PADRÃO DE METILAÇÃO DOS GENES XIST E IGF2 EM OVÓCITOS IMATUROS E MATURADOS IN VITRO DE PORCAS CÍCLICAS E MARRÃS PRÉ-PÚBERES

A idade reprodutiva da fêmea é um dos fatores que afeta a produção in vitro de embriões. Sabe-se que ovócitos de fêmeas pré-púberes comparados com fêmeas púberes apresentam menor competência de desenvolvimento. Portanto, é importante compreender os aspectos que causam essa menor competência para se alcançar uma melhor eficiência da PIVE. Nesta pesquisa comparou-se o padrão de metilação do gene XIST e da ICR/H19 de ovócitos obtidos de marrãs pré-puberes e porcas cíclicas antes e depois da maturação in vitro. Para a ICR/H19, não houve diferenças para os níveis de metilação entre os tratamentos avaliados. Os percentuais de metilação foram: mGV (36,15 ± 8,6%), pGV (30,14 ± 7,2%), mMII (17,35 ± 6,7%) e pMII (19,96 ± 6,9%). Porém, quando comparados ao controle (espermatozoide - 94,3 ± 1,04%), os ovócitos de mMII e pMII foram menos metilados (p=0,0001). Esses dados confirmam a característica imprinted do gene, com espermatozoide metilado e ovócito MII desmetilado. O gene XIST apresentou padrões de metilação diferentes entre os grupos mGV (17,29 ± 5,8%) e pGV (48,81 ± 9,6%) (p=0,0305), entre mGV e mMII (0,28 ± 0,2%) (p=0,0342) e entre mMII e pMII (82,35%) (p=0,0001). Quando comparado com o padrão de espermatozoide (0,42 ± 0,42%), os ovócitos de pMII foram estatisticamente diferentes (p=0,0001), porém os ovócitos de mMII foram iguais. Esses dados confirmam que essa região do XIST também apresenta uma característica imprinted, com espermatozoide desmetilado e ovócitos pMII metilado. Além disso, os resultados mostraram que os ovócitos menos competentes, de marrãs, não conseguiram se reprogramar corretamente para essa região do XIST após a maturação in vitro. Assim, sugere-se que essa região tem potencial para ser utilizada como um marcador molecular epigenético para competência ovocitária, já que os ovócitos menos competentes apresentaram um padrão de metilação muito alterado do que aquele esperado para um ovócito maturado.

The reproductive age of the female is one of the factors that affects the in vitro embryo production. It is known that oocytes from prepubertal females compared to cycling females have lower developmental competence. Therefore, it is important to better understand the aspects causing this lesse competence to achieve better efficiency of the IVP. In this research, the methylation pattern of the XIST gene and the ICR/H19 of oocytes obtained from prepubertal gilts (g) and cycling sows (s) were compared. Regarding the ICR/H19, there were no differences for methylation levels among the groups. The methylation percentage were: gGV (36.15 ± 8.6%), sGV (30.14 ± 7.2%), gMII (17.35 ± 6.7%) and sMII (19.96 ± 6,9%). However, when compared to the control (spermatozoa - 94.3 ± 1.04%), gMIII and sMII were less methylated (p=0.0001). These data confirm the imprinted pattern of the gene, with spermatozoa highly methylated and MII oocytes hypomethylated. The XIST gene showed different methylation pattern when comparing gGV (17.29 ± 5.8%) and sGV (48.81 ± 9.6%) groups (p=0.0305), gGV and gMII (0.28 ± 0.2%) (p=0.0342) and gMIII and sMII (82.35%) (p=0.0001). However, to the spermatozoa (0.42 ± 0.42%), sMII oocytes comparing were different (p = 0.0001). These data confirm that this region of the XIST also exhibits an imprinted pattern, with spermatozoa demethylated and the oocytes highly methylated. In addition, results showed that less competent oocytes, from gilts, were unable to correctly reprogram the methylation pattern of this region of XIST after in vitro maturation. Thus, it is suggested that this region of XIST has potential to be used as an epigenetic molecular marker for oocyte competence, since the less competent oocytes exhibit an altered methylation pattern than that what is expected for a matured competent oocyte.

