Resumo
A produção de fitoterápicos exige que em seu desenvolvimento haja testes em relação a sua toxicidade. Assim métodos que promovam a redução de animais em pesquisa devem ser aplicados também a estes compostos. A OECD (Guideline for the Testing of Chemicals) recomenda o teste do olho de frango como uma alternativa de triagem, antes de levar os produtos à ensaios in vivo. Os objetivos deste estudo foram determinar a toxicidade do extrato aquoso de Walteria ouradinha através de ensaio ex vivo em globo ocular de frangos, e demonstrar dados que justifiquem a utilização deste como teste de triagem anterior ao ensaio in vivo. Foram utilizados olhos de frangos ex vivo, distribuídos em grupos conforme o produto instilado em sua superfície: grupo extrato aquoso de W. douradinha (WD), salina 0,9% (CN) e ácido acético 10% (CP). A toxicidade foi avaliada para retenção de fluoresceína, opacidade e inchaço de córnea, e critérios histopatológicos, conforme recomendação da OECD. O grupo WD demonstrou resultados macroscópicos com baixo índice de irritabilidade, quando comparados com os olhos CP (P<0,05). Ainda, os olhos WD demonstraram menores alterações histopatológicas que os olhos CP, estando, em todas ocasiões, com índice não irritante. Nas condições deste estudo concluímos que o extrato aquoso de W. douradinha possui baixo grau de toxicidade perante as análises macroscópicas e histopatológicas. Mais que isso, indicamos o teste do olho da galinha como ensaio de triagem para determinação da toxicidade de fitoterápicos, podendo ser usado antes de levar os extratos à teste em animais, reduzindo assim o uso destes.
Requirements for the toxicological assessment of phytotherapies are increasing, as these become more widespread. Methods that reduce the animals used in these toxicology studies should also be applied for these compounds. The enucleated chicken eye test is recommended by OECD as an early screening method, used prior to the in vivo assays. The objectives of this study were to assess the toxicity of the aqueous extract of Walteria douradinha through the enucleated chicken eye test, as recommended by the OECD, and demonstrate evidence supporting it as a valid screening assay. The eyes of commercially slaughtered chicken were used in this study, these were divided into groups according to the product instilled: aqueous extract of W. douradinha (WD); 0.9% saline (CN); and 10% acetic acid (CP). Toxicity was evaluated by predetermined criteria for fluorescein retention, corneal opacity, and swelling, in five time points. Histopathological criteria for corneal lesions were also assessed. Throughout the study the WD group showed low rates of irritability compared with CP eyes (P <0.05) in the macroscopic criteria. Moreover, WD eyes showed lower histopathological changes than CP eyes, and were characterized as non irritant. In this study we conclude that the aqueous extract of W. douradinha has a low degree of toxicity, as shown by both macroscopic and histopathological parameters. Furthermore, we recommend the enucleated chicken eye test as a screening assay to determine the toxicity of herbal extracts, and should be used before in vivo testing, thus reducing the number of animals used.
