Genetic diversity of Mycoplasma hyopneumoniae in finishing pigs in Minas Gerais / Diversidade de cepas de Mycoplasma hyopneumoniae em suínos em terminação brasileiros

Mycoplasma hyopneumoniae is one of the most challenging respiratory pathogens involved with swine pneumonia worldwide, responsible for a chronic infection with high morbidity, which predisposes secondary bacterial infections in growing and finishing pigs. Advances in diagnostic techniques allowed identification of genetic characteristics associated with high antigenic and proteomic variability among bacterial strains. This study aimed to evaluate the genetic diversity of M. hyopneumoniae strains in lungs with pneumonic lesions obtained from 52 pig farms located in Minas Gerais, one of the largest swine production states in Brazil. Genotyping was performed using multilocus variable number of tandem repeat (VNTR) analysis (MLVA), targeting two loci encoding P97 and P146 adhesins VNTR. The results showed that this agent is widely disseminated in pig farms and there is a high polymorphism of M. hyopneumoniae variants circulating in the state of Minas Gerais. Different M. hyopneumoniae genotypes are randomly distributed in several regions of the state, with no specific geographic population structure pattern. M. hyopneumoniae association with viral agents was sporadic (3.17% with Influenza A and 1.9% with PCV2).

Mycoplasma hyopneumoniae é um dos patógenos respiratórios mais desafiadores envolvidos com pneumonia suína em todo o mundo. É responsável por uma infecção crônica de alta morbidade, que predispõe a infecções bacterianas secundárias nas fases de crescimento e terminação. Avanços nas técnicas diagnósticas permitiram a identificação de características genéticas do agente, associadas à alta variabilidade antigênica e proteômica entre cepas. Este estudo teve como objetivo examinar a ocorrência e diversidade genética de cepas de M. hyopneumoniae em pulmões com lesões pneumônicas em 52 granjas de suínos no estado de Minas Gerais, um dos maiores estados produtores de suínos do Brasil. A genotipagem foi realizada utilizando a técnica de "multilocus variable number of tandem repeat analysis" (VTNR/MLVA), usando dois loci que codificam VNTR das adesinas P97 e P146. Os resultados mostraram que esse agente está amplamente disseminado em granjas de suínos e que existe alto polimorfismo das variantes de M. hyopneumoniae circulando no estado de Minas Gerais. Diferentes genótipos de M. hyopneumoniae estão distribuídos aleatoriamente em várias regiões do estado, sem um padrão de estrutura populacional e geográfica específico. Associação de M. hyopneumoniae e agentes virais foi esporádica (3,17% com Influenza A e 1,9% com PCV2).

Molecular characterization of carnivore protoparvovirus strains circulating in cats in Turkey / Caracterização molecular de cepas de protoparvovírus carnívoros circulantes em gatos na Turquia

Cats are susceptible to feline panleukopenia virus (FPV) and canine parvovirus type 2 (CPV-2). Therefore, coinfection and superinfection with multiple parvovirus strains may occur, resulting in high heterogeneity and recombination. Considering the importance of cats as a potential source of genetic diversity for parvoviruses, we investigated the frequency of parvovirus infection in cats using their blood and fecal samples and performed molecular characterization of parvovirus strains circulating in cat populations. Accordingly, the fecal and blood samples of 60 cats with gastroenteritis symptoms were collected from Turkey's Burdur, Isparta, and Izmit provinces. Of these 15 fecal samples tested as parvovirus-positive by PCR, 14 were confirmed to have been infected with true FPV strains by sequencing analysis. Through the phylogeny analysis, those were located in the FPV cluster, closely related to CPV-2, and one was discriminated in the CPV-2b cluster. Additionally, sequence analysis of the VP2 gene of CPV and FPV revealed that the FPV strains detected in Turkey and the vaccine strains were highly related to each other, with a nucleotide identity of 97.7- 100%. Furthermore, 13 variable positions were detected in VP2 of the field and reference FPV strains. Three synonymous mutations were determined in the VP2 gene. Some amino acid mutations in the VP2 protein-affected sites were considered responsible for the virus's biological and antigenic properties. The partial sequence analysis of the VP2 gene revealed that four FPV strains detected in Turkey have a single nucleotide change from T to G at the amino acid position 384 between the nucleotides 3939-3941, which was reported for the first time. Therefore, these four isolates formed a different branch in the phylogenetic tree. The results suggest that both FPV and CPV-2b strains are circulating in domestic cats in Turkey and cats should be considered as potential sources of new parvovirus variants for cats, dogs and other animals.

Os gatos são suscetíveis ao vírus da panleucopenia felina (FPV) e ao parvovírus canino tipo 2 (CPV-2). Portanto, coinfecção e superinfecção com múltiplas cepas de parvovírus podem ocorrer, resultando em alta heterogeneidade e recombinação. Considerando a importância dos gatos como uma fonte potencial de diversidade genética para parvovírus, investigamos a frequência da infecção por parvovírus em gatos usando suas amostras de sangue e fezes e realizamos a caracterização molecular de cepas de parvovírus circulantes nas populações de gatos. Amostras fecais e de sangue de 60 gatos com sinais de gastroenterite foram coletadas nas províncias de Burdur, Isparta e Izmit, na Turquia. Destas, 15 amostras fecais testaram positivas para parvovírus por PCR e 14 foram confirmadas como infectadas com cepas verdadeiras de FPV por análise de sequenciamento. Através da análise filogenética, aqueles foram localizados no agrupamento FPV que está intimamente relacionado com o CPV-2, e um foi discriminado no agrupamento CPV-2b. Além disso, a análise da sequência do gene VP2 de CPV e FPV revelou que as cepas de FPV detectadas na Turquia e as cepas vacinais eram altamente relacionadas entre si, com uma identidade de nucleotídeos de 97,7-100%. Além disso, 13 posições variáveis foram detectadas em VP2 das cepas de campo e FPV de referência. Três mutações sinônimas foram determinadas no gene VP2. Algumas mutações de aminoácidos nos locais afetados pela proteína VP2 foram consideradas responsáveis pelas propriedades biológicas e antigênicas do vírus. A análise da sequência parcial do gene VP2 revelou que quatro cepas de FPV detectadas na Turquia têm uma única mudança de nucleotídeo de T para G na posição do aminoácido 384 entre os nucleotídeos 3939-3941, o que foi relatado pela primeira vez. Portanto, esses quatro isolados formaram um ramo diferente na árvore filogenética. Os resultados sugerem que ambas as cepas FPV e CPV-2b estão circulando em gatos domésticos na Turquia e os gatos devem ser considerados como fontes potenciais de novas variantes de parvovírus para gatos, cães e outros animais.

About the necessity of including HoBi-like pestiviruses in bovine respiratory and reproductive viral vacines / Sobre a necessidade de incluir pestivírus HoBi-like em vacinas virais respiratórias e reprodutivas para bovinos

HoBi-like pestiviruses (HoBiPeV) constitute a novel group of bovine pestiviruses, genetically and antigenically related to bovine viral diarrhea virus 1 (BVDV-1) and BVDV-2. Recent data shows that HoBiPeV are endemic among Brazilian cattle, yet bovine reproductive/respiratory vaccines contain only BVDV-1 and BVDV-2 strains. The present study investigated the neutralizing antibody response against these pestiviruses induced by two commercial vaccines (VA = attenuated, VI = inactivated) and by three experimental, replicative, vaccine formulations (VAC1 = monovalent, BVDV-1; VAC2 = bivalent, BVDV-1 + BVDV-2; VAC3 = trivalent, BVDV-1 + BVDV-2 and HoBiPeV). Seronegative beef calves were immunized once (replicative vaccines) or twice (inactivated vaccine) and serum samples were tested by virus-neutralization (VN) 30 days after vaccination (dpv) (replicative vaccines) or 30 days after the second dose (VI). We considered a threshold VN titer of ≥60 indicative of protection against clinical disease. At 30 dpv, VA induced protective titers against BVDV-2 in 7/7 animals (GMT=289.8) and against BVDV-1 and HoBiPeV in 5/7 animals (GMTs=97.5 and 80, respectively). VI induced protective titers against BVDV-1 in 1/7 animal (GMT=16.4), 2/7 animals against BVDV-2 (GMT=53.8) and in none of the calves against HoBiPeV (GMT=12.2). When a pool of sera of each vaccine group was tested against individual Brazilian isolates, VA induced protective titers against 3/7 BVDV-1 isolates, to 9/10 (BVDV-2) and 1/8 (HoBiPeV); VI induced protective titers against 1/7 (BVDV-1), 1/10 (BVDV-2) and none (0/8) HoBiPeV isolates. The experimental vaccine VAC1 induced protective titers against BVDV-1 in 9/9 animals (GMT=320) but in no animal against BVDV-2 or HoBiPeV (GMT<10). VAC2 induced protective titers to BVDV-1 and BVDV-2 in 9/9 animals (GMTs=160 and 640, respectively), and against HoBiPeV in 7/9 animals (GMT=108.5). Finally, VAC3 induced protective titers in all animals against BVDV-1 (GMT=234.3), BVDV-2 (294.9) and HoBiPeV (201.1). Testing the pool of sera against pestivirus isolates, VAC1 induced titers ≥ 60 against 4/7 BVDV-1 but to none BVDV-2/HoBiPeV isolate; VAC2 induced protective titers against 4/7 BVDV-1; 10/10 BVDV-2 and 2/8 HoBiPeV; VAC3 induced protective titers against all BVDV-1, BVDV-2 and HoBiPeV isolates. These results indicate that vaccines composed by BVDV-1+BVDV-2, especially those containing inactivated virus, may not induce serological response against a variety of HoBiPeV isolates. Thus, the need of inclusion of HoBiPeV in vaccine formulations should be considered.(AU)

