Criopreservação e cultivo de tecido testicular em mamíferos - estado da arte, desafios e perspectivas / Cryopreservation and culture of testicular tissue in mammals - state of the art, challenges and perspectives

O tecido testicular contém células germinativas, que possuem potencial para se desenvolver em espermatozoides viáveis por meio do cultivo in vitro ou xenotransplante, sendo uma alternativa interessante a ser utilizada na formação de biobancos. Esta revisão compila as atualizações, desafios e perspectivas relacionadas às técnicas de criopreservação e cultivo de tecido testicular como estratégia para a conservação de espécies mamíferas. O tecido testicular pode ser obtido tanto de indivíduos adultos como pré púberes, seja após orquiectomia ou até mesmo após a sua morte. O tecido fragmentado pode ser criopreservado por congelação lenta ou rápida e por métodos de vitrificação. Os crioprotetores são indispensáveis durante a criopreservação e podem variar o tipo e concentração de acordo com a espécie. Com os avanços da criopreservação deste material, espermatozoides podem ser obtidos por transplante de fragmentos testiculares ou células germinativas isoladas em camundongos imunodeficientes. No entanto, a obtenção de espermatozoides no cultivo in vitro ainda é um desafio.(AU)

The testicular tissue contains germ cells, which have the potential to develop into viable spermatozoa through in vitro culture or xenotransplantation, being an interesting alternative to be used in the formation of biobanks. This review compiles updates, challenges and perspectives related to cryopreservation techniques and testicular tissue culture as a strategy for the conservation of mammalian species. Testicular tissue can be obtained from both adult and pre-pubertal individuals, either after orchiectomy or even after their death. Fragmented tissue can be cryopreserved by slow or fast freezing and by vitrification methods. Cryoprotectants are indispensable during cryopreservation and may vary in type and concentration according to the species. With advances in cryopreservation of this material, spermatozoa can be obtained by transplanting testicular fragments or isolated germ cells into immunodeficient mice. However, obtaining spermatozoa in in vitro culture is still a challenge.(AU)

Recuperação, caracterização e criopreservação de espermatozoides epididimários de animais silvestres do bioma Caatinga / Recovery, characterization and cryopreservation of epididymal sperm from wild animals of the Caatinga biome

A Caatinga, bioma exclusivamente brasileiro, abriga grande diversidade biológica, porém sofre com graves ameaças ambientais. Por isso, é iminente a necessidade de desenvolvimento de técnicas voltadas para a conservação dos animais que nela habitam, bem como se seu germoplasma. Quando do súbito óbito de um animal biologicamente valioso, a recuperação de espermatozoides epididimários pode se apresentar como a única possibilidade para salvaguardar gametas. Ainda, esta biotécnicas configura-se em uma ferramenta possível de ser utilizada quando não há outra forma de se coletar o sêmen em determinada espécie. Os espermatozoides coletados podem ser armazenados por meio da criopreservação, e posteriormente utilizados em outras biotecnologias. Neste sentido, esta revisão tem como objetivo apresentar os aspectos da recuperação, caracterização e criopreservação de espermatozoides epididimários em animais silvestres com principal foco em espécies do bioma Caatinga, como os preás, cutias, catetos e emas.(AU)

The Caatinga, an exclusively Brazilian biome, is home to great biological diversity, but suffers from serious environmental threats. Therefore, there is an imminent need to develop techniques aimed at the conservation of the animals that inhabit it, as well as their germplasm. When the sudden death of a biologically valuable animal, the recovery of epididymal spermatozoa may present itself as the only possibility to safeguard gametes. Still, this biotechnique is a tool that can be used when there is no other way to collect semen in each species. Collected spermatozoa can be stored through cryopreservation, and later used in other biotechnologies. In this sense, this review aims to present aspects of recovery, characterization, and cryopreservation of epididymal spermatozoa in wild animals with a focus on species from the Caatinga biome, such as cavies, agoutis, collared peccary, and rheas.(AU)

Biobancos para a conservação da vida silvestre: desafios e perspectivas / Biobanks for wildlife conservation: challenges and prospects

Um repositório de amostras biológicas, ou biobanco, pode ser definido como uma coleção-base de amostras orgânicas de origem humana, animal, vegetal ou microbiana, destinados para a conservação da ampla variabilidade dos recursos genéticos, apresentando-se como uma alternativa para a manutenção da biodiversidade. Esses repositórios são instrumentos indispensáveis no proposito de salvaguardar e coordenar um conjunto de informações da fauna silvestre, dando origem a uma rede de dados para o desenvolvimento de estratégias para a conservação de espécimes com genótipos raros ou ameaçados. Portanto, esta revisão tem como objetivo ressaltar a importância e aplicabilidade dos biobancos para a conservação da vida silvestre, destacando o estado da arte, e enfatizando os aspectos técnicos, procedimentos necessários para sua implementação e quais os principais desafios e pespectivas para o aprimoramento e utilização desse recurso na biotecnologia reprodutiva.(AU)

A repository of biological samples or biobanks can be defined as a base collection of organic samples of human, animal, plant or microbial origin, intended for the conservation of the wide variability of genetic resources, presenting itself as an alternative for the maintenance of the biodiversity. These repositories are indispensable instruments for the purpose of safeguarding and coordinating a set of information on wildlife, giving rise to a data network for the development of strategies for the conservation of specimens with rare or endangered genotypes. Therefore, this review aims to highlight the importance and applicability of biobanks for the conservation of wildlife, highlighting the state of the art, and emphasizing the technical aspects, as well as the necessary procedures for its implementation and what are the main challenges and perspectives for the improvement and use of this resource in reproductive biotechnology.(AU)

Desafios para a reprodução assistida em animais de vida livre / Challenges for assisted reproduction in free-living animals

A reprodução assistida se faz necessária em programas de conservação de espécies ameaçadas de extinção, sendo um facilitador de transporte e troca de material genético. Neste contexto, o acesso ao material de animais de vida livre é essencial para incrementar o banco genético da espécie em questão, no entanto adaptar os métodos possíveis à realidade do campo torna essa área de pesquisa desafiadora. Ainda hoje os espermatozoides são os gametas mais acessados em animais de vida livre, porém com pouco uso efetivo para criopreservação e produção de filhotes. É pungente a necessidade de mais pesquisas nesta área, uma vez que há centenas de espécies brasileiras ameaçadas, com especificidades fisiológicas e que habitam habitats variados, o que demanda adaptações espécie-específicas e hábitat específicas.

Assisted reproduction is necessary for conservation programs for endangered species, facilitating transport and exchange of genetic material. In this context, access to material from free-living animals is essential to increase the genetic bank of the species in question. However, adapting the possible methods to the reality of the fieldwork makes this area of research a challenge. Even today, sperm are the most accessed gametes in free-living animals, but with little effective use for cryopreservation and production of offspring. The need for more research in this area is acute, as there are hundreds of Brazilian species under threat, with physiological specificities, and that inhabit varied habitats, which demand species-specific adaptations and specific habitats.