S-adenosil-L-homocisteína como substância desmetilante de DNA no cultivo de células / S-adenosyl-L-homocysteine as DNA demethylating substance in nucleus donor cells culture

Fatores epigenéticos são responsáveis por controlar a expressão de genes e a diferenciação durante a vida celular. Entre eles, a metilação do DNA é o mais estudado. Cada tipo celular possui um padrão epigenético altamente especializado. Após a fecundação natural ou a clonagem por transferência nuclear (SCNT), um padrão epigenético preexistente deve ser apagado e restabelecido para garantir o correto desenvolvimento embrionário. Porém, nos clones, essa reprogramação é ineficiente, mas é possível que o uso de substâncias desmetilantes de DNA utilizadas durante o cultivo celular de células doadoras de núcleo possa desmetilar o DNA, aumentando a eficiência da técnica. (AU)

Epigenetic factors are responsible for controlling gene expression and differentiation through the cell life. Among them, DNA methylation is the most studied. Each cell type possesses a specific and highly specialized epigenetic pattern. After natural fertilization or cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT), a pre-existing epigenetic pattern must be erased and reestablished to ensure correct embryo development. However, in cloning this reprogramming is inefficient and it is possible that the use of a DNA demethylating substance can improve the efficiency of the technique. (AU)

S-adenosil-L-homocisteína como substância desmetilante de DNA no cultivo de células / S-adenosyl-L-homocysteine as DNA demethylating substance in nucleus donor cells culture

Fatores epigenéticos são responsáveis por controlar a expressão de genes e a diferenciação durante a vida celular. Entre eles, a metilação do DNA é o mais estudado. Cada tipo celular possui um padrão epigenético altamente especializado. Após a fecundação natural ou a clonagem por transferência nuclear (SCNT), um padrão epigenético preexistente deve ser apagado e restabelecido para garantir o correto desenvolvimento embrionário. Porém, nos clones, essa reprogramação é ineficiente, mas é possível que o uso de substâncias desmetilantes de DNA utilizadas durante o cultivo celular de células doadoras de núcleo possa desmetilar o DNA, aumentando a eficiência da técnica.

Epigenetic factors are responsible for controlling gene expression and differentiation through the cell life. Among them, DNA methylation is the most studied. Each cell type possesses a specific and highly specialized epigenetic pattern. After natural fertilization or cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT), a pre-existing epigenetic pattern must be erased and reestablished to ensure correct embryo development. However, in cloning this reprogramming is inefficient and it is possible that the use of a DNA demethylating substance can improve the efficiency of the technique.

Padrão de metilação dos genes xist e igf2 em ovocitos de folículos antrais de vacas nelore

Modificações epigenéticas são eventos que controlam a expressão diferencial de genes, sendo a metilação do DNA um dos mais conhecidos, importante para a reprogramação epigenética durante a gametogênese. Entender como isso ocorre na ovogênese é importante para criar parâmetros para a competência ovocitária com o intuito de melhorar a produção in vitro de embriões. Nesse trabalho objetivou-se avaliar o padrão de metilação em ovócitos de duas categorias de folículos antrais: entre 1 e 3 mm e maiores que 6 mm. Para isso foram escolhidas duas ilhas CpGs, uma no éxon 1 do gene XIST – que está relacionado com a inativação do cromossomo X em fêmeas, e outra no último éxon do gene IGF2 – envolvido no desenvolvimento embrionário e placentação. Os ovócitos foram obtidos a partir de ovários de vacas Nelore provenientes de abatedouros usando o tissue chopper e sucessivas pipetagens para o isolamento dos ovócitos. A classificação dos ovócitos foi realizada de acordo com o seu diâmetro. O DNA extraído dos ovócitos foi tratado com bissulfito de sódio e os genes de interesse foram amplificados através de PCR nested. Os produtos purificados de gel de agarose 2% foram utilizados clonagem em células DH5α. Os clones foram sequenciados usando a metodologia dideoxi e analisados no programa BiQ Analyzer utilizando sequências controle do “GenBank”. Apenas sequências com mais de 90% de identidade e de conversão pelo bissulfito de sódio foram consideradas para análises. Os resultados mostraram que os ovócitos de folículos entre 1 e 3 mm e maiores que 6 mm possuem padrão de metilação iguais, tanto para o gene XIST (89,5% e 92,7%, respectivamente) quanto para o gene IGF2 (73,4% e 61,5%, respectivamente). Esses dados sugerem que, pelo menos para as regiões estudadas, o padrão de metilação já está estabelecido a partir da fase antral do folículo ovariano em ovócitos imaturos.

