Resumo

Calcinose enzoótica, causada por Nierembergia rivularis, no Uruguai, e Nierembergia veitchii, no Brasil, é uma doença caracterizada por mineralização de tecidos moles, hiperplasia das células parafoliculares da tireoide e elevação nos níveis de cálcio e fósforo. Descreve-se um caso de hiperplasia e carcinoma de células parafoliculares bilateral em um ovino de quatro anos, com calcinose enzoótica associada à intoxicação por Nierembergia rivularis. O diagnóstico histológico de hiperplasia e carcinoma de células parafoliculares é suportado pelas marcações imuno-histoquímicas positivas para calcitonina, peptídeo relacionado ao gene da calcitonina e enolase neurônio específica. Como a hiperplasia de células parafoliculares é uma lesão pré-neoplásica induzida por hipercalcemia, sugere-se que a hipercalcemia crônica causada pela intoxicação por N. rivularis pode ter induzido hiperplasia de células parafoliculares seguida de transformação em carcinoma, neste caso. Os efeitos carcinogênicos das plantas calcinogênicas no sistema endócrino devem ser melhor explorados.(AU)

Resumo

As plantas calcinogênicas têm importância na medicina veterinária mundial por conterem glicosídeos, que após a sua ingestão, liberam metabólitos da vitamina D, potencialmente nocivos. No Brasil, as espécies Solanum glaucophyllum (S. malacoxylon) e Nierembergia veitchii são responsáveis pela calcinose enzoótica, intoxicação de caráter endêmico que acomete ruminantes. A calcinose é caracterizada pela calcificação de tecidos moles e está frequentemente associada à metaplasias óssea e cartilaginosa. A hipótese do primeiro experimento é que as células tronco mesenquimais (CTMs) estejam envolvidas na gênese do processo de metaplasia óssea causado pela S. glaucophyllum, o que ainda carece de comprovação científica. Além da metaplasia, a intoxicação pela S. glaucophyllum causa alterações ósseas, representadas por osteopetrose, osteonecrose e osteoporose. Por ser o osteoblasto uma célula que deriva da diferenciação osteogênica das CTMs da medula óssea, a hipótese do segundo experimento é que a osteoporose induzida pela intoxicação por S. glaucophyllum seja decorrente não somente da ação da planta sobre os osteoblastos, como também do seu efeito sobre a diferenciação osteogênica das CTMs. A concentração de 1,25(OH)2D3 obtida, por meio da técnica de cromatografia líquida, no extrato da planta foi de 3,8 µg/mL. Em ambos os experimentos, foram testados os efeitos de 100µL, 1mL e 50mL de extrato/L, contendo respectivamente, 1nM (0,4 µg/L), 10nM (4 µg/L) e 50nM (20 µg/L) de 1,25(OH)2D3. Foram realizados os seguintes ensaios: ensaio de MTT, atividade de fosfatase alcalina, determinação da porcentagem de células por campo, número de nódulos de mineralização e avaliação da expressão dos transcritos gênicos para osteopontina, sialoproteína óssea e BMP-2, por RT-PCR tempo real. No primeiro experimento, culturas de CTMs da medula óssea foram utilizadas como modelo para estudo dos efeitos da S. glaucophyllum na indução da diferenciação osteogênica de células indiferenciadas. Na concentração de 5mL de extrato de S. glaucophyllum por L de cultura desprovido de fatores indutores da osteogênese, o extrato da planta induziu diferenciação osteogênica das CTMs, comprovada pela maior síntese de matriz mineralizada e pelo aumento da expressão relativa dos transcritos gênicos para BMP-2. A diferenciação osteogênica induzida pelo extrato da planta foi estatisticamente semelhante à diferenciação induzida por meio de cultura contendo fatores que comprovadamente induzem osteogênese, representados pelo -glicerofosfato, ácido ascórbico e pela dexametasona. Conclui-se que culturas de CTMs da medula óssea de ratos são um bom modelo para estudar o efeito do extrato da S. glaucophyllum sobre a diferenciação osteogênica de células indiferenciadas e que os extratos de S. glaucophyllum contendo 10nM (4 µg/L) e 50nM (20 µg/L) de 1,25(OH)2D3 causam diferenciação osteogênica de CTMs, sugerindo ser este um dos mecanismos pelo qual a S. glaucophyllum produz metaplasia óssea. No segundo experimento, a fim de estudar os efeitos da S. glaucophyllum em CTMs submetidas à diferenciação em osteoblastos, diferentes concentrações do extrato da planta foram adicionadas ao meio de cultura, juntamente com fatores conhecidamente promotores de diferenciação osteogênica, representados pelo -glicerofosfato, ácido ascórbico e pela dexametasona. Aos 21 dias, nas concentrações de 1mL e de 5mL de extrato/L, houve redução significativa do número e do tamanho dos nódulos de mineralização, respectivamente. A concentração de 5mL de extrato/L também reduziu significativamente a expressão do transcrito para osteopontina em comparação ao controle. Conclui-se que o extrato de S. glaucophyllum apresenta efeito negativo sobre culturas de CTMs comprometidas com a diferenciação osteogênica, o que sugere ser este um dos mecanismos pelo qual ocorre osteoporose nos animais intoxicados pela planta

