Apamin-induced alterations in J774 1. 6 macrophage metabolism / [Alterações induzidas por apamina no metabolismo de macrófagos J774 1. 6]

Among the immune system cells, macrophages have an important role. Apamin, a bee venom constituent, is important in the defense of these insects. Thus, we aimed to evaluate the metabolism of J774 1.6 macrophage cell line when exposed to isolated and purified apamin, using cytotoxicity tests by MTT reduction and analysis by flow cytometry (apoptosis / necrosis, production of reactive oxygen species (ROS), membranous lipoperoxidation (LPO), electrical potential of the mitochondrial membrane (mMP) and DNA fragmentation). None of the tested concentrations (10 to 100µg/mL) were cytotoxic according to MTT reductions. Apoptosis rates decreased at concentrations of 2.5, 5.0, and 10.0µg/mL (P<0.05), while necrosis rates increased (P<0.05). However, rates of healthy cells at the highest tested concentration (10µg/mL) did not differ from control (P>0.05). Apamin did not alter ROS, LPO, or DNA fragmentation. Therefore, all analyzed concentrations (1.25 to 10µg/mL) decreased mMP. Such decrease in apoptosis might be due to a suppression of mitochondrial pro-apoptotic messengers, as this peptide causes no oxidative stress, lipid peroxidation, and DNA damage. Highly sensitive techniques are majorly important for proper interpretation of cellular toxicity mechanisms, combined with routine laboratory methods.(AU)

Das células do sistema imunológico, macrófagos desempenham um papel fundamental. Apamina, constituinte do veneno de abelhas, é importante na defesa destas. Objetivou-se avaliar o metabolismo da linhagem de macrófagos J774 1.6 expostos à apamina isolada e purificada, avaliando-se citotoxicidade por redução de MTT e análise por citometria de fluxo (apoptose / necrose, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), lipoperoxidação membranosa (LPO), potencial elétrico da membrana mitocondrial (MMP) e fragmentação do DNA). Nenhuma concentração testada (10 a 100µg / mL) foi citotóxica. As taxas de apoptose diminuíram nas concentrações 2,5, 5,0 e 10,0µg / mL (P<0,05), enquanto as de necrose aumentaram (P<0,05). Entretanto, as taxas de células saudáveis na maior concentração testada (10µg / mL) não diferiram do controle (P>0,05). A apamina não alterou as ERO, a LPO nem a fragmentação do DNA. Portanto, todas as concentrações analisadas (1,25 a 10µg / mL) diminuíram a mMP. Tal diminuição na apoptose pode ser por uma supressão de mensageiros pró-apoptóticos mitocondriais, já que este peptídeo não causa estresse oxidativo, peroxidação lipídica nem dano ao DNA. Técnicas altamente sensíveis são importantes para adequada interpretação dos mecanismos de citotoxicidade.(AU)

Potencial antiviral e virucida da melitina e apamina contra herpesvírus bovino tipo 1 e vírus da diarreia viral bovina / Antiviral and virucidal potential of melittin and apamin against bovine herpesvirus type 1 and bovine viral diarrhea virus