Coleta e criopreservação de células espermáticas do epidídimo de cervo dama (Dama dama): relato de caso / Fallow deer (Dama dama) epididymal sperm collection and cryopreservation: case report

O objetivo do presente relato foi avaliar a viabilidade da técnica de coleta de células espermáticas do epidídimo de um cervo dama (Dama dama) após orquiectomia e comparar sua capacidade de criopreservação utilizando dois diluidores comerciais diferentes, o Triladyl® e o Andromed®. Foram avaliados o volume testicular, a motilidade e vigor espermáticos e a morfologia das células espermáticas antes e após o processo de criopreservação. Ao se comparar os dois meios comerciais, pode-se constatar que a motilidade e vigor espermáticos foram melhores na alíquota congelada com Triladyl® (25% e 2) do que com Andromed® (10% e 1). Quanto a morfologia espermática os dois diluidores apresentaram valores semelhantes de defeitos totais (32.5% com Andromed® e 33% com Triladyl®, sendo a cabeça lanciforme o defeito predominante em ambos os casos). Diante desses resultados, a técnica de coleta de células espermáticas do epidídimo é viável para cervídeos Dama e mais estudos são necessários para se estabelecer o melhor meio diluidor para esta espécie criada em climas tropicais.(AU)

The aim of the present report was to evaluate the viability of epididymal sperm collection technique in a fallow deer (Dama dama) after orchiectomy and to compare its cryopreservation capacity using two different commercial extenders, Triladyl® and Andromed®. Thus, testicular volume, sperm motility and vigor, and sperm cell morphology were evaluated before and after the cryopreservation process. When comparing the two commercial media, sperm motility and vigor were better in the post-thawed aliquot extended with Triladyl® (25% and 2) than with Andromed® (10% and 1). Regarding sperm morphology, the two dilutors presented similar values of total defects (32.5% with Andromed® and 33% with Triladyl®, with the lanciform head being the predominant defect in both cases). Given these results, the epididymal sperm cell collection technique is viable for Dama cervids and further studies are needed to establish the best extender for this species raised under tropical conditions.(AU)

Coleta e criopreservação de células espermáticas do epidídimo de cervo dama (Dama dama): relato de caso / Fallow deer (Dama dama) epididymal sperm collection and cryopreservation: case report

O objetivo do presente relato foi avaliar a viabilidade da técnica de coleta de células espermáticas do epidídimo de um cervo dama (Dama dama) após orquiectomia e comparar sua capacidade de criopreservação utilizando dois diluidores comerciais diferentes, o Triladyl® e o Andromed®. Foram avaliados o volume testicular, a motilidade e vigor espermáticos e a morfologia das células espermáticas antes e após o processo de criopreservação. Ao se comparar os dois meios comerciais, pode-se constatar que a motilidade e vigor espermáticos foram melhores na alíquota congelada com Triladyl® (25% e 2) do que com Andromed® (10% e 1). Quanto a morfologia espermática os dois diluidores apresentaram valores semelhantes de defeitos totais (32.5% com Andromed® e 33% com Triladyl®, sendo a cabeça lanciforme o defeito predominante em ambos os casos). Diante desses resultados, a técnica de coleta de células espermáticas do epidídimo é viável para cervídeos Dama e mais estudos são necessários para se estabelecer o melhor meio diluidor para esta espécie criada em climas tropicais.

The aim of the present report was to evaluate the viability of epididymal sperm collection technique in a fallow deer (Dama dama) after orchiectomy and to compare its cryopreservation capacity using two different commercial extenders, Triladyl® and Andromed®. Thus, testicular volume, sperm motility and vigor, and sperm cell morphology were evaluated before and after the cryopreservation process. When comparing the two commercial media, sperm motility and vigor were better in the post-thawed aliquot extended with Triladyl® (25% and 2) than with Andromed® (10% and 1). Regarding sperm morphology, the two dilutors presented similar values of total defects (32.5% with Andromed® and 33% with Triladyl®, with the lanciform head being the predominant defect in both cases). Given these results, the epididymal sperm cell collection technique is viable for Dama cervids and further studies are needed to establish the best extender for this species raised under tropical conditions.

Criopreservação e cultivo de tecido testicular como ferramenta na conservação de mamíferos silvestres / Testicular tissue cryopreservation and culture as a tool for the conservation of wild mammals

A criopreservação do tecido testicular se apresenta como ferramenta promissora para a reprodução assistida, possibilitando o armazenamento de fragmentos contendo grande número de células germinativas em várias fases de desenvolvimento, incluindo espermatogônias indiferenciadas que podem ser cultivadas, garantindo a produção ilimitada de espermatozoides. Nesta revisão, são abordados aspectos técnicos relativos ao processamento e aplicabilidade da criopreservação e do cultivo de tecido testicular em mamíferos silvestres, ressaltando seus desafios e perspectivas.(AU)

Cryopreservation of the testicular tissue is a promising tool for assisted reproduction, allowing the storage of fragments containing a large number of germ cells in various stages of development, including undifferentiated spermatogonia that can be cultured, guaranteeing the unlimited production of spermatozoa. In this review, technical aspects related to the processing and applicability of testicular tissue cryopreservation and culture in wild mammals are discussed, highlighting their challenges and perspectives.(AU)

Use of the ACP® and BTS extenders for cooling at 15°C white-lipped peccary (Tayassu pecari) semen / Uso dos diluidores ACP® e BTS para refrigeração a 15°C de sêmen de queixada (Tayassu pecari)

Knowledge about reproduction of white-lipped peccary is of great importance to assist with the conservation of this species and enable its rational use in captivity. This study aimed to evaluate the effect of ACP-103®, ACP-116® and BTS semen extenders on sperm viability during cooling of Tayassu pecari semen. Five ejaculates from four adult males were chilled. The animals were submitted to the protocols of sedation and anesthesia for semen collection by the electroejaculation method. After collection, the semen was macro- and microscopically assessed and diluted to reach 35x106 spermatozoa/mL in each of the three different extenders tested. The fresh-extended semen was packed in a BotuFLEX® thermal box to keep samples at 15°C for 24 hours. After cooling, the following semen parameters were analyzed: sperm motility, functional and structural integrity of sperm membranes, mitochondrial activity, chromatin condensation, and the thermoresistance test was performed. The parameters sperm motility, structural and functional integrity of sperm membranes, mitochondrial activity, and chromatin condensation were preserved after use of the extenders tested, and were similar to those of in natura semen (p>0.05). Curvilinear velocity (VCL) (p<0.05) was the only parameter with reduced values after cooling regardless of the extender used. The percentage of sperm with normal morphology was greater in samples cooled using the BTS extender (p<0.05). The ACP-103®, ACP-116® and BTS extenders can be used for the cooling and preservation of white-lipped peccary semen at 15°C for 24 hours.(AU)

Para auxiliar na conservação da espécie e permitir o uso racional do queixada em cativeiro é de grande importância o conhecimento sobre a reprodução da espécie. Objetivou-se avaliar o efeito dos diluidores de sêmen ACP-103®, ACP-116® e BTS na viabilidade espermática durante a refrigeração do sêmen do Tayassu pecari. Foram refrigerados cinco ejaculados provenientes de quatro machos adultos. Os animais foram contidos com auxílio de puçá e submetidos ao protocolo de sedação e anestesia para realização da coleta de sêmen pelo método da eletroejaculação. Depois da coleta, o sêmen foi avaliado macro e microscopicamente e diluído para atingir 35x106 espermatozoides/mL em cada um dos três diferentes diluidores testados. O sêmen diluído foi acondicionado em caixa térmica BotuFLEX® para manter as amostras a 15°C por um período de 24 horas. Depois da refrigeração, os espermatozoides foram avaliados quanto aos parâmetros de movimento espermático, integridade funcional e estrutural das membranas espermáticas, atividade mitocondrial, condensação da cromatina e teste de termorresistência. Os diluidores testados preservaram as características cinéticas, a integridade estrutural e funcional das membranas espermáticas, a atividade mitocondrial e a condensação da cromatina semelhante ao sêmen in natura (P>0,05). O único parâmetro que reduziu com o processo de refrigeração independente do diluidor utilizado foi a Velocidade Curvilinear (VCL) (P<0,05). Foi observado aumento do percentual de espermatozoides morfologicamente normais nas amostras refrigeradas em BTS (P<0,05). Os diluidores ACP-103®, ACP-116® e BTS podem refrigerar e conservar o sêmen de queixada a 15°C por 24 horas.(AU)

