Morphometry of bovine blastocysts produced in vitro in culture media with antioxidants cysteamine or oily extract of Lippia origanoides / [Morfometria de blastocistos bovinos produzidos in vitro em meio de cultura com antioxidantes cisteamina ou extrato oleoso de Lippia origanoides]

This study aimed to evaluate the ultrastructural morphometry of bovine embryos produced in vitro grown at different concentrations of antioxidants. After in vitro maturation and fertilization, the presumptive zygotes were assigned into five treatments. T1) without the addition of any antioxidants (negative control); T2) addition of 50µM/mL cysteamine; and T3, T4 and T5) adding 2.5µg/mL, 5.0µg/mL or 10.0µg/mL of the antioxidants derived from the oily extract from Lippia origanoides, respectively. On D7 of culture, the embryos in the blastocyst stage were fixed and prepared for electron transmission microscopy. These were evaluated for the proportion of cytoplasm-to-nucleus, cytoplasm-to-mitochondria, cytoplasm-to-vacuoles, cytoplasm-to-autophagic vacuoles and cytoplasm-to-lipid droplets. Blastocysts cultured in media containing oily extract of Lippia origanoides presented morphological characteristics such as high cell:mitochondria ratio and low cell:vacuoles and cell:autophagic vacuole ratio, possibly been morphological indicators of embryonic quality. Inner cell mass (ICM) from blastocysts cultured in media without any antioxidants had the highest cell:vacuole ratio. Similar results were found in the trophectoderm (TE) cells of blastocysts from treatment 2. Embryo culture media supplemented with antioxidants derived from Lippia origanoides oil produced embryos with a higher cytoplasmic proportion of organelles, such as mitochondria. Also, treatments without any antioxidants or with the addition of cysteamine presented cytoplasmic vacuolization, a characteristic related to production of poor-quality embryos.(AU)

Este estudo teve como objetivo avaliar a morfometria ultraestrutural de embriões bovinos produzidos in vitro e cultivados em diferentes concentrações de antioxidantes. Após a maturação e a fertilização in vitro, os possíveis zigotos foram divididos em cinco tratamentos: T1) sem adição de antioxidantes (controle negativo); T2) adição de 50µM/mL de cisteamina; e T3, T4 e T5) adição de 2,5µg/mL, 5,0µg/mL ou 10,0µg/mL dos antioxidantes derivados do extrato oleoso de Lippia origanoides, respectivamente. No D7 de cultivo, os embriões em estágio de blastocisto foram fixados e preparados para microscopia eletrônica de transmissão. Estes foram avaliados para a proporção entre citoplasma e núcleo, citoplasma e mitocôndria, citoplasma e vacúolos, citoplasma e vacúolos autofágicos e citoplasma e gotículas lipídicas. Blastocistos cultivados em meio contendo extrato oleoso de Lippia origanoides apresentaram características morfológicas como alta relação célula:mitocôndria e baixa relação célula:vacúolos e célula:vacúolo autofágico, possíveis indicadores morfológicos de qualidade embrionária. A massa celular interna (MCI) de blastocistos cultivados em meio sem quaisquer antioxidantes teve a maior razão célula:vacúolo. Resultados semelhantes foram encontrados nas células do trofectoderma (TE) de blastocistos do tratamento 2. Portanto, o meio de cultivo embrionário suplementado com antioxidantes derivados do óleo de Lippia origanoides produziu embriões com maior proporção citoplasmática de organelas, como mitocôndrias. Além disso, tratamentos sem antioxidantes ou com adição de cisteamina apresentaram vacuolização citoplasmática, característica relacionada à produção de embriões de baixa qualidade.(AU)

Antioxidant activity of oily extract obtained from Lippia origanoides improves the quality of bovine embryos produced in vitro / Atividade antioxidante de óleo essencial obtido de Lippia origanoides melhora a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro

The aim of this study was to evaluate the supplementation of embryo culture medium with antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides on in vitro blastocyst development and quality. Oocytes collected from slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro following standard laboratory procedures. Zygotes were cultured in SOF medium supplemented according to the following treatments: T1 embryo culture medium without antioxidant supplementation; T2)50µM/mL Cysteamine; T3)2.5µg/mL; T4)5.0µg/mL and T5)10.0µg/mL of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides. On the seventh day of culture, the blastocysts were fixed and evaluated for apoptosis rates, number of total cell and inner cell mass cells by means of the TUNEL Test. The use of antioxidants during cultivation did not increase (P> 0.05) the final blastocyst production rate. The treatments T2, T3, T4 and T5 had the lowest (P< 0.05) apoptotic indexes (4.5±1.1%, 8.4±2.5%, 3.4±1.1% and 5.5±0.9%, respectively) when compared to T1 treatment (10.0±1.4%). The number of inner cell mass did not differ (P> 0.05) among embryos from different treatments. The addition of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides reduces the apoptosis rate and improves the quality without increasing the total in vitro production of bovine embryos.(AU)

O objetivo desse estudo foi avaliar a suplementação de meio de cultura de embriões com antioxidante obtido do extrato oleoso da Lippia origanoides no desenvolvimento e na qualidade de blastocistos produzidos in vitro. Oócitos coletados de ovários de matadouros foram maturados e fertilizados in vitro segundo procedimento laboratorial padrão. Zigotos foram cultivados em meio SOF suplementado de acordo com os seguintes tratamentos: T1) meio de cultivo embrionário sem suplementação antioxidantes; T2) 50µM/mL Cisteamina; T3) 2,5µg/mL; T4) 5,0µg/mL e T5) 10,0µg/mL do antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides. No sétimo dia de cultivo, os blastocistos foram fixados e avaliados para taxa de apoptose, número total de células e massa celular interna através do teste TUNEL. O uso de antioxidantes durante cultivo não aumentou (P>0,05) a taxa de produção final de blastócitos. Os tratamentos T2, T3, T4 e T5 tiverem menor índice apoptótico (p>0,05 - 4,5±1,1%, 8,4±2,5%, 3,4±1,1% e 5,5±0,9%, respectivamente) quando comparados a T2 (10,0±1,4%). O valor de massa celular interna não diferenciou (p>0,05) entre embriões de diferentes tratamentos. A adição de antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides reduziu a taxa de apoptose e melhorou a qualidade sem aumentar a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

Antioxidant activity of oily extract obtained from Lippia origanoides improves the quality of bovine embryos produced in vitro / Atividade antioxidante de óleo essencial obtido de Lippia origanoides melhora a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro

The aim of this study was to evaluate the supplementation of embryo culture medium with antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides on in vitro blastocyst development and quality. Oocytes collected from slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro following standard laboratory procedures. Zygotes were cultured in SOF medium supplemented according to the following treatments: T1 embryo culture medium without antioxidant supplementation; T2)50µM/mL Cysteamine; T3)2.5µg/mL; T4)5.0µg/mL and T5)10.0µg/mL of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides. On the seventh day of culture, the blastocysts were fixed and evaluated for apoptosis rates, number of total cell and inner cell mass cells by means of the TUNEL Test. The use of antioxidants during cultivation did not increase (P> 0.05) the final blastocyst production rate. The treatments T2, T3, T4 and T5 had the lowest (P< 0.05) apoptotic indexes (4.5±1.1%, 8.4±2.5%, 3.4±1.1% and 5.5±0.9%, respectively) when compared to T1 treatment (10.0±1.4%). The number of inner cell mass did not differ (P> 0.05) among embryos from different treatments. The addition of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides reduces the apoptosis rate and improves the quality without increasing the total in vitro production of bovine embryos.(AU)

