification of HSP70 and HSP90 proteins. Before each OPU, the rectal temperature (RT) and respiratory frequency (RF) of each animal were measured. Thermal stress was estimated by the Black Globe Humidity Index (BGHI) which was calculated according to the formula described by Buffington et al. (1981) classified according to the National Weather Service, 90 days before each OPU. The rusticity of the Girolando and Pantaneira breeds can be confirmed by the maintenance of the RT and RF in physiological levels in BGHIs of up to 94. The HSP in the oocytes was influenced by the BGHIs for both breeds, but with opposite behaviors. However, the Pantaneira breed had negative effects on BGHIs <78 demonstrating stress at warmer temperatures. On the other hand, it is observed that BGHIs >78 have a deleterious effect on the quality of Girolando cow oocytes. It appears that the Pantaneira breed reacts negatively at lower temperatures, since it presented lower oocyte viability with BGHI <78. On the other hand it is observed that ITGUs of> 79 at 90 days before OPU have a deleterious effect on the quality of Girolando cow oocytes.

MONITORING OF NATURAL INFECTION BY BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS (BVDV) IN CATTLE HERDS / Monitoramento da infecção natural pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) em rebanhos bovinos

A infecção natural pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) foi monitorada em três rebanhos bovinos por meio de amostras de soro sangüíneo, obtidas em várias colheitas realizadas em cada rebanho, que foram submetidas ao teste de virusneutralização (VN) para o BVDV-1 e para o BVDV-2. As amostras não reagentes a pelo menos um dos genótipos e aquelas oriundas de bovinos com menos de seis meses de idade, reagentes ou não, foram analisadas pela reação em cadeia da polimerase precedida pela transcrição reversa (RT-PCR) para a pesquisa do BVDV. Em dois rebanhos o vírus não foi detectado em nenhuma amostra e a quantidade de animais reagentes ao vírus no teste de VN, principalmente nos animais jovens, diminuiu à medida que as colheitas foram realizadas. No entanto, no terceiro rebanho, a infecção permaneceu durante o período monitorado, pois o BVDV foi detectado em dois animais persistentemente infectados (PI) e também em um animal transitoriamente infectado (TI). O sistema de criação, bem como o intenso trânsito de animais, foram favoráveis à permanência

Avaliação do status funcional da glândula tireoide correlacionado com o metabolismo extratiroidiano em cães da raça golden retriever

O hipotireoidismo é uma doença hiperdiagnosticada em cães devido ao desafio que representa para o médico veterinário. Além de não apresentar sinais clínicos específicos, os métodos diagnósticos disponíveis na rotina clínica são falhos. Além desta problemática, novos estudos vêm surgindo evidenciando que os valores de referência usuais por espécie são ultrapassados e não correspondem à realidade diagnóstica. Com objetivo de avaliar os recursos laboratoriais em conjunto para diagnóstico desta endocrinopatia, foram utilizados 21 cães machos da raça Golden Retriever, variando entre 4 e 12 anos de idade. Todos os animais eram suspeitos de hipotireoidismo por pelo menos um sinal clínico ou laboratorial compatível, segundo a literatura. Além disso, todos foram avaliados quanto à ingestão diária de iodo devido à possibilidade dos resultados hormonais serem compatíveis com o efeito Wolff-Chaikoff. Na primeira fase do estudo, foram mensurados T4 livre por diálise (T4ld) e o hormônio estimulador da tireoide (TSH). Utilizando os valores normais para a espécie como referência, foi possível distribuir os animais em dois grupos devido à diferença estatística de T4ld (p=0,023): (1) Eutireoideos (n=13) e (2) Hipotireoideos (n=8). É importante destacar que não houve diferença significativa entre os grupos com relação à concentração plasmática de TSH (p=0,0455). Clinicamente, não houve relação entre os sinais apresentados com os resultados hormonais. Acerca da ingestão de iodo, foi possível perceber que todos os animais estavam sendo submetidos a dietas com excesso do microelemento, embora estas concentrações não possam ser relacionadas com a variação hormonal. A partir de então, iniciou-se a segunda fase do estudo com 12 cães submetidos ao teste de estimulação com TSH recombinante humano (rhTSH) e biópsia de pele para histopatologia e PCR em tempo real. Este último para determinar a expressão da desiodase do tipo 2 (D2) e receptor de hormônio tireoidiano do tipo (Tr). O teste de estimulação com rhTSH revelou diferença significativa entre a concentração de T4t pré e pós-TSH em ambos os grupos (grupo 1: p<0,05; grupo 2: p<0,001). Todavia, não houve diferença estatística entre os grupos. Os resultados obtidos a partir do exame histopatológico foram inconsistentes tanto para suscitar a doença como para excluí-la, sugerindo ser um exame auxiliar falho. Não obstante, ao avaliar os resultados hormonais frente a referência racial, nota-se que, na realidade, pode-se estar diante de 21 cães normotireoideos e, portanto, os resultados estatisticamente insignificantes seriam esperados. Desta forma, é possível concluir que os valores de referência necessitam ser utilizados com cautela e quanto menos variáveis existir neste quesito, maior a acurácia do diagnóstico.