Use of the ACP® and BTS extenders for cooling at 15°C white-lipped peccary (Tayassu pecari) semen / Uso dos diluidores ACP® e BTS para refrigeração a 15°C de sêmen de queixada (Tayassu pecari)

Knowledge about reproduction of white-lipped peccary is of great importance to assist with the conservation of this species and enable its rational use in captivity. This study aimed to evaluate the effect of ACP-103®, ACP-116® and BTS semen extenders on sperm viability during cooling of Tayassu pecari semen. Five ejaculates from four adult males were chilled. The animals were submitted to the protocols of sedation and anesthesia for semen collection by the electroejaculation method. After collection, the semen was macro- and microscopically assessed and diluted to reach 35x106 spermatozoa/mL in each of the three different extenders tested. The fresh-extended semen was packed in a BotuFLEX® thermal box to keep samples at 15°C for 24 hours. After cooling, the following semen parameters were analyzed: sperm motility, functional and structural integrity of sperm membranes, mitochondrial activity, chromatin condensation, and the thermoresistance test was performed. The parameters sperm motility, structural and functional integrity of sperm membranes, mitochondrial activity, and chromatin condensation were preserved after use of the extenders tested, and were similar to those of in natura semen (p>0.05). Curvilinear velocity (VCL) (p<0.05) was the only parameter with reduced values after cooling regardless of the extender used. The percentage of sperm with normal morphology was greater in samples cooled using the BTS extender (p<0.05). The ACP-103®, ACP-116® and BTS extenders can be used for the cooling and preservation of white-lipped peccary semen at 15°C for 24 hours.(AU)

Para auxiliar na conservação da espécie e permitir o uso racional do queixada em cativeiro é de grande importância o conhecimento sobre a reprodução da espécie. Objetivou-se avaliar o efeito dos diluidores de sêmen ACP-103®, ACP-116® e BTS na viabilidade espermática durante a refrigeração do sêmen do Tayassu pecari. Foram refrigerados cinco ejaculados provenientes de quatro machos adultos. Os animais foram contidos com auxílio de puçá e submetidos ao protocolo de sedação e anestesia para realização da coleta de sêmen pelo método da eletroejaculação. Depois da coleta, o sêmen foi avaliado macro e microscopicamente e diluído para atingir 35x106 espermatozoides/mL em cada um dos três diferentes diluidores testados. O sêmen diluído foi acondicionado em caixa térmica BotuFLEX® para manter as amostras a 15°C por um período de 24 horas. Depois da refrigeração, os espermatozoides foram avaliados quanto aos parâmetros de movimento espermático, integridade funcional e estrutural das membranas espermáticas, atividade mitocondrial, condensação da cromatina e teste de termorresistência. Os diluidores testados preservaram as características cinéticas, a integridade estrutural e funcional das membranas espermáticas, a atividade mitocondrial e a condensação da cromatina semelhante ao sêmen in natura (P>0,05). O único parâmetro que reduziu com o processo de refrigeração independente do diluidor utilizado foi a Velocidade Curvilinear (VCL) (P<0,05). Foi observado aumento do percentual de espermatozoides morfologicamente normais nas amostras refrigeradas em BTS (P<0,05). Os diluidores ACP-103®, ACP-116® e BTS podem refrigerar e conservar o sêmen de queixada a 15°C por 24 horas.(AU)

Criopreservação e cultivo de tecido testicular como ferramenta na conservação de mamíferos silvestres / Testicular tissue cryopreservation and culture as a tool for the conservation of wild mammals

A criopreservação do tecido testicular se apresenta como ferramenta promissora para a reprodução assistida, possibilitando o armazenamento de fragmentos contendo grande número de células germinativas em várias fases de desenvolvimento, incluindo espermatogônias indiferenciadas que podem ser cultivadas, garantindo a produção ilimitada de espermatozoides. Nesta revisão, são abordados aspectos técnicos relativos ao processamento e aplicabilidade da criopreservação e do cultivo de tecido testicular em mamíferos silvestres, ressaltando seus desafios e perspectivas.

Cryopreservation of the testicular tissue is a promising tool for assisted reproduction, allowing the storage of fragments containing a large number of germ cells in various stages of development, including undifferentiated spermatogonia that can be cultured, guaranteeing the unlimited production of spermatozoa. In this review, technical aspects related to the processing and applicability of testicular tissue cryopreservation and culture in wild mammals are discussed, highlighting their challenges and perspectives.

Superoxide dismutase and catalase activity in collared peccary (Pecari tajacu) seminal plasma and their relation to sperm quality / Atividade da superóxido dismutase e catalase no plasma seminal de catetos (Pecari tajacu) e sua relação com a qualidade espermática

The study of the seminal plasma help us to understand the mechanisms by which reactive oxygen species (ROS) affect the sperm. The antioxidant enzymes, as the superoxide dismutase - SOD and catalase - CAT, are capable of removing the oxidative agents before they produce injuries. The aim of the current study was to investigate the activity of antioxidant enzymes SOD and CAT in seminal plasma, and their association with sperm quality in collared peccaries. Study was conducted during the dry period (August and September) on a region characterized by a semiarid climate, with an average annual temperature of 27°C and irregular rainfall (Mossoro, RN, Brazil; 5°10´S and 37°10´W). Nine ejaculates were obtained from sexually mature males (1 sample per animal) by electroejaculation. Semen was evaluated for microscopic parameters and the activity of SOD and CAT was measured by spectrophotometry. All ejaculates were white in color. Mean values for concentration were of 207 ± 160 x106 sperm/mL, motility of 83.0 ± 20.9% and viability of 72.5 ± 10.4%. In regards to the enzymatic activity, none was observed for the CAT enzyme. Trace levels of SOD (0.033 ± 0.049 AU/mgP) were detected in the ejaculates of all individuals; however, no correlation was observed between SOD levels and the sperm motility (R = 0.35; P = 0.931), vigor (R = 0.29; P = 0.133), viability (R = 0.16; P = 0.29), functional membrane (R = 0.04; P = 0.617) or morphology (R = 0.03; P = 0.637). In conclusion, we demonstrated the first description of antioxidant enzyme activity in seminal plasma of fresh ejaculates obtained from collared peccaries. SOD antioxidant activity was evident during the dry period of a semiarid region, but no relationship between SOD and semen parameters was observed.

O estudo do plasma seminal nos auxilia a compreender os mecanismos pelos quais as espécies reativas de oxigênio (EROs) afetam o espermatozoide. As enzimas antioxidantes, como a superóxido dismutase - SOD e a catalase - CAT, são capazes de remover os agentes oxidativos antes que causem injúrias. O objetivo deste estudo foi investigar a atividade das enzimas SOD e CAT no plasma seminal, e sua associação com a qualidade espermática em catetos. O estudo foi conduzido durante o período seco (agosto a setembro) em uma região caracterizada pelo clima semiárido, com temperatura média anual de 27°C e pluviosidade irregular (Mossoró, RN, Brasil; 5°10´S e 37°10´W). Nove ejaculados foram obtidos de machos sexualmente maduros (1 amostra por animal) por eletroejaculação. O sêmen foi avaliado quanto aos parâmetros microscópicos e a atividade da SOD e da CAT foi mensurada por espectrofotometria. Todos os ejaculados apresentavam coloração branca. Os valores médios para a concentração foram de 207 ± 160 x106 espermatozoides/mL, motilidade de 83,0 ± 20,9% e viabilidade de 72,5 ± 10,4%. No que diz respeito à atividade enzimática, nenhuma foi observada para a enzima CAT. Traços de SOD (0,033 ± 0,049 AU/mgP) foram detectados nos ejaculados de todos os indivíduos; entretanto, nenhuma correlação foi observada entre os níveis de SOD e a motilidade espermática (R = 0,35; P = 0,931), o vigor (R = 0,29; P = 0,133), a viabilidade (R = 0,16; P = 0,29), a função de membrana (R = 0,04; P = 0,617) ou a morfologia espermática (R = 003; P = 0,637). Em conclusão, nós demonstramos a primeira descrição da atividade enzimática antioxidante no plasma seminal de ejaculados frescos obtidos de catetos. A atividade da SOD foi evidente durante o período seco de uma região semiárida, mas nenhuma relação entre a SOD e os parâmetros seminais foi observada.

