Morphology and immunolocalization of intertubular steroidogenic cell in mesonephros of Podocnemis expansa during gonadal differentiation

Sex steroid hormones are critical in gonadal differentiation in turtles. The gonads are not the only organs responsible for producing these hormones during this phase. Mesonephros play an important role in steroidogenesis. The present study aimed to investigate the presence of steroidogenic cells in mesonephros of Podocnemis expansa during gonadal differentiation and to evaluate their morphology and ultrastructure. Ten embryos of P. expansa were collected from 5 nests on day 36 of incubation, during spawning period on an artificial beach. Embryos were extracted from eggs by slicing the shell and euthanized. They were dissected under a stereoscopic microscope to collect the gonad-mesonephro complex, in which were fixed and subsequently processed for light microscopy, immunohistochemistry and transmission electron microscopy analysis. During histological analysis was observed mesonephros has typical morphological structure. Immunohistochemistry showed immunoreaction to aromatase in cells of intertubular space. Confirming these findings, it was possible to observe a type of intertubular cell in several regions of mesonephro, being more predominant in region close to blood vessels, distal and proximal tubules. In ultrastructural analysis these cells were characterized by having a clear, large, and rounded nucleus with evident nucleolus and cytoplasm rich in electron-dense droplets. This study demonstrated for the first time the presence of cells with morphological, immunohistochemical and ultrastructural characteristics similar to steroid-producing cells in P. expansa mesonephrons, suggesting that this organ may contribute to gonadal differentiation in this species.(AU)

Insecticidal activities and mechanism of extracts from neem leaves against Oxya chinensis / Atividade e mecanismos inseticidas de extratos de folhas "neem" contra Oxya chinesis

In this study, neem leaves were successively extracted with petroleum ether, 95% ethanol and water and the insecticidal activities of these extracts against Oxya chinensis larvae were measured. The results showed that 95% ethanol extract gave the highest extraction yield and insecticidal activity, and it was further extracted with five different solvents. The petroleum ether extract from the 95% ethanol extract possessed the highest insecticidal activity with median lethal concentration values ranging from 14.93 to 55.66mg/mL. The gas chromatography-mass spectrometer analysis showed that the petroleum ether extract mainly composed of alkanes, olefin, esters and amide. The pathological examination revealed that the prominent lesions, including reduced regenerative cells in midgut and swelled and degenerated cylindrical cells, were observed in the 5th instar Oxya chinensis after treatment. The ultrastructural features showed that the cylindrical cells, microvilli and mitochondria were seriously damaged. These results suggested that the petroleum ether extract from neem leaves had potent insecticidal activity and could be a candidate insecticide.(AU)

Nesse estudo, folhas "neem" foram extraídas com sucesso com éter de petróleo, 95% de etanol e água, e as atividades inseticidas desses extratos foram medidas contra larvas de Oxya chinesis. Os resultados mostram que extrato com 95% de etanol deram o maior resultado de extração e atividade inseticida e foi então extraído utilizando mais cinco diferentes solventes. O éter de petróleo do extrato de 95% etanol apresentou maior atividade inseticida com concentração letal média variando de 14.93 a 55.66mg/mL. A análise por cromatografia de massa mostrou que o extrato de éter de petróleo está composto principalmente de alcanos, alcenos, ésteres e amidas. A avaliação patológica revelou que as lesões proeminentes, inclusive células regenerativas reduzidas no intestino e células cilíndricas edemaciadas e degeneradas foram observadas no quinto estágio de desenvolvimento da Oxya chinesis após tratamento. As características ultraestruturais mostraram que as células cilíndricas, microvilos e mitocôndrias apresentavam lesões graves. Esses resultados sugerem que o extrato de éter de petróleo de folhas de "neem" tem atividade inseticida potente e pode ser um candidato a inseticida.(AU)

Insecticidal activities and mechanism of extracts from neem leaves against Oxya chinensis / Atividade e mecanismos inseticidas de extratos de folhas "neem" contra Oxya chinesis

In this study, neem leaves were successively extracted with petroleum ether, 95% ethanol and water and the insecticidal activities of these extracts against Oxya chinensis larvae were measured. The results showed that 95% ethanol extract gave the highest extraction yield and insecticidal activity, and it was further extracted with five different solvents. The petroleum ether extract from the 95% ethanol extract possessed the highest insecticidal activity with median lethal concentration values ranging from 14.93 to 55.66mg/mL. The gas chromatography-mass spectrometer analysis showed that the petroleum ether extract mainly composed of alkanes, olefin, esters and amide. The pathological examination revealed that the prominent lesions, including reduced regenerative cells in midgut and swelled and degenerated cylindrical cells, were observed in the 5th instar Oxya chinensis after treatment. The ultrastructural features showed that the cylindrical cells, microvilli and mitochondria were seriously damaged. These results suggested that the petroleum ether extract from neem leaves had potent insecticidal activity and could be a candidate insecticide.(AU)

Nesse estudo, folhas "neem" foram extraídas com sucesso com éter de petróleo, 95% de etanol e água, e as atividades inseticidas desses extratos foram medidas contra larvas de Oxya chinesis. Os resultados mostram que extrato com 95% de etanol deram o maior resultado de extração e atividade inseticida e foi então extraído utilizando mais cinco diferentes solventes. O éter de petróleo do extrato de 95% etanol apresentou maior atividade inseticida com concentração letal média variando de 14.93 a 55.66mg/mL. A análise por cromatografia de massa mostrou que o extrato de éter de petróleo está composto principalmente de alcanos, alcenos, ésteres e amidas. A avaliação patológica revelou que as lesões proeminentes, inclusive células regenerativas reduzidas no intestino e células cilíndricas edemaciadas e degeneradas foram observadas no quinto estágio de desenvolvimento da Oxya chinesis após tratamento. As características ultraestruturais mostraram que as células cilíndricas, microvilos e mitocôndrias apresentavam lesões graves. Esses resultados sugerem que o extrato de éter de petróleo de folhas de "neem" tem atividade inseticida potente e pode ser um candidato a inseticida.(AU)

Anthelmintic activity of Eucalyptus citriodora essential oil and its major component, citronellal, on sheep gastrointestinal nematodes / Atividade anti-helmíntica do óleo essencial de Eucalyptus citriodora e seu componente majoritário, citronelal, sobre nematoides gastrintestinais de ovinos