A busca por alternativa aos fármacos sintéticos têm revelado descobertas no campo da farmacologia e, nesse sentido, melitina e apamina, dois constituintes do veneno de abelhas, foram descritas com várias ações farmacológicas. Este estudo objetivou avaliar in vitro as capacidades antiviral e virucida destes componentes. Para tanto, células MDBK (Madin Darby Bovine Kidney), após verificação das respectivas doses tóxicas por ensaio MTT ((3-(4,5 dimetiltiazol-2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo), foram cultivadas em microplacas e tratadas com diferentes concentrações de apamina, melitina e sua associação. Esse tratamento ocorreu antes e após a infecção com 0,1 MOI (multiplicidade de infecção) de cepas citopatogênicas de herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) cepa Los Angeles e vírus da diarreia viral bovina (BVDV) cepa NADL. Após incubação por 72 horas, 37oC, as células foram submetidas ao ensaio MTT para estimativa da viabilidade celular. Em experimento paralelo, placas que foram submetidas ao mesmo procedimento sofreram ciclo de congelamento e descongelamento das células, para rompimento das mesmas e mensuração dos títulos virais. O ensaio virucida foi realizado incubando-se suspensões de BoHV-1 e BVDV com as soluções de apamina, melitina e associação por 24 horas a 37oC e 22oC. O título viral foi avaliado às 0 horas, 1, 2, 4, 8 e 24 horas de incubação. A concentração citotóxica para 50% das células (CC50) de melitina foi 2,32 μg/ml e apamina não demonstrou toxicidade à maior concentração testada (100μg/ml). Houve efeito antiviral da melitina sobre BoHV-1, especialmente na concentração de 2μg/ml, onde observou-se 85,96% de viabilidade celular quando o tratamento foi realizado antes da infecção e 86,78% de viabilidade quando o tratamento foi realizado após a infecção. Houve ainda redução de 90% das partículas virais de BoHV-1. Em menores concentrações (1 e 1,5μg/ml) de melitina não houve atividade antiviral, pois a viabilidade celular foi baixa, demonstrando efeito citopático do vírus. Na associação das duas substâncias houve queda no título de BVDV e observou-se maior viabilidade celular quando comparados à ação isolada dos composto sobre este vírus. Isso se confirma na atividade virucida, uma vez que houve decréscimo de 90% das partículas virais de BVDV com a associação dos dois compostos do veneno de abelhas. Atuando individualmente, melitina apresentou efeito antiviral e virucida frente ao BoHV-1, zerando seu título em apenas 2 horas a 37oC. Conclui-se que melitina tem ação antiviral e virucida frente ao BoHV-1 e sua associação com apamina potencializou seus efeitos frente ao BVDV.(AU)

The search for an alternative to synthetic drugs have revealed discoveries in the field of pharmacology and, according to melittin and apamin, two components of bee venom which have been described were with various pharmacological actions.This study aimed to evaluate the in vitro antiviral and virucidal capabilities of these components. Therefore, after verification of their toxic doses by MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay, MDBK cells (Madin Darby Bovine Kidney) have been cultivated in microplates and treated with different concentrations of apamin, melittin and its association. This treatment occurred before and after infection with MOI (multiplicity of infection) 0.1 of cytopathogenic strains of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) strain Los Angeles and bovine viral diarrhea virus (BVDV) strain NADL. After incubation for 72 hours, 37°C, the cells were submitted to MTT assay to estimate cell viability. In parallel experiments, plates were subjected to the same procedure suffered freezing and thawing cycle the cells to rupture the same and measurement of viral titers. The virucidal assay was performed by incubating suspension of bovine herpesvirus type-1 and BVDV with apamin solutions, melittin and association for 24 hours at 37°C and 22°C. The viral titer was evaluated at 0 hours, 1, 2, 4, 8 and 24 hours of incubation. The cytotoxic concentration to 50% of the cells (CC50) of melittin was 2.32g/mL and apamin did not show toxicity at the greater concentration tested (100μg/mL). There was antiviral effect of melittin on bovine herpesvirus type-1, especially at a concentration of 2μg/mL, where was observed 85.96% cell viability when treatment was performed before the infection and 86.78% viability when the treatment was carried out after infection. There was also a 90% reduction of viral particles of bovine herpesvirus type-1. In lower concentrations (1 and 1.5μg/mL) melittin no antiviral activity because cell viability was low, showing cytopathic effect of the virus. At the association two substances there were a decrease in the title of BVDV and there was higher cell viability when compared to the isolated action of the compounds of this virus. This is confirmed in the virucidal activity, since there was a decrease of 90% of the viral particles of BVDV with the combination of the two compounds of bee venom. Acting individually, melittin showed antiviral effect and virucidal against for BoHV-1, zeroing its title in just 2 hours at 37°C. It is concluded that melittin has antiviral and virucidal action against the BoHV-1 and its association with apamin potentiate its effects against BVDV.(AU)

Potencial antiviral e virucida da melitina e apamina contra herpesvírus bovino tipo 1 e vírus da diarreia viral bovina / Antiviral and virucidal potential of melittin and apamin against bovine herpesvirus type 1 and bovine viral diarrhea virus