Superoxide dismutase and catalase activity in collared peccary (Pecari tajacu) seminal plasma and their relation to sperm quality / Atividade da superóxido dismutase e catalase no plasma seminal de catetos (Pecari tajacu) e sua relação com a qualidade espermática

The study of the seminal plasma help us to understand the mechanisms by which reactive oxygen species (ROS) affect the sperm. The antioxidant enzymes, as the superoxide dismutase - SOD and catalase - CAT, are capable of removing the oxidative agents before they produce injuries. The aim of the current study was to investigate the activity of antioxidant enzymes SOD and CAT in seminal plasma, and their association with sperm quality in collared peccaries. Study was conducted during the dry period (August and September) on a region characterized by a semiarid climate, with an average annual temperature of 27°C and irregular rainfall (Mossoro, RN, Brazil; 5°10´S and 37°10´W). Nine ejaculates were obtained from sexually mature males (1 sample per animal) by electroejaculation. Semen was evaluated for microscopic parameters and the activity of SOD and CAT was measured by spectrophotometry. All ejaculates were white in color. Mean values for concentration were of 207 ± 160 x106 sperm/mL, motility of 83.0 ± 20.9% and viability of 72.5 ± 10.4%. In regards to the enzymatic activity, none was observed for the CAT enzyme. Trace levels of SOD (0.033 ± 0.049 AU/mgP) were detected in the ejaculates of all individuals; however, no correlation was observed between SOD levels and the sperm motility (R = 0.35; P = 0.931), vigor (R = 0.29; P = 0.133), viability (R = 0.16; P = 0.29), functional membrane (R = 0.04; P = 0.617) or morphology (R = 0.03; P = 0.637). In conclusion, we demonstrated the first description of antioxidant enzyme activity in seminal plasma of fresh ejaculates obtained from collared peccaries. SOD antioxidant activity was evident during the dry period of a semiarid region, but no relationship between SOD and semen parameters was observed.(AU)

O estudo do plasma seminal nos auxilia a compreender os mecanismos pelos quais as espécies reativas de oxigênio (EROs) afetam o espermatozoide. As enzimas antioxidantes, como a superóxido dismutase - SOD e a catalase - CAT, são capazes de remover os agentes oxidativos antes que causem injúrias. O objetivo deste estudo foi investigar a atividade das enzimas SOD e CAT no plasma seminal, e sua associação com a qualidade espermática em catetos. O estudo foi conduzido durante o período seco (agosto a setembro) em uma região caracterizada pelo clima semiárido, com temperatura média anual de 27°C e pluviosidade irregular (Mossoró, RN, Brasil; 5°10´S e 37°10´W). Nove ejaculados foram obtidos de machos sexualmente maduros (1 amostra por animal) por eletroejaculação. O sêmen foi avaliado quanto aos parâmetros microscópicos e a atividade da SOD e da CAT foi mensurada por espectrofotometria. Todos os ejaculados apresentavam coloração branca. Os valores médios para a concentração foram de 207 ± 160 x106 espermatozoides/mL, motilidade de 83,0 ± 20,9% e viabilidade de 72,5 ± 10,4%. No que diz respeito à atividade enzimática, nenhuma foi observada para a enzima CAT. Traços de SOD (0,033 ± 0,049 AU/mgP) foram detectados nos ejaculados de todos os indivíduos; entretanto, nenhuma correlação foi observada entre os níveis de SOD e a motilidade espermática (R = 0,35; P = 0,931), o vigor (R = 0,29; P = 0,133), a viabilidade (R = 0,16; P = 0,29), a função de membrana (R = 0,04; P = 0,617) ou a morfologia espermática (R = 003; P = 0,637). Em conclusão, nós demonstramos a primeira descrição da atividade enzimática antioxidante no plasma seminal de ejaculados frescos obtidos de catetos. A atividade da SOD foi evidente durante o período seco de uma região semiárida, mas nenhuma relação entre a SOD e os parâmetros seminais foi observada.(AU)

COLETA E CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE CACHORRO-DO-MATO (CERDOCYON THOUS)

O desenvolvimento de técnicas reprodutivas que possam ser utilizadas nos animais em vida-livre permite coletar e preservar material genético que convencionalmente não teríamos acesso, permitindo aumentar a variabilidade de amostras em um biobanco. Porém, infelizmente, muitas das técnicas conhecidas e amplamente utilizadas, foram desenvolvidos em ambientes laboratoriais controlados e que quando aplicados a campo, não é possível obter os mesmos resultados, sendo necessário a criação de novos protocolos para essas situações. Entre os meios comerciais, é de maior interesse para uso a campo, um diluente que possa ser armazenado à temperatura ambiente, sem necessidade de armazenamento a 5°C e que obtenha bons resultados com aumento do tempo de equilíbrio. É por isto que neste estudo, objetivou-se avaliar a viabilidade de coletar sêmen de Cachorro-do-mato (Cerdocyon thous), in situ, utilizando a técnica da cateterização uretral após indução farmacológica com medetomidina na dose 0,1 mg/kg e avaliar se o meio de congelamento de sêmen comercial (optiXcell) que permite armazenamento a temperatura ambiente para uso em canídeos, facilitando sua manutenção e utilização a campo. Além disso, testou-se também dois períodos de equilíbrio (duas e quatro horas) no resfriamento com o objetivo de avaliar se é possível prolongar esse tempo para quatro horas, o que tornaria mais favorável seu uso a campo. Com o primeiro experimento, utilizando cães domésticos como modelo experimental, foi avaliado a qualidade seminal pós-descongelamento em três diluentes comerciais (CaniPlus Freeze, Triladyl, OptiXcell) após duas e quatro horas de resfriamento através de análise subjetiva, por sistema computadorizado de análise seminal e por citometria de fluxo. Neste experimento, obtivemos resultados favoráveis ao uso do optixcell com quatro horas de tempo de equilíbrio, este tratamento demonstrou boas taxas de manutenção das membranas espermáticas, além disso obteve resultados próximos aos outros dois meios já utilizados em cães domésticos, podendo ser uma nova opção prática. Para o segundo experimento, a coleta farmacológica em cachorros-do-mato obteve quatro coletas com qualidade para criopreservação, demonstrando que este método pode ser utilizado em momentos que a manipulação digital ou eletroejaculação não possam ser utilizados. Também foi observado que os melhores resultados de coleta foram obtidos nos meses de junho a setembro, podendo indicar sazonalidade reprodutiva. Não foi possível realizar o descongelamento de sêmen de cachorros-do-mato com qualidade, muito provavelmente devido aos intemperes de sua manipulação em ambiente não controlado, demonstrando a necessidade e urgência de estabelecermos protocolos aplicáveis a campo.