This study aimed to evaluate the anthelmintic activity of Eucalyptus citriodora essential oil and citronellal on sheep gastrointestinal nematodes. Essential oil composition was determined by gas chromatography mass spectrometry. The substances were evaluated in vitro using adult worm motility test (AWMT) and transmission electron microscopy (TEM). The acute toxicity test in mice and the fecal egg count reduction test (FECRT) in sheep were performed. Citronellal was confirmed as the essential oil major constituent (63.9%). According to the AWMT, 2 mg/mL of essential oil and citronellal completely inhibited Haemonchus contortus motility at 6 h post exposure. H. contortus exposed to essential oil and citronellal exhibited internal ultrastructural modifications. The lethal dose 50 values in mice were 5,000 and 2,609 mg/kg for essential oil and citronellal, respectively. E. citriodora essential oil reduced sheep epg at 14 days post treatment by 69.5% (P 0.05). No significant differences were observed in epg between the citronellal and negative control groups (P>0.05). The interaction between citronellal and other constituents in the essential oil may be relevant for its in vivo anthelmintic activity. Thus, E. citriodora essential oil and citronellal pharmacokinetic studies may help elucidate the anthelmintic activity of these compounds.(AU)

Este trabalho objetivou avaliar a atividade anti-helmíntica do óleo essencial de Eucalyptus citriodora e citronelal sobre nematoides gastrintestinais de ovinos. A composição do óleo essencial foi determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. As substâncias foram avaliadas in vitro utilizando-se teste de motilidade de vermes adultos (AWMT) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Teste de toxicidade aguda em camundongos e teste de redução da contagem de ovos fecais (FECRT) em ovinos foram realizados. Citronelal foi confirmado como componente majoritário do óleo essencial (63,9%). No AWMT, 2 mg/mL de óleo essencial e citronelal inibiram completamente a motilidade de H. contortus 6 h pós-exposição. H. contortus expostos ao óleo essencial e citronelal exibiram modificações ultraestruturais internas. Os valores da dose letal 50 em camundongos foram 5.000 e 2.609 mg/kg para óleo essencial e citronelal, respectivamente. Óleo essencial de E. citriodora reduziu opg de ovinos 14 dias pós-tratamento em 69,5% (P 0,05). Não houve diferença significativa de opg entre grupo controle negativo e citronelal (P>0,05). A interação entre citronelal e outros constituintes do óleo essencial pode ser relevante na atividade anti-helmíntica in vivo. Portanto, avaliação farmacocinética do óleo essencial de E. citriodora e citronelal pode auxiliar a elucidar a atividade anti-helmíntica desses compostos.(AU)

Effect of somatotropin and thyroxine on the in vitro development of bovine preantral follicles / Efeito da somatotropina e tiroxina no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais bovinos

The aim of the study was to evaluate the effect of recombinant bovine somatotropin (rbST) and thyroxine (T4) on survival and growth of bovine preantral ovarian follicles (PAOF) cultured in vitro. Ovarian fragments were collected in local abattoirs and immediately fixed for classical histology and transmission electron microscopy (non-cultured control). The other fragments were then cultured in situ for seven days in minimum essential medium alone (MEM+ - cultured control) or in the presence of 1,000 ng/mL rbST and 20 ng/mL T4, isolated or associated. After seven days, there was a reduction (P0.01) of the medium used on the follicular diameter of the PAOF cultured for seven days. Ultrastructural analysis showed cell damage. In conclusion, the presence of rbST maintains the rate of morphologically normal follicles during the culture for seven days (observed by optical microscopy), but it does not exert beneficial effects on its ultrastructural integrity and oocyte and follicular growth.

O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da somatotropina recombinante bovina (rbST) e da tiroxina (T4) sobre a sobrevivência e o crescimento de folículos ovarianos pré-antrais (FOPA) bovinos cultivados in vitro. Fragmentos ovarianos foram coletados em abatedouros locais e imediatamente fixados para histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão (controle não cultivado). Os demais fragmentos foram cultivados in situ por sete dias em meio essencial mínimo sozinho (MEM+ - controle cultivado), ou na presença de 1.000 ng/mL de rbST e 20 ng/mL de T4, isoladamente ou em associação. Após sete dias, houve redução (P0,01) do meio utilizado, no diâmetro folicular, dos FOPA cultivados por sete dias. A análise ultraestrutural demonstrou danos celulares. Conclui-se que, apesar da presença da rbST manter a taxa de folículos morfologicamente normais durante o cultivo por sete dias (observado por microscopia óptica), o uso de rbST e T4 em meio de cultivo in vitro de FOPA, nas concentrações utilizadas no presente experimento, não exerce efeitos benéficos quanto à integridade ultraestrutural e aos crescimentos oocitário e folicular.

Effect of somatotropin and thyroxine on the in vitro development of bovine preantral follicles / Efeito da somatotropina e tiroxina no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais bovinos

The aim of the study was to evaluate the effect of recombinant bovine somatotropin (rbST) and thyroxine (T4) on survival and growth of bovine preantral ovarian follicles (PAOF) cultured in vitro. Ovarian fragments were collected in local abattoirs and immediately fixed for classical histology and transmission electron microscopy (non-cultured control). The other fragments were then cultured in situ for seven days in minimum essential medium alone (MEM+ - cultured control) or in the presence of 1,000 ng/mL rbST and 20 ng/mL T4, isolated or associated. After seven days, there was a reduction (P<0.05) in the percentage of normal follicles in MEM+ alone or with T4. In oocyte diameter, there was a reduction in MEM+ alone. There was no influence (P>0.01) of the medium used on the follicular diameter of the PAOF cultured for seven days. Ultrastructural analysis showed cell damage. In conclusion, the presence of rbST maintains the rate of morphologically normal follicles during the culture for seven days (observed by optical microscopy), but it does not exert beneficial effects on its ultrastructural integrity and oocyte and follicular growth.(AU)

O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da somatotropina recombinante bovina (rbST) e da tiroxina (T4) sobre a sobrevivência e o crescimento de folículos ovarianos pré-antrais (FOPA) bovinos cultivados in vitro. Fragmentos ovarianos foram coletados em abatedouros locais e imediatamente fixados para histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão (controle não cultivado). Os demais fragmentos foram cultivados in situ por sete dias em meio essencial mínimo sozinho (MEM+ - controle cultivado), ou na presença de 1.000 ng/mL de rbST e 20 ng/mL de T4, isoladamente ou em associação. Após sete dias, houve redução (P<0,05) na percentagem de folículos normais no MEM+ sozinho ou quando adicionado T4. No diâmetro oocitário, houve redução no MEM+ sozinho. Não houve influência (P>0,01) do meio utilizado, no diâmetro folicular, dos FOPA cultivados por sete dias. A análise ultraestrutural demonstrou danos celulares. Conclui-se que, apesar da presença da rbST manter a taxa de folículos morfologicamente normais durante o cultivo por sete dias (observado por microscopia óptica), o uso de rbST e T4 em meio de cultivo in vitro de FOPA, nas concentrações utilizadas no presente experimento, não exerce efeitos benéficos quanto à integridade ultraestrutural e aos crescimentos oocitário e folicular.(AU)