O objetivo desse estudo foi avaliar a suplementação de meio de cultura de embriões com antioxidante obtido do extrato oleoso da Lippia origanoides no desenvolvimento e na qualidade de blastocistos produzidos in vitro. Oócitos coletados de ovários de matadouros foram maturados e fertilizados in vitro segundo procedimento laboratorial padrão. Zigotos foram cultivados em meio SOF suplementado de acordo com os seguintes tratamentos: T1) meio de cultivo embrionário sem suplementação antioxidantes; T2) 50µM/mL Cisteamina; T3) 2,5µg/mL; T4) 5,0µg/mL e T5) 10,0µg/mL do antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides. No sétimo dia de cultivo, os blastocistos foram fixados e avaliados para taxa de apoptose, número total de células e massa celular interna através do teste TUNEL. O uso de antioxidantes durante cultivo não aumentou (P>0,05) a taxa de produção final de blastócitos. Os tratamentos T2, T3, T4 e T5 tiverem menor índice apoptótico (p>0,05 - 4,5±1,1%, 8,4±2,5%, 3,4±1,1% e 5,5±0,9%, respectivamente) quando comparados a T2 (10,0±1,4%). O valor de massa celular interna não diferenciou (p>0,05) entre embriões de diferentes tratamentos. A adição de antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides reduziu a taxa de apoptose e melhorou a qualidade sem aumentar a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

In vitro maturation of collared peccary (Pecari tajacu) oocytes after different incubation times / Maturação in vitro de oócitos de cateto (Pecari tajacu) após diferentes períodos de incubação

Oocyte in vitro maturation (IVM) is the first step of the in vitro reproductive technologies that enables mature oocytes to be generated ex vivo and after used for embryo production. In this sense, the establishment of culture environment, as oocyte incubation time, is essential for the success of the IVM. Therefore, the study was carried out to investigate the relationship between the meiotic potential and the IVM times of collared peccary oocytes, wild mammals of great commercial and ecological interest. Thus, ovaries were collected of females derived from captivity and transported to the laboratory within 1 hour of slaughtering. The oocytes derived from follicles (3-6mm in diameter) were recovered by aspirated and sliced. Good quality oocytes (evenly granulated cytoplasm with a least one layer of surrounding cumulus cells) were selected and subjected to culture in TCM 199 supplemented with 10µg/mL FSH, 10% FBS and 100µM cysteamine at 38.5°C, 5% CO2 and maximum humidity for 24 or 48 hours. After the incubation period, the nuclear status, the presence of first polar body and the expansion of cumulus cells of oocytes were assessed. The data obtained were analyzed by Fisher exact test (P<0.05). A total of four sessions (2-3 females per session) were performed, resulting in eighteen aspirated and sliced ovaries with normal morphological characteristics. An oocyte recovery rate of about 83.1% (59/71) was obtained with 3.3 oocytes/ovary and 2.3 viable oocytes/ovary. After different incubation times, differences (P<0.05) were observed in 24 and 48 hours for expansion of the cumulus cells (38.1% vs. 100%), presence of first polar body (52.4% vs. 90.5%) and nuclear status in second metaphase (19.0% vs. 76.2%), respectively. In conclusion, 48 hours is suitable time for the in vitro maturation of oocytes derived from collared peccaries when compared to the time of 24 hours, according to the meiotic potential observed. Additional studies should be conducted to improve the quality of the oocyte culture environment, as medium composition, aiming to obtain viable mature oocytes for other in vitro biotechnologies.(AU)

A maturação in vitro (MIV) oocitária é a primeira etapa das tecnologias reprodutivas in vitro que permite que oócitos maturados sejam gerados ex vivo e depois usados para a produção de embriões. Nesse sentido, o estabelecimento do ambiente de cultivo, como o período de incubação de oócitos, é essencial para o sucesso da MIV. Portanto, o estudo foi realizado para investigar a relação entre o potencial meiótico e os períodos de MIV de oócitos derivados de catetos, mamíferos silvestres de grande interesse comercial e ecológico. Para tanto, os ovários foram coletados de fêmeas derivadas de cativeiro e transportados ao laboratório dentro de 1 h após o abate. Os oócitos derivados de folículos (3-6mm de diâmetro) foram recuperados por aspiração e fatiados. Oócitos de boa qualidade (citoplasma uniformemente granulado com pelo menos uma camada circundante de células cumulus) foram selecionados e submetidos ao cultivo em TCM 199 suplementado com 10µg/mL de FSH, 10% de SFB e 100μM de cisteamina a 38,5°C, 5% de CO2 e umidade máxima por 24 e 48 h. Após o período de incubação, o estado nuclear, a presença do primeiro corpúsculo polar e a expansão das células do cumulus dos oócitos foi avaliada. Os dados obtidos foram analisados pelo teste exato de Fisher (P<0,05). Um total de quatro sessões (2-3 fêmeas por sessão) foi realizado, resultando em dezoito ovários aspirados e fatiados com características morfológicas normais. Uma taxa de recuperação oocitária de aproximadamente 83,1% (59/71) foi obtida com 3,3 oócitos/ovário e 2,3 oócitos viáveis/ovário. Após diferentes períodos de incubação, diferenças (P<0,05) foram observadas entre 24 e 48 h para a expansão das células cumulus (38,1% vs. 100%), presença de primeiro corpúsculo polar (52,4% vs. 90,5%) e estado nuclear na segunda metáfase (19,0% vs. 76,2%), respectivamente. Em conclusão, 48 h é o período adequado para a maturação in vitro de oócitos derivados de catetos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico observado. Estudos adicionais devem ser conduzidos para melhorar a qualidade do ambiente de cultivo oocitário, como a composição de meio, objetivando obter oócitos maturados viáveis para outras biotecnologias in vitro.(AU)

In vitro maturation of collared peccary (Pecari tajacu) oocytes after different incubation times / Maturação in vitro de oócitos de cateto (Pecari tajacu) após diferentes períodos de incubação

Oocyte in vitro maturation (IVM) is the first step of the in vitro reproductive technologies that enables mature oocytes to be generated ex vivo and after used for embryo production. In this sense, the establishment of culture environment, as oocyte incubation time, is essential for the success of the IVM. Therefore, the study was carried out to investigate the relationship between the meiotic potential and the IVM times of collared peccary oocytes, wild mammals of great commercial and ecological interest. Thus, ovaries were collected of females derived from captivity and transported to the laboratory within 1 hour of slaughtering. The oocytes derived from follicles (3-6mm in diameter) were recovered by aspirated and sliced. Good quality oocytes (evenly granulated cytoplasm with a least one layer of surrounding cumulus cells) were selected and subjected to culture in TCM 199 supplemented with 10µg/mL FSH, 10% FBS and 100µM cysteamine at 38.5°C, 5% CO2 and maximum humidity for 24 or 48 hours. After the incubation period, the nuclear status, the presence of first polar body and the expansion of cumulus cells of oocytes were assessed. The data obtained were analyzed by Fisher exact test (P<0.05). A total of four sessions (2-3 females per session) were performed, resulting in eighteen aspirated and sliced ovaries with normal morphological characteristics. An oocyte recovery rate of about 83.1% (59/71) was obtained with 3.3 oocytes/ovary and 2.3 viable oocytes/ovary. After different incubation times, differences (P<0.05) were observed in 24 and 48 hours for expansion of the cumulus cells (38.1% vs. 100%), presence of first polar body (52.4% vs. 90.5%) and nuclear status in second metaphase (19.0% vs. 76.2%), respectively. In conclusion, 48 hours is suitable time for the in vitro maturation of oocytes derived from collared peccaries when compared to the time of 24 hours, according to the meiotic potential observed. Additional studies should be conducted to improve the quality of the oocyte culture environment, as medium composition, aiming to obtain viable mature oocytes for other in vitro biotechnologies.(AU)