A busca por alternativa aos fármacos sintéticos têm revelado descobertas no campo da farmacologia e, nesse sentido, melitina e apamina, dois constituintes do veneno de abelhas, foram descritas com várias ações farmacológicas. Este estudo objetivou avaliar in vitro as capacidades antiviral e virucida destes componentes. Para tanto, células MDBK (Madin Darby Bovine Kidney), após verificação das respectivas doses tóxicas por ensaio MTT ((3-(4,5 dimetiltiazol-2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo), foram cultivadas em microplacas e tratadas com diferentes concentrações de apamina, melitina e sua associação. Esse tratamento ocorreu antes e após a infecção com 0,1 MOI (multiplicidade de infecção) de cepas citopatogênicas de herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) cepa Los Angeles e vírus da diarreia viral bovina (BVDV) cepa NADL. Após incubação por 72 horas, 37oC, as células foram submetidas ao ensaio MTT para estimativa da viabilidade celular. Em experimento paralelo, placas que foram submetidas ao mesmo procedimento sofreram ciclo de congelamento e descongelamento das células, para rompimento das mesmas e mensuração dos títulos virais. O ensaio virucida foi realizado incubando-se suspensões de BoHV-1 e BVDV com as soluções de apamina, melitina e associação por 24 horas a 37oC e 22oC. O título viral foi avaliado às 0 horas, 1, 2, 4, 8 e 24 horas de incubação. A concentração citotóxica para 50% das células (CC50) de melitina foi 2,32 μg/ml e apamina não demonstrou toxicidade à maior concentração testada (100μg/ml). Houve efeito antiviral da melitina sobre BoHV-1, especialmente na concentração de 2μg/ml, onde observou-se 85,96% de viabilidade celular quando o tratamento foi realizado antes da infecção e 86,78% de viabilidade quando o tratamento foi realizado após a infecção. Houve ainda redução de 90% das partículas virais de BoHV-1. Em menores concentrações (1 e 1,5μg/ml) de melitina não houve atividade antiviral, pois a viabilidade celular foi baixa, demonstrando...(AU)

The search for an alternative to synthetic drugs have revealed discoveries in the field of pharmacology and, according to melittin and apamin, two components of bee venom which have been described were with various pharmacological actions.This study aimed to evaluate the in vitro antiviral and virucidal capabilities of these components. Therefore, after verification of their toxic doses by MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay, MDBK cells (Madin Darby Bovine Kidney) have been cultivated in microplates and treated with different concentrations of apamin, melittin and its association. This treatment occurred before and after infection with MOI (multiplicity of infection) 0.1 of cytopathogenic strains of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) strain Los Angeles and bovine viral diarrhea virus (BVDV) strain NADL. After incubation for 72 hours, 37°C, the cells were submitted to MTT assay to estimate cell viability. In parallel experiments, plates were subjected to the same procedure suffered freezing and thawing cycle the cells to rupture the same and measurement of viral titers. The virucidal assay was performed by incubating suspension of bovine herpesvirus type-1 and BVDV with apamin solutions, melittin and association for 24 hours at 37°C and 22°C. The viral titer was evaluated at 0 hours, 1, 2, 4, 8 and 24 hours of incubation. The cytotoxic concentration to 50% of the cells (CC50) of melittin was 2.32g/mL and apamin did not show toxicity at the greater concentration tested (100μg/mL). There was antiviral effect of melittin on bovine herpesvirus type-1, especially at a concentration of 2μg/mL, where was observed 85.96% cell viability when treatment was performed before the infection and 86.78% viability when the treatment was carried out after infection. There was also a 90% reduction of viral particles of...(AU)

Potencial antiviral e virucida da melitina e apamina contra herpesvírus bovino tipo 1 e vírus da diarreia viral bovina