Os pestivírus HoBi-like (HoBiPeV) compõe um grupo novo de pestivírus de bovinos, genética e antigenicamente relacionados com os vírus da diarreia viral bovina 1 e 2 (BVDV-1, BVDV2). Dados recentes indicam que os HoBiPeV são endêmicos na população bovina do Brasil, mas as vacinas respiratórias e reprodutivas bovinas contêm apenas cepas de BVDV-1 e BVDV-2. O presente estudo investigou a atividade neutralizante contra estes pestivírus induzidas por duas vacinas comerciais (VA = atenuada, VI = inativada) e por três vacinas experimentais replicativas (VAC1 = monovalente, BVDV-1; VAC2 = bivalente, BVDV-1 + BVDV-2; VAC3 = trivalente, BVDV-1 + BVDV-2 e HoBiPeV). Bezerros soronegativos foram imunizados uma vez (vacinas replicativas) ou duas (vacina inativada) e amostras de soro foram testadas por vírus-neutralização (VN) 30 dias após a vacinação (dpv) (vacinas replicativas) ou 30 dias após a segunda dose (VI). Títulos neutralizantes ≥60 foram considerados indicativos de proteção contra doença clínica. Nesta data, a VA induziu títulos protetivos contra o BVDV-2 em 7/7 animais (GMT=289,8) e contra BVDV-1 e HoBiPeV em 5/7 animals (GMTs=97,5 e 80, respectivamente). VI induziu títulos protetores contra BVDV-1 em 1/7 animal (GMT=16,4), em 2/7 animais contra BVDV-2 (GMT=53,8) e em nenhum contra HoBiPeV (GMT=12,2). Quando um pool de soro de cada grupo vacinal foi testado frente a isolados Brasileiros, a VA induziu títulos protetores contra 3/7 isolados de BVDV-1, 9/10 (BVDV-2) e 1/8 (HoBiPeV); VI induziu títulos protetores em 1/7 contra BVDV-1, 1/10 (BVDV-2) e em nenhum (0/8) contra isolados de HoBiPeV. A VAC1 induziu títulos protetores contra BVDV-1 em 9/9 animais (GMT=320) mas em nenhum animal contra BVDV-2 ou HoBiPeV (GMT<10). VAC2 induziu títulos protetores contra BVDV-1e BVDV-2 em 9/9 animais (GMTs=160 e 640, respectivamente),e contra HoBiPeV em 7/9 animais (GMT=108,5). Finalmente, VAC3 induziu títulos protetores em todos os animais contra BVDV-1 (GMT=234,3), BVDV-2 (294,9) e HoBiPeV (201,1). No teste de pool de soro contra isolados de pestivírus, VAC1 induziu títulos ≥60 contra 4/7 BVDV-1 mas contra nenhum isolado de BVDV-2/HoBiPeV; VAC2 induziu títulos protetores contra 4/7 BVDV-1; 10/10 BVDV-2 e 2/8 HoBiPeV; VAC3 induziu títulos protetores contra todos BVDV-1, BVDV-2 e HoBiPeV. Esses resultados indicam que vacinas contendo apenas BVDV-1 BVDV-2, especialmente aquelas inativadas, podem não conferir resposta sorológica protetora contra vários isolados de HoBiPeV. Portanto, a necessidade de se incluir cepas de HoBiPeV nas vacinas deve ser considerada.(AU)

About the necessity of including HoBi-like pestiviruses in bovine respiratory and reproductive viral vacines / Sobre a necessidade de incluir pestivírus HoBi-like em vacinas virais respiratórias e reprodutivas para bovinos

HoBi-like pestiviruses (HoBiPeV) constitute a novel group of bovine pestiviruses, genetically and antigenically related to bovine viral diarrhea virus 1 (BVDV-1) and BVDV-2. Recent data shows that HoBiPeV are endemic among Brazilian cattle, yet bovine reproductive/respiratory vaccines contain only BVDV-1 and BVDV-2 strains. The present study investigated the neutralizing antibody response against these pestiviruses induced by two commercial vaccines (VA = attenuated, VI = inactivated) and by three experimental, replicative, vaccine formulations (VAC1 = monovalent, BVDV-1; VAC2 = bivalent, BVDV-1 + BVDV-2; VAC3 = trivalent, BVDV-1 + BVDV-2 and HoBiPeV). Seronegative beef calves were immunized once (replicative vaccines) or twice (inactivated vaccine) and serum samples were tested by virus-neutralization (VN) 30 days after vaccination (dpv) (replicative vaccines) or 30 days after the second dose (VI). We considered a threshold VN titer of ≥60 indicative of protection against clinical disease. At 30 dpv, VA induced protective titers against BVDV-2 in 7/7 animals (GMT=289.8) and against BVDV-1 and HoBiPeV in 5/7 animals (GMTs=97.5 and 80, respectively). VI induced protective titers against BVDV-1 in 1/7 animal (GMT=16.4), 2/7 animals against BVDV-2 (GMT=53.8) and in none of the calves against HoBiPeV (GMT=12.2). When a pool of sera of each vaccine group was tested against individual Brazilian isolates, VA induced protective titers against 3/7 BVDV-1 isolates, to 9/10 (BVDV-2) and 1/8 (HoBiPeV); VI induced protective titers against 1/7 (BVDV-1), 1/10 (BVDV-2) and none (0/8) HoBiPeV isolates. The experimental vaccine VAC1 induced protective titers against BVDV-1 in 9/9 animals (GMT=320) but in no animal against BVDV-2 or HoBiPeV (GMT<10). VAC2 induced protective titers to BVDV-1 and BVDV-2 in 9/9 animals (GMTs=160 and 640, respectively), and against HoBiPeV in 7/9 animals (GMT=108.5). Finally, VAC3 induced protective titers in all animals against BVDV-1 (GMT=234.3), BVDV-2 (294.9) and HoBiPeV (201.1). Testing the pool of sera against pestivirus isolates, VAC1 induced titers ≥ 60 against 4/7 BVDV-1 but to none BVDV-2/HoBiPeV isolate; VAC2 induced protective titers against 4/7 BVDV-1; 10/10 BVDV-2 and 2/8 HoBiPeV; VAC3 induced protective titers against all BVDV-1, BVDV-2 and HoBiPeV isolates. These results indicate that vaccines composed by BVDV-1+BVDV-2, especially those containing inactivated virus, may not induce serological response against a variety of HoBiPeV isolates. Thus, the need of inclusion of HoBiPeV in vaccine formulations should be considered.(AU)

Os pestivírus HoBi-like (HoBiPeV) compõe um grupo novo de pestivírus de bovinos, genética e antigenicamente relacionados com os vírus da diarreia viral bovina 1 e 2 (BVDV-1, BVDV2). Dados recentes indicam que os HoBiPeV são endêmicos na população bovina do Brasil, mas as vacinas respiratórias e reprodutivas bovinas contêm apenas cepas de BVDV-1 e BVDV-2. O presente estudo investigou a atividade neutralizante contra estes pestivírus induzidas por duas vacinas comerciais (VA = atenuada, VI = inativada) e por três vacinas experimentais replicativas (VAC1 = monovalente, BVDV-1; VAC2 = bivalente, BVDV-1 + BVDV-2; VAC3 = trivalente, BVDV-1 + BVDV-2 e HoBiPeV). Bezerros soronegativos foram imunizados uma vez (vacinas replicativas) ou duas (vacina inativada) e amostras de soro foram testadas por vírus-neutralização (VN) 30 dias após a vacinação (dpv) (vacinas replicativas) ou 30 dias após a segunda dose (VI). Títulos neutralizantes ≥60 foram considerados indicativos de proteção contra doença clínica. Nesta data, a VA induziu títulos protetivos contra o BVDV-2 em 7/7 animais (GMT=289,8) e contra BVDV-1 e HoBiPeV em 5/7 animals (GMTs=97,5 e 80, respectivamente). VI induziu títulos protetores contra BVDV-1 em 1/7 animal (GMT=16,4), em 2/7 animais contra BVDV-2 (GMT=53,8) e em nenhum contra HoBiPeV (GMT=12,2). Quando um pool de soro de cada grupo vacinal foi testado frente a isolados Brasileiros, a VA induziu títulos protetores contra 3/7 isolados de BVDV-1, 9/10 (BVDV-2) e 1/8 (HoBiPeV); VI induziu títulos protetores em 1/7 contra BVDV-1, 1/10 (BVDV-2) e em nenhum (0/8) contra isolados de HoBiPeV. A VAC1 induziu títulos protetores contra BVDV-1 em 9/9 animais (GMT=320) mas em nenhum animal contra BVDV-2 ou HoBiPeV (GMT<10). VAC2 induziu títulos protetores contra BVDV-1e BVDV-2 em 9/9 animais (GMTs=160 e 640, respectivamente),e contra HoBiPeV em 7/9 animais (GMT=108,5). Finalmente, VAC3 induziu títulos protetores em todos os animais contra BVDV-1 (GMT=234,3), BVDV-2 (294,9) e HoBiPeV (201,1). No teste de pool de soro contra isolados de pestivírus, VAC1 induziu títulos ≥60 contra 4/7 BVDV-1 mas contra nenhum isolado de BVDV-2/HoBiPeV; VAC2 induziu títulos protetores contra 4/7 BVDV-1; 10/10 BVDV-2 e 2/8 HoBiPeV; VAC3 induziu títulos protetores contra todos BVDV-1, BVDV-2 e HoBiPeV. Esses resultados indicam que vacinas contendo apenas BVDV-1 BVDV-2, especialmente aquelas inativadas, podem não conferir resposta sorológica protetora contra vários isolados de HoBiPeV. Portanto, a necessidade de se incluir cepas de HoBiPeV nas vacinas deve ser considerada.(AU)

Identification and characterization of pestiviruses isolated from individual fetal bovine serum samples originated in Rio Grande do Sul state, Brazil / Identificação e caracterização de pestivírus isolados de amostras individuais de soro fetal bovino originárias do Rio Grande do Sul, Brasil

The identification of diversity of bovine pestiviruses circulating in the field is fundamental for continuous evaluation of diagnostic tests and vaccine composition. In this article we performed the genetic and antigenic characterization of twelve bovine pestiviruses isolated in the western region of Rio Grande do Sul, Brazil. The viruses were isolated from sera of bovine fetuses or from animals with clinical presentations suggestive of pestivirus infection. Genetic characterization by sequencing and phylogenetic analysis of the 5'UTR region of the viral genome allowed for the identification of bovine viral diarrhea virus (BVDV-1a, 4/12, 33.3%), BVDV-1b (6/12, 50%) and BVDV-2 (2/12, 16.7%). The reactivity of the isolates with a panel of monoclonal antibodies raised against envelope proteins (Erns, E1 and E2) demonstrated a high antigenic variability among isolates. Thus, the active circulation of bovine pestivirus infection, with high genetic and antigenic variability, in cattle on the western border of RS was confirmed, demonstrating the importance of continuous characterization of the pestiviruses circulating in the cattle herds to keep the diagnostic and control measures up to date.(AU)

A identificação da diversidade de pestivírus bovinos que circulam no campo é fundamental para a avaliação contínua dos testes de diagnóstico e composição de vacina. Neste artigo, realizamos a caracterização genética e antigênica de doze pestivírus bovinos isolados na região oeste do Rio Grande do Sul, Brasil. Os vírus foram isolados de soros de fetos bovinos ou de animais com apresentações clínicas sugestivas de infecção por pestivírus. A caracterização genética por sequenciamento e análise filogenética da região 5'UTR do genoma viral permitiu a identificação do vírus da diarréia viral bovina (BVDV-1a, 4/12, 33,3%), BVDV-1b (6/12, 50%) e BVDV-2 (2/12, 16,7%). A reatividade dos isolados com um painel de anticorpos monoclonais criados contra proteínas do envelope (Erns, E1 e E2) demonstrou uma alta variabilidade antigênica entre os isolados. Assim, confirmou-se a circulação ativa da infecção por pestivírus bovino, com alta variabilidade genética e antigênica, em bovinos na fronteira oeste do RS, demonstrando a importância da contínua caracterização dos pestivírus circulantes em bovinos para manter atualizadas as medidas de diagnóstico e controle.(AU)

Identification and characterization of pestiviruses isolated from individual fetal bovine serum samples originated in Rio Grande do Sul state, Brazil / Identificação e caracterização de pestivírus isolados de amostras individuais de soro fetal bovino originárias do Rio Grande do Sul, Brasil