The development of reproductive techniques that can be used in free-living animals allows the collection and preservation of genetic material that we would not conventionally have access to, allowing to increase the variability of samples in a biobank. However, unfortunately, many of the known and widely used techniques were developed in controlled laboratory environments and that when applied to the field, it is not possible to obtain the same results, being necessary to create new protocols for these situations. Among commercial freezing médium for semen, a diluent that can be stored at room temperature, without the need for storage at 5°C and that obtains good results with extended equilibrium time, is of most interest for use in the field. That is why this study aimed to evaluate the viability of collecting semen from Crab-eating-fox (Cerdocyon thous), in situ, using the technique of urethral catheterization after pharmacological induction with medetomidine at a dose of 0.1 mg/kg and evaluate whether the comercial semen freezing medium (optiXcell) that allows storage at room temperature can be used in canids, facilitating their maintenance and use in the field. In addition, two periods of equilibrium (two and four hours) in the cooling were also tested in order to assess whether it is possible to extend this time to four hours making it more effective in the field. With the first experiment, using domestic dogs as an experimental model, the post-thaw seminal quality was evaluated in three commercial diluents (CaniPlus Freeze, Triladyl, OptiXcell) after two and four hours of cooling. They were analyzed through computerized seminal analysis system for sperm motility and by flow cytometry. In this experiment, we obtained favorable results for the use of optixcell in dogs sperm with four hours of equilibrium time, this treatment demonstrated good maintenance rates of sperm membranes, and in addition, the OptiXcell medium obtained results close to the other two extenders already used in domestic dogs, which can be a new practical option. For the second experiment, pharmacological collection in crab-eatingfoxes obtained four collections with quality for cryopreservation, demonstrating that this method can be used at times when digital manipulation or electroejaculation cannot be used. It was also observed that the best collection results were obtained between June and September, which may indicate reproductive seasonality. Although the optixcell medium has been validated for use in domestic dogs, it was not possible to thaw semen from wild dogs withquality and viability of use, most likely due to the weathering of its handling in an uncontrolled environment, demonstrating the need and urgency to establish protocols applicable to the field.

ESTABELECIMENTO DE CARIOPLASTOS E CITOPLASTOS DE CATETOS, Pecari tajacu (LINNAEUS, 1758), VISANDO A CLONAGEM POR TRANSFERÊNCIA NUCLEAR DE CÉLULA SOMÁTICA EM TAIASSUÍDEOS

O direcionamento dos primeiros passos para a realização da transferência nuclear de célula somática (TNCS) em catetos garantirá uma ferramenta efetiva na conservação da espécie, perante sua acelerada diminuição populacional e sua atividade ecológica indispensável para o ecossistema. Para tanto, a presente tese foi dividida em duas etapas (três experimentos por etapa), sendo a primeira etapa o estudo das células doadoras de núcleo ou carioplastos e a segunda etapa, o estudo das células doadoras de citoplasma ou citoplastos. Assim, diante da importância de carioplastos de qualidade reconhecida para a TNCS, nós inicialmente estabelecemos cinco linhagens de fibroblastos de catetos, monitorando a viabilidade, atividade metabólica e estresse oxidativo, de acordo com os efeitos do número de passagens (primeira, terceira e décima) e criopreservação. Embora não haja efeito desses critérios sobre a viabilidade, células em décima passagem tiveram uma redução de seu metabolismo. Adicionalmente, células congeladas/descongeladas tiveram um aumento no número de espécies reativas de oxigênio e potencial de membrana mitocondrial. Além disso, sabendo da importância de manter estas células armazenadas em um biobanco de maneira adequada, nós otimizamos a solução crioprotetora utilizada na congelação lenta de fibroblastos de catetos. Deste modo, a solução composta por 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) com 0,2 M de sacarose e 50% de soro fetal bovino (SFB) foi considerada a solução mais eficiente em manter a viabilidade, atividade proliferativa, metabolismo e níveis adequados de estresse oxidativo de células somáticas de catetos, quando comparada a soluções na ausência de sacarose e com 10% de SFB em diferentes combinações. Finalmente, um passo essencial no estabelecimento dos carioplastos para a TNCS consiste na sincronização das células em G0/G1 do ciclo celular. Deste modo, nós avaliamos diferentes métodos de sincronização do ciclo celular: (i) supressão de soro (SS) por um a quatro dias, (ii) inibição por contato (IC) por um a três dias e (iii) agentes químicos [DMSO, 6-dimetilaminopurina (6-DMAP), ciclohexamida (CHX), e citocalasina B (CB)] por um a dois dias, em termos de seus efeitos sobre a sincronização em G0/G1 e viabilidade. Assim, nós observamos que a IC por três dias foi o método mais eficiente para sincronização do ciclo celular e manutenção da viabilidade de fibroblastos de catetos. Portanto, com estes três experimentos, nós estabelecemos a etapa de carioplastos da TNCS de catetos, obtendo células de qualidade e aptas a serem usadas como doadoras de núcleo. Na segunda etapa, nós, inicialmente, adequamos as condições de maturação in vitro (MIV) de oócitos de catetos, avaliando o tempo de MIV e o efeito do fator de crescimento epidermal (EGF) sobre a habilidade meiótica. Assim, nós concluímos que 48 h é o período adequado para a MIV de oócitos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico. Ainda, observou-se que o EGF pode ser utilizado para otimizar o meio de MIV. Finalmente, no terceiro experimento, nós avaliamos a habilidade de desenvolvimento destes oócitos após ativação artificial, usando a ionomicina como ativador primário e comparando diferentes ativadores secundários (6-DMAP, CHX e CB). Nós verificamos que a ativação química usando ionomicina e 6-DMAP foi a mais eficiente combinação, tendo esta tese alcançado como resultado significativo, uma taxa de 27,6% de blastocistos de catetos derivados da ativação oocitária artificial. Em síntese, nós obtivemos carioplastos e citoplastos que poderão ser empregados na TNCS de catetos, deixando a ponto as etapas fundamentais para a clonagem desta espécie. Ainda, destaca-se que os conhecimentos aqui gerados poderão ser aplicados em estudos de fecundação in vitro, compreensão do desenvolvimento embrionário, produção de células induzidas à pluripotência, e ensaios de toxicidade. Portanto, este trabalho foi um grande passo para a conservação de catetos.

The direction of the first steps for the achievement of somatic cell nuclear transfer (SCNT) in collared peccary will guarantee an effective tool in the conservation of the species, in view of its accelerated population decrease and its essential ecological activity for the ecosystem. Therefore, the present thesis was divided into two steps (three experiments per step), being the first step the study of the donor cells of nucleus or karyoplast and the second stage, the study of the donor cells of cytoplasm or cytoplasts. Thus, in view of the importance of acknowledge quality karyoplast for SCNT, we initially established five cell lines of collared peccary fibroblasts, monitoring viability, metabolic activity and oxidative stress, according to the effects of the number of passages (first, third and tenth) and cryopreservation. Although there is no effect of these criteria on viability, cells in tenth passage had a reduction in their metabolism. Additionally, frozen/thawed cells had an increase in the number of reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential. Moreover, knowing the importance of maintaining these cells stored in a biobank properly, we optimize the cryoprotectant solution used in the slow freezing of collared peccary fibroblasts. Thus, the solution composed of 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) with 0.2 M sucrose and 50% fetal bovine serum (FBS) was considered the most efficient solution in maintaining the viability, proliferative activity, metabolism and adequate levels of oxidative stress of somatic cell cells, when compared to solutions in the absence of sucrose and with 10% FBS in different combinations. Finally, an essential step in establishing the karyoplast for SCNT is the synchronization of cells in G0/G1 of the cell cycle. Thus, we evaluated different cell cycle synchronization methods: (i) serum suppression (SS) for one to four days, (ii) contact inhibition (CI) for one to three days and (iii) chemical agents [DMSO, 6-dimethylaminopurine (6-DMAP), cyclohexamide (CHX), and cytochalasin B (CB)] for one to two days, in terms of their effects on G0/G1 synchronization and viability. Thus, we observed that the IC for three days was the most efficient method for synchronizing the cell cycle and maintaining the viability of collared peccary fibroblasts. Consequently, with these three experiments, we have established karyoplast stage of SCNT in collared peccary, obtaining quality cells and able to be used as nuclear donors. In the second stage, we initially adjusted the in vitro maturation (IVM) conditions of collared peccary oocytes, evaluating the IVM time and the effect of the epidermal growth factor (EGF) on the meiotic ability. Thus, we concluded that 48 h is the appropriate period for oocyte IVM when compared to 24 h, according to meiotic potential. Still, it was observed that EGF can be used to optimize the IVM medium. Finally, in the third experiment, we evaluated the developmental ability of these oocytes after artificial activation, using ionomycin as the primary activator and comparing different secondary activators (6-DMAP, CHX and CB). We found that chemical activation using ionomycin and 6-DMAP was the most efficient combination, with this thesis achieving as a significant result, a rate of 27.6% of blastocysts of collared peccaries derived from oocyte artificial activation. In summary, we got karyoplast and cytoplasts that may be employed in the SCNT of collared peccary, leaving the point the fundamental steps for the cloning of this species. Furthermore, it is emphasized that the knowledge generated here can be applied for in vitro fertilization, studies understanding of embryonic development, production cells induced to pluripotency, and toxicity assessments. Therefore, this work was a great step for the conservation of collared peccaries.