A maturação in vitro (MIV) oocitária é a primeira etapa das tecnologias reprodutivas in vitro que permite que oócitos maturados sejam gerados ex vivo e depois usados para a produção de embriões. Nesse sentido, o estabelecimento do ambiente de cultivo, como o período de incubação de oócitos, é essencial para o sucesso da MIV. Portanto, o estudo foi realizado para investigar a relação entre o potencial meiótico e os períodos de MIV de oócitos derivados de catetos, mamíferos silvestres de grande interesse comercial e ecológico. Para tanto, os ovários foram coletados de fêmeas derivadas de cativeiro e transportados ao laboratório dentro de 1 h após o abate. Os oócitos derivados de folículos (3-6mm de diâmetro) foram recuperados por aspiração e fatiados. Oócitos de boa qualidade (citoplasma uniformemente granulado com pelo menos uma camada circundante de células cumulus) foram selecionados e submetidos ao cultivo em TCM 199 suplementado com 10µg/mL de FSH, 10% de SFB e 100μM de cisteamina a 38,5°C, 5% de CO2 e umidade máxima por 24 e 48 h. Após o período de incubação, o estado nuclear, a presença do primeiro corpúsculo polar e a expansão das células do cumulus dos oócitos foi avaliada. Os dados obtidos foram analisados pelo teste exato de Fisher (P<0,05). Um total de quatro sessões (2-3 fêmeas por sessão) foi realizado, resultando em dezoito ovários aspirados e fatiados com características morfológicas normais. Uma taxa de recuperação oocitária de aproximadamente 83,1% (59/71) foi obtida com 3,3 oócitos/ovário e 2,3 oócitos viáveis/ovário. Após diferentes períodos de incubação, diferenças (P<0,05) foram observadas entre 24 e 48 h para a expansão das células cumulus (38,1% vs. 100%), presença de primeiro corpúsculo polar (52,4% vs. 90,5%) e estado nuclear na segunda metáfase (19,0% vs. 76,2%), respectivamente. Em conclusão, 48 h é o período adequado para a maturação in vitro de oócitos derivados de catetos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico observado. Estudos adicionais devem ser conduzidos para melhorar a qualidade do ambiente de cultivo oocitário, como a composição de meio, objetivando obter oócitos maturados viáveis para outras biotecnologias in vitro.(AU)

Only VEGF is necessary to stimulate the meiotic competence of caprine oocytes during in vitro maturation / Apenas VEGF é necessário para estimular a competência meiótica de oócitos caprinos durante a maturação in vitro

Para o sucesso da maturação in vitro (MIV), faz-se necessário uma sincronização entre as maturação nuclear e citoplasmática. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo comparar o efeito do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) como fator de crescimento na maturação in vitro (MIV) de oócitos caprinos com os fatores de crescimento epidermal (EGF) e semelhante à insulina I (IGF-I) adicionados juntos. Complexos cúmulos oócito (CCOs) foram isolados por slicing de ovários caprinos (n=40) utilizando bisturi cirúrgico. Apenas oócitos ≥110 μm com citoplasma homogêneo circundado por pelo menos uma camada compacta e coesiva de células do cúmulus foram selecionados para MIV. O meio de cultivo de base foi o TCM199 suplementado com 1% de BSA, 5 g/mL de hormônio luteinizante (LH), 0,5 g/mL de hormônio folículo estimulante recombinante (rFSH®), 0,911 mMol/L de piruvato,1μg/mL de estradiol, e 100 μM de cisteamina, o qual foi denominado TCM199+. OsCCOs selecionados foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos: 1) EGF e IGF-I, TCM199+ Suplementado com 10 ng/mL de EGF e 50 ng/mL de IGF-I; 2) VEGF, TCM199+ suplementado com 100 ng/mL de VEGF. Após a MIV, foram utilizados marcadores fluorescentes para avaliar a configuração da cromatina (Hoechst) e a viabilidade oocitária (calceína-AM e etídio homodímero). De uma maneira geral, ambos os tratamentos VEGF (80.2 e 35.7%) e EGF e IGF-I (70.5 e 29.9%) apresentaram resultados similares de quebra da vesícula germinativa (GVBD) e metáfase II rates (MII), respectivamente, sendo o tratamento VEGF numericamente superior ao EGF e IGF-I. Desta forma, conclui-se que o VEGF atua de forma similar ao EGF e IGF-I na competência oocitária para retomar ameiose.

For successful IVM, oocytes must undergo synchronically nuclear and cytoplasmic maturation. Thus, the aim of the present study was to compare vascular endothelial growth factor (VEGF) as a growth factor to the in vitro maturarion (IVM) to caprine oocytes instead of epidermal growth factor (EGF) plus insulin like growth factor I (IGF-I).Then, cumulus oocyte complexes (COCs) were pooled from slicing of caprine ovaries (n=40) using a surgical blade. Only oocytes ≥110 μm with homogeneous cytoplasm and surrounded by at least one compact layer of shiny and cohesive cumulus cells were selected to the IVM. The basic culture medium consisted of TCM199 supplemented with 1% of BSA, 5 g/mL of luteinizing hormone (LH), 0.5 g/mL of recombinant follicle-stimulanting hormone (rFSH®), 0.911 mMol/L pyruvate,1 μg/mL estradiol, and 100 μM cysteamine named TCM199+. The selected COCs were randomly distributed in the following treatments: 1) EGF plus IGF-I, TCM199+supplemented with 10 ng/ml of EGF and 50 ng/mL of IGF-I; 2) VEGF, TCM199+supplemented only with 100ng/mL of recombinant VEGF-A. After the IVM, oocytes were stained with fluorescent markers for the assessment of chromatin configuration (Hoechst) and to evaluate oocyte viability (calcein-AM and ethidium homodimer). Overall, both VEGF (80.2 and 35.7%) and EGF plus IGF-I (70.5 and 29.9%) treatments presented similar results of germinal vesicle breakdown (GVBD) and metaphase II rates (MII), respectively, being VEGF numerically greater than EGF plus IGF-I. Thus, we can infer that VEGF may act similar to EGF plus IGF-I in in vitro oocyte competence to resumes meiosis.