ABSTRACT: The search for an alternative to synthetic drugs have revealed discoveries in the field of pharmacology and, according to melittin and apamin, two components of bee venom which have been described were with various pharmacological actions.This study aimed to evaluate the in vitro antiviral and virucidal capabilities of these components. Therefore, after verification of their toxic doses by MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay, MDBK cells (Madin Darby Bovine Kidney) have been cultivated in microplates and treated with different concentrations of apamin, melittin and its association. This treatment occurred before and after infection with MOI (multiplicity of infection) 0.1 of cytopathogenic strains of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) strain Los Angeles and bovine viral diarrhea virus (BVDV) strain NADL. After incubation for 72 hours, 37°C, the cells were submitted to MTT assay to estimate cell viability. In parallel experiments, plates were subjected to the same procedure suffered freezing and thawing cycle the cells to rupture the same and measurement of viral titers. The virucidal assay was performed by incubating suspension of bovine herpesvirus type-1 and BVDV with apamin solutions, melittin and association for 24 hours at 37°C and 22°C. The viral titer was evaluated at 0 hours, 1, 2, 4, 8 and 24 hours of incubation. The cytotoxic concentration to 50% of the cells (CC50) of melittin was 2.32g/mL and apamin did not show toxicity at the greater concentration tested (100g/mL). There was antiviral effect of melittin on bovine herpesvirus type-1, especially at a concentration of 2g/mL, where was observed 85.96% cell viability when treatment was performed before the infection and 86.78% viability when the treatment was carried out after infection. There was also a 90% reduction of viral particles of bovine herpesvirus type-1. In lower concentrations (1 and 1.5g/mL) melittin no antiviral activity because cell viability was low, showing cytopathic effect of the virus. At the association two substances there were a decrease in the title of BVDV and there was higher cell viability when compared to the isolated action of the compounds of this virus. This is confirmed in the virucidal activity, since there was a decrease of 90% of the viral particles of BVDV with the combination of the two compounds of bee venom. Acting individually, melittin showed antiviral effect and virucidal against for BoHV-1, zeroing its title in just 2 hours at 37°C. It is concluded that melittin has antiviral and virucidal action against the BoHV-1 and its association with apamin potentiate its effects against BVDV.

RESUMO: A busca por alternativa aos fármacos sintéticos têm revelado descobertas no campo da farmacologia e, nesse sentido, melitina e apamina, dois constituintes do veneno de abelhas, foram descritas com várias ações farmacológicas. Este estudo objetivou avaliar in vitro as capacidades antiviral e virucida destes componentes. Para tanto, células MDBK (Madin Darby Bovine Kidney), após verificação das respectivas doses tóxicas por ensaio MTT ((3-(4,5 dimetiltiazol-2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo), foram cultivadas em microplacas e tratadas com diferentes concentrações de apamina, melitina e sua associação. Esse tratamento ocorreu antes e após a infecção com 0,1 MOI (multiplicidade de infecção) de cepas citopatogênicas de herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) cepa Los Angeles e vírus da diarreia viral bovina (BVDV) cepa NADL. Após incubação por 72 horas, 37oC, as células foram submetidas ao ensaio MTT para estimativa da viabilidade celular. Em experimento paralelo, placas que foram submetidas ao mesmo procedimento sofreram ciclo de congelamento e descongelamento das células, para rompimento das mesmas e mensuração dos títulos virais. O ensaio virucida foi realizado incubando-se suspensões de BoHV-1 e BVDV com as soluções de apamina, melitina e associação por 24 horas a 37oC e 22oC. O título viral foi avaliado às 0 horas, 1, 2, 4, 8 e 24 horas de incubação. A concentração citotóxica para 50% das células (CC50) de melitina foi 2,32 g/ml e apamina não demonstrou toxicidade à maior concentração testada (100g/ml). Houve efeito antiviral da melitina sobre BoHV-1, especialmente na concentração de 2g/ml, onde observou-se 85,96% de viabilidade celular quando o tratamento foi realizado antes da infecção e 86,78% de viabilidade quando o tratamento foi realizado após a infecção. Houve ainda redução de 90% das partículas virais de BoHV-1. Em menores concentrações (1 e 1,5g/ml) de melitina não houve atividade antiviral, pois a viabilidade celular foi baixa, demonstrando efeito citopático do vírus. Na associação das duas substâncias houve queda no título de BVDV e observou-se maior viabilidade celular quando comparados à ação isolada dos composto sobre este vírus. Isso se confirma na atividade virucida, uma vez que houve decréscimo de 90% das partículas virais de BVDV com a associação dos dois compostos do veneno de abelhas. Atuando individualmente, melitina apresentou efeito antiviral e virucida frente ao BoHV-1, zerando seu título em apenas 2 horas a 37oC. Conclui-se que melitina tem ação antiviral e virucida frente ao BoHV-1 e sua associação com apamina potencializou seus efeitos frente ao BVDV.