Cultivo in vitro de células derivadas de pele em mamíferos silvestres - estado da arte / In vitro culture of wild mammals skin derived cells - state of art

O cultivo de células somáticas derivadas da pele consiste numa técnica de relevante aplicabilidade,tanto para a investigação básica quanto para o uso em biotécnicas reprodutivas. Além disso, o cultivo de célulasda pele derivadas de mamíferos silvestres tem sido uma etapa interessante na formação de criobancos, visando àpreservação da biodiversidade genética. Assim, o objetivo desta revisão é apresentar os progressos técnicosalcançados no cultivo de células somáticas em mamíferos silvestres, destacando as principais variaçõesencontradas nos meios e evidenciando os avanços em algumas espécies.(AU)

The culture of somatic cells derived from skin is a technique of important applicability, both for basicresearch and for the use in reproductive biotechnologies. Moreover, skin cell culture derived from wildmammals has been an interesting step to build a cryobank, aimed at preserving genetic biodiversity. Thus, theaim of this review is to present the technical progress achieved in the somatic cell culture in wild mammals,highlighting the main variances found in the media and showing the progress in some species.(AU)

Cultivo in vitro de células derivadas de pele em mamíferos silvestres - estado da arte / In vitro culture of wild mammals skin derived cells - state of art

O cultivo de células somáticas derivadas da pele consiste numa técnica de relevante aplicabilidade,tanto para a investigação básica quanto para o uso em biotécnicas reprodutivas. Além disso, o cultivo de célulasda pele derivadas de mamíferos silvestres tem sido uma etapa interessante na formação de criobancos, visando àpreservação da biodiversidade genética. Assim, o objetivo desta revisão é apresentar os progressos técnicosalcançados no cultivo de células somáticas em mamíferos silvestres, destacando as principais variaçõesencontradas nos meios e evidenciando os avanços em algumas espécies.

The culture of somatic cells derived from skin is a technique of important applicability, both for basicresearch and for the use in reproductive biotechnologies. Moreover, skin cell culture derived from wildmammals has been an interesting step to build a cryobank, aimed at preserving genetic biodiversity. Thus, theaim of this review is to present the technical progress achieved in the somatic cell culture in wild mammals,highlighting the main variances found in the media and showing the progress in some species.

EFEITO DA PROTEÍNA MORFOGENÉTICA ÓSSEA 15 (BMP15) NO CULTIVO IN SITU DE TECIDO OVARIANO DE CATETOS (Pecari tajacu LINNAEUS, 1958)

Os catetos são animais silvestres que possuem grande importância ecológica e potencial econômico. Assim, a fim de aumentar o potencial reprodutivo desta espécie, biotécnicas como cultivo in vitro de folículos pré-antrais vem sendo estudadas. Sabe-se que a foliculogênese pré-antral é regulada por fatores autócrinos e parácrinos em um mecanismo orquestrado que define o curso de desenvolvimento ou morte folicular. Entre esses fatores está a proteína morfogenética óssea 15 (BMP15), que atua na ativação, sobrevivência e desenvolvimento folicular em diferentes espécies. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de BMP15 sobre a sobrevivência, ativação, crescimento e proliferação das células da granulosa de folículos pré-antrais de catetos cultivados in vitro por 6 dias. Para tanto, 5 pares de ovários foram coletados de fêmeas de cateto e de cada par foram retirados fragmentos do córtex, dos quais, um foi utilizado como controle fresco, e os demais foram cultivados in vitro por 1 ou 6 dias nos diferentes tratamentos: 0, 1, 25 e 50 ng/mL de BMP15. Os fragmentos do controle fresco e pós-cultivo foram fixados, processados para histologia clássica (hematoxilina/eosina e AgNOR) para a confecção das lâminas. Os folículos ovarianos foram avaliados quanto à morfologia, sendo classificados em normais ou degenerados e quanto ao grau de evolução, sendo classificados em primordiais ou em desenvolvimento (primários e secundários). Este último parâmetro foi utilizado para o estudo da ativação folicular, levando em consideração a razão entre o percentual de folículos primordiais e em desenvolvimento ao longo do cultivo. Além disso, os folículos e oócitos foram mensurados antes e após o cultivo para registrar o crescimento folicular e oocitário. A proliferação celular dos folículos ovarianos durante o cultivo foi avaliada pela contagem das regiões organizadoras nucleolares (NORs) pela técnica de AgNOR. O controle fresco apresentou altas taxas de folículos com morfologia normal (92.68% ± 1,09) e, após o cultivo, a adição de BMP15 (25 ng/mL) ao meio resultou numa maior percentagem de folículos normais (79,67% ± 0,69) quando comparada aos demais tratamentos (P<0,05), exceto 1 ng/mL BMP15 (74,00% ± 1,90) (P> 0,05). Além disso, as concentrações mais elevadas de BMP15 (25 ng/ml e 50 ng/ml) estimularam a ativação dos foliculos primordiais em relação ao controle cultivado (P<0,05). No entanto, esta substância não demonstrou efeitos no crescimento oocitário e folicular. Todas as concentrações de BMP15 utilizadas aumentaram o número de NORs após 1 dia de cultivo em relação ao controle fresco e cultivado (P<0,05), e após 6 dias de cultivo, o número de NORs nos fragmentos cultivados em todos os tratamentos foi maior do que a observada no controle fresco (P<0,05). Em conclusão, a adição de 25 ng/ml de BMP15 ao meio de cultivo de folículos pré-antrais de catetos mantém um elevado número de folículos morfologicamente saudáveis e estimula a ativação de folículos primordiais após 6 dias de cultivo.