The identification of diversity of bovine pestiviruses circulating in the field is fundamental for continuous evaluation of diagnostic tests and vaccine composition. In this article we performed the genetic and antigenic characterization of twelve bovine pestiviruses isolated in the western region of Rio Grande do Sul, Brazil. The viruses were isolated from sera of bovine fetuses or from animals with clinical presentations suggestive of pestivirus infection. Genetic characterization by sequencing and phylogenetic analysis of the 5'UTR region of the viral genome allowed for the identification of bovine viral diarrhea virus (BVDV-1a, 4/12, 33.3%), BVDV-1b (6/12, 50%) and BVDV-2 (2/12, 16.7%). The reactivity of the isolates with a panel of monoclonal antibodies raised against envelope proteins (Erns, E1 and E2) demonstrated a high antigenic variability among isolates. Thus, the active circulation of bovine pestivirus infection, with high genetic and antigenic variability, in cattle on the western border of RS was confirmed, demonstrating the importance of continuous characterization of the pestiviruses circulating in the cattle herds to keep the diagnostic and control measures up to date.(AU)

A identificação da diversidade de pestivírus bovinos que circulam no campo é fundamental para a avaliação contínua dos testes de diagnóstico e composição de vacina. Neste artigo, realizamos a caracterização genética e antigênica de doze pestivírus bovinos isolados na região oeste do Rio Grande do Sul, Brasil. Os vírus foram isolados de soros de fetos bovinos ou de animais com apresentações clínicas sugestivas de infecção por pestivírus. A caracterização genética por sequenciamento e análise filogenética da região 5'UTR do genoma viral permitiu a identificação do vírus da diarréia viral bovina (BVDV-1a, 4/12, 33,3%), BVDV-1b (6/12, 50%) e BVDV-2 (2/12, 16,7%). A reatividade dos isolados com um painel de anticorpos monoclonais criados contra proteínas do envelope (Erns, E1 e E2) demonstrou uma alta variabilidade antigênica entre os isolados. Assim, confirmou-se a circulação ativa da infecção por pestivírus bovino, com alta variabilidade genética e antigênica, em bovinos na fronteira oeste do RS, demonstrando a importância da contínua caracterização dos pestivírus circulantes em bovinos para manter atualizadas as medidas de diagnóstico e controle.(AU)

Evolution of equine influenza viruses (H3N8) during a Brazilian outbreak, 2015

Equine influenza is one of the major respiratory infectious diseases in horses. An equine influenza virus outbreak was identified in vaccinated and unvaccinated horses in a veterinary school hospital in São Paulo, SP, Brazil, in September 2015. The twelve equine influenza viruses isolated belonged to Florida Clade 1. The hemagglutinin and neuraminidase amino acid sequences were compared with the recent isolates from North and South America and the World Organisation for Animal Health recommended Florida Clade 1 vaccine strain. The hemagglutinin amino acid sequences had nine substitutions, compared with the vaccine strain. Two of them were in antigenic site A (A138S and G142R), one in antigenic site E (R62K) and another not in antigenic site (K304E). The four substitutions changed the hydrophobicity of hemagglutinin. Three distinct genetic variants were identified during the outbreak. Eleven variants were found in four quasispecies, which suggests the equine influenza virus evolved during the outbreak. The use of an out of date vaccine strain or updated vaccines without the production of protective antibody titers might be the major contributing factors on virus dissemination during this outbreak.(AU)

Avaliação do ensaio RT-qPCR LN34 Pan-Lyssavirus para a detecção do vírus da raiva no Brasil

A raiva, causada pelo rabies virus (RABV), caracteriza-se por ser uma encefalomielite viral aguda. O RABV pertence ao gênero Lyssavirus, que contempla outros 17 vírus. Como a raiva é uma doença que apresenta letalidade próxima a 100%, as técnicas de diagnóstico devem se mostrar precisas e fidedignas, para que possa ser realizado o controle da doença. A prova padrão ouro para o diagnóstico é a imunofluorescência direta (IFD), uma vez que apresenta alta sensibilidade e especificidade. Porém, problemas como o estado avançado de autólise das amostras, baixa carga viral, qualidade inapropriada dos insumos e até mesmo a inexperiência de profissionais para a leitura das lâminas, podem diminuir a acurácia dos resultados. O ensaio LN34 Pan-Lyssavirus para RT-PCR em tempo real (RT-qPCR), que combina primers degenerados e múltiplos com sonda de hidrólise do tipo Locked Nucleic Acid (LNA), é um candidato para ser prova confirmatória da IFD, devido a sua facilidade de manuseio e capacidade de detectar as diferentes espécies de vírus dentro do gênero Lyssavirus, e por apresentar alta especificidade e sensibilidade. Esse ensaio detecta e amplifica porção leader 3 do genoma e a região inicial do gene codificador da nucleoproteína, considerada a mais conservada entre os Lyssavirus. Esse estudo visa a padronização e implementação do ensaio LN34 Pan-Lyssavirus de RT-qPCR para detecção das diferentes linhagens genéticas e variantes antigênicas do RABV descritas no Brasil. Para isso, foram coletadas 324 amostras positivas e compatíveis com as diferentes variantes antigênicas e linhagens genéticas do RABV presentes no Brasil, e testadas na RT-qPCR utilizando o ensaio LN34 Pan-Lyssavirus. A RT-qPCR two-steps com ensaio LN34 Pan-Lyssavirus apresentou uma positividade de 87,3%, e 41 amostras obtiveram resultado falso negativo. Estas amostras, que tiveram resultado falso-negativo na RT-qPCR two-steps, foram testadas na técnica de RT-qPCR one-step com ensaio LN34 Pan-Lyssavirus, e todas tiveram o resultado verdadeiro positivo confirmado. Diante desses resultados, é possível inferir que a utilização do ensaio LN34 com a RT-qPCR em duas etapas apresenta dificuldade de detecção das diferentes linhagens genéticas e variantes antigênicas do RABV, possivelmente devido ao não anelamento do primer senso durante a transcrição reversa. Por outro lado, a RT-qPCR em uma etapa com o ensaio LN34 Pan-Lyssavirus foi capaz de detectar e amplificar aquelas amostras falso negativas pela reação em duas etapas, se mostrando um teste altamente sensível, e com potencial para ser utilizado como prova confirmatória à IFD para o diagnóstico da raiva no Brasil.

Rabies, caused by rabies virus (RABV), is characterized by viral acute progressive encephalitis. The RABV belongs to Lyssavirus genus, that includes seventeen others virus. Due to the high lethality, almost 100%, diagnosis techniques for rabies must be accurate and reliable for the accomplishment of diseases control. The gold standard for rabies diagnostic is the direct fluorescent antibody test (dFAT), due to its high sensibility and specificity. Although, sample conservation, low viral title, poor quality inputs, and skilled technicians may hamper results accurate. The RT-qPCR LN34 Pan-Lyssavirus assay is a combination of degenerated and multiple primers with Locked Nucleic Acid (LNA) probe that can be used as secondary test for dFAT, due to its ease manipulation and capacity for detecting the different virus species within the Lyssavirus genus, and due its high sensitivity and specificity. This assay detects and amplifies the leader region 3 and the initial portion of nucleoprotein gene that is considered the most conserved gene within the Lyssavirus. This study aims the LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay standardization and implementation for detecting the different RABV genetic lineages and antigenic variants described in Brazil. Therefore, 324 positive samples compatible with different RABV genetic lineages or antigenic variants were collected and tested in RT-qPCR, using LN34 Pan-Lyssavirus assay. The two steps LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay, showed positivity of 87,3%, and 41 samples obtained false negative result. Those false negative samples in the two steps LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay were tested in the one step LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay, and 100% of those samples confirmed the true positive result. Based in these results, is possible to infer that the two steps RT-qPCR assay may hamper the detection of different RABV genetic lineages and antigenic variants, probably due to mismatches between sense primer and the target region during the revere transcription technique. On the other hand, the one step RT-qPCR LN34 Pan-Lyssavirus assay were able to detect and amplify those false negative samples in two steps RT-qPCR, showing to be a highly sensitivity test, and showing potential to be used as confirmatory test to dFAT for rabies diagnosis.

Sobre a Necessidade de Inclusão de Pestivírus Hobi-Like em Vacinas Respiratórias e Reprodutivas para Bovinos

Os pestivírus Hobi-like (HoBiPeV) constituem um novo grupo de pestivírus bovino, geneticamente e antigenicamente relacionados ao vírus da diarreia viral bovina 1 (BVDV-1) e BVDV-2. Dados recentes mostram que os HoBiPeV são endêmicos na população bovina brasileira, e as vacinas reprodutivas/respiratórias de bovinos contêm apenas cepas de BVDV-1 e BVDV-2. O presente estudo investigou a resposta de anticorpos neutralizantes contra estes pestivírus induzida por duas vacinas comerciais (VA vacina atenuada; VI vacina inativada) e por três vacinas experimentais replicativas (VAC1 monovalente, BVDV1-; VAC2 bivalente, BVDV-1+BVDV-2 e VAC3 trivalente, BVDV-1+BVDV-2+HoBiPeV). Bovinos de raças de corte, soronegativos, foram imunizados uma vez (vacinas replicativas) ou duas vezes (para VI) e amostras de soro foram testadas por vírus-neutralização (VN) 30 dias após a vacinação (dpv) (vacinas replicativas) ou 30 dias após a segunda dose (VI). Considerou-se o título 60 indicador de proteção à doença clínica. Aos 30 dpv, a VA induziu títulos protetores ao BVDV-2 em 7/7 animais (GMT=289,8), e ao BVDV-1 e HoBiPeV em 5/7 animais (GMTs=97,5 e 80 respectivamente). A VI induziu títulos neutralizantes protetores frente ao BVDV-1 em 1/7 animal (GM=16,4), a BVDV-2 em 2/7 animais (GMT=53,8) e a HoBiPeV em nenhum dos animais (GMT=12,2). Quando o pool de soro dos grupos vacinados foi testado frente a isolados de pestivírus, a VA induziu títulos protetores contra 3/7 BVDV-1, 9/10 (BVDV-2) e 1/8 (HoBiPeV); a VI induziu títulos protetores contra 1/7 (BVDV-1), 1/10 (BVDV-2) e nenhum (0/8) HoBiPeV. A vacina experimental VAC1 induziu título protetor ao BVDV-1 em 9/9 animais (GMT=320), e em nenhum animal frente a BVDV-2 e HoBiPeV (GMT<10). A VAC2 induziu títulos protetores a BVDV-1 e BVDV-2 em 9/9 animais (GMTs=160 e 640, respectivamente), e contra HoBiPeV em 7/9 animais (GMT=108,5). Por fim, a vacina trivalente (VAC3) induziu títulos protetores similares a BVDV-1 (GMT=234,3,) BVDV-2 (GMT=294,9) e HoBiPeV (GMT=201,1) na totalidade dos animais. Quando o pool de amostras das vacinas foi testado frente aos isolados, VAC1 induziu títulos protetores contra 4/7 isolados de BVDV-1 mas contra nenhum BVDV-2 ou HoBiPeV; VAC2 induziu títulos protetores frente à 4/7 BVDV-1; 10/10 BVDV-2 e 2/8 HoBiPeV. Já a VAC3 conferiu títulos protetores contra todos os isolados de BVDV-1, BVDV-2 e HoBiPeV testados. Estes resultados indicam que vacinas contendo apenas BVDV-1 e BVDV-2 especialmente aquelas com vírus inativado - podem não induzir resposta sorológica compatível com proteção frente à isolados de HoBiPeV. Dessa forma, a necessidade de incluir isolados de HoBiPeV em formulações vacinais no Brasil deve ser considerada.