Morphological and immunohistochemical analysis of proteins CASPASE 3 and XIAP in rats subjected to cerebral ischemia and chronic alcoholism

Purpose: To evaluate histopathological and ultrastructural changes and expression of proteins related to apoptosis CASPASE 3 and XIAP after experimental induction of temporary focal cerebral ischemia (90 minutes) due to obstruction of the middle cerebral artery in alcoholism model. Methods: Forty adult Wistar rats were used, subdivided into 5 experimental groups: control group (C); Sham group (S); Ischemic group (I); Alcoholic group (A); and Ischemic and Alcoholized group (I+A): animals submitted to the same treatment of group A and after four weeks were submitted to focal cerebral ischemia during 90 minutes, followed by reperfusion of 48 hours. Were processed for histopathological analysis and immunohistochemistry (for the protein expression of CASPASE -3 and XIAP). Results: Greater histopathological changes were observed in the animals of groups I and I+A in the three areas analyzed. The neuronal loss was higher in the medial striatum region of the animals of groups I and I + A. The protein expression of CASPASE -3 was higher than that of XIAP in the groups I and I + A for both proteins. Conclusion: The expression of XIAP was slightly higher where the histopathological changes and expression of CASPASE -3 was less evident.(AU)

Ultrastructural analysis and residual DNA evaluation of rabbit vein scaffold

Purpose: To investigate the ultrastructural characteristics and analysis of residual DNA in scaffold models, produced with decellularized vena cava in an experimental model with rabbits. Methods: Three groups were created for ultrastructural and residual DNA analysis: group 1 - control, consisting of samples of vena cava in natura; group 2 - SD, consisting of vein fragments submitted to 2% sodium deoxycholate decellularization by shaking (160rpm - Shaker News Brunswick Scientific®) for 1 hour at controlled temperature shaker at 37°C; group 3 - SDS, consisting of vein fragments submitted to 1% sodium dodecyl sulfate decellularization under the same previous condition, for 2 hours. Results: The ultrastructural matrix of the blood vessel maintained its vintegrity after either decellularization models. The results of the two quantification methods demonstrated a significant decrease in the DNA content of the decellularized vena cava samples as compared to the control samples and, differed statistically from each other, p 0.05. Conclusion: The 2% DS protocol for vein decellularization, in this experimental model, was considered the best protocol because it presented less amount of residual DNA without causing substantial destruction of the extracellular matrix.(AU)

Degenerative axonopathy associated with copper deficiency in pigs / Axonopatia degenerativa associada com deficiência de cobre em suínos

The epidemiological, clinic and morphological (pathological and ultrastructural) aspects of four outbreaks of copper deficiency affecting 21- to 90-day-old pigs in the Northeast region of Brazil are reported. Clinical signs began with paraparesis and ataxia and progressed to flaccid or spastic paralysis of the pelvic and thoracic limbs, followed by sternal and/or lateral recumbence. In addition, some animals showed dog-sitting position and intention tremors. The clinical manifestation period was 5-20 days. Significant gross lesions were not observed; however, microscopically, symmetrical degeneration of the white matter with ballooned myelin sheaths containing occasional macrophages was observed, mainly in the spinal cord. Two pigs presented with necrosis ad loss of Purkinje cells and ectopic Purkinje cells in the granular layer and cerebellar white matter. A ultrastructural analysis showed different degrees of damage of myelinated axons in the spinal segments, including an absence of the axoplasm structures with only axonal residues remaining. The myelin sheaths were degenerated and often collapsed into the space previously occupied by the axon. These results suggest that myelin degeneration is secondary to the axonal lesion. Finally, the concentration of copper in the liver was determined using atomic absorption spectrophotometry and was found to be low (ranging from 2.2 to 10.8 ppm). In conclusion, in the Brazilian semiarid region, Cu deficiency occurs in 21 to 90-day-old pigs that ingested different types of waste in their food.(AU)

São relatados os achados epidemiológicos, clínicos e morfológicos (patológicos e ultraestruturais) de quatro surtos de deficiência de cobre em suínos afetados entre 21 e 90 dias de idade na região Nordeste do Brasil. Os sinais clínicos iniciaram com paraparesia e ataxia, que progrediu a paralisia flácida ou espástica dos membros pélvicos e torácicos, seguido de decúbito esternal e/ou lateral. Além disso, alguns animais apresentaram posição de cão sentado e tremores de intenção. O período de manifestação clínica variou de 5-20 dias. Não foram observadas lesões macroscópicas significativas; no entanto, microscopicamente, foi observada degeneração simétrica da substância branca com fragmentação das bainhas de mielina, contendo ocasionais macrófagos, principalmente na medula espinal. Dois suínos apresentaram necrose e perda de células de Purkinje e células de Purkinje ectópicos na camada granular da substância branca cerebelar. A análise ultraestrutural mostrou diferentes graus de lesões em axônios mielinizados em segmentos da medula espinhal, incluindo o desaparecimento de estruturas do axoplasma, restando apenas restos axonais. A bainha de mielina encontrava-se degenerada e muitas vezes, colapsada dentro do espaço previamente ocupado pelo axônio. Esses resultados sugerem que a degeneração da mielina é secundária à lesão axonal. Finalmente, a concentração do cobre no fígado foi determinada usando espectrometria de absorção atômica e revelou baixos valores (variando de 2,2-10,8ppm). Conclui-se que na região semiárida do Brasil ocorre deficiência de cobre em suínos de 21 a 90 dias de idade alimentados com diferentes tipos de resíduos.(AU)

Degenerative axonopathy associated with copper deficiency in pigs / Axonopatia degenerativa associada com deficiência de cobre em suínos