Padrão de metilação dos genes xist e igf2 em ovocitos de folículos antrais de vacas nelore

Modificações epigenéticas são eventos que controlam a expressão diferencial de genes, sendo a metilação do DNA um dos mais conhecidos, importante para a reprogramação epigenética durante a gametogênese. Entender como isso ocorre na ovogênese é importante para criar parâmetros para a competência ovocitária com o intuito de melhorar a produção in vitro de embriões. Nesse trabalho objetivou-se avaliar o padrão de metilação em ovócitos de duas categorias de folículos antrais: entre 1 e 3 mm e maiores que 6 mm. Para isso foram escolhidas duas ilhas CpGs, uma no éxon 1 do gene XIST que está relacionado com a inativação do cromossomo X em fêmeas, e outra no último éxon do gene IGF2 envolvido no desenvolvimento embrionário e placentação. Os ovócitos foram obtidos a partir de ovários de vacas Nelore provenientes de abatedouros usando o tissue chopper e sucessivas pipetagens para o isolamento dos ovócitos. A classificação dos ovócitos foi realizada de acordo com o seu diâmetro. O DNA extraído dos ovócitos foi tratado com bissulfito de sódio e os genes de interesse foram amplificados através de PCR nested. Os produtos purificados de gel de agarose 2% foram utilizados clonagem em células DH5α. Os clones foram sequenciados usando a metodologia dideoxi e analisados no programa BiQ Analyzer utilizando sequências controle do “GenBank”. Apenas sequências com mais de 90% de identidade e de conversão pelo bissulfito de sódio foram consideradas para análises. Os resultados mostraram que os ovócitos de folículos entre 1 e 3 mm e maiores que 6 mm possuem padrão de metilação iguais, tanto para o gene XIST (89,5% e 92,7%, respectivamente) quanto para o gene IGF2 (73,4% e 61,5%, respectivamente). Esses dados sugerem que, pelo menos para as regiões estudadas, o padrão de metilação já está estabelecido a partir da fase antral do folículo ovariano em ovócitos imaturos.(AU)

Citoplastos receptores produzidos por diferentes técnicas de enucleação na transferência nuclear em bovinos

Uma das etapas mais críticas do procedimento de transferência nuclear (TN) é a remoção da cromatina do oócito para a produção de citoplastos. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito de diferentes ambientes citoplasmáticos obtidos a partir de três técnicas de enucleação (convencional, assistida quimicamente e induzida quimicamente) sobre o remodelamento nuclear e desenvolvimento embrionário, avaliando-se o perfil de expressão dos genes XIST, G6PD e HSPA1A em embriões bovinos. Para isso, quatro experimentos foram delineados. No primeiro experimento, verificou-se que o processo de enucleação pode ser iniciado a partir de 1,0 h de tratamento com demecolcina nas duas técnicas de enucleação química. A dinâmica nuclear e de microtúbulos de oócitos ativados tratados com demecolcina foi avaliada em um segundo experimento, e oócitos tratados apresentaram redução da densidade dos microtúbulos, porém, essas estruturas não desapareceram completamente na maioria dos oócitos. No experimento III, a demecolcina não apresentou efeitos significativos na atividade do fator promotor de maturação (MPF) e da proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK) quando utilizada na concentração 0,05?g/mL. No último experimento, a demecolcina não prejudicou o desenvolvimento embrionário e também não alterou o perfil de expressão dos genes XIST, G6PD e HSPA1A em embriões reconstituídos com células embrionárias; porém, quando foram avaliados os níveis de transcritos desses genes em embriões reconstituídos com células somáticas, observou-se maior expressão relativa do XIST e do G6PD em embriões oriundos da técnica de enucleação assistida quimicamente em comparação aos embriões produzidos pela técnica convencional. Portanto, conclui-se que a enucleação química não altera a reprogramação nuclear nem...