Only VEGF is necessary to stimulate the meiotic competence of caprine oocytes during in vitro maturation / Apenas VEGF é necessário para estimular a competência meiótica de oócitos caprinos durante a maturação in vitro

Para o sucesso da maturação in vitro (MIV), faz-se necessário uma sincronização entre as maturação nuclear e citoplasmática. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo comparar o efeito do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) como fator de crescimento na maturação in vitro (MIV) de oócitos caprinos com os fatores de crescimento epidermal (EGF) e semelhante à insulina I (IGF-I) adicionados juntos. Complexos cúmulos oócito (CCOs) foram isolados por slicing de ovários caprinos (n=40) utilizando bisturi cirúrgico. Apenas oócitos ≥110 μm com citoplasma homogêneo circundado por pelo menos uma camada compacta e coesiva de células do cúmulus foram selecionados para MIV. O meio de cultivo de base foi o TCM199 suplementado com 1% de BSA, 5 g/mL de hormônio luteinizante (LH), 0,5 g/mL de hormônio folículo estimulante recombinante (rFSH®), 0,911 mMol/L de piruvato,1μg/mL de estradiol, e 100 μM de cisteamina, o qual foi denominado TCM199+. OsCCOs selecionados foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos: 1) EGF e IGF-I, TCM199+ Suplementado com 10 ng/mL de EGF e 50 ng/mL de IGF-I; 2) VEGF, TCM199+ suplementado com 100 ng/mL de VEGF. Após a MIV, foram utilizados marcadores fluorescentes para avaliar a configuração da cromatina (Hoechst) e a viabilidade oocitária (calceína-AM e etídio homodímero). De uma maneira geral, ambos os tratamentos VEGF (80.2 e 35.7%) e EGF e IGF-I (70.5 e 29.9%) apresentaram resultados similares de quebra da vesícula germinativa (GVBD) e metáfase II rates (MII), respectivamente, sendo o tratamento VEGF numericamente superior ao EGF e IGF-I. Desta forma, conclui-se que o VEGF atua de forma similar ao EGF e IGF-I na competência oocitária para retomar ameiose.(AU)

For successful IVM, oocytes must undergo synchronically nuclear and cytoplasmic maturation. Thus, the aim of the present study was to compare vascular endothelial growth factor (VEGF) as a growth factor to the in vitro maturarion (IVM) to caprine oocytes instead of epidermal growth factor (EGF) plus insulin like growth factor I (IGF-I).Then, cumulus oocyte complexes (COCs) were pooled from slicing of caprine ovaries (n=40) using a surgical blade. Only oocytes ≥110 μm with homogeneous cytoplasm and surrounded by at least one compact layer of shiny and cohesive cumulus cells were selected to the IVM. The basic culture medium consisted of TCM199 supplemented with 1% of BSA, 5 g/mL of luteinizing hormone (LH), 0.5 g/mL of recombinant follicle-stimulanting hormone (rFSH®), 0.911 mMol/L pyruvate,1 μg/mL estradiol, and 100 μM cysteamine named TCM199+. The selected COCs were randomly distributed in the following treatments: 1) EGF plus IGF-I, TCM199+supplemented with 10 ng/ml of EGF and 50 ng/mL of IGF-I; 2) VEGF, TCM199+supplemented only with 100ng/mL of recombinant VEGF-A. After the IVM, oocytes were stained with fluorescent markers for the assessment of chromatin configuration (Hoechst) and to evaluate oocyte viability (calcein-AM and ethidium homodimer). Overall, both VEGF (80.2 and 35.7%) and EGF plus IGF-I (70.5 and 29.9%) treatments presented similar results of germinal vesicle breakdown (GVBD) and metaphase II rates (MII), respectively, being VEGF numerically greater than EGF plus IGF-I. Thus, we can infer that VEGF may act similar to EGF plus IGF-I in in vitro oocyte competence to resumes meiosis.(AU)

POTENCIAL ANTIOXIDANTE DOS BIOATIVOS PRESENTES NO ÓLEO ESSENCIAL DE Syzygium aromaticum L. NA MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS

O óleo essencial de Syzygium aromaticum (OESA) possui comprovada atividade antioxidante. Contudo, por seus bioativos serem de diferentes constituições, é necessária a aplicação de estudos bioguiados para denotar o maior potencial antioxidante do OESA, bem como determinar a concentração ideal. Assim, considerando que a produção in vitro de embriões (PIVE) em bovinos apresenta eficiência variável em virtude das condições de estresse oxidativo, a suplementação do meio com esses compostos pode ser uma alternativa para otimizar a técnica. Portanto, o objetivo foi avaliar o potencial antioxidante dos bioativos isolados do OESA em oócitos bovinos, sobre a maturação nuclear e citoplasmática, viabilidade das células do cumulus, níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), níveis de glutationa intracelular (GSH), potencial de membrana mitocondrial (m), desenvolvimento embrionário partenogenético (Etapa 1); e diferentes concentrações do bioativo definido na primeira etapa sobre os mesmos parâmetros (Etapa 2). Para tanto, oócitos foram maturados nas seguintes suplementações: OESA20 (20 g/mL OESA), EUG (83 M eugenol), -CA (19 M -cariofileno), ACT (12 M acetato de eugenila), CIS (100 M cisteamina) e controle (sem antioxidante) para a Etapa 1; e eugenol E83 (83 M eugenol), E100 (100 M eugenol), E120 (120 M eugenol), controle positivo (100 M cisteamina) e controle negativo (sem antioxidante) para Etapa 2. Na etapa 1, todos os antioxidantes foram superiores ao controle nas taxas de metáfase II (MII, P < 0,05). Contudo, EUG, OESA20 e CIS aumentaram as taxas de extrusão do primeiro corpúsculo polar (1CP, P < 0,05). Além disso, EUG apresentou taxas de expansão e viabilidade das células do cumulus superiores aos demais grupos (P < 0,05). As taxas de maturação citoplasmática por distribuição mitocondrial foram maiores nos grupos EUG e ACT, e para os padrões de agregação mitocondrial se destacaram EUG, ACT e CIS (P < 0,05). Os níveis de EROs foram reduzidos e os de GSH aumentaram com o EUG e CIS (P < 0,05). Ainda, todos os grupos mostraram menores níveis de m comparado ao grupo controle e -CA (P < 0,05). EUG, OESA20 e CIS promoveram maiores taxas de clivagem e qualidade embrionária, mas o EUG promoveu uma maior taxa de blastocistos e estruturas com 8 células (P < 0,05). Apesar da ação dos demais bioativos serem positivas, o eugenol promoveu a maior atividade e foi usado na etapa seguinte. Na etapa 2, as taxas de MII foram superiores para E83 quando comparados aos demais grupos (P < 0,05). E83, E120 e o controle positivo aumentaram as taxas de 1CP (P < 0,05). E83 e controle positivo resultaram em expansão e viabilidade de células cumulus superiores (P < 0,05). A maturação citoplasmática não diferiu entre os grupos com antioxidantes, mas, a agregação mitocondrial se destacou em E83 e controle positivo (P < 0,05). Um m menor foi mostrado nos grupos suplementados com antioxidantes (P < 0,05). Os níveis de EROs reduziram com os grupos E83 e controle positivo, e os de GSH aumentaram com esses e o E120 (P < 0,05). A taxa de clivagem e o número de blastocistos eclodidos foi maior em E83, assim como a qualidade embrionária (P < 0,05). Em conclusão, apesar do -CA e ACT terem efeitos antioxidantes, 83 M de eugenol adicionado aos meios de MIV foi a mais interessante alternativa entre os bioativos para a manutenção da qualidade de oócitos bovinos, bem como promover o aumento do subsequente desenvolvimento embrionário.