The epidemiological, clinic and morphological (pathological and ultrastructural) aspects of four outbreaks of copper deficiency affecting 21- to 90-day-old pigs in the Northeast region of Brazil are reported. Clinical signs began with paraparesis and ataxia and progressed to flaccid or spastic paralysis of the pelvic and thoracic limbs, followed by sternal and/or lateral recumbence. In addition, some animals showed dog-sitting position and intention tremors. The clinical manifestation period was 5-20 days. Significant gross lesions were not observed; however, microscopically, symmetrical degeneration of the white matter with ballooned myelin sheaths containing occasional macrophages was observed, mainly in the spinal cord. Two pigs presented with necrosis ad loss of Purkinje cells and ectopic Purkinje cells in the granular layer and cerebellar white matter. A ultrastructural analysis showed different degrees of damage of myelinated axons in the spinal segments, including an absence of the axoplasm structures with only axonal residues remaining. The myelin sheaths were degenerated and often collapsed into the space previously occupied by the axon. These results suggest that myelin degeneration is secondary to the axonal lesion. Finally, the concentration of copper in the liver was determined using atomic absorption spectrophotometry and was found to be low (ranging from 2.2 to 10.8 ppm). In conclusion, in the Brazilian semiarid region, Cu deficiency occurs in 21 to 90-day-old pigs that ingested different types of waste in their food.(AU)

São relatados os achados epidemiológicos, clínicos e morfológicos (patológicos e ultraestruturais) de quatro surtos de deficiência de cobre em suínos afetados entre 21 e 90 dias de idade na região Nordeste do Brasil. Os sinais clínicos iniciaram com paraparesia e ataxia, que progrediu a paralisia flácida ou espástica dos membros pélvicos e torácicos, seguido de decúbito esternal e/ou lateral. Além disso, alguns animais apresentaram posição de cão sentado e tremores de intenção. O período de manifestação clínica variou de 5-20 dias. Não foram observadas lesões macroscópicas significativas; no entanto, microscopicamente, foi observada degeneração simétrica da substância branca com fragmentação das bainhas de mielina, contendo ocasionais macrófagos, principalmente na medula espinal. Dois suínos apresentaram necrose e perda de células de Purkinje e células de Purkinje ectópicos na camada granular da substância branca cerebelar. A análise ultraestrutural mostrou diferentes graus de lesões em axônios mielinizados em segmentos da medula espinhal, incluindo o desaparecimento de estruturas do axoplasma, restando apenas restos axonais. A bainha de mielina encontrava-se degenerada e muitas vezes, colapsada dentro do espaço previamente ocupado pelo axônio. Esses resultados sugerem que a degeneração da mielina é secundária à lesão axonal. Finalmente, a concentração do cobre no fígado foi determinada usando espectrometria de absorção atômica e revelou baixos valores (variando de 2,2-10,8ppm). Conclui-se que na região semiárida do Brasil ocorre deficiência de cobre em suínos de 21 a 90 dias de idade alimentados com diferentes tipos de resíduos.(AU)

Identification of ultrastructural and functional damages in sperm from six-banded armadillos (Euphractus sexcinctus) due to cryopreservation / Identificação de danos ultraestruturais e funcionais em espermatozoides de tatus-peba (Euphractus sexcinctus) oriundos da criopreservação

The aim of the study was to cryopreserve the semen of six-banded armadillos (Euphractus sexcinctus) in Tris-yolk and glycerol diluent, and to determine the damage caused by the freezing-thawing process, using fluorescent markers and ultrastructural analysis. Semen samples (n=11) collected from 4 adult six-banded armadillos by electroejaculation were cryopreserved in Tris diluent plus 20% egg yolk and 3% glycerol, in a fast freezing curve. Classical analysis of samples was performed after dilution, refrigeration and thawing, followed by fluorescence analysis, using a combination of fluorescent probes to assess membrane integrity (propidium iodide - PI and Hoechst - H342), and mitochondrial activity (CMXRos - Mito Tracker Red®). We also used the ultrastructural analysis to verify possible morphological alterations caused by cryoinjuries. When compared with fresh samples, we verified a significant decline in all the armadillos' semen parameters after thawing, in which only 6.1% motile sperm were found. However, the percentage of sperm which remained with viable (13%) and functional (24.7%) membranes after thawing suggests that some cells could be live but immotile. Analysis using fluorescent markers revealed that the mitochondria of armadillos' sperm is highly sensible to the freezing protocol and the findings through ultrastructure analysis proved this statement. Additionally, the images obtained by transmission electron microscopy revealed that frozen-thawed sperm presented damaged plasma membrane, nuclear modifications as changes in chromatin and acrossomal changes relative to sperm capacitation. In conclusion, this study is the first attempt to cryopreserve the semen of an armadillo species, and to help us to identify critical points on the freezing-thawing procedure in order to improve the protocol.(AU)

O objetivo deste estudo foi criopreservar o sêmen de tatus-peba (Euphractus sexcinctus) em diluente Tris-gema e glicerol, e determinar os danos causados pelo processo de congelação-descongelação, utilizando marcadores fluorescentes e análise ultraestrutural. As amostras de sêmen (n=11) coletadas de 4 tatus-peba adultos por eletroejaculação foram criopreservadas em diluente Tris acrescido de 20% de gema de ovo e 3% de glicerol, em curva rápida de congelação. A análise clássica das amostras foi realizada após a diluição, refrigeração e descongelação, seguida por análise de fluorescência, utilizando uma combinação de sondas fluorescentes para avaliar a integridade da membrana (Iodeto de Propídio - PI e Hoechst - H342), e a atividade mitocondrial (CMXRos - Mito Tracker RED®). Foi também utilizada a análise ultraestrutural para verificar possíveis alterações morfológicas causadas pela crioinjúria. Quando comparadas com as amostras a fresco, verificou-se uma queda significativa em todos os parâmetros seminais dos tatus após a descongelação, em que apenas 6,1% de espermatozoides móveis foram encontrados. No entanto, o percentual de espermatozoides que permaneceu com membrana viável (13%) e funcional (24,7%) após a descongelação sugere que algumas células podem estar vivas, mas imóveis. Análises utilizando marcadores fluorescentes revelaram que as mitocôndrias dos espermatozoides de tatus são altamente sensíveis ao protocolo de congelação e os achados através da análise ultraestrutural comprovaram esta afirmação. Além disso, as imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão revelaram que espermatozoides congelados-descongelados apresentaram membranas plasmáticas danificadas, modificações nucleares como alterações na cromatina, e alterações acrossomais relativas à capacitação espermática. Em conclusão, este estudo é a primeira tentativa de criopreservação de sêmen em uma espécie de tatu, e nos auxiliou a identificar pontos críticos no processo de congelação-descongelação, a fim de melhorar o protocolo.(AU)

Identification of ultrastructural and functional damages in sperm from six-banded armadillos (Euphractus sexcinctus) due to cryopreservation / Identificação de danos ultraestruturais e funcionais em espermatozoides de tatus-peba (Euphractus sexcinctus) oriundos da criopreservação