oBi-like pestiviruses (HoBiPeV) constitute a novel group of bovine pestiviruses, genetically and antigenically related to bovine viral diarrhea virus 1 (BVDV-1) and BVDV-2. Recent data shows that HoBiPeV are endemic among Brazilian cattle, yet bovine reproductive/respiratory vaccines contain only BVDV-1 and BVDV-2 strains. The present study investigated the neutralizing antibody response against these pestiviruses induced by two commercial vaccines (VA attenuated; VI inactivated) and by three experimental, replicative, vaccine formulations (VAC1 monovalent, BVDV-1; VAC2 bivalent, BVDV-1 + BVDV-2 and VAC3 trivalent, BVDV-1 + BVDV-2 and HoBiPeV). Seronegative beef calves were immunized once (replicative vaccines) or twice (inactivated vaccine) and serum samples were tested by virus-neutralization (VN) 30 days after vaccination (dpv) (replicative vaccines) or 30 days after the second dose (VI). We considered a threshold VN titer of 60 indicative of protection against clinical disease. At 30 dpv, VA induced protective titers against BVDV-2 in 7/7 animals (GMT=289.8) and against BVDV-1 and HoBiPeV in 5/7 animals (GMTs=97.5 and 80, respectively). VI induced protective titers against BVDV-1 in 1/7 animal (GMT=16.4), 2/7 animals against BVDV-2 (GMT=53.8) and in none of the calves against HoBiPeV (GMT=12.2). When a pool of sera of each vaccine group was tested against individual Brazilian isolates, VA induced protective titers against 3/7 BVDV-1 isolates, to 9/10 (BVDV-2) and 1/8 (HoBiPeV); VI induced protective titers against 1/7 (BVDV-1), 1/10 (BVDV-2) and none (0/8) HoBiPeV isolates. The experimental vaccine VAC1 induced protective titers against BVDV-1 in 9/9 animals (GMT=320) but in no animal against BVDV-2 or HoBiPeV (GMT<10). VAC2 induced protective titers to BVDV-1 and BVDV-2 in 9/9 animals (GMTs = 160 and 640, respectively), and against HoBiPeV in 7/9 animals (GMT=108.5). Finally, VAC3 induced protective titers in all animals against BVDV-1 (GMT=234.3), BVDV-2 (294.9) and HoBiPeV (201.1). Testing the pool of sera against pestivirus isolates, VAC1 induced titers 60 against 4/7 BVDV-1 but to none BVDV-2/HoBiPeV isolate; VAC2 induced protective titers against 4/7 BVDV-1; 10/10 BVDV-2 and 2/8 HoBiPeV; VAC3 induced protective titers against all BVDV-1, BVDV-2 and HoBiPeV isolates. These results indicate that vaccines composed by BVDV-1+BVDV-2 especially those containing inactivated virus - may not induce serological response against a variety of HoBiPeV isolates. Thus, the need of inclusion of HoBiPeV in vaccine formulations should be considered.

Avaliação do microbioma cutâneo de gatos com dermatofitose pela técnica de sequenciamento de alto rendimento e caracterização de proteínas imunodominantes do Microsporum canis para o sorodiagnóstico da dermatofitose felina

A dermatofitose e uma doenca fungica comumente vista no atendimento ambulatorial de felinos. A sua importancia clinica e epidemiologica reside no fato de ser uma dermatopatia cosmopolita, infecciosa, contagiosa e zoonotica. Atualmente, o cultivo fungico e a principal ferramenta de diagnostico utilizada, porem a sua morosidade na emissao do resultado indica a necessidade do desenvolvimento de novas estrategias de diagnostico. A aplicacao de tecnologias de imunodiagnostico, bem como tecnologias de sequenciamento da microbiota, tem um grande potencial para contribuir na identificacao e desenvolvimento de novos alvos diagnosticos. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar as proteinas imunodominantes do Microsporum canis para aplicabilidade no sorodiagnostico da dermatofitose felina. Alem disso, objetivou-se avaliar a composicao e a diversidade das microbiotas fungica e bacteriana de gatos com dermatofitose, gatos assintomaticos (carreadores de M. canis) e gatos higidos. Para os ensaios de caracterizacao das proteinas de M. canis, foram colhidas amostras cutaneas e de sangue de 70 felinos: sintomaticos (n= 20), assintomaticos (n= 20), negativos (n = 20) e negativos heterologos (n= 10). As amostras cutaneas foram submetidas a cultivos fungicos para confirmacao diagnostica e subsequente extracao de M. canis e as amostras de sangue foram avaliadas por Western blot uni e bidimensional. Para a realizacao dos ensaios de sequenciamento da microbiota, foram colhidas amostras cutaneas, pelos metodos carpete e escova de dentes, de 45 felinos: sintomaticos (n= 15), assintomaticos (n= 15) e negativos (n= 15). Essas amostras foram submetidas ao sequenciamento de alto rendimento na plataforma Illumina utilizando analise dos genes 16S rRNA e ITS1. Na avaliacao bidimensional das proteinas de M. canis, foi observado que elas se encontravam majoritariamente na faixa de pH de 7 a 3. Ainda, o WB revelou um amplo perfil antigenico com proteinas variando de 150 a 20 kDa em peso molecular. As proteinas de 30 e 42 kDa demonstraram intensa imunorreatividade em felinos sintomaticos e assintomaticos e baixa imunorreatividade nos negativos. O teste de Western blot conseguiu discriminar bem os gatos positivos dos gatos negativos para M. canis demonstrando elevados indices de sensibilidade (92,5%) e especificidade (90%) diagnosticas. Quanto aos resultados da analise de sequenciamento, foi observado que gatos sintomaticos e assintomaticos apresentaram um padrao semelhante na composicao e distribuicao da microbiota. Adicionalmente, nao foi observado diferenca estatistica na distribuicao relativa do Microsporum entre esses grupos. Os resultados do imunodiagnostico sugerem que as proteinas de 30 e 42 kDa apresentam elevada acuracia diagnostica e podem ser utilizadas em teste de WB, bem como sao potenciais candidatas a purificacao e subsequente utilizacao em ensaios enzimaticos. Adicionalmente, conclui-se que a atividade proteolitica do M. canis possui maior acao em ph acido. Em relacao aos dados do sequenciamento, conclui-se que o desencadeamento da dermatofitose esta mais relacionado a fatores intrinsecos referentes a imunidade do hospedeiro do que com fatores relacionados ao dermatofito ou com a distribuicao/composicao da microbiota comensal. Adicionalmente, conclui-se que embora o M. canis seja o agente causal e fator determinante para o desencadeamento da dermatofitose, sua acao isolada nao e suficiente para desencadear a enfermidade.

Dermatophytosis is a superficial fungal disease commonly seen in dermatological practice. This mycosis is an important skin disease of cats because it is contagious, infectious and can be transmitted to people. Currently, several diagnostic techniques are available to confirm clinical suspicion, and the fungal culture remains one of the most employed diagnostic tools. However, dermatophytes are slow-growing fungi and it may take several weeks for results. Therefore, the development of new diagnostic tests as immunodiagnostic, as well as microbiota sequencing Technologies can contribute to the proper identification and development of new diagnostic targets. The aim of this study was to identify the immunodominant proteins of Microsporum canis for the serological diagnosis of feline dermatophytosis. Additionally, this study aimed to evaluate the composition and diversity of skin fungal and bacterial communities of cats with dermatophytosis, asymptomatic cats (carriers of M. canis), and healthy cats. For the M. canis protein study, skin and blood samples were collected from 70 cats: symptomatic (n=20), asymptomatic (n=20), negative (n=20) and heterologous negative (n=10 ). Skin samples were submitted to fungal cultures for diagnostic confirmation and subsequent extraction of M. canis, and blood samples were evaluated by Western blot. For the microbiota study, skin samples were collected by combing the coat using a sterile polyester carpet and toothbrush, from 45 cats: symptomatic (n=15), asymptomatic (n=15) and negative (n=15). Samples were submitted to next-generation sequencing on the Illumina platform using 16S rRNA and ITS1 gene analysis. In the two-dimensional evaluation of M. canis proteins, it was observed that they were distributed in the pH range of 7 to 3. Furthermore, the WB revealed a broad antigenic profile with proteins ranging from 150 to 20 kDa. The 30 and 42 kDa proteins showed strong immunoreactivity in symptomatic and asymptomatic samples and low immunoreactivity in negative samples. The Western blot test was able to distinguish positive and negative cats for M. canis, showing high sensitivity (92.5%) and specificity (90%). The microbiota analysis showed that symptomatic and asymptomatic cats presented a similar pattern in the composition and distribution of skin microbiota. Additionally, no statistical difference was observed in the relative distribution of Microsporum between these groups. Immunodiagnostic results suggest that proteins of 30 and 42 kDa present high diagnostic accuracy and can be applied in WB tests, as well as being potential candidates for purification and subsequent application in serological assays. Additionally, it is concluded that the proteolytic activity of M. canis occurred mainly in acidic ph. Regarding the sequencing data, it is concluded that dermatophytosis is more linked to the host's immunity than to factors associated with the dermatophyte or distribution of the commensal microbiota. Additionally, it is concluded that although M. canis is the causative agent and responsible for triggering dermatophytosis, its isolated activity is not sufficient to trigger the disease.

Análise genética e antigênica do ectodominio DA da glicoproteína E2 de pestivírus isolados de bovinos do Rio Grande do Sul

Os pestivírus bovinos, o vírus da diarréia viral bovina 1, 2 (BVDV-1, BVDV-2) e o tipo HoBi (HobiPeV) estão associados a várias manifestações clínicas e falhas reprodutivas e produzem importantes perdas para a indústria pecuária. Os isolados de pestivírus de campo apresentam uma variabilidade genética e antigênica significativa, principalmente na glicoproteína E2 do envelope. Essa variabilidade pode comprometer o diagnóstico molecular e imunológico e estratégias de imunização. Assim, este estudo realizou uma análise genética e antigênica de 51 isolados de pestivírus obtidos de bovinos de corte no Rio Grande do Sul, Brasil, em 2017. Inicialmente, os isolados foram identificados por PCR e confirmados por sequenciamento e análise filogenética da região 5'UTR do genoma, complementando uma análise anteriormente realizada em uma região mais abrangente do 5'UTR. Em seguida, os isolados foram submetidos a ensaios de reatividade com 11 anticorpos monoclonais (MAbs) contra a glicoproteína E2, seguidos de sequenciamento e análise do domínio A (DA) do ectodomaco E2. Com base na análise filogenética do 5'UTR, 27 isolados foram identificados como BVDV-1 (22 -1a e 5 de -1b), 23 como BVDV-2 (todos como -2b) e um como HobiPeV (-3a). Essa subtipagem confirmou uma classificação anterior com base em uma sequência 5'UTR mais longa. A análise de sequência (nucleotídeo e aminoácido) do domínio DA E2 identificou várias alterações de nucleotídeo e aminoácido (aa), principalmente em locais imunodominantes sujeitos à ligação por anticorpos. Os resíduos de aminoácidos que apresentaram maior variabilidade foram nos locais: 695 e 782 no genoma do pestivírus bovino, locais previamente descritos por apresentarem uma alta taxa de mutações e alterações de aminoácidos. Foram observadas menos alterações aa nas posições 701 e 734. Os ensaios de ligação ao MAb revelaram uma variabilidade acentuada na maioria dos epítopos E2. Enquanto alguns MAbs reconheceram quase todos os isolados, confirmando a existência de epítopos altamente conservados em E2, muitos MAbs reconheceram poucos ou nenhum isolado. Assim, o presente estudo fornece informações importantes sobre a variabilidade genética e antigênica do ectodomínio E2 DA de pestivírus bovinos. Esta informação pode ser útil para orientar o diagnóstico molecular e imunológico e também para a formulação de vacinas