Canine hypothyroidism is overdiagnosed because it is a real challenge for clinicians. In addition to not presenting specific clinical signs, the diagnostic methods available in the clinical routine are flawed. Besides that, new studies have emerged evidencing that the usual reference values by species are exceeded and do not correspond to the real diagnostic. In order to evaluate the laboratory tests used to diagnose this endocrinopathy, 21 male Golden Retriever dogs, ranging from 4 to 12 years of age, were used. All animals showed some clinical signs suggesting hypothyroidism or laboratory-compatible signal, according to the literature. Futhermore, all dogs were evaluated for the daily intake of iodine due to the possibility that the hormonal results are compatible with the Wolff-Chaikoff effect. In the first phase of the study, free T4 (fT4) and thyroid stimulating hormone (TSH) were measured. Using the normal values for the species as reference, it was possible to distribute animals in two groups due to the statistical difference of T4ld (p = 0.023): (1) Euthyroid (n = 13) and (2) Hypothyroid (n = 8). It is important to note that there was no significant difference between the groups regarding the plasma TSH concentration (p = 0.0455). Clinically, there was no relationship between the signs presented with the hormonal results. Regarding iodine intake, it was possible to observe that all the animals were being submitted to diets with excess microelement, although these concentrations could not be related to the hormonal variation. Thereafter, the second phase of the study was started with 12 dogs submitted to the stimulation test with human recombinant TSH (rhTSH) and skin biopsy for histopathology and real-time PCR. This was used to determine the expression of type 2 deiodinase (D2) and type thyroid hormone receptor (Tr). The rhTSH stimulation test revealed a significant difference between total T4 concentrations before and after TSH in both groups (group 1: p <0.05, group 2: p <0.001). However, there was no statistical difference between those groups. Histopathological examination were inconsistent both to elicit the disease and to exclude it, suggesting that it is a faulty auxiliary examination. Nevertheless, when evaluating the hormonal results against the racial reference, it can be observed that in fact, there were 21 normotireoideos dogs and, therefore, the statistically insignificant results would be expected. In this way, it is possible to conclude that reference values should be used with caution and it is necessary to decrease the variables to improve the accuracy of the diagnosis

Estudo da fauna flebotomínica e dos aspectos ambientais relacionados à transmissão das leishmanioses no município de Juatuba, MG, Brasil - 2015 à 2016.

O estudo foi realizado em Juatuba, Minas Gerais, cujos dados anteriores de casos das leishmanioses humana e canina apontam para um perfil complexo dessa doença no município. Objetivou-se estudar a fauna flebotomínica, os aspectos epidemiológicos, climáticos e ambientais relacionados à transmissão das leishmanioses no município, além de correlacionar as variáveis de estudo com a prevalência de leishmaniose visceral canina (LVC). Foi realizado um estudo epidemiológico prospectivo de coleta sistemática de flebotomíneos e inquérito sorológico canino no período de abril de 2015 a março de 2016. O estudo entomológico foi realizado em duas áreas de estudo, a saber: Área 1 Satélite, contemplou os bairros Satélite I e II e Área 2- Vila Maria Regina (VMR), contemplou os bairros VMR I e II. Foram instaladas 24 armadilhas luminosas em 12 residências distribuídas nas duas áreas de estudo. Em cada ponto de captura foram instaladas duas armadilhas, localizadas no intradomicílio e peridomicílio. As coletas se deram de maneira sistemática, na última semana de cada mês, durante 12 meses. Para análise dos aspectos climáticos, utilizou-se a correlação simples de Spearman para cada par de variáveis e para análise espacial foram utilizados a estimativa de Kernel, a função K e a lógica Fuzzy. Para determinar a taxa de prevalência de LVC, foram coletadas amostras de sangue de cães das duas áreas estudadas para realização do teste diagnóstico de triagem TR-DPP e teste diagnóstico sorológico confirmatório ELISA. Em relação ao estudo entomológico, foram capturados 431 flebotomíneos, sendo 69% machos e 74% do total provenientes do peridomicílio. A espécie Lutzomyia longipalpis foi capturada em maior número (44%). Em relação à infecção natural, das 89 fêmeas submetidas a análise por PCR, 5,6% apresentaram positividade à infecção por Leishmania spp.. Dessas, 100% das fêmeas apresentaram-se infectadas por Leishmania infantum e pertenciam ao VMR. Em relação aos fatores climáticos, a variável temperatura média apresentou correlação positiva (p<0,05) com a variação da densidade vetorial mensal e a umidade relativa apresentou correlação negativa (p<0,05). A variável precipitação mensal apresentou correlação negativa em relação à densidade vetorial mensal, sem significância estatística. O inquérito canino foi realizado em 1.752 cães, 1163 foram do Satélite e 589 do VMR, com a taxa de prevalência de 4,12% e 7,13%, respectivamente, com diferença significativa entre as áreas. As duas áreas do município apresentaram condições ambientais favoráveis para a manutenção das leishmanioses, sobretudo da LVC, com o encontro de Lu. longipalpis, presença da infecção canina e detecção de Le. infantum em vetores, indicando que a interface parasito-reservatório-vetor está ativa nas áreas estudadas. As ações de vigilância e controle devem ser direcionadas principalmente ao VMR, uma vez que apresentou sítios de reprodução vetorial e as análises indicaram ser uma área mais favorável ao acometimento da leishmaniose visceral, devido a maior densidade vetorial, maior positividade canina, presença da infecção vetorial por Le. infantum e condições ambientais com elevada presença de fatores de risco.