The Syzygium aromaticum essential oil (EOSA) has proven antioxidant activity. Nevertheless, because its bioactive substances are of different constitutions, it is necessary to apply bioguided studies to denote the greater antioxidant potential of EOSA, as well as to determine the ideal concentration. Thus, considering that the in vitro embryo production (IVEP) in cattle has variable efficiency, due to oxidative stress conditions, medium supplementation with these compounds may be an alternative to optimize the technique. Therefore, the aim was to evaluate the antioxidant potential of EOSA bioactives in bovine oocytes on nuclear and cytoplasmic maturation, viability of cumulus cells, levels of reactive oxygen species (ROS), levels of intracellular glutathione (GSH), mitochondrial membrane potential (m), parthenogenetic embryonic development (Step 1); and different concentrations of the bioactive defined in the first step on the same parameters (Step 2). Oocytes were matured in the following supplements: EOSA20 (20 g/mL EOSA), EUG (83 M eugenol), -CA (19 M -caryophyllene), ACT (12 M acetyl acetate), CYS (100 M cysteamine) and control (without antioxidant) for step 1; and E83 (83 M eugenol), E100 (100 M eugenol), E120 (120 M eugenol), positive control (100 M cysteamine) and negative control (without antioxidant) for step 2. In the step 1, all antioxidants were superior to the control for metaphase II (MII) rates (P < 0.05). Nevertheless, EUG, EOSA20 and CYS increased the extrusion rates of the first polar body (1PB, P < 0.05). Moreover, EUG showed a superior expansion and viability of the cumulus cells rates (P < 0.05). The rates of cytoplasmic maturation by mitochondrial distribution were higher in the EUG and ACT, and for the patterns of mitochondrial aggregation EUG, ACT and CYS stood out (P < 0.05). ROS levels were reduced and GSH levels were increased with EUG and CYS (P < 0.05). All groups showed lower levels of m compared to the control and -CA (P < 0.05). EUG, EOSA20 and CYS promoted higher rates of cleavage and embryonic quality, but EUG promoted a higher rate of blastocysts and structures with 8 cells in the cleavage (P < 0.05). Although the action of the other bioactive agents was positive, eugenol promoted the greatest activity and was used in the next step. In the step 2, the MII rates were higher in the E83 when compared other groups (P < 0.05). E83, E120 and the positive control increased the rates of 1PB (P < 0.05). E83 and positive control resulted in higher expansion and viability of cumulus cells (P < 0.05). Cytoplasmic maturation did not differ among groups with antioxidants, but mitochondrial aggregation stood out in E83 and positive control (P < 0.05). A lower m was shown in the groups supplemented with antioxidants (P < 0.05). The ROS levels decreased with E83 and positive control, and the GSH levels increased with these and the E120 (P < 0.05). The cleavage rate and the number of hatched blastocysts was higher in the E83, as well as the embryonic quality (P < 0.05). In conclusion, although -CA and ACT have positive antioxidant effects, 83 M of eugenol added to IVM medium was the most interesting alternative among bioactive agents for maintaining the quality of bovine oocytes, as well as promoting the increase of subsequent embryonic development.

Uso de diferentes gonadotrofinas na maturação in vitro de oócitos ovinos

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do uso das gonadotrofinas eCG e hCG, comparado ao FSH, na maturação in vitro de oócitos ovinos. Para tanto, ovários ovinos foram transportados do matadouro local para o laboratório, em solução salina, a 0,9%, a 30°C, até duas horas após o abate. Após a colheita, os oócitos foram avaliados e divididos em três grupos: grupo CON, onde os oócitos foram imersos em meio MIV base: TCM-199, suplementado com EGF (20 ng/mL), cisteamina (100 L/mL); E2 (1 g/mL); L glutamina (1 mM), Piruvato (40 mM); Soro Fetal Bovino (10%v/v); nos grupos ECG e HCG, os oócitos foram imersos em meio MIV base, adicionado, respectivamente, de 10 UI/mL de eCG e de 10 UI/mL de hCG; já no grupo FSH, os oócitos foram imersos em meio MIV base, adicionado de 10 g/mL de FSH-p. A MIV dos oócitos foi realizada a 38,5°C em atmosfera umidificada de 5% de CO2 em ar, durante 24 horas. Não foram observadas diferenças significativas com relação à taxa de expansão de células do cumulus. Todavia, ao se comparar os grupos dentro de cada grau de expansão, no grupo FSH, foi obtido o maior percentual de oócitos com expansão total de células do cumulus (P<0,05). Já o grupo eCG foi superior para expansão moderada (P<0,05), enquanto o grupo HCG foi superior para expansão leve (P<0,05). A percentagem de oócitos em MII foi maior no grupo ECG do que no grupo CON e HCG (P<0,05), mas foi semelhante ao grupo FSH. Em conclusão, 10 UI de eCG podem ser utilizadas em substituição ao FSH na MIV de oócitos ovinos.

The aim of this study was to evaluate the effect of using gonadotropins eCG and hCG, compared to FSH, on in vitro maturation of sheep oocytes. To this end, sheep ovaries were transported from the local slaughterhouse to the laboratory in 0.9% saline at 30 °C within two hours of slaughter. After harvest, the oocytes were evaluated and allocated into three groups: CON group, where the oocytes were immersed in IVM base medium: TCM-199, supplemented with EGF (20 ng / mL), cysteamine (100 L / mL); E2 (1 g / mL); L - glutamine (1 mM), Pyruvate (40 mM); Fetal Calve Serum (10% v / v); in the ECG and HCG groups, the oocytes were immersed in IVM base medium, added, respectively, 10 IU / mL eCG and 10 IU / mL hCG; In the FSH group, the oocytes were immersed in IVM base medium, added with 10 g / mL pFSH. The IVM was performed at 38.5 °C, in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air, for 24 hours. No significant differences were observed with respect to cumulus cell expansion rate. However, when comparing the groups within each degree of expansion, in the FSH group, the highest percentage of oocytes with total cumulus cell expansion was obtained (P<0.05). The eCG group was superior for moderate expansion (P<0.05), while the HCG group was superior for mild expansion (P<0.05). The percentage of oocytes in MII was higher in the ECG group than in the CON and HCG groups (P <0.05), but was similar to the FSH group. In conclusion, 10 IU eCG can be used in place of FSH in sheep oocyte IVM.

Antioxidantes associados à pressão hidrostática sobre a viabilidade embrionária pós-desvitrificação / Association between antioxidant and hidrostatic pressure on the embryonic viability after

Avaliou-se o efeito de dois antioxidantes no cultivo de embriões pós-desvitrificação, associados ounão à pressão hidrostática (PH) em três experimentos. O primeiro avaliou a interação entre PH e antioxidante(β-mercaptoetanol - BME, cisteamina - CYST e BME + CYST). O segundo, similar ao primeiro, vitrificou osembriões uma hora após passarem ou não pela PH. Os parâmetros foram taxas de eclosão e degeneração com24 e 48 h após passar pela PH (experimento 1) e 12, 24, 48 e 72 h pós-desvitrificação (experimento 2). Oexperimento 3 avaliou a taxa de prenhez de embriões cultivados por 12 h com/sem BME. O primeiroexperimento não demonstrou interação entre os tratamentos. No segundo, os resultados foram similares para BX.O tratamento BME + CYST obteve melhor taxa de eclosão dos BL com 48 e 72 h (76,04%). O mesmo fatoocorreu para a taxa de degeneração às 24 h (BME + CYST = 7,29%; 32,29% controle). Ao transferir os embriões(n = 55), percebeu-se uma similaridade em todos os grupos (38,9% CONT; 16,7% VITRIF e 31,6% BME). Opresente trabalho mostrou que o uso da pressão hidrostática e de BME e CYST não influencia as taxas deeclosão, degeneração e de prenhez de embriões vitrificados.(AU)