Assuntos
Malvaceae/intoxicação , Malvaceae/toxicidade , Medicamento Fitoterápico , Experimentação Animal , Extratos Vegetais/análiseResumo
Devido à grande importância da intoxicação por Senecio spp. em bovinos no Sul do Brasil e o impacto provocado pela doença, nessa tese estão incluídos dois artigos científicos acerca do tema. No primeiro trabalho, realizou-se uma revisão bibliográfica da intoxicação por Senecio spp. em bovinos. O objetivo desse estudo foi fornecer uma abordagem detalhada da intoxicação nessa espécie, com enfoque nos seguintes aspectos: princípio tóxico e patogenia, epidemiologia, sinais clínicos, diagnóstico e controle e profilaxia. No segundo trabalho são descritos os aspectos epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos de um surto de intoxicação natural por Senecio brasiliensis em bezerros e a caracterização e evolução das lesões hepáticas durante o surto. Um lote com 206 bovinos, fêmeas, sem raça definida, foi desmamado com aproximadamente quatro meses de idade e soltos em campo nativo com 25 hectares, com grande quantidade de Senecio brasiliensis em diferentes estágios. Os bovinos permaneceram nesse campo durante três meses e posteriormente foram transferidos para outra área. Na nova área, seis bezerras, com idades entre sete a oito meses, começaram a apresentar sinais clínicos de emagrecimento, fraqueza, diarreia e edema subcutâneo na região submandibular. Os seis bovinos morreram em um período de 15 dias e um deles foi necropsiado. Macroscopicamente, foi visualizado o primeiro (Padrão 1) dos três padrões distintos de lesão hepática dos bovinos desse surto, que se caracterizava por um fígado aumentado de tamanho, com os bordos arredondados e com superfície capsular e de corte alaranjada. Histologicamente, havia acentuada degeneração vacuolar hepatocelular difusa, bilestase, megalocitose, leve proliferação de ductos biliares e fibrose periportal. Dois meses após o início do surto, constatou-se que em um período de 20 dias adoeceram mais 28 bezerras e, dessas, 14 morreram. Os bovinos acometidos nessa segunda visita tinham idades entre nove a 10 meses. O principal sinal clínico observado foi fotossensibilização. Das 14 bezerras mortas, realizou-se a necropsia de duas delas, e foi visualizado o segundo padrão de lesão hepática nesse surto (Padrão 2). Os fígados estavam com a superfície capsular lisa e esbranquiçada, e moderadamente diminuídos de tamanho. Ao corte observou-se leve irregularidade do parênquima e áreas mais claras intercaladas com áreas avermelhadas. O aspecto histológico incluía acentuada fibrose periportal, marcada proliferação de ductos biliares, megalocitose, áreas multifocais de necrose de hepatócitos, hemorragia e lesões veno-oclusivas. A atividade sérica da gamaglutamiltransferase foi avaliada em 15 bovinos afetados nessa segunda visita à propriedade. Desses, 13 bezerras testadas apresentaram alterações nos valores, que variaram de 26-175 U/L. Em uma terceira visita à propriedade, sete meses após o início do surto, mais 27 bezerras adoeceram em um período de 40 dias e, dessas, 23 morreram, sendo três submetidas à necropsia. Evidenciou-se o terceiro padrão de lesão hepática (Padrão 3). O fígado dos três bovinos estava diminuído de tamanho e acentuadamente firme. A superfície capsular era lisa e esbranquiçada, e a superfície de corte apresentava-se difusamente acastanhada. Lesões histológicas semelhantes ao segundo padrão foram também constatadas no fígado dessas três bezerras. Na quarta visita à propriedade, realizaram-se biópsias hepáticas nos 163 bovinos restantes do lote. Lesões hepáticas características da intoxicação estavam presentes em 103 dos 163 bovinos submetidos à biopsia hepática.
Poisoning of cattle by plants of the Senecio genus represents an important cause of death in cattle and has important economic repercussions in southern Brazil.Thus, in this thesis are included two scientific articles on the subject. At first work a bibliographic review was carried out on the disease. This review is intended to provide a detailed review of Senecio spp. intoxication in cattle and addresses issues regarding the toxic principle and pathogenesis of the disease caused by these plants and the epidemiology, clinical signs, diagnosis, control and prophylaxis of the disease. In the second article, the epidemiological, clinical and anatomopathological aspects of a spontaneous outbreak of Senecio brasiliensis in calves are described here. Characterization and evolution of liver lesions during the outbreak are also described. Two hundred and six 4-month-old female calves were weaned and placed in a 25-hectare pasture heavily infested by S. brasiliensis at of varying growth stages. The calves remained in this pasture for three months and were later transferred to another area where six calves aged 7-8- month-old developed clinical signs including unthriftiness, diarrhea, and subcutaneous dependent edema in the submandibular region. All these six affected calves died within 15 days from the onset of clinical signs and one of those was necropsied. Grossly the first of three patterns of hepatic lesions described in this report was observed and it was characterized by an enlarged liver, with round borders and an orange hue to the capsular and cut surfaces. Histologically there was marked diffuse vacuolar