The bovine pestiviruses, bovine viral diarrhea virus 1, 2 (BVDV-1, BVDV-2) and HoBi-like (HobiPeV) are associated with several reproductive and clinical manifestations, producing important losses for the cattle industry. Field isolates have a significant genetic and antigenic variability, especially in the envelope glycoprotein E2. This variability may compromise molecular and immunological diagnosis and immunization strategies. Thus, this study performed a genetic and antigenic analysis of 51 pestivirus isolates obtained from beef cattle in Rio Grande do Sul, Brazil, in 2017. Initially, the isolates were identified by PCR and confirmed by sequencing and phylogenetic analysis of the 5'UTR region of the genome, complementing an analysis previously carried out in a more comprehensive region of the 5'UTR. Then, the isolates were submitted to reactivity assays with 11 monoclonal antibodies (MAbs) to the E2 glycoprotein, followed by sequencing and analysis of the domain A (DA) of the E2 ectodomain. Based on the phylogenetic analysis of the 5UTR, 27 isolates were identified as BVDV-1 (22 -1a and 5 of -1b), 23 as BVDV-2 (all as -2b) and one as HobiPeV(-3a). This subtyping corresponded to a previous study that characterized the entire portion of 5'UTR. Sequence analysis (nucleotide and amino acid) of the E2 DA domain identified several nucleotide and amino acid changes, mainly at immunodominant sites subjected to binding by antibodies. The amino acid residues that presented the highest variability were at sites: 695 and 782 on the bovine pestivirus genome. Fewer aa changes were also observed at position 701 and 734. MAb binding assays revealed marked variability in most E2 epitopes. On the other hand, some MAbs recognized almost all isolates, confirming the existence of highly conserved epitopes in E2, while other MAbs recognized few or no isolates. Thus, the present study provides important information about the genetic and antigenic variability of the E2 DA domain of bovine pestivirus. This information may be useful to guide molecular an immunological diagnosis and for vaccine formulation as well.

Swine Influenza Virus: Standardization of a nested RT-PCR and subtyping of field samples circulating in Brazil from 2012-2018

O vírus influenza A (IAV) causa doença respiratória aguda em suínos, caracterizada por alta morbidade nos rebanhos. Os IAVs possuem RNA segmentado de senso negativo, contribuindo para mutações e rearranjos genéticos do vírus. As glicoproteínas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) são os principais alvos da resposta imune do hospedeiro, e mutações nas mesmas contribuem para a diversidade genética do IAV. Três subtipos do vírus da influenza suína (SIV) circulam mundialmente nos suídeos: H1N1, H1N2 e H3N2. A rápida identificação dos subtipos é importante para monitorar o SIV, auxiliando na detecção de possíveis surtos e variações antigênicas virais. O objetivo deste estudo foi padronizar um teste de RT-PCR para detectar subtipos de SIV presentes no Brasil, analisando suas distribuições combinada a dados sorológicos dos anos de 2012-2018. O delineamento de primers específicos para regiões de HA, foi realizado a partir de sequências de amostras brasileiras previamente depositadas no GenBank. Amostras caracterizadas de H1N1pdm09, H3N2 e H1Delta foram utilizadas como referências. Realizou-se uma primeira (One Step RT-PCR) e uma segunda (Nested PCR) reação para padronizar o teste. Noventa e duas amostras de campo, positivas para IAV, dos anos de 2012 a 2018, foram utilizadas para validar o RT-PCR. A sensibilidade foi avaliada a partir do teste de limite de detecção e a especificidade a partir de ensaios de primers cruzados nas amostras controle. Os produtos de PCR amplificados, a partir das amostras de campo, foram sequenciados, realizando-se a análise filogenética, bem como o cálculo do p-distance entre amostras de mesmo subtipo. Sequências parciais de HA, das amostras de H1pdm do estudo e de amostras de outros anos, foram traduzidas e comparadas. Subtipagem do gene N de amostras positivas para H1Delta foi executada. Realizou-se análises sorológicas em 949 amostras de soro obtidas nos anos de 2017-2018, avaliando a presença de anticorpos contra H1N1pdm09 e H3N2 pelo teste de Inibição da Hemaglutinação (HI). O teste Nested foi mais sensível que a reação One-step. Não houve amplificação cruzada inespecífica. Setenta e uma (71/92-77%) das amostras de campo foram subtipadas pelo Nested RT-PCR, sendo 14 (14/71-20%) coletadas em 2012-2013, 35 (35/71-49%) em 2014-2015, e 22 (22/71-31 %) em 2017-2018. Em 2012-2015, a maioria foram positivas para H1N1pdm09, seguido de H1Delta e H3N2, havendo também co-infecção de H1N1pdm09+H3N2 e H1N1pdm09+H1Delta. Em 2017-2018 observou-se mais amostras positivas para H1Delta, seguido de H1N1pdm e H3N2, sendo co-infecção também foi observada. Das amostras positivas para H1Delta, apenas 57% (12/21) foram subtipadas para o gene N, a maioria positiva para N2. Das amostras de soro analisadas, 716 foram positivas para IAV, e em 2017 e 2018 a ocorrência de H3N2 foi maior que a de H1N1pdm09 bem como a co-infecção por H1N1pdm09 e H3N2. Pela análise filogenética, sequências parciais de cada subtipo analisado se agruparam em grupos semelhantes. Na análise de p-distance identificou-se dissimilaridade entre as amostras de H1Delta e de H1N1pdm09 nos períodos analisados. O alinhamento de aminoácidos de sequências parciais de H1N1pdm de diferentes anos, mostraram variações residuais, especialmente em sítios antigênicos. A técnica de Nested RT-PCR mostrou-se rápida, sensível e específica, sendo recomendada para a subtipagem de SIV. Existe a circulação de quatro subtipos de SIV no Brasil. Nos anos de 2012-2015 uma maior ocorrência de H1N1pdm foi evidenciada, porém o H3N2 foi o mais observado em 2017-2018. A análise de resíduos de aminoácidos das sequências de H1N1pdm demonstrou substituições pontuais entre amostras de diferentes anos, sugerindo a evolução do vírus ao longo do tempo. Estudos relacionados à caracterização genética de SIVs circulantes no Brasil são essenciais para entender a evolução dos vírus e suas características antigênicas

Influenza A virus (IAV) causes an acute respiratory disease in pigs, characterized by high morbidity in the herds. The IAVs have a segmented negative sense genomic RNA, which contributes to genetic mutations and virus rearrangements. The surface glycoproteins haemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are the main targets of host immune response, and mutations in these glycoproteins contribute to the genetic diversity of the virus. Three subtypes of swine influenza virus (SIV) circulate worldwide in the swine population: H1N1, H1N2 and H3N2. Rapid identification of viral subtypes is important for virus monitoring, assisting the detection of possible outbreaks and viral antigenic variations. The objective of this study was to standardize a RT-PCR test for the detection of SIV subtypes present in Brazil, analyzing their distribution combined with serological data from 2012-2018. The delineation of specific primers for the HA region was carried out from sequences of Brazilian samples, previously deposited at GenBank database. Characterized samples of H1N1pdm09, H3N2 and H1Delta were used as references. A first (One Step RT-PCR) and a second (Nested PCR) reaction was performed to standardize the test. Ninety-two field samples, previously positive for IAV, from 2012 to 2018 were used for the test validation. Sensitivity was assessed from the detection limit test and specificity from cross primer assays in control samples. The amplified PCR products from the field samples were sequenced and phylogenetic analysis was performed, as well as the p-distance calculation between samples of the same subtype. Partial HA sequences of H1pdm, from samples of the study and from other years, were translated and compared. Subtyping the N gene of H1Delta positive samples was performed. Serological analyzes were performed on 949 serum samples obtained from 2017-2018, evaluating the presence of antibodies against H1N1pdm09 and H3N2 by the Hemagglutination Inhibition (HI) test. The Nested test was more sensitive than the One-step reaction. There was no nonspecific cross amplification. Seventy-one (71/92-77%) of the field samples were subtyped by the Nested RT-PCR, 14 (14/71-20%) collected in 2012-2013, 35 (35/71- 49%) in 2014-2015, and 22 (22/71-31%) in 2017-2018. In 2012-2015, most of the samples were positive for H1N1pdm09, followed by H1Delta and H3N2, with H1N1pdm09 + H3N2 and H1N1pdm09 + H1Delta co-infection. In 2017-2018, there were more positive samples for H1Delta, followed by H1N1pdm and H3N2, and co-infection was also observed. From the H1Delta positive samples, only 57% (12/21) were subtyped for the N gene, with the majority positive for N2. A total of 716 serum samples were positive for IAV, and in 2017-2018 the occurrence of H3N2 was higher than H1N1pdm09 as well as the co-infection between H1N1pdm09+H3N2. By the phylogenetic analysis, partial sequences of each analyzed subtype have grouped into similar clusters. The p-distance analysis identified dissimilarity between samples into the H1Delta cluster and samples into H1N1pdm09 group. Amino acid alignment of H1N1pdm partial sequences, from different years, showed residual variations, especially at antigenic sites. The Nested RT-PCR technique was fast, sensitive and specific, which is recommended for SIV subtyping. Four subtypes of SIV circulate in Brazil. In 2012-2015 a higher occurrence of H1N1pdm was evidenced, but H3N2 was the most observed in 2017-2018. Analysis of amino acid residues of the H1N1pdm sequences demonstrated point substitutions between samples from different years, suggesting the evolution of the virus over time. Studies related to the genetic characterization of circulating SIVs in Brazil are essential to understand the evolution of viruses and their antigenic characteristics.

Sorologia comparativa para pestivirus de ruminantes em rebanhos bovinos do nordeste brasileiro.

A diarreia viral bovina (BVD) é uma importante enfermidade, sendo responsável por perdas econômicas em rebanhos de todo o mundo. A BVD é causada por três espécies do gênero Pestivirus da família Flaviviridae, sendo eles o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), BVDV-2 e BVDV-3. Os pestivírus apresentam grande variabilidade genética e antigênica entre as espécies virais, o que pode levar a falhas no diagnóstico e na imunização. O presente trabalho investigou a diversidade de pestivírus de bovinos de amostras da Região Nordeste brasileira através da técnica de vírus neutralização (VN) comparativa e reação de RT-PCR seguida de sequenciamento dos produtos de amplificação. Seiscentas amostras de soro foram testadas por VN contra cepas de BVDV-1, -2 e -3 e comparou-se os títulos obtidos contra cada espécie. Como resultado, 26% (156/600) das amostras apresentaram-se soropositivas, sendo que 14,3% (86/600) apresentaram maiores títulos de anticorpos (mais que quatro vezes) contra o BVDV-2, 5,3% (32/600) contra o BVDV-1 e 3,3% (20/600) contra o BVDV-3. Além disso, 1,5% (9/600) apresentaram título (inferior a quatro vezes) contra mais de uma cepa, não sendo possível definir a cepa para qual a amostra é de fato soropositiva, o que foi observado entre BVDV-1 e -2, BVDV-1 e -3 e BVDV-2 e BVDV-3 em 0,7% (4/600), 0,5% (3/600) e 0,3% (2/600) amostras, respectivamente. Uma amostra (0,16%) foi positiva na RT-PCR e o sequenciamento indicou identidade de 97,6% com uma cepa de BVDV-3. A maior soroprevalência para BVDV-2 no Nordeste do País observada no presente estudo contrasta com a maior frequência de BVDV-1 relatada na maioria do mundo, além da maior frequência de BVDV-3 relatada na mesma região em trabalho prévio utilizando RT-PCR e sequenciamento. Os dados expostos no presente estudo reforçam a necessidade de revisão das vacinas contra a BVD utilizadas no País que deveriam conter BVDV-1, -2 e -3.