The aim of the study was to cryopreserve the semen of six-banded armadillos (Euphractus sexcinctus) in Tris-yolk and glycerol diluent, and to determine the damage caused by the freezing-thawing process, using fluorescent markers and ultrastructural analysis. Semen samples (n=11) collected from 4 adult six-banded armadillos by electroejaculation were cryopreserved in Tris diluent plus 20% egg yolk and 3% glycerol, in a fast freezing curve. Classical analysis of samples was performed after dilution, refrigeration and thawing, followed by fluorescence analysis, using a combination of fluorescent probes to assess membrane integrity (propidium iodide - PI and Hoechst - H342), and mitochondrial activity (CMXRos - Mito Tracker Red®). We also used the ultrastructural analysis to verify possible morphological alterations caused by cryoinjuries. When compared with fresh samples, we verified a significant decline in all the armadillos' semen parameters after thawing, in which only 6.1% motile sperm were found. However, the percentage of sperm which remained with viable (13%) and functional (24.7%) membranes after thawing suggests that some cells could be live but immotile. Analysis using fluorescent markers revealed that the mitochondria of armadillos' sperm is highly sensible to the freezing protocol and the findings through ultrastructure analysis proved this statement. Additionally, the images obtained by transmission electron microscopy revealed that frozen-thawed sperm presented damaged plasma membrane, nuclear modifications as changes in chromatin and acrossomal changes relative to sperm capacitation. In conclusion, this study is the first attempt to cryopreserve the semen of an armadillo species, and to help us to identify critical points on the freezing-thawing procedure in order to improve the protocol.(AU)

O objetivo deste estudo foi criopreservar o sêmen de tatus-peba (Euphractus sexcinctus) em diluente Tris-gema e glicerol, e determinar os danos causados pelo processo de congelação-descongelação, utilizando marcadores fluorescentes e análise ultraestrutural. As amostras de sêmen (n=11) coletadas de 4 tatus-peba adultos por eletroejaculação foram criopreservadas em diluente Tris acrescido de 20% de gema de ovo e 3% de glicerol, em curva rápida de congelação. A análise clássica das amostras foi realizada após a diluição, refrigeração e descongelação, seguida por análise de fluorescência, utilizando uma combinação de sondas fluorescentes para avaliar a integridade da membrana (Iodeto de Propídio - PI e Hoechst - H342), e a atividade mitocondrial (CMXRos - Mito Tracker RED®). Foi também utilizada a análise ultraestrutural para verificar possíveis alterações morfológicas causadas pela crioinjúria. Quando comparadas com as amostras a fresco, verificou-se uma queda significativa em todos os parâmetros seminais dos tatus após a descongelação, em que apenas 6,1% de espermatozoides móveis foram encontrados. No entanto, o percentual de espermatozoides que permaneceu com membrana viável (13%) e funcional (24,7%) após a descongelação sugere que algumas células podem estar vivas, mas imóveis. Análises utilizando marcadores fluorescentes revelaram que as mitocôndrias dos espermatozoides de tatus são altamente sensíveis ao protocolo de congelação e os achados através da análise ultraestrutural comprovaram esta afirmação.[...] (AU)

Ecophysiological, anatomical and ultrastructural characteristics of Vitex polygama Cham. (Verbenaceae) submitted to different concentrations of fluoride / Características ecofisiológicas, anatômicas e ultraestruturais de Vitex polygama Cham. (Verbenaceae) submetida a diferentes concentrações de flúor

Fluorides released during the manufacture of aluminum, fertilizers, glass and ceramics are considered to be highly toxic to plants, causing damages in relatively small concentrations. This study aimed to evaluate fluoride (F) accumulation and its effects on Vitex polygama Cham. (Verbenaceae) exposed to simulated rain containing potassium fluoride in concentrations of 5, 10, 15 and 20 mg L-1. Vitex polygama presented no visual symptoms of foliar injury and accumulated a relatively small amount of F-, significant only for the treatments with higher concentrations of the pollutant. F- promoted an increase in nonphotochemical quenching (qN) and in the coefficient due to non-photochemical extinction (NPQ), which indicates higher dissipation of radiant energy in the heat form. Damages in the chloroplast structure, in cellular membranes and in epicuticular waxes, besides cytoplasm granulation and irregularities in the epidermal cell walls were also detected in plants exposed to the pollutant. The results show a considerable resistance of Vitex polygama to F and reinforce the prognostic value of physiological, anatomical and ultrastructural analysis in the detection of damages caused by the pollutant in the leaf structure of this species.(AU)

Fluoretos, liberados durante a manufatura de alumínio, fertilizantes, vidro e cerâmica, são considerados altamente tóxicos para as plantas, causando danos em concentrações relativamente pequenas. Este estudo teve como finalidade avaliar o acúmulo de flúor (F) e seus efeitos sobre Vitex polygama Cham. (Verbenaceae) em plantas expostas a chuva simulada contendo fluoreto de potássio em concentrações de 5, 10, 15 e 20 mg L-1. Vitex polygama não apresentou sintomas visíveis de injúria foliar e acumulou uma quantidade relativamente pequena de F-, significativa apenas para os tratamentos com maiores concentrações do poluente. O F- promoveu aumentos no coeficiente devido à extinção não fotoquímica (qN) e no coeficiente devido à extinção não fotoquímica (NPQ), que indicam maior dissipação de energia radiante na forma de calor. Danos na estrutura dos cloroplastos, em membranas celulares e nas ceras epicuticulares, além de granulação do citoplasma e irregularidades na parede celular de células epidérmicas, foram também detectados em plantas expostas ao poluente. Os resultados demonstram uma considerável resistência de Vitex polygama ao F e reforçam o valor prognóstico de análises fisiológicas, anatômicas e ultraestruturais na detecção de danos causados pelo poluente na estrutura foliar dessa espécie.(AU)

Experimental acrylonitrile butadiene styrene and polyamide evisceration implant: a rabbit clinical and histopathology study / Estudo clínico e histopatológico em coelhos eviscerados com utilização de implantes de poliamida e acrilonitrila butadieno estireno