Prospecção de atividades biológicas da apamina e melitina

A busca por novos fármacos têm levado as pesquisas ao encontro dos produtos naturais que oferecem uma quantidade inimaginável de princípios ativos ainda desconhecidos. A apicultura moderna é um segmento da agropecuária que fornece alguns produtos naturais como a própolis, o mel, a cera, a geleia real e a apitoxina, que vêm sendo alvo de pesquisas devido às diversas atividades biológicas já apresentadas. A apitoxina (veneno de abelhas) é uma complexa mistura de substâncias bioativas, entre elas os peptídeos apamina e melitina. O primeiro trata se da menor neurotoxina conhecida e com apenas 18 aminoácidos em sua composição representa 2% do peso seco do veneno. Já melitina, composta de 26 aminoácidos, corresponde a 50% do peso seco do veneno e é um conhecido peptídeo tóxico capaz de causar lise em diversos tipos celulares. Neste sentido, este estudo objetivou caracterizar estes dois peptídeos quanto à sua citotoxicidade e seu poder antimicrobiano. Através do ensaio de redução do MTT (3-(4,5 dimetiltiazol- 2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo) foi possível determinar as concentrações citotóxicas de melitina para 50% dos cultivos celulares (CC50), que variou de 2,3 a 4,1 µg/mL e a CC90, que variou de 2,7 a 4,7 µg/mL para diferentes linhagens celulares e, ao expor estas células frente à melitina por diferentes períodos pôde-se observar que com apenas 5 minutos de exposição, houve queda nas viabilidades celulares. Já os ensaios de toxicidade realizados em citometria de fluxo demonstram que, com concentrações de melitina abaixo das consideradas tóxicas pelo ensaio de redução do MTT, as células já apresentavam sinais de toxicidade da melitina, alterando os padrões de apoptose e necrose, aumentando a peroxidação das membranas lipídicas (LPO), assim como a produção intracelular de espécies reativas ao oxigênio (ROS) e da fragmentação de seu DNA. Por microscopia confocal foi possível a observação de focos de apoptose e necrose e do aumento da fluidez das membranas das células proporcional ao aumento da concentração de melitina em que essas foram expostas. Houve correlação positiva entre LPO e ROS (r=0,3158, p<0,05), taxa de apoptose (r= 0,4978, p<0,05) e com a funcionalidade das mitocôndrias (r= 0,3149, p<0,05). LPO parece iniciar os demais eventos de toxicidade celular avaliados e aumentar a funcionalidade mitocondrial em resposta ao estresse sofrido pelas células. Sendo assim, a citometria de fluxo e a microscopia confocal demonstraram eficiência em auxiliar a desvendar os mecanismos de toxicidade de melitina e se portam como técnicas complementares ao ensaio MTT, que avalia a viabilidade celular apenas através da funcionalidade mitocondrial. Quanto à atividade antiviral da melitina, houve a inativação de herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1), especialmente na concentração 2µg/ml. Apamina atuandoisoladamente não apresentou poder antiviral, porém quando aliada à melitina, apresentou efeito antiviral contra o vírus da diarreia viaral bovina (BVDV). Resultados com padrões semelhantes ocorreram ao analisar o poder virucida das substâncias, quando melitina inativou BoHV-1 em 2 horas de incubação com este vírus mas não apresentou ação contra o BVDV, assim como a apamina, mas a associação potencializou o efeito virucida contra BVDV. Já quanto à atividade antibacteriana, a concentração inibitória mínima (CIM) e bactericida mínima (CBM) de melitina foram, respectivamente (em µg/ml), frente a Staphylococcus aureus (6-7 e 32-64), Escherichia coli (40-42,5 e 64-128) e Pseudomonas aeruginosa (65-70 e 64-128). Biofilmes de S. aureus foram mais sensíveis à ação da melitina quanto comparados aos biofilmes produzidos pelas Gram negativas. Melitina foi capaz de destruir biofilmes pré-formados pelas três espécies bacterianas estudadas além de inibir a formação dos biofilmes por estas espécies quando foram previamente incubadas com melitina em concentrações abaixo da CIM. Os resultados são promissores quanto à capacidade antimicrobiana das substâncias apresentando potencial para o desenvolvimento de novos fármacos e/ou sanitizantes e, os mecanismos de toxicidade avaliados podem auxiliar nesse desenvolvimento.