Calcinogenic plants are important in veterinary medicine worldwide because they contain glycosides, which after their ingestion release potentially harmful vitamin D metabolites. In Brazil, the species Solanum glaucophyllum (S. malacoxylon) and Nierembergia veitchii are responsible for enzootic calcinosis, endemic intoxication that affects ruminants. Calcinosis is characterized by soft tissue calcification and is often associated with bone and cartilaginous metaplasias. The hypothesis of the first experiment is that the mesenchymal stem cells (MSCs) are involved in the genesis of the bone metaplasia caused by S. glaucophyllum, which still lacks scientific proof. In addition to metaplasia, S. glaucophyllum intoxication causes bone changes, represented by osteopetrosis, osteonecrosis and osteoporosis. Because the osteoblast is a cell derived from osteogenic differentiation of bone marrow MSCs, the hypothesis of the second experiment is that osteoporosis induced by S. glaucophyllum intoxication arises not only from the action of the plant on osteoblasts, but also from its effect on the osteogenic differentiation of MSCs. The concentration of 1,25(OH)2D3 obtained in the liquid chromatography technique in the extract of the plant was 3.8 g/mL. In both experiments, the effects of 100L, 1mL and 5mL of extract per liter of medium with 1nM (0.4g/L), 10nM (4g/L) and 50nM (20g/L) of 1,25(OH)2D3, respectivelly, were tested. The following assays were performed: MTT assay, alkaline phosphatase activity, determination of cells per field percentage, number of mineralization nodules and evaluation of the expression of the gene transcripts for osteopontin, bone sialoprotein and BMP-2 by RT -PCR real-time. In the first experiment, bone marrow MSCs cultures were used as a model for the study of the effects of S. glaucophyllum on the induction of osteogenic differentiation of undifferentiated cells. In the concentration of 5mL of S. glaucophyllum extract per liter of culture medium lacking osteogenesis inducing factors, the plant extract induced osteogenic differentiation of the MSCs, evidenced by the increase of mineralized matrix and relative expression of the gene transcripts to BMP-2. The osteogenic differentiation induced by the plant extract was statistically similar to the differentiation induced by culture containing factors that proved to induce osteogenesis, represented by -glycerophosphate, ascorbic acid and dexamethasone. It is concluded that rat bone marrow MSCs cultures are a good model for studying the effect of S. glaucophyllum extract on osteogenic differentiation of undifferentiated cells and that S. glaucophyllum extracts containing 10nM (4 g/L) and 50nM (20 g/L) of 1,25(OH)2D3 causes osteogenic differentiation of MSCs, suggesting that this is one of the mechanisms by which S. glaucophyllum produces bone metaplasia. In the second experiment, in order to study the effects of S. glaucophyllum on MSCs undergoing differentiation in osteoblasts, different concentrations of the plant extract were added to the culture medium, together with factors known to promote osteogenic differentiation, represented by -glycerophosphate, ascorbic acid and dexamethasone. At 21 days, in the concentrations of 1mL and 5mL of extract/L, there was a significant reduction in the number and size of mineralization nodules, respectively. The concentration of 5mL extract/L also significantly reduced transcript expression for osteopontin compared to control. It is concluded that the extract of S. glaucophyllum has a negative effect on cultures of mesenchymal stem cells compromised by osteogenic differentiation, suggesting that this is one of the mechanisms by which osteoporosis occurs in animals intoxicated by the plant