The purpose of this study was to evaluate acrylonitrile butadiene styrene (ABS) and polyamide implants in rabbits submitted to evisceration at the macroscopic and microstructure level and to assess clinical response and histopathological changes as well. For the experimental study implants of 12mm diameter were prepared by rapid prototyping, weighed and the outer and inner surfaces evaluated macroscopically and by electron microscopy. In addition, a compression test was performed and ultrastructural damage was then determined. After evisceration of the left eyeball, nine New Zealand rabbits received ABS implants and nine others received polyamide implants. The animals were assessed daily for 15 days after surgery and every seven days until the end of the study (90 days). Histopathological evaluation was performed at 15, 45 and 90 days after surgery. The ABS implants weighed approximately 0.44g, while the polyamide ones weighed 0.61g. Scanning electron microscopy demonstrated that the ABS implants had regular-sized, equidistant micropores, while the polyamide ones showed micropores of various sizes. The force required to fracture the ABS implant was 14.39 ±0.60 Mpa, while for the polyamide one, it was 16.80 ±1.05 Mpa. Fifteen days after surgery, we observed centripetal tissue infiltration and scarce inflammatory infiltrate. Implants may be used in the filling of anophthalmic cavities, because they are inert, biocompatible and allow tissue integration.(AU)

Avaliou-se a macroscopia, a microestrutura, a resposta clínica e histopatológica de implantes de acrilonitrila butadieno estireno (ABS) e poliamida em coelhos submetidos à evisceração. Para o estudo experimental, os implantes foram elaborados por meio de prototipagem rápida, com 12mm de diâmetro, pesados e tiveram suas superfícies avaliadas macroscopicamente e por microscopia eletrônica de varredura. Adicionalmente, foi realizado ensaio de compressão para determinar a força necessária para fraturar os implantes. Após a evisceração do olho esquerdo, nove coelhos da raça Nova Zelândia receberam implantes de poliamida e nove outros receberam implantes de ABS. Os animais foram avaliados diariamente nos primeiros 15 dias após a cirurgia e a cada sete dias até o fim do período experimental (90 dias). Avaliação histopatológica foi realizada aos 15, 45 e 90 dias após a cirurgia. Os implantes de ABS pesaram 0,44g, e os de poliamida 0,61g. A microscopia eletrônica de varredura demonstrou que os implantes de ABS eram formados por microporos equidistantes, enquanto os de poliamida apresentavam microporos de vários tamanhos. A força necessária para fraturar os implantes de ABS foi de 14.39±0.60 Mpa, enquanto para os de poliamida foi de 16.80±1.05Mpa. Quinze dias após a cirurgia, foi observada infiltração fibrovascular centrípeta. Os implantes podem ser utilizados para correção de cavidades anoftálmicas por se mostrarem inertes, biocompatíveis e permitirem a infiltração tecidual.(AU)

Experimental acrylonitrile butadiene styrene and polyamide evisceration implant: a rabbit clinical and histopathology study / Estudo clínico e histopatológico em coelhos eviscerados com utilização de implantes de poliamida e acrilonitrila butadieno estireno

The purpose of this study was to evaluate acrylonitrile butadiene styrene (ABS) and polyamide implants in rabbits submitted to evisceration at the macroscopic and microstructure level and to assess clinical response and histopathological changes as well. For the experimental study implants of 12mm diameter were prepared by rapid prototyping, weighed and the outer and inner surfaces evaluated macroscopically and by electron microscopy. In addition, a compression test was performed and ultrastructural damage was then determined. After evisceration of the left eyeball, nine New Zealand rabbits received ABS implants and nine others received polyamide implants. The animals were assessed daily for 15 days after surgery and every seven days until the end of the study (90 days). Histopathological evaluation was performed at 15, 45 and 90 days after surgery. The ABS implants weighed approximately 0.44g, while the polyamide ones weighed 0.61g. Scanning electron microscopy demonstrated that the ABS implants had regular-sized, equidistant micropores, while the polyamide ones showed micropores of various sizes. The force required to fracture the ABS implant was 14.39 ±0.60 Mpa, while for the polyamide one, it was 16.80 ±1.05 Mpa. Fifteen days after surgery, we observed centripetal tissue infiltration and scarce inflammatory infiltrate. Implants may be used in the filling of anophthalmic cavities, because they are inert, biocompatible and allow tissue integration.(AU)

Avaliou-se a macroscopia, a microestrutura, a resposta clínica e histopatológica de implantes de acrilonitrila butadieno estireno (ABS) e poliamida em coelhos submetidos à evisceração. Para o estudo experimental, os implantes foram elaborados por meio de prototipagem rápida, com 12mm de diâmetro, pesados e tiveram suas superfícies avaliadas macroscopicamente e por microscopia eletrônica de varredura. Adicionalmente, foi realizado ensaio de compressão para determinar a força necessária para fraturar os implantes. Após a evisceração do olho esquerdo, nove coelhos da raça Nova Zelândia receberam implantes de poliamida e nove outros receberam implantes de ABS. Os animais foram avaliados diariamente nos primeiros 15 dias após a cirurgia e a cada sete dias até o fim do período experimental (90 dias). Avaliação histopatológica foi realizada aos 15, 45 e 90 dias após a cirurgia. Os implantes de ABS pesaram 0,44g, e os de poliamida 0,61g. A microscopia eletrônica de varredura demonstrou que os implantes de ABS eram formados por microporos equidistantes, enquanto os de poliamida apresentavam microporos de vários tamanhos. A força necessária para fraturar os implantes de ABS foi de 14.39±0.60 Mpa, enquanto para os de poliamida foi de 16.80±1.05Mpa. Quinze dias após a cirurgia, foi observada infiltração fibrovascular centrípeta. Os implantes podem ser utilizados para correção de cavidades anoftálmicas por se mostrarem inertes, biocompatíveis e permitirem a infiltração tecidual.(AU)

Pb and Cd on growth, leaf ultrastructure and essential oil yield mint (Mentha arvensis L. ) / Pb e Cd no crescimento, ultraestrutura foliar e produção de óleo essencial de hortelã (Mentha arvensis L. )

Contamination of medicinal plants with heavy metals as Pb and Cd can affect the growth and the essential oil production of the plants and represent a risk to those who consume as medicine. This study aimed to evaluate the effects of absorption and localization of Pb and Cd on growth, ultrastructural aspects of leaves and essential oil yield and composition of Mentha arvensis, applied on the soil with increasing concentrations (8, 16, 32, 64 and 128mg kg-1). There was a differential absorption of Pb and Cd by M. arvensis mainly concentrated in the roots. Pb was found in small amounts in the leaves while Cd largely exceeded the safety limit without symptoms of toxicity. The ultrastructural analysis revealed the metal accumulation on vesicles surrounding the mitochondria and the presence of electron dense deposits surrounding the mitochondria, nucleus and chloroplasts. Little changes caused by Pb and Cd application were not enough to affect the growth and essential oil yield and composition of M. arvensis .(AU)