The study was conducted in Juatuba, Minas Gerais, whose previous data from human and canine leishmaniasis point to a complex profile of this disease in the municipality.The main objective was to study the phlebotominae fauna, the epidemiological, climatic and environmental aspects related to the transmission of leishmaniasis, in the city and to correlate the study variables with the prevalence of canine visceral leishmaniasis (CVL). A prospective epidemiological study of systematic sampling of phlebotomine and canine serological survey was carried out from April 2015 to March 2016. The entomological study was carried out in two study areas,namely: Area 1 - Satelite I and II; Area 2 - Vila Maria Regina (VMR) contemplated the neighborhoods VMR I and II. Twenty-four light traps were installed in 12 residences distributed in the two study areas. At each capture point, two traps were installed, located in the intradomicile and peridomicile. The collections were done systematically, in the last week of each month, for 12 months. For the analysis of the climatic aspects, we used the simple Spearman correlation for each pair of variables and for spatial analysis we used Kernel estimation, K function and Fuzzy logic. To determine the prevalence rate of CVL, blood samples were collected from dogs distributed in two study areas, to perform the TR-DPP screening test and the ELISA confirmatory serological diagnostic test. In relation to the entomological study, 431 sandflies were captured, being 69% male and 74% of the total coming from the peridomicile. The species Lutzomyia Longipalpis was captured in greater numbers (44%). Regarding the natural infection, of the 89 females submitted to PCR analysis, 5.5% presented positivity to the infection by Leishmania sp. Of those, 100% of the females were infected with Leishmania infantum and belonged to the VMR. Regarding climatic factors, the mean temperature variable presented a positive correlation (p <0.05) with the monthly vector density variation and the relative humidity presented negative correlation (p <0.05). The monthly precipitation variable presented a negative correlation in relation to the monthly vector density, with no statistical significance. The canine survey was performed in 1.752 dogs, 1163 were from Satelite and 589 from VMR, with a prevalence rate of 4.12% and 7.13%, respectively, being this significant difference between the areas. The two areas of the municipality presented favorable environmental conditions for the maintenance of leishmaniasis, especially CVL, with Lu. longipalpis, presence of canine infection and Le. infantum detection in vectors, indicating that the parasite-reservoir-vector interface is active in the studied areas. Surveillance and control actions should be directed mainly to the VMR, since it presented vectorial breeding sites and the analyzes indicated to be an area more favorable to the affection of visceral leishmaniasis, due to greater vector density, greater canine positivity, presence of vector Le. infantum and environmental conditions with high presence of risk factors.

EXPRESSÃO GÊNICA, DESEMPENHO, PARÂMETROS FISIOLÓGICOS E COMPORTAMENTAIS EM FUNÇÃO DO BALANÇO DE ELETRÓLITOS DIETÉTICOS EM FRANGOS DE CORTE NA FASE INICIAL