Resumo

Solanum glaucophyllum (Sg) [= S. malacoxylon] is a calcinogenic plant inducing "Enzootic Calcinosis" in cattle. The 1,25-dihydroxyvitamin D3, its main toxic principle, regulates bone and calcium metabolism and also exerts immunomodulatory effects. Thymocyte precursors from bone marrow-derived progenitor cells differentiate into mature T-cells. Differentiation of most T lymphocytes is characterized not only by the variable expression of CD4/CD8 receptor molecules and increased surface density of the T cell antigen receptor, but also by changes in the glycosylation pattern of cell surface glycolipids or glycoproteins. Thymocytes exert a feedback influence on thymic non-lymphoid cells. Sg-induced modifications on cattle thymus T-lymphocytes and on non-lymphoid cells were analysed. Heifers were divided into 5 groups (control, intoxicated with Sg during 15, 30 or 60 days, and probably recovered group). Histochemical, immunohistochemical, lectinhistochemical and morphometric techniques were used to characterize different cell populations of the experimental heifers. Sg-poisoned heifers showed a progressive cortical atrophy that was characterized using the peanut agglutinin (PNA) lectin that recognizes immature thymocytes. These animals also increased the amount of non-lymphoid cells per unit area detected with the Picrosirius technique, WGA and DBA lectins, and pancytokeratin and S-100 antibodies. The thymus atrophy found in intoxicated animals resembled that of the physiological aging process. A reversal effect on these changes was observed after suppression of the intoxication. These findings suggest that Sg-intoxication induces either directly, through the 1,25-dihydroxyvitamin D3 itself, or indirectly through the hypercalcemia, the observed alteration of the thymus.

Solanum glaucophyllum (Sg) [= S. malacoxylon] é uma planta calcinogênica que induz "Calcinose Enzoótica" em bovinos. O 1,25-dihidroxivitamina D3, seu principal agente tóxico, regula o metabolismo ósseo, o metabolismo de cálcio e também mostra efeitos na imunomodulação. Precursores de timócitos derivados da medula óssea se diferenciam em linfócitos T maduros. A diferenciação da maioria dos linfócitos T é caracterizada pela expressão variável de moléculas de receptores CD4/CD8 e densidade aumentada dos receptores antigênicos de superfície de células T. Alem disso, há mudanças no padrão de glicosilação de glicolipídeos na superfície celular ou de glicoproteínas. Timócitos mostram uma influência de retro alimentação em células tímicas não-linfóides. Foram analisadas modificações induzidas pelo Sg em linfócitos T e células tímicas não-linfóides de bovinos. Novilhas foram divididas em 5 grupos (controle, intoxicadas com Sg durante 15, 30 ou 60 dias, e grupo provavelmente recuperado). As diferentes populações celulares das novilhas experimentais foram caracterizadas com técnicas histoquímicas, imuno-histoquímicas, lectina-histoquímicas e morfométricas. As novilhas intoxicadas com Sg mostraram uma atrofia cortical progressiva que foi caracterizada usando a lectina aglutinina de amendoim (PNA) que reconhece timócitos imaturos. Estes animais também aumentaram as células não-linfóides tímicas por unidade de área, detectadas com a técnica de Picrosirius, lectinas WGA e DBA e anticorpos antipancitoqueratina e anti-S-100. A atrofia de timo observada nos animais intoxicados foi semelhante àquela do processo de envelhecimento fisiológico. Após supressão da intoxicação, foi observado um efeito de reversão nestas mudanças. Estes resultados sugerem que a intoxicação por Sg induza a alteração observada no timo diretamente, pela ação de 1,25-dihidroxivitamina D3, ou indiretamente, pela ação da hipercalcemia.