Bovine viral diarrhea (BVD) is an important disease, accounting for economic losses in herds around the world. BVDV is caused by three species of the genus Pestivirus of the Flaviviridae family, including BVDV-1, BVDV-2 and BVDV-3. Pestiviruses show great genetic and antigenic variability among viral species, which can lead to failures in diagnosis and immunization. The present work investigated the bovine pestivirus diversity of samples from the Brazilian Northeast region through the comparative virus neutralization (VN) and RT-PCR reaction followed by sequencing the amplification products. Six hundred serum samples were tested by VN against BVDV-1, -2 and -3 strains and the titers obtained against each species were compared. As a result, 26% (156/600) of the samples were seropositive, and 14.3% (86/600) presented higher antibody titres (more than fourfold) against BVDV-2, 5.3% (32/600) against BVDV-1 and 3.3% (20/600) against BVDV-3. In addition, 1.5% (9/600) presented titre (less than fourfold) against more than one strain, and it is not possible to define the strain for which the sample is actually seropositive, which was observed between BVDV-1 and -2, BVDV-1 and -3 and BVDV-2 and BVDV-3 in 0.7% (4/600), 0.5% (3/600) and 0.3% (2/600) samples, respectively . A sample (0.16%) was positive on RT-PCR and the sequencing indicated 97.6% identity with a BVDV-3 strain. The greater seroprevalence for BVDV-2 in the Northeast of the country observed in the present study contrasts with the higher frequency of BVDV-1 reported in most of the world, besides the higher frequency of BVDV-3 reported in the same region in previous work using RT-PCR and sequencing. The data presented in this study reinforce the need to review BVDV-1, -2 and -3 vaccines against BVDV in the country.

Diversidade antigênica de isolados brasileiros de pestivírus HoBi-like

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um dos principais patógenos de bovinos, está distribuído mundialmente e causa grandes perdas econômicas na pecuária bovina. O gênero Pestivirus, da família Flaviviridae, é composto por quatro espécies virais: os vírus da diarreia viral bovina 1 e 2 (BVDV-1 e BVDV-2), o vírus da doença da fronteira dos ovinos (BDV) e o vírus da peste suína clássica (CSFV). Uma quinta espécie de pestivírus está sendo proposta (pestivírus atípicos bovino, HoBi-like ou BVDV-3), devido às suas diferenças genéticas e antigênicas em relação às espécies de BVDV já descritas. Estes vírus foram originalmente identificados em soro fetal bovino de origem brasileira e, posteriormente, isolados de animais infectados em vários países. Este trabalho relata uma caracterização antigênica de oito isolados brasileiros do vírus HoBi-like, oriundos de animais infectados persistentemente (PI) e de casos de doença gastroentérica (2007 a 2015). A análise filogenética baseada na região não traduzida 5 (UTR) agrupou esses vírus com outros vírus HoBi-like de origem europeia e asiática. Testes de reatividade com anticorpos monoclonais (mAbs) indicaram variabilidade na glicoproteína E2 entre os vírus Hobi-like e diferenças significativas das glicoproteínas homólogas do BVDV-1 e BVDV-2. Análise da relação antigênica com base em títulos neutralizantes, utilizando-se antissoros específicos, revelou que os vírus HoBi-like são antigenicamente muito diferentes do BVDV-1 e, em menor grau, do BVDV-2. Os ensaios de neutralização cruzada entre pares de vírus HoBi-like e seus respectivos antissoros indicaram a existência de variabilidade antigênica entre esses vírus, mesmo para vírus isolados do mesmo rebanho em diferentes ocasiões. Além disso, a identificação de um isolado HoBi-like com baixa semelhança antigênica com os outros isolados indica a existência potencial de subgrupos antigênicos entre esses vírus. Finalmente, soro de cordeiros imunizados com vacinas BVDV comerciais mostrou atividade neutralizante baixa ou indetectável contra isolados HoBi-like. Estes resultados indicam diferenças antigênicas importantes entre isolados de BVDV e vírus HoBi-like brasileiros e a existência de variabilidade antigênica dentro desse grupo de pestivírus. Esses achados ampliam o conhecimento sobre a diversidade antigênica de vírus HoBi-like e reforçam a necessidade de sua inclusão em vacinas de BVDV atuais.

Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a major pathogen of bovine herds and it is distributed globally, causing important economic losses to the cattle industry. The genus Pestivirus of the family Flaviviridae is composed by four viral species: bovine viral diarrhea virus 1 and 2 (BVDV-1 and BVDV-2), border disease virus (BDV) and classical swine fever virus (CSFV). A fifth species has been proposed (atypical pestiviruses, HoBi-like pestiviruses or BVDV-3), due to their genetic and antigenic differences in relation to BVDV species. These viruses were originally identified in fetal bovine serum from Brazilian origin and, subsequently, isolated from diseased animals in several countries. Herein we performed an antigenic characterization of eight Brazilian HoBi-like viruses isolated from persistently infected (PI) animals and from gastroenteric disease (2007 to 2015). Phylogenetic analysis based on the 5 unstranslated region (UTR) clustered these viruses with other HoBi-like viruses from European and Asiatic origin. Monoclonal antibody (mAb) binding indicated variability in the Hobi-like virus glycoprotein E2 and significant differences from the homologous BVDV-1 and BVDV-2 glycoprotein. Analysis of antigenic relatedness based on virus-neutralizing titers using virus-specific antisera revealed that HoBi-like viruses are antigenically very different from BVDV-1 and, to a lesser extent, from BVDV-2. Cross-neutralizing assays between pairs of HoBi-like viruses and their respective antisera indicated the existence of antigenic variability among these viruses, even for viruses isolated from the same herd in different occasions. Moreover, the identification of a HoBi-like isolate with low antigenic similarity with the other isolates indicates the potential existence of antigenic subgroups among HoBi-like virus isolates. Finally, sera of lambs immunized with commercial BVDV vaccines showed low or undetectable neutralizing activity against HoBi-like isolates. These results indicate significant antigenic differences between BVDV genotypes and Brazilian HoBi-like viruses and the existence of antigenic variability within this atypical group of pestiviruses. These findings extend the knowledge about the antigenic diversity of HoBi-like viruses and reinforce the need for their inclusion in current BVDV vaccines.

Perfil da infecção pelo vírus da diarreia viral bovina (BVDV) em um rebanho bovino leiteiro de alta produção e com programa de vacinação contra o BVDV / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) infection profile in a high production dairy herd with vaccination program against BVDV

A infecção pelo vírus da diarreia viral bovina (BVDV) foi avaliada em um rebanho bovino leiteiro de alta produção com histórico de problemas reprodutivos e de vacinação regular contra o BVDV. A identificação do vírus foi realizada por RT-PCR em soro sanguíneo e o perfil sorológico por vírus-neutralização. Inicialmente, 100% (n=692) dos animais do rebanho foram avaliados com relação à presença de infecção ativa pelo BVDV por meio da RT-PCR. Quatro meses após, todos os animais positivos (n=29) na primeira avaliação foram avaliados novamente pela RT-PCR, assim como todos os animais que nasceram (n=72) e os que apresentaram problemas reprodutivos (n=36) no intervalo entre a primeira e a segunda colheita de sangue. Os resultados finais do estudo possibilitaram identificar 27 animais transitoriamente infectados e três animais persistentemente infectados (PI). A sorologia, realizada apenas nos animais positivos na primeira avaliação pela RT-PCR e nas vacas que apresentaram problemas reprodutivos entre a primeira e a segunda RT-PCR, demonstrou grande flutuação nos títulos de anticorpos neutralizantes, além de soroconversão na maioria dos animais. Foram identificados aumentos nos títulos de anticorpos neutralizantes que variaram entre 3 e 8 log2, indicando infecção ativa no rebanho. A circulação viral no rebanho avaliado foi responsável pela expressão de sinais clínicos da esfera reprodutiva em animais com baixo título de anticorpos e consequente falha na proteção fetal. Os resultados demonstram que o controle da infecção pelo BVDV apenas por meio da vacinação regular em rebanhos com animais PI pode não ser eficaz na profilaxia dessa virose.(AU)

The profile of bovine viral diarrhea virus (BVDV) infection was studies in a high production dairy herd selected based on a history of reproductive failures and regular vaccination against BVDV. Virus identification was performed by RT-PCR and serological profile was determined by virus-neutralization (VN). Initially, 100% (n=692) of the animals in the herd were monitored for identification of an active infection by RT-PCR in sera. Four months later, all positive animals (n=29) were retested by RT-PCR, along with newly born animals (n=72), or those that had reproductive failures (n=36) in the interval. The RT-PCR assay identified 27 transiently infected animals and three persistently infected (PI). Serology performed only in positive animals in the first RT-PCR and in cows with reproductive failures between the first and second RT-PCR analysis, showed large variation VN antibody titers and seroconversion in most animals. Increases in VN titers were demonstrated, with variation between 3 and 8 log2, indicating virus circulation within the herd. Virus circulation in the vaccinated herd evaluated in this study was likely responsible for reproductive failures observed in cows with low VN titers and for fetal infections. These results demonstrate that control of BVDV infection by regular vaccination in dairy cattle herds with PI animals represents a great challenge for the prophylaxis of this infection.(AU)

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E ANTIGÊNICA DE Clostridium chauvoei ISOLADOS DE CASOS DE CARBÚNCULO SINTOMÁTICO EM BOVINOS