hepatocellular degeneration, bilestasis, hepatocellular megalocytosis, and mild bile duct proliferation and periportal fibrosis. Two months after the onset of the outbreak, in another visit to the farm, it was observed that an additional 28 calves got sick and 14 died. Affected calves observed in this second on-site visit were 9-10 month-old and their main clinical sign was photosensitization characterized by varying degrees of photophobia, tearing from the eyes, marked drooling, mucopurulent ocular discharge, increased nasal secretion, and ventral diphtheric glossitis. Two of the fourteen calves that died were necropsied and displayed the second pattern of hepatic lesions observed in the outbreak. Liver had smooth and whitish capsular surfaces and a moderate decrease in size. There was moderate irregularity to the cut surface of hepatic parenchyma and pale areas intercalated with red ones. Histologically there was marked periportal fibrosis, marked bile duct proliferation, hepatocellular megalocytosis, focal areas of hepatocellular necrosis, and hemorrhage and veno-occlusive changes. In this second on-site visit, gamma-glutamyltransferase serum activity was determined in 15 affected calves and 13 of them had increased values (26-175 U/L). Seven months after the onset of the outbreak, a third visit was made to the farm when was learned that and additional 27 calves have been affected, 23 of which died within a period of 40 days. At the necropsy of three of these calves the third pattern of hepatic lesions were observed. The liver was decreased in size and markedly firm. The capsular surface was smooth and whitish and the capsular surface.
Resumo
SIQUEIRA, A. de. Avaliação dos efeitos tóxicos dos carbamatos: I. Modelo experimental em ratos Wistar e comparação com a intoxicação exógena intencional em gatos e cães; II. Análise de estabilidade dos compostos e dos seus efeitos no post mortem imediato e em animais exumados. [Evaluation of the toxic effects of carbamates: I. Experimental model in Wistar rats and comparison with the intentional poisoning of cats and dogs; II. Analysis of the stability of the compounds and their effects in the immediate post mortem and in exhumed animals]. 2015. 101 f. Tese (Doutorado em Ciências) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, 2015. A intoxicação intencional de animais e de pessoas é uma ameaça à saúde e à segurança públicas em todo o mundo. No Brasil, os pesticidas da classe dos carbamatos aldicarbe e carbofurano são facilmente obtidos, e uma única dose letal daqueles é facilmente misturada a alimentos palatáveis e iscas. Foram analisadas as necropsias de 26 gatos e 10 cães, da rotina do Serviço de Patologia Animal da FMVZ-USP, com variados intervalos post mortem e tipos de conservação de carcaça, intoxicados pelos carbamatos aldicarbe e carbofurano, confirmados pela cromatografia de camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta performance com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD). Foram colhidas as matrizes biológicas para histopatologia e análise toxicológica. CLAE-DAD foi utilizada para detectar o aldicarbe e seus metabólitos, aldicarbe sulfóxido e aldicarbe sulfona, e carbofurano e seu metabólito 3-hidroxicarbofurano. As análises macroscópica e histopatológica revelaram predominantemente achados congestivos e hemorrágicos, o que pode ser resultante dos efeitos tóxicos dos carbamatos e seus metabólitos. Foram feitos 2 experimentos envolvendo exposição a uma dose única de carbofurano e de aldicarbe via gavagem em ratos Wistar. No primeiro, no qual foram avaliados os efeitos no post mortem imediato, 30 animais forma separados nos seguintes grupos: aldicarbe (n=10), carbofurano (n=10) e grupo controle (n=10). Os animais foram filmados para avaliar as alterações clínicas na intoxicação aguda e, quando foram sedados, foi colhido sangue por punção cardíaca para fazer o hemograma, bioquímica sérica, colinesterase e exame toxicológico e, após a eutanásia, foi feita a necropsia e colhido material para o exame histopatológico. Em todos os animais experimentais foi possível ser feita a detecção e a quantificação do aldicarbe e do carbofurano, além das alterações microscópicas congestivas e hemorrágicas, com alterações em parâmetros hematológicos e bioquímicos. No segundo experimento, foram utilizados 30 animais, e o protocolo experimental foi idêntico ao experimento anterior, exceto que, após o óbito, os animais foram colocados em uma caixa com terra nos seguintes grupos: 1 dia, 3 dias, 5 dias, 7 dias e 10 dias, e em cada dia foram agrupados 2 animais intoxicados e 1 controle, sendo que as necropsias foram feitas nestes intervalos. Foram colhidos cérebro, pulmão, fígado e rim ao exame histopatológico e globo ocular, conteúdo gástrico, fígado e músculo esquelético ao exame toxicológico. Foram observadas as alterações tanatológicas e, em todas as matrizes analisadas, puderam ser quantificados o aldicarbe e/ou seus metabólitos aldicarbe sulfóxido e aldicarbe sulfona, bem como o carbofurano e seu metabólito 3-hidroxicarbofurano. Estes estudos mostram a importância da necropsia e da coleta de matrizes diversas ao exame toxicológico, que são complementares e cruciais na investigação de óbitos decorrentes de intoxicações por praguicidas, tanto no post mortem imediato quanto em exumações.