A evolução da avicultura teve como resultado um frango de corte de crescimento rápido, no entanto, surgiram diversas dificuldades no que diz respeito ao metabolismo e manejo dessas aves. Tem-se evidenciado o efeito do balanço eletrolítico dietético (BED) sobre parâmetros produtivos, saúde e sanidade na criação de frangos de corte, entretanto, não foram encontrados estudos relacionados ao comportamento e expressão de genes em função do BED. Dessa forma, objetivou-se com este estudo avaliar o efeito de níveis de BED sobre o desempenho, expressão de genes relacionados ao equilíbrio ácido-básico, a absorção e ao transporte de nutrientes, além de parâmetros fisiológicos e comportamentais em frangos de corte na fase de 1 a 21 dias criados em estresse térmico cíclico natural. O experimento foi realizado no setor de Avicultura do Colégio Técnico de Bom Jesus CTBJ, pertencente à Universidade Federal do Piauí, no município de Bom Jesus-PI. Utilizou-se 245 pintos machos da linhagem Cobb na fase de 1 a 21 dias de idade. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com cinco níveis de BED (110, 175, 240, 305 e 370 mEq/Kg) e 7 repetições de 7 aves cada. Foram avaliados o consumo de ração (CR), ganho de peso (GP), conversão alimentar (CA); parâmetros comportamentais a partir de um etograma com base na atividade, ociosidade e movimentos agonísticos; os parâmetros fisiológicos temperatura retal (TR), frequência respiratória (FR), frequência cardíaca (FC) e temperatura superficial média (TSM), e a análise da expressão dos genes ATP1A1, CHP1, SLC1A1, SLC5A1, SLC7A6, SLC7A7, SLC9A1, SLC12A2, SLC24A3 e SLC26A4 no fígado, intestino e rim por meio da metodologia RT-qPCR em tempo real. Houve efeito significativo (p<0,05) para a conversão alimentar aos 7 e 21 dias. Houve efeito significativo (p<0,05) dos níveis de BED sobre frequência respiratória e frequência cardíaca. Os comportamentos Ativo, Comer, e Respiração Ofegante apresentaram diferença significativa (p<0,05) em função do BED. Houve diferença de expressão (p<0,05) para os genes ATP1A1, CHP1, SLC1A1, SLC5A1, SLC7A6, SLC9A1, SLC12A2 e SLC26A4 no fígado; os genes ATP1A1, SLC7A6, SLC24A3 e SLC26A4 no intestino; e ATP1A1, SLC9A1, SLC24A3 e SLC26A4 no rim. O BED da dieta afeta a expressão de gênica e, consequentemente, o desempenho zootécnico, parâmetros fisiológicos e comportamentais de frangos de corte de 1 a 21 dias, sendo recomendados os níveis de 110 e 370 mEq/kg.

The evolution of poultry production resulted in a fast-growing broiler chicken, however, there were several difficulties regarding the metabolism and management of these birds. The effect of dietary electrolyte balance (BED) on productive parameters, health and sanity in broiler breeding has been evidenced, however, no studies related to the behavior and expression of genes as a function of BED have been found. Thus, the objective of this study was to evaluate the effect of BED levels on performance, expression of genes related to acid-base balance, nutrient uptake and transport, as well as physiological and behavioral parameters in broilers in the stage from 1 to 21 days under natural cyclic thermal stress. The experiment was carried out in the poultry sector of the Technical College of Bom Jesus - CTBJ, belonging to the Federal University of Piauí, in the municipality of Bom Jesus-PI. 245 male chicks of the Cobb strain were used in the 1 to 21 days age phase. The experimental design was completely randomized with five BED levels (110, 175, 240, 305 and 370 mEq / kg) and 7 replicates of 7 birds each. The following parameters were evaluated: dietary consumption (CR), weight gain (GP), food conversion (CA); behavioral parameters from an etogram based on activity, idleness and agonistic movements; physiological parameters respiratory rate (FR), heart rate (FC) and mean surface temperature (TSM) and analysis of the expression of the ATP1A1, CHP1, SLC1A1, SLC5A1, SLC7A6, SLC7A7, SLC9A1, SLC12A2, SLC24A3 and SLC26A4 genes in the liver, intestine and kidney by real-time RT-qPCR methodology. There was a significant effect (p <0.05) for feed conversion at 7 and 21 days. There was a significant (p <0.05) effect of BED levels on respiratory rate and heart rate. The behaviors "Active", "Eat", and "Breathing Breathing" presented significant difference (p <0.05) as a function of BED. There were differences in expression (p <0.05) for the ATP1A1, CHP1, SLC1A1, SLC5A1, SLC7A6, SLC9A1, SLC12A2, and SLC26A4 genes in the liver; the ATP1A1, SLC7A6, SLC24A3 and SLC26A4 genes in the gut; and ATP1A1, SLC9A1, SLC24A3, and SLC26A4 in the kidney. The BED affects the gene expression and, consequently, the zootechnical performance, physiological and behavioral parameters of broilers from 1 to 21 days, and levels of 110 and 370 mEq / kg are recommended.