This study aimed to evaluate different antioxidants in embryo culture after vitrification, with or withoutthe previous use of hydrostatic pressure (PH). Three experiments were designed to evaluate the interactionbetween PH and antioxidants (β-mercaptoethanol - BME, cysteamine - CYST and BME + CYST) in fresh andvitrified in vitro produced embryos. In experiment 1 hatching and degeneration rates were evaluated at 24 and48 h after passing through the PH and in experiment 2 the same parameters were evaluated at 12, 24, 48 and72 h after heating. The last step of the study evaluated the pregnancy rate of vitrified embryos, cultured for 12 hwith / without BME. The first experiment showed no difference between treatments. The second found similarresults for all parameters evaluated in BX embryos. Note that the BME + CYST treatment obtained a betterhatching rate in BL with 48 and 72 h (76.04%) than the control group (45.83%). The same behavior wasobserved in degeneration 24 h, where the BME + CYST group was 7.29% against 32.29% in the control.However, the pregnancy rates (55 embryo transfers) were not different between control fresh, control vitrifiedand BME groups (38.9%, 16.7% and 31.6%, respectively). This study showed that the use of hydrostaticpressure and antioxidant had no effect on the evaluated parameters.(AU)

Antioxidantes associados à pressão hidrostática sobre a viabilidade embrionária pós-desvitrificação / Association between antioxidant and hidrostatic pressure on the embryonic viability after

Avaliou-se o efeito de dois antioxidantes no cultivo de embriões pós-desvitrificação, associados ounão à pressão hidrostática (PH) em três experimentos. O primeiro avaliou a interação entre PH e antioxidante(β-mercaptoetanol - BME, cisteamina - CYST e BME + CYST). O segundo, similar ao primeiro, vitrificou osembriões uma hora após passarem ou não pela PH. Os parâmetros foram taxas de eclosão e degeneração com24 e 48 h após passar pela PH (experimento 1) e 12, 24, 48 e 72 h pós-desvitrificação (experimento 2). Oexperimento 3 avaliou a taxa de prenhez de embriões cultivados por 12 h com/sem BME. O primeiroexperimento não demonstrou interação entre os tratamentos. No segundo, os resultados foram similares para BX.O tratamento BME + CYST obteve melhor taxa de eclosão dos BL com 48 e 72 h (76,04%). O mesmo fatoocorreu para a taxa de degeneração às 24 h (BME + CYST = 7,29%; 32,29% controle). Ao transferir os embriões(n = 55), percebeu-se uma similaridade em todos os grupos (38,9% CONT; 16,7% VITRIF e 31,6% BME). Opresente trabalho mostrou que o uso da pressão hidrostática e de BME e CYST não influencia as taxas deeclosão, degeneração e de prenhez de embriões vitrificados.

This study aimed to evaluate different antioxidants in embryo culture after vitrification, with or withoutthe previous use of hydrostatic pressure (PH). Three experiments were designed to evaluate the interactionbetween PH and antioxidants (β-mercaptoethanol - BME, cysteamine - CYST and BME + CYST) in fresh andvitrified in vitro produced embryos. In experiment 1 hatching and degeneration rates were evaluated at 24 and48 h after passing through the PH and in experiment 2 the same parameters were evaluated at 12, 24, 48 and72 h after heating. The last step of the study evaluated the pregnancy rate of vitrified embryos, cultured for 12 hwith / without BME. The first experiment showed no difference between treatments. The second found similarresults for all parameters evaluated in BX embryos. Note that the BME + CYST treatment obtained a betterhatching rate in BL with 48 and 72 h (76.04%) than the control group (45.83%). The same behavior wasobserved in degeneration 24 h, where the BME + CYST group was 7.29% against 32.29% in the control.However, the pregnancy rates (55 embryo transfers) were not different between control fresh, control vitrifiedand BME groups (38.9%, 16.7% and 31.6%, respectively). This study showed that the use of hydrostaticpressure and antioxidant had no effect on the evaluated parameters.

PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS SUPLEMENTADA COM ANTIOXIDANTES: EFEITOS NO DESENVOLVIMENTO EMBRI-ONÁRIO E NA TAXA DE PRENHEZ

No primeiro experimento foram utilizados oócitos de ovários de abatedouro distribuídos em seis grupos: 1) Maturação e Cultivo in vitro sem adição de antioxidantes (Ct-Ct); 2) Maturação com 2 M de quercetina (Qc-Ct); 3) Cultivo com 2 M de quercetina (Ct-Qc); 4) Maturação e Cultivo com 2 M de quercetina (Qc-Qc); 5) Maturação com 100 M de cisteamina e Cultivo com de 2 M de quercetina (Cis-Qc) e 6) Maturação com cisteamina (Cis-Ct). Com base no primeiro experimento, os oócitos provenientes de Ovum pick up foram avaliados nos grupos Cis-Qc e Cis-Ct. Os resultados do experimento 1 e 2 para os grupos Cis-Qc e Cis-Ct foram confrontados. A análise estatística considerou significância de 5% nas avaliações. O percentual médio de desenvolvimento dos embriões foi similar entre os grupos Qc-Ct, Ct-Qc, Cis-Qc e Cis-Ct (49,55±5.1), porém superiores aos grupos Ct-Ct e Qc-Qc (42,4±6.1). A taxa média de blastocistos eclodidos foi similar entre os grupos Ct-Ct, Qc-Ct, CisQc e Cis-Ct (60,9±6.3), e estes superior grupo Qc-Qc (54,7±9.7). Para o número médio de células dos blastocistos o grupo Cis-Ct (145±25) foi superior os grupos Cis-Qc, Ct-Ct e Qc-Ct (128±25) e estes superiores os grupos Ct-Qc e Qc-Qc (109±32). No experimento 2 a taxa de clivagem não diferiu entre Cis-Ct (88,8±3.9) e Cis-Qc (87,7±4.5). Mas o percentual de blastocistos foi superior para Cis-Qc (64,6±9.8) em relação a Cis-Ct (56,4±3.6). Enquanto a taxa de prenhez do grupo 2 Cis-Ct (45,1±2.5) foi superior ao Cis-Qc (38,5±3.5). O percentual de blastocisto do experimento 2 (56,4±3.6 e 64,6±9.8%) foram superiores aos do experimento 1 (48,9±3.6 e 52,2±5.1%) para os grupos Cis-Ct e Cis-Qc, respectivamente. Em conclusão, a produção in vitro de embriões suplementada com antioxidante dependendo do grupo foi positiva, mas este benefício não foi confirmado na taxa de prenhez com o uso da quercetina no cultivo in vitro