Resumo

Investigou-se o efeito de extratos aquosos de Solanum malacoxylon (Sendter) Solanaceae (SM) (sin.: S. glaucophyllum) e Nierembergia veitchii (Hook) Solanaceae (NV), plantas calcinogênicas encontradas no Brasil, sobre a reproduçäo de ratos e sobre suas progênies. No experimento 1, ratos e ratas Wistar, em número variável conforme o grupo, receberam por via oral, durante os 40 dias anteriores ao acasalamento, extrato aquoso de ambas as plantas em dosagem equivalente à administraçäo diária de 10,9gxkg elevado a menos um de planta seca. Os resultados foram comparados com os de um grupo tratado diariamente com vitamina D3 (3,0mgxkg elevado a menos um) e com os de um grupo-controle (salina). No experimento 2, ratas prenhes receberam, por via oral, três diferentes doses dos extratos de ambas as plantas (equivalentes à administraçäo diária de 5,4; 10,9 e 21,7gxkg elevado a menos um de planta seca), durante toda a gestaçäo. Os resultados foram comparados com três grupos tratados com vitamina D3 (0,75; 2,25 e 3,75mgxkg elevado a menos um) e um grupo-controle (salina). Quando administradas antes da gestaçäo, o ganho de peso das fêmeas e a fertilidade foram reduzidos nos grupos tratados com SM (11 por cento) e vitamina D3 (11 por cento). No grupo tratado com NV, a fertilidade também foi reduzida (25 por cento), mas o desenvolvimento ponderal durante o tratamento näo foi afetado. Nos grupos tratados com SM e vitamina D3 anterior à gestaçäo, o número de filhotes por ninhada foi reduzido, assim como o seu peso ao nascer. Características de desenvolvimento e desempenho físico dos filhotes näo foram afetados em nenhum dos grupos. O tratamento das fêmeas com extrato aquoso de SM durante a gestaçäo causou reduçäo significativa e dose-dependente nas características reprodutivas estudadas. O mesmo foi observado com as fêmeas tratadas com vitamina D3. Com o extrato aquoso de NV näo foram observadas reduçöes nas taxas reprodutivas, quando as fêmeas foram tratadas durante a gestaçäo. Com as doses 10,9 e 21,7xkg elevado a menos um de NV foram observadas anomalias morfológicas fetais (2,3 e 0,1 por cento, respectivamente), também presentes nos filhotes de fêmeas tratadas com vitamina D3 (2,25mgxkg elevado a menos um). A presença de vitamina D3 e seus metabólitos nas plantas calcinogênicas provavelmente é responsável pela infertilidade observada, näo somente devido à toxicidade sistêmica, mas também devido aos seus efeitos específicos sobre o aparelho reprodutor

Resumo

The effects of oral administration of aqueous (NvH2O), methanolic (NvmeOH), buthanolic (Nvbut) and hexan (Nvhex) extracts, sequentialy obtained from 500g Nierembergia veitchii (dried plant) were compared with a vitamin D3 treated group and with a control group (saline), when administered during the pregnancy to Wistar rats (21 days). Weigth gain was reduced in dams treated with Nvhex, Nvbut and vitamin D3. In these groups it was observed a reduction in uterine implantations (9.3 ± 1.4, 9.6 ± 1.4 and 8.4 ± 1.4) when compared with the control (11.2 ± 0.4). The reduction could also be observed in the number of pups per litter (8.1 ± 1.3, 9.0 ± 1.5, 5.1 ± 1.7 and 10.3 ± 0.6), and in the weigth of pups at birth (2.1g ± 0.5, 2.9g ± 0.4, 1.9g ± 0.1 and 3.3g ± 0.1). We didn’t observe any difference betwen NvH2O, NvmeOH and control group. Macroscopicaly abnormalities were observed in some pups of Nvhex and Nvbut groups (0.1% and 0.2% respectively). The results of the skeleton avaliation showed 33.3%, 45%, 9.8% e 11.1% of abnormalities for NvH2O, NvmeOH, Nvbut and control group respectively. The most frequently observed abnormalities were found in the skull, and were: incomplete ossification of supraocciopital, interparietal, parietal, frontal and temporal.

Os efeitos da administração oral dos extratos aquoso (NvH2O), metanólico (NvmeOH), butanólico (Nvbut) e hexano (Nvhex), obtidos, seqüencialmente, de 500g de Nierembergia veitchii (planta seca), foram comparados aos obtidos com vitamina D3 (2,5mg.kg-1) e aos de um grupo controle (solução fisiológica - SF), quando administrados, durante todo o período de gestação (21 dias), a ratas albinas Wistar. A redução do ganho de peso foi evidente nas fêmeas tratadas com Nvhex, Nvbut e vitamina D3. Nesses grupos, houve redução do número de implantes uterinos (9,3 ± 1,4; 9,6 + 1,4 e 8,4 ± 1,4), quando comparados com o controle (SF) (11,2 ± 0,4). Essa redução também foi observada no número de filhotes por ninhada (8,1 ± 1,3; 9,0 ± 1,5; 5,1 ± 1,7 e 10,3 ± 0,6), e na massa corporal dos filhotes ao nascer (2,1g ± 0,5; 2,9g ± 0,4; 1,9g ± 0,1 e 3,3g ± 0,1). Os resultados obtidos com NvH2O e NvmeOH não diferiram dos obtidos com o grupo controle. Anomalias macroscópicas foram observadas em fetos de ratas tratadas com Nvhex e Nvbut, 0,1 e 0,2% respectivamente. Os resultados da análise da morfologia óssea dos fetos mostraram a ocorrência de 33,3%; 45%; 9,8% e 11,1% de anomalias para os grupos NvH2O, NvmeOH, Nvbut e SF, respectivamente. As anomalias ósseas mais freqüentemente observadas ocorreram no crânio e constaram de ossificação incompleta de supraoccipital, interparietais, parietais, frontal e temporal.