Collared peccaries are wild animals that have a great ecological importance and economic potential. Thus, in order to increase reproductive potential this species, biotechniques such as in vitro culture of preantral follicles have been studied. It is known preantral folliculogenesis is regulated by autocrine and paracrine factors in an orchestrated mechanism that defines the course of development or death. Among these factors is bone morphogenetic protein 15 (BMP15), which acts on activation, survival and follicular development in different species. Nevertheless, the roles of BMP15 in the regulation of primordial follicle development in collared peccaries remains unknown. The aims of present study were to investigate the effects of BMP15 on in vitro culture of collared peccaries preantral follicles using histological studies. To this end, fragments of collared peccaries (Pecari tajacu) ovarian cortex were cultured for 1 or 6 days, at 38.5 °C in an atmosphere containing 5% CO2, in TCM199+ (control medium) supplemented with different concentrations of recombinant human BMP15 (rhBMP15, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) (1, 25 and 50 ng/mL). The fresh control and cultured fragments were fixed, processed for classical histology (hematoxylin/eosin and AgNOR), and the ovarian follicles were evaluated for morphology, classified as normal or degenerate, and classified as primordial or developing (primary and secondary). The latter parameter was used for study of follicular activation, taking into account the ratio between percentage of primordial and developing follicles throughout the culture. In addition, follicles and oocytes were measured before and after culture to record follicular and oocyte growth. The cell proliferation of ovarian follicles during experiment was evaluated by counting the nucleolar organizing regions (NORs) by the AgNOR technique. The fresh control showed high rates of follicles with normal morphology (92.68% ± 1.09) and, after culturing, addition of BMP15 (25 ng/mL) to medium resulted in a higher percentage of normal follicles (79.67 ± 0.69) compared to the other treatments (P<0.05), except for 1 ng/mL BMP15 (74.00% ± 1.90) (P>0.05). In addition, higher concentrations of BMP15 (25 ng/ml and 50 ng/ml) stimulated the activation of primordial follicles in relation to cultured control (P<0.05). However, this substance did not demonstrate effects on oocyte and follicular growth. All concentrations of BMP15 used increased the number of NORs after 1 day of cultivation relative to fresh and cultivated control (P<0.05), and, after 6 days, number of NORs in fragments cultured in all treatments was higher than that observed in fresh control (P <0.05). In conclusion, the addition of 25 ng/ml of BMP15 to culture medium of preantral follicles of peccaries maintains a high number of morphologically healthy follicles and stimulates activation of primordial follicles after 6 days of culture.

ESTEBELECIMENTO DE PROTOCOLOS PARA A CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO TESTICULAR DE CATETOS (Pecari tajacu LINNAEUS, 1758)

A criopreservação de tecido gonadal masculino pode ser usada na conservação de material genético, no intuito da formação de um banco de germoplasma permitindo a manutenção da variabilidade genética em animais pré-puberes e adultos. Diante disso, objetivou-se estabelecer um protocolo eficiente de criopreservação de tecido testicular de catetos. Para tanto, o estudo foi dividido em dois experimentos, sendo utilizados 10 animais adultos, 5 em cada experimento, oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres da UFERSA. No experimento I, cinco pares de testículos foram fragmentados (9 mm3) e alocados em grupos não-vitrificados (controle) e vitrificados em superfície sólida (VSS), após a exposição a diferentes crioprotetores (dimetilsulfóxido - DMSO 3,0 M, etileno glicol - EG 3,0 M e a combinação 1,5 M DMSO/1,5 M EG). As amostras não-vitrificadas e vitrificadas foram avaliadas quanto à histomorfologia, ultraestrutura, viabilidade e potencial de capacidade proliferativa. A conservação adequada da organização ultraestrutural do túbulo seminífero em termos de presença de lúmen e junções celulares foi observada somente com o uso da combinação DMSO/EG. Independentemente do crioprotetor, a vitrificação conservou efetivamente a visualização e a condensação nuclear das células de maneira semelhante à observada no grupo não vitrificado. Além disso, a combinação DMSO/EG proporcionou uma melhor conservação das membranas basais dos túbulos seminíferos que o DMSO (P < 0,05). Somente a combinação DMSO/EG manteve o potencial de capacidade proliferativa para espermatogônia (3,69 Regiões Organizadoras de Nucléolos - NORs/célula) e célula de Sertoli (3,19 NORs/célula) semelhantes aos controles (3,46 e 3,31 NORS/célula, respectivamente). Portanto, DMSO/EG é melhor que o DMSO ou o EG sozinho para VSS de tecido testicular de cateto adulto. No experimento II, cinco pares de testículos foram fragmentados (3 mm3) e alocados a grupos não-criopreservados (controle) e criopreservados usando três métodos de criopreservação: congelação lenta (CL), vitrificação em criotubos (VC) e VSS, sendo então expostos a diferentes combinações de crioprotetores (1,5 M DMSO/1,5 M EG, 1,5 M DMSO/1,5 M glicerol G, e 1,5 M G/1,5 M EG). As amostras, não-criopreservadas e criopreservadas foram avaliadas quanto à fragmentação de DNA, viabilidade, potencial de capacidade proliferativa e histomorfologia. Apenas no uso de DMSO/EG durante a CL e VC foi possível conservar a integridade do DNA de modo similar ao controle (P>0,05). Em adição, observou-se que, independentemente do método de criopreservação, as combinações DMSO/EG e DMSO/G foram capazes de conservar a viabilidade (P>0,05). Todos os tratamentos mantiveram o potencial de capacidade proliferativa para espermatogônia de modo similar; entretanto, apenas o G/EG, nos métodos de CL e VSS, foram inferiores ao controle para célula de Sertoli (P>0,05). Finalmente, o protocolo de CL usando as combinações DMSO/EG e DMSO/G foram melhores em evitar o aparecimento de edemas que G/EG CL e DMSO/G VSS (P<0.05). Assim, sugere-se a utilização da combinação DMSO/EG associada aos métodos de congelação lenta ou vitrificação para a criopreservação de tecido testicular de catetos adultos.

Cryopreservation of male gonadal tissue can be used in the conservation of genetic material, in order to form a germplasm bank allowing the maintenance of genetic variability in prepubertal and adult animals. Therefore, the aim was to establish an efficient protocol for cryopreservation of testicular tissue of collared peccaries. Therefore, the study was divided into two experiments, using 10 adult animals, 5 for each experiment, from the UFERSA Center for Wild Animals Multiplication. In experiment I, five pairs of testicles were fragmented (9 mm3) and allocated to non-vitrified (control) and vitrified solid-surface (SSV) groups following exposure to different cryoprotectants (3.0 M dimethyl sulfoxide (DMSO), 3.0 M ethylene glycol (EG) or 1.5 M DMSO/1.5 M EG). After warming, samples were evaluated for histomorphology, ultrastructure, viability, and proliferative capacity potential. The appropriate conservation of the ultrastructural organization of the seminiferous tubule in terms of lumen presence and cell junctions was only observed at the use of DMSO/EG combination. Regardless of the cryoprotectant, the vitrification effectively preserved cell nuclear visualization and condensation similarly as observed at the non-vitrified group. Moreover, DMSO/EG combination provided a better preservation of basal membranes of seminiferous tubules than DMSO (P < 0.05). Only the DMSO/EG combination maintained the proliferative capacity potential for spermatogonia (3.69 Nucleolus Organizing Regions - NORs/cell) and Sertoli cell (3.19 NORs/cell) similar to controls (3.46 and 3.31 NORS/cell, respectively). In conclusion, DMSO/EG in combination is better than DMSO or EG alone for SSV of testicular tissue biopsies from adult collared peccaries. In experiment II, five pairs of testicles were also fragmented (3 mm3) and allocated to non-cryopreserved (control) and cryopreserved groups using three cryopreservation methods: slow freezing (SF), cryotube vitrification (CV) and solid surface vitrification (SSV), and then exposed to different combinations of cryoprotectants (1.5 M DMSO/1.5 M EG, 1.5 M DMSO/1.5 M glycerol - G, and 1.5 M G/1.5 M EG). Non-cryopreserved and cryopreserved samples were evaluated for histomorphology, viability, proliferative potential and DNA fragmentation. Only in the use of DMSO/EG during SF and CV, it was possible to preserve DNA integrity in a similar way to control (P> 0.05). In addition, it was observed that, regardless the cryopreservation method, the DMSO/EG and DMSO/G combinations were able to preserve viability (P> 0.05). All treatments maintained the proliferative capacity potential for spermatogonia in a similar manner; however, G/EG in the SF and SSV methods impaired the proliferative potential of Sertoli cells (P> 0.05). Finally, the SF protocol using the DMSO/EG or DMSO/G combinations were better at preventing edema than G/EG for SF and DMSO/ G for SSV (P <0.05). In conclusion, we suggest the use of a DMSO/EG combination associated with slow freezing or vitrification in cryotubes for cryopreservation of testicular tissue of adult peccaries.