SIQUEIRA, A. de. Evaluation of the toxic effects of carbamates: I. Experimental model in Wistar rats and comparison with the intentional poisoning of cats and dogs; II. Analysis of the stability of the compounds and their effects in the immediate post mortem and in exhumed animals. [Avaliação dos efeitos tóxicos dos carbamatos: I. Modelo experimental em ratos Wistar e comparação com a intoxicação exógena intencional em gatos e cães; II. Análise de estabilidade dos compostos e dos seus efeitos no post mortem imediato e em animais exumados]. 2015. 101 f. Tese. (Doutorado em Ciências) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, 2015. The intentional poisoning of animals and people is a threat to public health and safety worldwide. In Brazil, the carbamate pesticides aldicarb and carbofuran are easily obtained. A single lethal dose of these carbamates is easily mixed with palatable food or baits. Necropsies and histopathological examinations of 26 cats and 10 dogs poisoned by the carbamates aldicarb and carbofuran were performed in the Service of Animal Pathology of FMVZ-USP, and the poisoning was confirmed by thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography with diode-array detector (HPLC-DAD), with variable post mortem interval and conservation of the carcass. Biological matrices were collected for histopathological and toxicological analysis. HPLC-DAD was utilised to detect aldicarb and its metabolites, aldicarb sulphoxide and aldicarb sulphone, and carbofuran and its metabolite 3-hydroxycarbofuran. Gross and histopathological evaluations showed mainly congestive and haemorrhagic findings, which may result from the toxic effects of the carbamates and their metabolites. Two experimental protocols were performed in Wistar rats by exposing them to a single oral gavage dose to the carbamates aldicarb and carbofuran. The first experiment was performed to evaluate the immediate post mortem effects of carbamates, and 30 rats were divided into three groups: aldicarb (n-=10), carbofuran (n=10) and control (n=10). The animals were filmed to evaluate the clinical signs of poisoning, and they were sedated to collect blood by heart puncture, to perform CBC, serum biochemistry, and to measure serum cholinesterase. After euthanasia, tissues were collected for histopathological evaluation. Aldicarb and carbofuran were detected and quantified in the blood of all experimental groups, and the most common histological changes observed were congestion and haemorrhage. In the second experiment, the experimental protocol was identical to the first one, but the animals were buried in a plastic box with garden soil within 5 groups of 3 animals, two exposed to the same pesticide and 1 control, as follows: day 1, day 3, day 5, day 7 and day 10. The exhumations were performed within these days (1, 3, 5, 7 and 10). We collected brain, lung, liver and kidney to examine the thanatological changes, and the eyeballs, gastric content, liver and skeletal muscle to perform the toxicological screening. Thanatological changes could be observed within and between the groups, and, in all the matrices we could detect aldicarb and its metabolites aldicarb sulphoxide and aldicarb sulphone, and carbofuran and its metabolite 3-hydroxycarbofuran. The studies have shown the importance of the necropsy and the collection of diverse matrices to the toxicological screening, because both are complementary and crucial to the investigation of deaths by pesticides poisoning, even in exhumation, since we could evaluate the thanatological changes and correlate them to the action of the pesticides in the tissues.