Resumo

The aim of this study was to describe the bone changes observed after a daily oral administration of the calcinogenic plant Solanum malacoxylon (syn. S. glaucophyllum) (Sm) during 9 days. The Sm-poisoned rabbits had an increase of bone resorption in the endosteal surface of the cortical zone and also in the surface covered by osteoblasts of the primary and secondary spongiosa of the trabecular bone compartment. Moreover, the epiphyseal growth plates in long bones appeared narrower than in the control rabbits, with reduction of the proliferative and hyperthrophic chondrocyte zones. The electron microscopic study revealed a significant decrease of proteoglycans in the hyperthrophic chondrocyte zone evidenced by a significant reduction of rutenium red positive granules in the poisoned rabbit. Altogether, these data suggest that cell differentiation may play a pivotal role in the pathogenesis of Sm-induced bone lesions.

Resumo

Seis coelhos com cerca de três meses, de ambos os sexos, receberam via sonda gástrica, extrato aquoso de Solanum malacoxylon equivalente a 100 mg de folhas dessecadas por kg de peso vivo. Dois animais näo receberam o extrato e serviram como testemunhas, sendo sacrificados ao final do experimento. Entre 48, 72 e 120 horas após o início do experimento, todos os outros coelhos foram sacrificados e fragmentos do miocárdio foram processados para microscopia óptica e eletrônica. As alteraçöes macroscópicas mais importantes foram estrias esbranquiçadas no miocárdio, particularmente no átrio esquerdo. Em microscopia óptica, grupos de células musculares mostravam sarcoplasma tumefeito, com perda das estriaçöes, discreta basofilia e eventualmente vacuolizaçöes do sarcoplasma. Estas células geralmente estavam rodeadas por macrófagos, células mesenquimais e alguns polimorfonucleares neutrófilos de permeio com material necrótico. No interstício foi evidenciado material basofílico finamente granular. A reaçäo de von Kossa nestes locais revelou depósitos de cálcio no sarcoplasma dos miócitos, no interstício e, eventualmente, ao redor de células musculares aparentemente näo lesadas. Os vasos coronários exibiam mineralizaçäo da média. Na ultra-estrutura foram observadas: ativaçäo dos cardiomiócitos e das células intersticiais, deposiçäo do cálcio no interstício e no sarcoplasma das células musculares cardíacas e no cistoplasma de células intersticiais. Em fases mais avançadas observou-se necrose dos cardiomiócitos, com mineralizaçäo das células e lise celular. Alguns polimorfonucleares neutrófilos e macrófagos fagocitando material necrótico mineralizado säo também vistos nestes locais. O aspecto morfológico do miocárdio sugere que as lesöes de necrose e calcificaçäo säo o resultado da açäo direta do 1,25(OH)2D3 contido na planta sobre as células do miocárdio. Os animais testemunhas näo exibiram alteraçöes no miocárdio

Six rabbits of both sexes, 3-months old, were given via gastric tube an aqueous extract of the plant Solanum malacoxylon, equivalentto 100 mg of dried leaves per kg of body weight. Two rabbits (controls) did not receive the extract and were killed at the end of theexperiment. All others rabbits were killed at 48,72 and 120 hours after extract administration. Fragments of myocardium were sampledand processed for both light and electron microscopy. Most significant gross changes observed were whitish streaks in the myocardium,especially in the right atrium. On light microscopic examination, groups of muscle cells had swollen sarcoplasms with loss of striations,slight basophila and eventual sarcoplasmic vacuolizations. These groups of cells were usually surrounded by macrophages,mesenchymal cells and few neutrophils admixed with necrotic debris. There was a delicate granular basophilic material in the interstitium.Von Kossa staining revealed, at these sites, calcium deposits within the sarcoplasm of cardiac myocytes in the interstitium and,occasionally, around apparently non damaged myocytes. There was mineralization of the medial tunic of coronary arteries. On the EMexamination the following changes were observed: activation of cardiac myocytes and interstitial cells, calcium deposits in the interstitiumand in the sarcosplasm of cardiac myocytes, as well as in the cytoplasm of interstitial cells. In late stages there was necrosis of cardiacmyocytes, with mineralization and cytolisis. Few neutrophils and macrophages, with phagocytized mineral necrotic debris were alsoobserved at these sites. The morphological aspect of the myocardium suggests that necrosis and calcification result from the directaction of the 1,25(OH)2D3 present in the plant on the myocardial cells. No changes in the myocardium of control rabbits were found