DESCRIÇÃO ULTRAESTRUTURAL DE ESPERMATOZOIDES A FRESCO E CRIOPRESERVADOS DE CATETOS (Pecari tajacu Linnaeus, 1758)

A presente dissertação teve por objetivo descrever a ultraestrutura de espermatozoides frescos e criopreservados de catetos por meio das microscopias eletrônicas de varredura (MEV) e transmissão (MET). Para tanto, três catetos machos adultos foram submetidos à eletroejaculação e o sêmen obtido foi imediatamente avaliado quanto à motilidade, integridade e funcionalidade da membrana, integridade da cromatina e morfologia por meio da microscopia de luz. Posteriormente, as amostras foram criopreservadas em diluente Tris acrescido de gema de ovo (20%) e glicerol (6%), descongeladas após uma semana e avaliadas. Amostras de sêmen fresco e descongelado foram combinadas em pools distintos de espermatozoides que foram processados para MEV e MET, sendo microfotografadas e avaliadas. Após a descongelação, observou-se um declínio na motilidade espermática, integridade e funcionalidade da membrana (P < 0,05), porém a morfologia espermática e a integridade da cromatina avaliadas pela microscopia de luz não foram significativamente afetadas. Por meio da MEV, identificou-se que os espermatozoides de catetos apresentam cabeça achatada em forma de pá, medindo 6,1 ± 0,1 m de comprimento e 3,8 ± 0,1 m de largura, com um vasto acrossomo (4,3 ± 0,1 m) apresentando uma clara demarcação entre a região pós-acrossomal, sendo delimitada por uma borda distendida, denominada de espessamento marginal. As caudas normais mediram 38,1 m, sendo formadas por uma extensa peça intermediária de 15,5 m de comprimento. Nas amostras descongeladas, tanto a MEV quanto a MET forneceram informações sobre crioinjúrias não detectadas através da microscopia de luz como a presença de vesículas no acrossomo, membrana plasmática frouxa, mitocôndrias vacuolizadas, fibras densas desorganizadas e cromatina descondensada. Em conclusão, o presente estudo fornece a primeira descrição da ultraestrutura dos espermatozoides de catetos. Além disso, a MEV e a MET contribuíram na identificação de alguns danos nanométricos provocados pelo processo de criopreservação, fornecendo informações valiosas para o aprimoramento de importantes protocolos usados para a formação de biobancos.

The objective of the present work was to describe the ultrastructure of fresh and cryopreserved spermatozoa from collared peccaries by scanning (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). Three adult males were submitted to electroejaculation and semen was immediately evaluated for motility, membrane integrity and functionality, chromatin integrity and morphology. Subsequently, the samples were cryopreserved in Tris extender plus egg yolk (20%) and glycerol (6%), thawed after one week and evaluated. Samples of fresh and frozen-thawed semen were combined in distinct pools that were processed for SEM and TEM,. After thawing, there was a decline in sperm motility, membrane integrity and functionality (P < 0.05), sperm morphology and chromatin integrity assessed by light microscopy were not significantly affected. Analysis by SEM revealed that collared peccaries sperm presents a flattened head in a paddle format, measuring 6.1 ± 0.1 m in length and 3.8 ± 0.1 m in width. Collared peccaries sperm had a long acrosome (4.3 ± 0.1 m), presenting a clear demarcation across the post-acrosomal region, being delimited by a distended border, called the marginal thickening. Normal tails measured 38.1 m, formed by an extensive midpiece with 15.5 m in length. In frozen-thawed analysis by SEM and TEM detected presence of vesicles in the acrosome, loose plasma membrane, vacuolized mitochondria, dense fibers disorganized, and decondensed chromatin. In conclusion, we provide the first description of the ultrasctruture on sperm from collared peccaries. Moreover, SEM and TEM help us to identify some nanometric damage caused by freezing-thawing procedures, thus providing valuable information for the improvement of protocols used for biobanking formation.

Detecção molecular de Ranavirus em espécies de anfíbios anuros selvagens da região centro-leste do estado de São Paulo

O objetivo do trabalho foi realizar investigação sobre ocorrência de ranavirose, infecção causada por vírus do gênero Ranavirus, família Iridoviridiae, em anfíbios anuros silvestres nos municípios de Porto Ferreira e Pirassununga, cidades da região centro-leste do estado de São Paulo, Brasil, utilizando diagnóstico molecular. Ao todo, 40 anuros adultos silvestres da espécie Leptodactylus fuscus foram capturados nos municípios citados, sendo coletados três órgãos alvos (fígado, baço e rins) de replicação viral, com registro de eventuais alterações macroscópicas nesses órgãos, e dos quais extraiu-se DNA. Na sequencia, fez-se a reação em cadeia pela polimerase (PCR), utilizando-se primers específicos para o gene MCP (major capsid protein) de Frog Virus 3 (FV3), ranavírus circulante no Brasil, com isolado de FV3 pertencente ao biobanco do Laboratório de Higiene Zootécnica da FZEA-USP empregado como controle positivo e água livre de nuclease como controle negativo. Como resultados, em relação às alterações macroscópicas, somente um espécime apresentou hepatoesplenomegalia e hipopigmentação do coração. No entanto, ao diagnóstico molecular, nenhum dos 40 animais amostrados foi positivo à ranavirose. Tal resultado pode estar associado tanto a fatores intrínsecos (espécie, idade, resposta imune) como extrínsecos ao hospedeiro (alterações ambientais, patogenicidade viral). Em paralelo, em rãs de criação comercial, surtos por FV3 já foram detectados em vários ranários do país; contudo, essa é a primeira vez que uma prospecção para ranavirose é realizada especificamente com representantes da espécie Leptodactylus fuscus, em municípios da região centro-leste do estado de São Paulo. Assim, são necessárias mais pesquisas com espécies silvestres de rãs, particularmente no entorno de ranários com histórico de animais positivos para FV3, para melhor conhecimento da epidemiologia e dinâmica de transmissão da ranavirose entre rãs silvestres.

The objective of this study was to investigate the occurrence of ranavirus infection caused by virus belonging to genus Ranavirus, Iridoviridiae family, in wild anuran amphibians from Porto Ferreira and Pirassununga municipalities, located in the central-eastern region of the state of São Paulo, Brazil, using molecular diagnostics. In all, 40 wild adult anurans of the species Leptodactylus fuscus were captured in the mentioned municipalities, and three target organs (liver, spleen and kidneys) of the viral replication were collected, being possible macroscopic changes in these organs recorded, and from which DNA was extracted. In the sequence, the polymerase chain reaction (PCR) was carried out using primers specific for the MCP (major capsid protein) gene of Frog Virus 3 (FV3), a circulating ranavirus in Brazil, with a FV3 isolate belonging to the biobank of the Laboratory of Zootechnical Hygiene of FZEA-USP employed as positive control and nuclease-free water as negative control. As a result, in relation to macroscopic alterations, only one specimen showed hepatosplenomegaly and heart hypopigmentation. However, for molecular diagnostics, none of the 40 animals sampled were positive for ranavirus. This result may be associated to both intrinsic (species, age, immune response) and extrinsic (environmental changes, viral pathogenicity) factors to the host. In parallel, FV3 outbreaks have already been detected in several frog farms in the country. However, this is the first time that a prospection for ranavirus infection is performed specifically with specimens of the Leptodactylus fuscus from municipalities in the central-eastern region of the state of São Paulo. Thus, more studies on wild-type frogs are needed, particularly in the settings of frog farms with positive animal history for FV3, to better understand the epidemiology and dynamics of ranavirus transmission among wild frogs.