In the first experiment we used oocytes from ovaries of slaughterhouse distributed in six groups: 1) Maturation and cultivation without the addition of antioxidants (Ct-Ct); 2) Maturation with 2 M of quercetin (Qc-Ct); 3) Cultivation with 2 M of quercetin (Ct-Qc); 4) Maturation and cultivation with 2 M of quercetin (Qc-Qc); 5) Maturation with 100 M of cysteamine and cultivation with of 2 M of quercetin (CisQc) and 6) Maturation with cysteamine (Cis-Ct). Based in experiment 1, the oocytes of Ovum pick up (OPU) were evaluated in Cis-and Cis-Qc CT. for experiment 3 were assessed the results of experiment 1 and 2 for groups Cis-and Cis-Ct Qc. Statistical analysis significance of 5% was considered in reviews. The percentage of embryos was superior to Qc-Ct, Ct-Qc, Cis-and Cis-Ct Qc (49,55±5.1), about Ct-Ct and QcQc (42.4±6.1). The hatching rate was similar to Ct-Ct, Qc-Ct, Cis-and Cis-Ct Qc (60,9±6.3), however the Group Qc-Qc (54,7±9.7). Had the lowest rate of hatching, followed by the Ct-Qc (57.3 ± 11.0). The number of cells in the embryos of the Group Cis-Ct (145±25) was superior to the Cis-Qc groups, Ct-Ct and Qc-Ct (media 128 ± 25). The embryos of Ct-Qc groups and Qc-Qc (media 109 ± 32) had the fewest cell. The rate of cleavage in the oocytes OPU did not differ between Cis-Ct (88.8±3.9) and Cis-Qc (87.7 ± 4.5). But the percentae of blastocyst was superior to Cis-Qc (64.6 ± 9.8) for the Cis-Ct (56.4 ± 3.6). However, the rate of pregnancy blastocyst Cis group- 4 Ct (45.1±2.5) were higher than those of Cis-Qc (38.5±3.5). The percentage of blastocyst OPU oocytes (56.4 ± 3.6 and 64.6 ± 9.8%) were higher than those of slaughterhouse (48.9 ± 3.6 and 52.2 ± 5.1%) independent of the groups evaluated (Cis-and Cis-Qc Ct), respectively. In conclusion, the in vitro production of embryos supplemented with antioxidant depending on the Group was positive, but this benefit has not been confirmed pregnant rate with the use of quercetin on in vitro cultivation.

Maturação in vitro de oócitos bovinos em meios suplementados com quercetina e seu efeito sobre o desenvolvimento embrionário / In vitro maturation of bovine oocytes in medium supplemented with quercetin, and its effect on embryonic development

A quercetina é um flavonoide, amplamente encontrada em frutas, vegetais, grãos, flores, com elevada concentração no vinho tinto, e tem sido caracterizada funcionalmente pela atividade antioxidante. Para avaliação da maturação nuclear e do desenvolvimento embrionário bovino, os oócitos foram maturados por 22h na presença de quercetina (0,4, 2, 10 e 50µM), cisteamina (100µM) e na ausência dos antioxidantes. Os oócitos maturados foram corados com Hoechst para avaliação da maturação in vitro. Para avaliação do desenvolvimento embrionário, os oócitos foram fertilizados e cultivados in vitro, as taxas de desenvolvimento embrionário foram determinadas no sétimo dia de cultivo e o percentual de eclosão e o número de células dos embriões no oitavo dia. Os níveis de glutationa (GSH) dos oócitos foram mensurados por emissão de fluorescência com CMF2HC. A porcentagem de maturação nuclear (±89%) não diferiu entre os grupos. O desenvolvimento embrionário variou entre os tratamentos, o percentual de blastocisto foi superior (P<0,05) nos grupos tratados com 0,4, 2, 10 e 50∝M de quercetina (56,9, 59,5, 53,6 e 49,6%, respectivamente) e com 100∝M de cisteamina (50,4%) em relação ao grupo controle (42,3%). Na comparação entre os dois antioxidantes, a quercetina (0,4 e 2µM) foi superior na produção de embriões (56,9 e 59,5%, respectivamente) em comparação com cisteamina (50,4%). As taxas de embriões eclodidos foram similares (P>0,05) entre os grupos (±63,0%). O número médio de células dos embriões também foi similar entre os grupos (±233). Os níveis intracelulares de GSH foram superiores nos oócitos maturados com cisteamina, mas similares entre os oócitos tratados com quercetina e o controle. A suplementação da maturação in vitro com antioxidantes melhora as taxas de blastocistos. A quercetina foi superior à cisteamina, que, por sua vez, foi superior ao controle. Mas os níveis de GSH foram superiores somente nos oócitos tratados com cisteamina.(AU)

Quercetin is a flavonoid widely found in fruit, vegetables, grains and flowers, with a high concentration in red wine, and has been functionally characterized by its antioxidant activity. For assessment of nuclear maturation and bovine embryo, oocytes were matured for 22h in the presence of quercetin (0.4, 2, 10 and 50µM), cysteamine (100µM) and in the absence of antioxidants. The matured oocytes were stained with Hoechst to evaluate the in vitro maturation. To assess embryonic development, oocytes were fertilized and cultured in vitro and rates of embryo development were obtained in the seventh day of culture and the percentage of hatching and the number of cells on eighth day embryos. The levels of glutathione (GSH) of the oocytes were measured by fluorescence emission with CMF2HC. The percentage of nuclear maturation (±89%) did not differ between groups. Embryonic development varied between treatments, the percentage of blastocyst was higher (P<0.05) in the groups treated with 0.4, 2, 10 and 50∝M of quercetin (56.9, 59.5, 53.6 and 49.6%, respectively) and 100 ∝M cysteamine (50.4%) compared to the control group (42.3%). Comparing the two antioxidants, quercetin (0.4 to 2µM) was superior in embryo production (56.9 and 59.5% respectively) compared with cysteamine (50.4%). The rates of hatched embryos were similar (P>0.05) between groups (±63.0%). The average number of embryo cells was also similar in both groups (±233). The intracellular GSH levels were higher in oocytes matured with cysteamine, but similar between the oocytes treated with quercetin and control. The supplementation of matured in vitro with antioxidants improves blastocyst rates. Quercetin was greater than cysteamine, which in turn was superior to the control. However, GSH levels were higher in oocytes treated only with cysteamine.(AU)

Características de embriões bovinos produzidos in vitro em meio de cultivo suplementado com Cisteamina ou extrato oleoso de Lippia Origanoides.

No presente estudo foi adicionado o extrato oleoso da Lippia origanoides no meio de cultivo de embriões bovinos produzidos in vitro, com a finalidade de avaliar seu efeito antioxidante. Na etapa de cultivo embrionário, os possíveis zigotos eram cultivados em meios com diferentes concentrações de antioxidantes, sendo um total de 5 tratamentos: T1 - meio de cultivo sem adição de antioxidantes; T2 - meio de cultivo + 50M/mL Cisteamina; T3 - meio de cultivo + 2,5g/mL do extrato oleoso de Lippia origanoides; T4 - meio de cultivo + 5,0g/mL do extrato oleoso de Lippia origanoides; T5 - meio de cultivo + 10,0g/mL de do extrato oleoso de Lippia origanoides. Após o sétimo dia de cultivo (D7), os blastocistos obtidos foram selecionados para as análises. Como resultado das analises realizadas, foram encontrados baixos índices apoptóticos para os embriões cultivados em meios que continham o extrato oleoso de Lippia origanoides. Os tratamentos que induziram à menor taxa de apoptose continham maior proporção de mitocôndrias e menor vacuolização citoplasmática, avaliadas por meio da morfometria celular. Além disso, os resultados da expressão gênica indicaram que os tratamentos suplementados com Lippia origanoides apresentaram diferenças na expressão da enzima antioxidante PRDX-1, uma importante enzima antioxidante capaz de reduzir o peróxido de hidrogênio. Os resultados obtidos nos diferentes estudos dessa tese sugerem que os compostos presentes no extrato oleoso de Lippia origanoides não influenciam diretamente nas taxas de produção total de embriões, porém, podem agir em etapas que incrementam a qualidade das células embrionárias de forma molecular e morfológica.