The search for new drugs leads the researchs to meeting the natural products that offers an unimaginable amount of still unknown active principles. The modern apiculture is a segment of agriculture that provides some natural products such as propolis, honey, wax, royal jelly and apitoxin, which have been the subject of research due to the various biological activities already presented. Apitoxin (bee venom) is a complex mixture of bioactive substances, and between them the peptides apamin and melittin. The first is the smaller known neurotoxin and, with only 18 amino acids in its composition, represent 2% of the dry weight of the venom. Melitin, composed of 26 amino acids, corresponds to 50% of the dry weight of the venom and is a known toxic peptide capable of causing lysis in several cell types. In this sense, this study aims to characterize these two peptides as to their cytotoxicity and their antimicrobial power. By the reduction of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) - 2-5-diphenyl-2H-tetrazolate bromide) test, it was possible to determine the cytotoxic concentrations of melittin to 50% of the cell cultures (CC50) which ranged from 2.3 to 4.1 g / mL and CC90, ranging from 2.7 to 4.7 g / mL for different cell lines, and by expose these cells to melina for different periods it was observed that only 5 minutes of exposure, there was decrease in cellular viability. The toxicity tests performed in flow cytometry shows that, with melittin concentrations below the toxic concentration considerated by the MTT reduction test, the cells showed signs of melittin toxicity, altering the patterns of apoptosis and necrosis, increasing the peroxidation of membranes (LPO), as well as an intracellular production of oxygen reactive species (ROS) and the fragmentation of their DNA. By confocal microscopy it was possible to observe foci of apoptosis, necrosis and the increase of cell membranes fluidity proportional to the increase in the concentration of melittin in which they were exposed. There was a positive correlation between LPO and ROS (r = 0.3158, p <0.05), apoptosis rate (r = 0.4978, p <0.05) and mitochondrial functionality (r = 0.3149, P0.05). LPO seems to initiate the other evaluated events of cellular toxicity and increase mitochondrial functionality in response to the stress undergone by the cells. Therefore, the flow cytometry and confocal microscopy have demonstrated efficiency in helping to unravel the mechanisms of melittin toxicity and behave as complementary techniques to the MTT assay, which evaluates the cellular viability by mitochondrial functionality. As for the antiviral activity of melittin, there was inactivation of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), especially at 2g / ml concentration. Apamin acting alone did not present antiviral power, but when allied to melittin, presented antiviral effect against bovine viral diarrhea virus (BVDV). Results with similar patterns ocurred when analyzing the virucidal power of the substances,when melittin inactivated BoHV-1 with 2 hours of incubation with this virus but showed no action against BVDV, as well as apamine, but the association potentiated their virucidal effect against BVDV. As for antibacterial activity, the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) of melittin were, respectively (in g / mL), against Staphylococcus aureus (6-7 and 32- 64), Escherichia coli (40- 42,5 and 64-128) and Pseudomonas aeruginosa (65-70 and 64-128). Biofilms of S. aureus were more sensitive to the action of melitin compared to biofilms produced by Gram negative bacteria. Melittin was able to destroy preformed biofilms by the three bacterial species studied and inhibited the formation of biofilms by these species when they were previously incubated with melittin at concentrations below MIC. The results are promising as to the antimicrobial capacity of the substances presenting potential for the development of new drugs and / or sanitizers and the mechanisms of toxicity can aid in the development