Removal of the oocyte chromatin for production of cytoplasts is one of the most critical steps of the standard nuclear transfer (NT) procedure. The aim of this work was to study the effect of different cytoplasmic environments from three enucleation techniques (conventional, chemical-assisted, and chemical-induced enucleation) on nuclear reprogramming and embryonic development, evaluating the expression patterns of XIST, G6PD and HSPA1A genes in bovine embryos. Therefore, four experiments were designed. In the first experiment, it was verified that the enucleation procedure can be initiated 1.0 h after starting demecolcine treatment on both chemical enucleation techniques. The nuclear and microtubular dynamics of activated oocytes treated with demecolcine were evaluated in a second experiment, and treated oocytes showed decreased microtubule density, but these structures did not completely disappear in most oocytes. In experiment III, demecolcine at a concentration of 0.05?g/mL had no significant effect on maturation promoting factor (MPF) and mitogen activated protein kinase (MAPK) activity. In the last experiment, demecolcine had no detrimental effects on embryonic development. Also, the expression patterns of XIST, G6PD and HSPA1A were not altered in reconstituted embryos derived from embryonic donor cells; however, evaluation of transcript levels of these genes in embryos reconstituted using somatic donor cells revealed higher relative expression of XIST and G6PD in embryos derived from chemicalassisted enucleation in comparison to embryos those produced by the conventional technique. In conclusion, chemical enucleation has no effect on nuclear reprogramming and embryonic development after nuclear transfer using embryonic donor cells. Also, chemical-assisted enucleation increases XIST and G6PD expression in nuclear transfer embryos...

Interação núcleo-citoplasmática em embriões e expressão de genes "imprinted" em fetos bovinos produzidos in vivo, in vitro e partenogenéticos

A maturação oocitária é marcada pela retomada da primeira divisão da meiose, com progressão do estádio de Vesícula Germinativa (GV) da Prófase I até a Metáfase II (MII), e inclui todos os eventos necessários para que o oócito expresse seu potencial máximo de desenvolvimento após a fecundação. Para avaliarmos a eficiência da maturação in vitro (MIV), utilizamos oócitos classificados em viáveis (graus I, II e III) e inviáveis (atrésico e desnudo), e acompanhamos a progressão nuclear e a distribuição dos grânulos corticais (GC) como indício de maturação citoplasmática, após MIV em TCM 199 com soro fetal bovino, hormônios, antibiótico e piruvato, por 24h em 5% de CO2 em ar. Maturação nuclear (78,4-87,8%) e citoplasmática (GC periféricos; 67,2-79,3%) foram semelhantes entre as diferentes classes de oócitos e apresentaramse como eventos independentes. Para o acompanhamento dos eventos desencadeados pelo espermatozóide, avaliamos a dinâmica nuclear e de microtúbulos, em intervalos de 2h, após fecundação in vitro (FIV), em meio TALP com heparina, PHE e sêmen preparado em gradiente de Percoll. Observamos que o estádio de MII foi predominante de 2 a 8h; MII e Anáfase/Telófase (A/T) predominaram às 10h; MII, A/T e estádio pronuclear (PN) de 14 a 16h; e PN a partir de 18h. A penetração do espermatozóide ocorreu após 4h da inseminação dos oócitos; a diferenciação dos PN 14 masculino e feminino pelo tamanho foi possível de 14 a 18h e a singamia ocorreu a partir de 24h. O período de 10h pode ser suficiente para que a FIV seja efetiva em oócitos bovinos, nas condições aqui descritas

We aimed to evaluate events involved in in vitro maturation, fertilization and development, and parthenogenetic activation of bovine oocytes assessed by nuclear-cytoplasmic interaction and gene expression. Oocyte morphological selection did not affect nuclear maturation (78.4-87.8%) and cytoplasmic cortical granule distribution (67.2-79.3%). Following nuclear and microtubular dynamics after fertilization (IVF), we observed sperm penetration 4h after insemination; male and female pronuclei differentiation by size from 14 to 18h; syngamy after 24h; and sufficient co-incubation of spermatozoa and oocytes for 10h. Pronuclear transfer to study the interaction between nucleus (N) and cytoplasm (C) in parthenogenetic embryos produced by ionomycin followed by strontium (S) or 6-DMAP (D) was assessed by cleavage, eight-cell, and blastocyst development rates: CSND (76.5, 36.4, and 6.8%) and CDNS (69.5, 25.0, and 4.9%). S cytoplasm promoted dominant effect on D nucleus. Higher rates of developmental arrest up to the eight-cell stage were observed by the combination of cytoplasm and nucleus produced by the two different activation treatments. We recovered parthenogenetic D fetuses on Day 35, which were small but normal in formation and in appearance of chorio-alantoic membranes. Genomic imprinting of IGF2 was observed, but XIST was maternally expressed in extra-embryonic tissues. In vitro culture promoted higher expression of IGF2 and H19 genes and also increased IGF2/IGF2r ratio in IVF embryos compared to in vivo produced ones