As clostridioses formam o grupo de infecções e intoxicações causadas por micro-organismos anaeróbios do gênero Clostridium. Dentre estas enfermidades, a principal doença que determina mionecrose é o carbúnculo sintomático, uma infecção endógena e aguda que acomete principalmente os bovinos, cujo agente etiológico é Clostridium chauvoei. O controle desta enfermidade se baseia em medidas adequadas de manejo e vacinações sistemáticas de todo o rebanho. As vacinas contra o carbúnculo sintomático comercializadas no Brasil são, no geral, compostas de múltiplos antígenos e seguem as normas para o controle da qualidade e eficiência definidas na legislação publicada pela Secretaria de Defesa Agropecuária (SDA) do Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). No entanto, são escassos os trabalhos com evidências científicas que comprovem a eficiência da vacina, assim como trabalhos que indiquem o grau de similaridade entre cepas de C. chauvoei utilizadas na produção destas vacinas, cepas de maior ocorrência no campo e a cepa padrão utilizada no teste de eficiência da vacina pelo MAPA. Da mesma forma os relatos acerca de falhas vacinais são informais e as circunstâncias destas falhas não são claramente elucidadas. Os principais fatores de virulência de C. chauvoei são a neuraminidase, citotoxina A (CctA) e a flagelina, sendo que a CctA parece ser o principal. Esta tese teve por objetivo avaliar a eficácia protetiva de vacinas comerciais frente ao desafio com C. chauvoei, bem como realizar a comparação genômica das cepas utilizadas no desafio vacinal (manuscrito 2). A diversidade molecular foi investigada, a partir do sequenciamento parcial dos genes da neuraminidase (nanA), CctA (cctA) e flagelina (fliC) de dezessete cepas de C. chauvoei isoladas de casos clínicos em bovinos (manuscrito 3). Também pretendeu à comparação genômica de seis cepas isoladas de casos de carbúnculo sintomático no Brasil com vistas a pesquisar diferenças moleculares na única cepa com apresentação clínica visceral (manuscrito 4). Dessa forma, discutir as implicações da caracterização molecular e antigênica no entendimento do carbúnculo sintomático, e subsidiar futuras pesquisas a fim de melhorar o controle da doença. Concluímos que o desempenho equivalente das duas cepas de C. chauvoei após o desafio in vivo e a incapacidade de infectar os animais vacinados estão correlacionados com a homologia genética das cepas, sugerindo que as falhas vacinais não estão relacionadas à variabilidade antigênica. O sequenciamento parcial dos genes nanA e cctA mostrou alta homologia entre as cepas. Por essa razão, estes antígenos solúveis são bons candidatos a antígenos vacinais. Além disso, três alelos foram detectados no gene fliC. Na comparação genômica as seis cepas brasileiras se mostraram altamente conservadas, tal como foi observado no sequenciamento parcial dos genes e na comparação das cepas utilizadas no desafio vacinal. Os resultados apresentados nesta tese podem ser um indicativo de que neste momento evolutivo C. chauvoei não está sendo desafiado a desenvolver mutações

Clostridioses are the group of infections and intoxications caused by anaerobic microorganisms of the genus Clostridium. Among these diseases, the main disease that causes myonecrosis is blackleg, an endogenous and acute infection that mainly affects cattle, whose etiological agent is Clostridium chauvoei. Control of this disease is based on adequate management measures and systematic vaccinations of herd. Vaccines against blackleg marketed in Brazil are, in general, composed of multiple antigens and follow the standards for quality and efficiency control defined in the legislation published by the Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply (MAPA). However, there are few studies with scientific evidence to prove the effectiveness of the vaccine, as well as studies indicating the degree of similarity between strains of C. chauvoei used in the production of these vaccines, strains occurring in the field and the standard strain. Likewise reports of vaccine failures are informal and the circumstances of these failures are not clearly elucidated. The main virulence factors of C. chauvoei are neuraminidase, cytotoxin A (CctA) and flagellin, and CctA appears to be the main. This thesis aimed to evaluate the protective efficacy of commercial vaccines against the challenge with C. chauvoei, as well as to carry out the genomic comparison of the strains used in the vaccine challenge (manuscript 2). The molecular diversity, from the partial sequencing of the neuraminidase (nanA), CctA (cctA) and flagellin (fliC) genes of seventeen strains of C. chauvoei isolated from clinical cases in cattle was investigated (manuscript 3). It also aimed to the genomic comparison of six strains isolated from cases of blackleg in Brazil with a view to investigate molecular differences in the only strain with visceral clinical presentation (manuscript 4). Thus, to discuss the implications of molecular and antigenic characterization in the understanding of blackleg, and to support future research with the objective of improving disease control. We concluded that the similar performance observed between the strains in challenge in vivo and the inability to infect the vaccinated animals are correlated with the genetic homology of the strains, suggesting that vaccine failures are not related to antigenic variability. Partial sequencing of nanA and cctA genes showed high homology between strains. For this reason, these soluble antigens are good candidates for vaccine antigens. Moreover, three different fliC alleles were detected among the strains studied. In the genomic comparison, the six Brazilian strains were highly conserved, as observed in the partial sequencing of the genes and in the comparison of the strains used in the vaccine challenge. The results presented in this thesis may be indicative that at this evolutionary time C. chauvoei is not being challenged to develop mutations.

Insight into the diversity, adaptation and virulence of fish-pathogenic Streptococcus agalactiae strains through transcriptomic and proteomic analysis.

A infecção por Streptococcus agalactiae (GBS) é uma das principais doenças detectadas na piscicultura mundial. Essa bactéria é o principal patógeno de tilápias, uma commodity global do setor aquícola, causando surtos de septicemia e meningoencefalite. Os isolados brasileiros de GBS oriundos de peixes possuem diferentes genótipos quando avaliados pela técnica de MLST, predominando os ST-260, ST-927 e as linhagens não tipáveis. Considerando o relacionamento evolutivo entre esses genótipos e por eles representarem as principais linhagens que infectam peixes no país, se torna necessário entender as características de metabolismo, adaptação e patogenicidade destes grupos genéticos e o seu relacionamento com o hospedeiro aquático. Para avaliar a expressão de transcritos e proteínas dos isolados de GBS, dois experimentos foram conduzidos. O primeiro experimento avaliou o pan-proteoma destes mesmos genótipos, comparou a expressão diferencial de proteínas entre os isolados obtidos de peixes e ser humano usando LC-UDMSE e identificou in silico proteínas antigênicas conservadas que poderiam ser usadas como possíveis alvos para a produção de vacinas. Enquanto que o segundo experimento objetivou avaliar o transcriptoma e o proteoma de uma linhagem de GBS obtido de peixe no Brasil, sendo o experimento conduzido em diferentes temperaturas de cultivo e analisados usando as técnicas de microarranjos e cromatografia líquida associada com espectrometria de massa (LC-HDMSE). No primeiro experimento, um total de 1065 proteínas corresponderam ao pan-proteoma dos isolados de GBS oriundos de peixes, sendo 989 identificadas em todos os isolados simultaneamente (core proteoma), 62 compartilhadas em pelo menos 2 isolados (proteoma acessório) e 14 exclusivamente expressas entre cada amostra. O alto grau de conservação de proteínas entre os isolados avaliados com diferentes STs sugerem que utilização de vacinas monovalentes podem ser efetivas contra as diferentes variantes genéticas circulantes no país. Nós observamos que as proteínas identificadas no pan-proteoma refletem na habilidade adaptativa dos isolados de peixes em responder aos fatores estressantes impostos pelo ambiente aquático e que permitem a sobrevivência e multiplicação bacteriana em peixes. Um total de 215 e 269 proteínas foram up- e down-reguladas, respectivamente, em isolados obtidos de peixes em comparação ao isolado de ser humano. Por fim, independente da similaridade do conteúdo de proteínas, a expressão global de proteínas entre os isolados de GBS obtidos de peixes e ser humano foram diferentes, sugerindo uma distinta adaptação em mamíferos e hospedeiros aquáticos na regulação do proteoma. No segundo experimento, a análise de transcriptoma detectou um total de 107 genes diferencialmente expressos no isolado SA53 a 32 ºC quando comparado com 22 ºC. Enquanto que na análise de proteoma foram detectadas 81 proteínas diferencialmente expressas. Os resultados demonstraram que a temperatura é capaz de regular a expressão diferencial de genes e proteínas, principalmente daquelas envolvidas com a expressão de fatores de virulência, metabolismo, adaptação e resistência ao estresse térmico. Em conjunto os dois experimentos providenciaram novos conhecimentos sobre diversidade, adaptação e virulência de isolados patogênicos de GBS obtidos de peixes através das análises de transcriptoma e proteoma.

Streptococcus agalactiae (GBS) infection is one the main diseases diagnosed in worldwide fish farming. This bacterium is a major pathogen for the Nile tilapia, a global commodity of the aquaculture sector, causing outbreaks of septicemia and meningoencephalitis. The Brazilian GBS fish strains have distinct known genotypes, when evaluated by the MLST technique, predominantly the ST-260, ST-927 and the non-typeable lineage. Considering the evolutionary relationship between these genotypes and for representing the major lineages that infects fish in Brazil, it becomes necessary to understand the specific characteristics of metabolism, adaptation and pathogenicity of these genetic groups as well as their relationships with the aquatic host. In order to evaluate the transcript and protein expression on GBS strains, two experiment trials were performed. The first trial evaluated the pan-proteome of these same genotypes, compared the differential expression of proteins identified between isolates from fish and human using a LC-UDMSE, and identified in silico conserved antigenic proteins that can be used as target in vaccine design. The second trial aimed to evaluate the transcriptome and proteome of a Brazilian fish-adapted GBS strain, being cultured in vitro under different temperatures and analyzed using microarray and liquid chromatography-mass spectrometry label-free shotgun (LC-HDMSE) approaches. In the first trial, a total of 1,065 protein clusters corresponded to pan-proteome of GBS fish strains, being 989 identified in all GBS fish strains (core proteome), 62 shared by at least two strains (accessory proteome) and 14 were exclusively expressed to each strain. The high degree of conservation among strains with different STs suggests that monovalent vaccines may be effective against different genetic variants. We also observed that the identified proteins in pan-proteome reflect the adaptive ability of the GBS fish strains in the response to stress factors imposed by the aquatic environment allowing the bacterial survival and multiplication in the fish host. A total of 215 and 269 proteins from GBS fish strains were up- and down-regulated, respectively, in comparison to human isolate. Regardless of the similarities in protein content, the global protein expression of the GBS human strain was different from the GBS fish strains suggesting distinct adaptations to mammal and fish host at the proteome level. In the second trial, the transcriptomic analysis detected 107 genes as being differentially expressed in SA53 at 32 ºC when compared with 22 ºC. While in proteomic analysis were detected 81 differentially expressed proteins. The results demonstrated that the temperature regulates the differential expression of genes and proteins, mainly those involved with the expression of virulence factors, metabolism, adaptation and bacterial resistance to thermal stress. Together, the two experiments provided news insights into the diversity, adaptation and virulence of fish-pathogenic GBS strains through transcriptomic and proteomic analysis.