A contaminação de plantas medicinais com Pb e Cd pode afetar o crescimento e a produção de óleo essencial das plantas e representa um risco para quem as consome como medicamento. Este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da absorção e localização de Pb e Cd sobre o crescimento das plantas, aspectos ultraestruturais de folhas e sobre o rendimento e composição química do óleo essencial de M. arvensis, os quais foram aplicados ao solo em concentrações crescentes (8, 16, 32, 64 and 128mg kg-1). Houve absorção diferencial de Pb e Cd por M. arvensis, que se concentraram principalmente nas raízes. O Pb foi encontrado em baixas concentrações nas folhas, enquanto o Cd excedeu largamente o limite de segurança sem demonstrar sintomas de toxicidade. As análises ultraestruturais revelaram o acúmulo de metais em vesículas ao redor de mitocôndrias e a presença de depósitos eletrodensos ao redor de mitocôndrias, núcleo e cloroplastos. As pequenas mudanças causadas pela aplicação de Pb e Cd não foram suficientes para afetar o crescimento das plantas e o rendimento e composição química do óleo essencial de M. arvensis .(AU)

Estocagem de esperma em serpentes Neotropicais: uma abordagem fisiológica e ultra estrutural do espermatozoide

A estocagem de espermatozoides pelas fêmeas em vertebrados é bem descrita e ocorre por períodos de tempo distintos, em lugares diferentes ao longo do trato reprodutivo. Dentre todos os vertebrados, as fêmeas de répteis são conhecidas pelos mais longos períodos de estocagem de espermatozoides, sendo que em serpentes há relatos de até 5 anos, podendo ocorrer na região anterior da vagina, no útero posterior ou no infundíbulo, seja em criptas ou em tubos de estocagem de esperma especializados (SST). Além disso, os machos de serpentes também podem estocar espermatozoides durante pelo menos uma estação, dentro dos ductos deferentes. Entretanto, desde a primeira descrição de estocagem em serpentes, até trabalhos que relatam a quantidade estimada de tempo de estocagem e a variabilidade paterna da prole, a mesma pergunta permanece sem resposta, como é possível que os espermatozoides permaneçam vivos por tanto tempo? Há hipóteses que indicam que o oviduto feminino se encarregaria de manter esses espermatozoides, outros apontam que a manutenção dessas células se deve a secreções do segmento sexual renal masculino, mas poucos estudos focam em como a estrutura do espermatozoide e sua fisiologia poderiam ser a chave de sua longa sobrevivência. Assim, esse trabalho teve como objetivo analisar a célula germinativa masculina de serpentes Neotropicais, do ponto de vista ultra estrutural e fisiológico, com a finalidade de avaliar e descrever os espermatozoides maduros antes da cópula. Para tanto, esse estudo foi dividido nas seguintes partes: (1) um protocolo minimamente invasivo para obtenção de sêmen em serpentes; (2) parâmetros de avaliação seminal de motilidade, vigor e vitalidade das amostras; (3) a ultraestrutura dos espermatozoides e por fim (4) a integridade do material genético dos espermatozoides. Palavras-chave: Estocagem de esperma. Avaliação espermática. Espermatozoides de serpente. Ultraestrutura. Citometria de fluxo.

The sperm storage in vertebrate females is a well described process and occurs for distinct time periods, taking place in different portions of female reproductive tract. Among all vertebrates, the reptile females are known for the longer sperm storage and in snakes there are reports of up to 5 years, occurring inside the anterior vagina, posterior uterine tube and infundibulum, whether in crypts or in SST. In addition, male snakes can also store sperm for at least one season, inside the ductus deferens. However, since the first sperm storage description in snakes, until works reporting the estimated storage time and within-clutch multiple paternity, the same question stills without answer: How is possible that the spermatozoa be alive for so long? There are hypothesis indicating that female oviduct is in charged for sperm maintenance, others suggest that sperm cells maintenance are due to sexual segment of kidney (SSK) secretions, but few studies focus on how the spermatozoon structure and physiology could be the key for its long survival. Thus, this work aimed to analyse the Neotropical snakes spermatozoa with a physiological and ultrastructural approach, for the purpose of evaluating and describing mature sperm before copulation. Therefore, we divided our study on four topics: (1) establishing a minimally invasive snake semen collection protocol; (2) evaluation of the snake semen parameters motility, vigor and vitality; (3) description the spermatozoa ultrastructure and (4) recognize if the genetic material of mature snake sperm is viable.

Qualidade ambiental de um estuário no delta amazônico utilizando análises imunohistoquímicas e morfológicas de brânquias como biomarcadores / Environmental quality of an estuary in Amazon delta using immunohistochemical and morphological analyses of gill as biomarkers

Neste estudo foram utilizados biomarcadores histológicos, ultraestruturais e imunohistoquímicos em tecidos brânquiais de duas espécies de peixes, Plagioscion squamosissimus e Lithodoras dorsalis, para avaliar a situação ecológica em um estuário amazônico relacionando a saúde do peixe com a qualidade ambiental. O tecido branquial foi analisado qualitativamente e semiquantitativamente. Foram verificadas diferenças entre as espécies selecionadas e as áreas de estudo, no que se refere ao tipo e severidade das lesões no tecido branquial. Foi detectada uma variedade de alterações histopatológicas severas somente nos peixes capturados nas áreas B e C, tais como: Aneurisma, elevação epitelial e intensa hiperplasia. As análises de microscopia eletrônica e de imunohistoquímica confirmaram danos mais prejudiciais nas brânquias apenas nestas áreas de estudo. Enquanto que na área A poucos peixes apresentaram alterações leves nos tecidos e pouca marcação de apoptose. Estes resultados confirmam a necessidade de um efetivo controle dos dejetos de poluentes assim como um planejamento urbano eficaz nesta região, uma vez que esta área possui um complexo industrial importante próximo à área urbana.(AU)

In this study, histological, ultrastructural, and immunohistochemical observations of the gill tissue of two fish species (Plagioscion squamosissimus and Lithodoras dorsalis) were used as biomarkers to assess the ecological conditions of an estuary in the Amazon delta, by relating the health status of the fishes to environmental quality. The gill tissue was analyzed both qualitatively and semi-quantitatively. Marked differences in the type and severity of lesions were verified between species and among study sites. A variety of severe damages were confirmed histologically in specimens from the two impacted areas (B and C), including aneurysms, epithelial lifting, and intense hyperplasia. Electron microscopy and immunohistochemical analyses also revealed injuries in the gill tissue of specimens from these two areas. While, on area A only few specimens showed mild changes in gill tissues and rare marking of apoptosis. These results confirm the urgent need for the more effective control of the discharge of pollutants into the estuary as well as more effective urban planning, given the close proximity of a major industrial complex to residential areas.(AU)