Genetic variability of bovine viral diarrhea virus in the 5-utr in the central anatolia of Turkey / Genetic variability of bovine viral diarrhea virus in the 5-utr in the central anatolia of Turkey

Background: The genus Pestivirus in the family Flaviviridae comprises the members bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), classical swine fever virus and border disease virus. The BVDV enveloped and the genome is a single-strand positive sense RNA molecule of approximately 12.3 kilobases in length. The genome is transcribed as a single open reading frame, fl anked by 5 and 3 untranslated regions. Genetic typing of BVDV has usually been performed using sequences from the 5-UTR, Npro and E2 regions. BVDV is an RNA virus with a high genome variability having practical consequences on epidemiology, diagnosis and disease control. Genetic monitoring was suggested as the fi rst step in BVDV control because genetic typing of BVDV shows evidence of an increasing number of variants. For this reason circulating genetic typing of BVDV is important update these data. Circulating BVDV in the fi eld shows genetic and antigenic diversity. 5-UTR nucleotide sequence analysis has been widely used for pestivirus genotype identifi cation. To further characterize the BVDV, the nucleotide sequence of the 5-UTR that represents a conserved region of the virus genome was analyzed in many studies. The purpose of the current study was to investigate genotypes of pestivirus were circulating in cattle populations in Central Anatolia Region of Turkey.Materials, Methods & Results: Blood samples

Background: The genus Pestivirus in the family Flaviviridae comprises the members bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), classical swine fever virus and border disease virus. The BVDV enveloped and the genome is a single-strand positive sense RNA molecule of approximately 12.3 kilobases in length. The genome is transcribed as a single open reading frame, fl anked by 5 and 3 untranslated regions. Genetic typing of BVDV has usually been performed using sequences from the 5-UTR, Npro and E2 regions. BVDV is an RNA virus with a high genome variability having practical consequences on epidemiology, diagnosis and disease control. Genetic monitoring was suggested as the fi rst step in BVDV control because genetic typing of BVDV shows evidence of an increasing number of variants. For this reason circulating genetic typing of BVDV is important update these data. Circulating BVDV in the fi eld shows genetic and antigenic diversity. 5-UTR nucleotide sequence analysis has been widely used for pestivirus genotype identifi cation. To further characterize the BVDV, the nucleotide sequence of the 5-UTR that represents a conserved region of the virus genome was analyzed in many studies. The purpose of the current study was to investigate genotypes of pestivirus were circulating in cattle populations in Central Anatolia Region of Turkey.Materials, Methods & Results: Blood samples

DETECÇÃO E VARIABILIDADE GENÉTICA DE Mycoplasma hyopneumoniae EM AMOSTRAS DE PULMÃO DE SUÍNOS DO ESTADO DE MINAS GERAIS, BRASIL

A suinocultura é um setor agropecuário de grande importância para a economia brasileira. Os diversos sistemas de produção enfrentam grandes perdas econômicas causadas pelas doenças respiratórias, sendo a Pneumonia Enzoótica Suína (PES) uma das principais doenças respiratórias. A PES é causada pela bactéria Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) e a doença se caracteriza por uma tosse seca e crônica que afeta suínos de qualquer faixa etária. Sabemos que Mhyo possui grande diversidade genômica e proteômica, além de diferenças na virulência entre as cinco cepas conhecidas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade genética de Mhyo baseado em genes que codificam proteínas antigênicas. Foram avaliadas 148 amostras de pulmão de suínos provenientes de duas regiões do estado de Minas Gerais, 133 (89.9 %) amostras foram positivas no PCR de identificação de Mhyo. As amostras positivas foram submetidas a PCRs dos genes selecionados: mhp 0043, mhp 0660, mhp 0099, mhp 0360, mhp 0107, mhp 0067, mhp 0272, mhp 0487 e mhp 0580. Além disso, algumas amostras foram selecionadas para realizar o sequenciamento parcial dos genes específicos. Os resultados mostraram variações na frequência de distribuição dos nove genes em amostras de campo. Os genes mhp 0043, mhp 0660, mhp 0107, mhp 0067, mhp 0487 e mhp 0580 apresentaram frequência maior que 90%. Analisando o resultado do sequenciamento parcial de cada gene, observamos que as sequencias destes nove genes são bem conservadas nas cepas analisadas. Foi possível observar que Mhyo possui grande diversidade genética, no que se refere ausência ou presença destes genes. Com base nestes resultados, o estudo sugere que os genes mhp 0043, mhp 0660, mhp 0107, mhp 0067, mhp 0487 e mhp 0580 devem ser investigados como candidatos a produção de vacinas.

Pig farming is an agricultural sector of great importance to Brazilian economy. The systems of production pigs face great economic losses resulting from respiratory diseases, Swine Enzootic Pneumonia (PES) is the major respiratory diseases.PES is caused by Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) and the disease is characterized by a dry and chronic cough that affects pigs of any age. It is known that Mhyo has genomic and proteomic diversity, as well as differences in virulence among the five known strains. The objective of this work was to evaluate the genetic diversity of Mhyo based on genes encoding antigenic proteins. A total of 148 pig lung samples from two regions of the state of Minas Gerais were evaluated. 133 (89.9 %) samples were positive in PCR of Mhyo. Positive samples were submitted to PCR of nine genes selected: mhp 0043, mhp 0660, mhp 0099, mhp 0360, mhp 0107, mhp 0107, mhp 0067, mhp 0272, mhp 0487 and mhp 0580. In addition, some samples were selected to partial sequencing of specific genes. These results showed variations in the distribution frequency in field samples of nine genes. Genes mhp 0043, mhp 0660, mhp 0107, mhp 0067, mhp 0487 and mhp 0580 showed a frequency greater than 90%. Analyzing the result of the partial sequencing of each gene, we observed that the sequences of these nine genes are well conserved in the analyzed field strains. We observed that Mhyo possesses great genetic diversity, regarding the absence or presence of these genes. Based on these results, our study suggests that the genes mhp 0043, mhp 0660, mhp 0107, mhp 0067, mhp 0487 and mhp 0580 should be investigated as candidates to produce vaccines, however, future studies that determine the antigenicity of the proteins expressed by these genes should be realized.

DIVERSIDADE GENÉTICA DE Babesia bovis EM BEZERROS NATURALMENTE INFECTADOS DAS REGIÕES DE SÃO PAULO E RIO DE JANEIRO, BRASIL

A babesiose é uma doença infecciosa economicamente importante que afeta o gado bovino em todo o mundo, endêmica e importante causa de morbidade e mortalidade em bovinos no Brasil. A doença é causada por Babesia bigemina e B. bovis, protozoários parasitas intraeritrocíticos do filo Apicomplexa, agentes de enorme importância econômica em regiões tropicais e subtropicais. Merozoitos de B. bovis possuem em sua superfície, pelo menos, cinco glico-proteínas, que pertencem à família de antígenos variáveis de superfície do merozoíto (VMSA). A família VMSA de B. bovis inclui os genes msa-1, msa-2a1, msa-2a2, msa-2b e msa-2c. Estes antígenos são altamente imunogênicos e contêm epítopos sensíveis à neutralização e, por conseguinte, têm sido considerados como antígenos candidatos para o desenvolvimento de vacinas de subunidades contra B. bovis. No entanto, estes antígenos de superfície são geneticamente diversificados entre diferentes isolados de B. bovis, O que resulta em diferenças antigénicas entre vários isolados de B. bovis. A fim de avaliar a resposta imune humoral contra B. bovis e a diversidade genética de antígenos de superfície de merozoítos de B. bovis, amostras de soro e DNA de sangue de 30 bezerras, sendo 15 da Fazenda Pesagro, Seropédica, Rio de Janeiro, e outras 15 da Fazenda Germânia, Taiaçu, São Paulo, foram obtidas trimestralmente, desde o nascimento até aos 12 meses de idade. Os Anticorpos IgG para B. bovis foram detectados pelos testes de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Ensaio de Imunoadsorção Enzimático Indireto (IELISA). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi utilizada com o objetivo de avaliar a diversidade genética de B. bovis, com base em genes que codificam antígenos de superfície de merozoítos (MSAs). Os resultados da sorologia demonstram que, a partir dos seis meses de idade, todas as bezerras foram soropositivas para B. bovis. Entre as 150 amostras de DNA testadas para a presença de três fragmentos de genes de msa de B. bovis, amplicons positivos foram obtidos em 14 amostras para msa-1, 24 para msa-2b e 34 para msa-2c de bezerras da Fazenda Pesagro e em 9 amostras para msa-1, 28 para msa-2b e 34 para msa-2c em amostras de bezerras da Fazenda Germânia. O sequenciamento foi realizado pelo método de Sanger para os fragmentos de genes msa-2b (n = 3), msa- 2c (n = 5) de Seropédica e msa-1 (n = 2), msa-2b (n = 5), msa-2c (n = 5) de Taiaçu. A análise filogenética foi realizada pelo método de Máxima verossimilhança e modelos GTR + G, GTR + G + I e GTR + G+ I para MSA-1, MSA-2b e MSA-2c, respectivamente. As sequências de MSAs dos genes msa-2b e msa-2c de Seropédica posicionaram-se em dois clados, enquanto que as sequências de MSAs dos genes msa-1 e msa-2b de Taiaçu posicionaram-se em dois clados, e sequências do gene msa-2c agruparam-se em um único clado. Os resultados da sorologia mostram que foi atingida a estabilidade endêmica em ambas as fazendas. Com base nas sequências do gene msa-2b, amplificadas no presente estudo, e a análise filogenética, pode-se afirmar que as amostras de B. bovis das fazendas Pesagro e Germânia dividem-se em dois grupos genotipicos, havendo um genótipo compartilhado por ambas as fazendas.

Babesiosis, an economically important infectious disease that affects cattle worldwide, is endemic and important cause of morbidity and mortality of cattle in Brazil. The disease is caused by Babesia bigemina and B. bovis, apicomplexan intraerythrocytic protozoa parasites, which are agents of huge economic importance in tropical and subtropical regions. B. bovis merozoites present at least five (glyco-) proteins on their surfaces, which belong to a family of variable merozoite surface antigens (VMSA). The members of the VMSA family consist of merozoite surface antigen msa-1, msa-2a1, msa-2a2, msa-2b, and msa-2c. These antigens are highly immunogenic and contain neutralization-sensitive epitopes, and therefore have been considered as candidate antigens for developing subunit vaccines against B. bovis. However, these surface antigens are genetically diverse among different isolates of B. bovis, which results in antigenic differences among various B. bovis isolates. In order to evaluate the humoral immune response against B. bovis and genetic diversity of merozoite surface antigens of B. bovis, serum and DNA blood samples of 30 dairy calves, 15 from Seropedica, state of Rio de Janeiro, and the other 15 from a herd located in Taiaçu, state of São Paulo were obtained quarterly, since the birth up to 12 months of age. IgG antibodies to B. bovis were detected by Indirect Fluorescent Antibody Test (IFAT) and Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay (ELISA) tests. Polymerase Chain Reaction (PCR) was used aiming to assess the genetic diversity of B. bovis, based on genes that encode merozoite surface antigens (MSAs). The serology results demonstrate that up to six months of age all calves were seropositive to B. bovis. Among the 150 DNA blood samples tested for the presence of three B. bovis-msa gene fragments, positive amplicons were obtained in 14 samples for msa-1, 24 samples for msa-2b and 34 for msa-2c from calves of Pesagro herd, 9 samples for msa-1, 28 for msa-2b and 34 for msa-2c from calves of Germânia herd. Sequencing, by Sanger method, was performed for msa-2b (n=3), and msa-2c (n=5), genes fragments of Seropedica and msa-1(n=2), msa-2b (n=5), and msa-2c (n=5), genes fragments of Taiaçu. The phylogenetic analysis was performed by Maximum Likelihood method and models GTR+G, GTR+G+I and GTR+G+I for MSA-1, MSA-2b and MSA-2c, respectively. The Seropedica MSAs sequences namely msa-2b and msa-2c were positioned in two clades, and a Taiaçu MSAs sequence, that is msa-1 and msa-2b, were positioned in two clades, while msa-2c sequences were all grouped in only one clade. Serology results show that endemic stability has been achieved in both farms. Based on the msa-2b gene sequences amplified in the present study, and the phylogenetic analysis, it can be stated that the B. bovis samples from the Pesagro and Germânia farms are classified into two genotypic groups, having one genotype shared by both farms.