BIOLOGIA REPRODUTIVA DE HYPOPHTHALMUS MARGINATUS E ESTUDO COMPARATIVO DA ESPERMIOGÊNESE HYPOPHTHALMUS MARGINATUS, AGENEIOSUS UCAYALENSIS E AUCHENIPTERICHTHYS LONGIMANUS (TELEOSTEI: SILURIFORMES)

O presente estudo tem como objetivo analisar aspectos da biologia reprodutiva, proliferação das células germinativas no testículo de Hypophthalmus marginatus, bem como comparar a morfologia dos espermatozóides de Hypophthalmus marginatus, Ageneiosus ucayalensis e Auchenipterichthys longimanus baseado em análises ultraestruturais. Para isso o trabalho foi desenvolvido em três capítulos. O primeiro, verificou a proporção sexual entre fêmeas e machos de H. marginatus, estágios de maturação sexual; índice gonadossomático; período reprodutivo, tipo de desova; fator de condição e tamanho médio na primeira maturação sexual. A atividade reprodutiva ocorreu a jusante da barragem hidrelétrica de Tucuruí. Esta atividade reprodutiva coincidiu com o aumento da vazão e oxigênio dissolvido na água. O segundo, descreveu a estrutura testicular e a ultraestrutura de células germinativas de Hypophthalmus marginatus durante a espermatogênese. H. marginatus apresentaram testículos filiformes, o parênquima testicular era composto por células da linhagem espermatogênica e células de Sertoli. As células espermatogênicas estavam organizadas em cistos espermáticos. Durante a espermiogênese as espermatídes não apresentaram rotação nuclear, o centríolo proximal era perpendicular ao centríolo distal, característico da espermiogênese do tipo III. Morfologicamente os espermatozoides apresentaram cabeça ovóide sem acrossoma, um núcleo condensado e uma fossa nuclear rasa, peça central curta com um único longo flagelo, que exibia a estrutura do axonema clássico de nove pares de microtúbulos periféricos e um central. A peça final era fina com apenas microtúbulos periféricos. O terceiro capítulo analisou a morfologia dos espermatozóides de Hypophthalmus marginatus, Ageneiosus ucayalensis e Auchenipterichthys longimanus. Os resultados demostraram que algumas características evidenciadas nos espermatozoides de Hypophthalmus marginatus, Ageneiosus ucayalensis e Auchenipterichthys longimanus permaneceram conservadas, como a cabeça sem acrossoma, peça intermediária, uniflagelar e axonema clássico de 9+2 microtúbulos. Estas informações podem contribuir para a preservação da espécie, estudos filogenéticos entre os grupos de Siluriformes, bem como subsidiar o aproveitamento de H. marginatus na aquicultura.

The present study aimed to analyse aspects of the reproductive biology and germ cell proliferation on the testicles of Hypophthalmus marginatus, as well to compare the spermatozoid morphology of H. marginatus, Ageneiosus ucayalensis and Auchenipterichthys longimanus based on ultrastructural analyses. For this, the work was divided in three chapters. The first, chapter verified the sex ratio in H. marginatus, its gonadal maturing stages, gonadossomatic index, reproductive period, spawn type, condition factor and average size during the first maturation. Reproductive activity occurred downstream of the Tucuruí hydroelectric dam. This reproductive activity coincided with the increase in flow and dissolved oxygen in the water. The second, described the testicular structure and germ cell ultrastructure of H. marginatus during spermatogenesis. H. marginatus showed filiform testicles and its testicular parenchyma was formed by spermartogenic lineage cells and Sertoli cells. The spermatogenic cells were organized in spermatic cysts. During spermiogenesis, spermatids did not show nuclear rotation and the proximal centriole was perpendicular to the distal centriole, a characteristic of type III spermatogenesis. Morphologically, spermatozoids showed ovoid head without acrossome, a condensed nucleus and shallow nuclear fossa, short central piece and one long flagellum, wich exhibits the typical structure of axoneme in nine pairs of peripheral microtubules and one central pair. The final piece is thin and has only peripheral microtubules. The third, chapter analysed the morphology of spermatozoids in H. marginatus, Ageneiosus ucayalensis and Auchenipterichthys longimanus. The results demonstrated that some of the spermatozoids characteristics on the three species remain conserved, such as a head without acrossome, intermediary piece, uniflagellar and a classic axoneme of 9 + 2 microtubules. This information can contribute to the preservation of the species, phylogenetic studies among Siluriform groups, as well as subsidize the use of H. marginatus in aquaculture. Palavras-chave: Auchenipteridae. Pimelodidae. Reproduction. L50. Histology.

Effects of BMP-4 and FSH on growth, morphology and mRNA expression of oocyte-secreted factors in cultured bovine secondary follicles

This study evaluated the effect of different concentrations of bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), as well as the interaction of BMP-4 and follicle stimulating hormone (FSH) on growth, ultrastructural integrity, and expression of mRNA for growth differentiation factor-9 (GDF-9), BMP-15, maternal antigen that the embryo requires (Mater) and nucleoplasmin-2 (Npm-2) in bovine secondary follicles cultured in vitro for 18 days. Follicles cultured in the presence of 50 ng/ml BMP-4 had a progressive increase in their diameters with the increase of culture period from 0 to 6 and 12 days, but no significant differences were observed among treatments. The presence of both FSH and BMP-4 in a culture medium did not stimulate follicle growth when compared to the control medium. After 12 days, the percentage of normal follicles was maintained similar to that of day 0 in the medium supplemented with both FSH and BMP-4, but no significant differences among treatments were observed after 18 days of culture. BMP-4 maintained the ultrastructural integrity of follicles after 18 days of culture, while follicles cultured in medium supplemented with FSH or both BMP-4 and FSH had oocyte with irregular zona pellucida, vesicular bodies, and an abundance of vacuoles. Follicles cultured in the presence of BMP-4 had an increase in the levels of BMP-15 mRNA, when compared to those cultured in medium supplemented with FSH alone. In conclusion, the addition of BMP-4 in culture medium contributes to preserve follicular ultrastructure, but BMP-4 did not interact positively with FSH. Regarding secondary follicles cultured in the presence of FSH, BMP-4 increases the expression of mRNA for BMP-15.