The present work was added to the oily extract of Lippia origanoides in vitro of bovine embryos produced in vitro, with an estimated purpose of its antioxidant effect. In the embryonic culture stage, the possible zygotes were cultivated in media with different concentrations of antioxidants, being a total of 5 treatments: T1 - culture medium without addition of antioxidants; T2 - culture medium + 50M / mL Cysteamine; T3 - culture medium + 2.5g / mL of Lippia origanoides oily extract; T4 - culture medium + 5.0g / mL of Lippia origanoides oily extract; T5 - culture culture + 10.0g / mL oily extract of Lippia origanoides. After the seventh day of culture (D7), the blastocysts were selected for analysis. As a result of the cultivated analyzes, they were found in the apoptotic indexes for the embryos cultured in media containing the oily extract of Lippia origanoides. The treatments that induce lower rate of apoptosis are larger in proportion to mitochondria and less cytoplasmic vacuolization, evaluated by means of cellular morphometry. In addition, gene expression results indicated that supplementation tests with Lippia origanoides were altered in the expression of the antioxidant enzyme PRDX-1, an important antioxidant enzyme capable of reducing the hydrogen content. The results obtained in the different studies were those that were submitted to a non-oil extract test of Lippia origanoides do not influence the rates of total embryo production, but may act to increase the quality of the embryonic cells in a molecular and morphological way

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO ÓLEO ESSENCIAL DE Syzygium aromaticum L. SOBRE GAMETAS BOVINOS

O uso de antioxidantes naturais em meios de cultivo pode ser uma alternativa para minimizar os efeitos negativos do estresse oxidativo produzido pelas condições in vitro. Nesse sentido, o óleo essencial de Syzygium aromaticum (OESA) possui propriedades terapêuticas, incluindo atividade antioxidante, e poderia ser utilizado durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos e incubação de espermatozoides bovinos. Portanto, o objetivo foi avaliar a atividade antioxidante do OESA sobre os gametas bovinos, especificamente sua adição (i) durante a MIV e influência sobre a maturação nuclear, maturação citoplasmática, viabilidade das células do cumulus, níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), potencial de membrana mitocondrial (m) e desenvolvimento embrionário partenogenético; e (ii) durante a incubação por 1 e 6 h de espermatozoides epididimários e sua influência sobre a qualidade espermática e níveis de EROs. Para tanto, gametas foram cultivados em meios contendo as seguintes suplementações: OESA0 (sem antioxidante), OESA10 (10 g/mL de OESA), OESA15 (15 g/mL de OESA), OESA20 (20 g/mL de OESA), CIS (100 M de cisteamina, somente para os oócitos) e Controle (somente para espermatozoides frescos, imediatamente avaliados). Assim, quanto à influência do OESA durante a MIV, nenhuma diferença foi observada para as taxas de maturação. Contudo, OESA15, OESA20 e CIS melhoraram a viabilidade das células do cumulus após a MIV, sendo somente o OESA20 maior que o OESA0 (P < 0,05). Além disso, embora nenhuma diferença tenha sido observada para os níveis de EROs (P > 0,05), oócitos derivados dos grupos OESA15, OESA20 e CIS mostraram m menor que os oócitos do grupo OESA0 (P < 0,05). Adicionalmente, embora nenhuma diferença tenha sido observada para as taxas de clivagem de oócitos ativados partenogeneticamente, OESA20 melhorou as taxas de blastocistos, tanto quando calculada pelo número total de oócitos cultivados, quando pelo número total de oócitos clivados. Ainda, essas taxas de blastocistos foram diferentes do OESA0 e similares ao grupo CIS. Quanto à qualidade dos embriões produzidos, os grupos OESA15 e OESA20 mostraram um maior número de blastômeros quando comparados ao OESA0 (P < 0,05). Já quanto à influência do OESA durante a incubação dos espermatozoides, nenhuma diferença foi observada para a morfologia espermática (P > 0,05). Contudo, espermatozoides incubados na presença de OESA preservaram os parâmetros ao longo do tempo, especialmente para integridade estrutural e funcional da membrana plasmática, atividade mitocondrial, velocidade curvilínea e atividade metabólica (P < 0,05). Além disso, espermatozoides derivados do grupo OESA15 mantiveram resultados similares ao grupo controle para velocidade média após 6 h de incubação, integridade funcional da membrana e percentual de membrana danificada e mitocôndria inativa (P < 0,05). Ainda, nenhuma diferença foi observada para os níveis de EROs após a incubação. Em conclusão, OESA a 20 g/mL e 15 g/mL adicionado aos meios durante a MIV e a incubação espermática, respectivamente, pode ser uma interessante alternativa de antioxidante para manutenção da qualidade de gametas bovinos in vitro.

The use of natural antioxidants in culture media may be an alternative to minimize the negative effects of oxidative stress produced by in vitro conditions. In this sense, the essential oil of Syzygium aromaticum (EOSA), has therapeutic properties, including antioxidant activity, and could be used during in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes and incubation of bovine spermatozoa. Therefore, the aim was to evaluate the antioxidant activity of EOSA on bovine gametes, specifically its addition (i) during IVM and influence on nuclear maturation, cytoplasmic maturation, viability of cumulus cells, reactive oxygen species (ROS) levels, mitochondrial membrane potential (m), and parthenogenetic embryonic development; and (ii) during incubation for 1 and 6 h of epididymal spermatozoa and its influence on sperm quality and ROS levels. Thus, gametes were cultured in media containing the following supplements: EOSA (without antioxidants), EOSA 10 (10 g/mL of EOSA), EOSA15 (15 g/mL of EOSA), EOSA20 (20 g/mL of EOSA) (100 M of cysteamine, only for oocytes) and Control (only for fresh spermatozoa, immediately evaluated). Thus, regarding the influence of EOSA during IVM, no difference was observed for maturation rates. Nevertheless, EOSA15, EOSA 20 and CYS improved the viability of cumulus cells after IVM, being only the EOSA20 group greater than EOSA0 (P < 0.05). Moreover, although no difference was observed for ROS levels (P > 0.05), oocytes derived from the EOSA15, EOSA20 and CYS groups showed m lower than the EOSA0 (P < 0.05) oocytes. Additionally, although no differences was observed for cleavage rates of the parthenogenetically activated oocytes, EOSA20 improved blastocyst rates, both when calculated by the total number of cultured oocytes, and by the total number of cleaved oocytes. Also, these blastocyst rates were different from EOSA0 group and similar to CYS group. As to the quality of the embryos produced, OESA15 and OESA20 groups showed a higher number of blastomeres when compared to OESA0 (P < 0.05). Regarding the influence of EOSA during sperm incubation, no difference was observed for sperm morphology (P > 0.05). Nevertheless, spermatozoa incubated in the presence of EOSA preserved the parameters over time, especially for structural and functional integrity of the plasma membrane, mitochondrial activity, curvilinear velocity and metabolic activity (P < 0.05). Moreover, spermatozoa derived from the EOSA15 group maintained similar results to the control group for medium velocity after 6 h of incubation, functional integrity of the membrane and percentage of damaged membrane and inactive mitochondria (P < 0.05). Also, no difference was observed for ROS levels after incubation. In conclusion, OESA at 20 g/mL and 15 g/mL added to media during IVM and sperm incubation, respectively, may be an interesting antioxidant alternative for maintaining the quality of bovine gametes in vitro.

Efeito das células do cumulus e cisteamina durante o cultivo de maturação in vitro de oócitos bovinos sobre a maturação nuclear e aquisição da competência para desenvolvimento embrionário / Effects of cumulus cells and cysteamine during bovine oocyte in vitro maturation on meiosis progression and acquisition of developmental competence

Complexos cumulus-oócito (COC), oócitos desnudos (DO) e DO cocultivados com células do cumulus em suspensão (DO+CC) foram maturados in vitro (MIV) na presença ou ausência de cisteamina (50mM). Observou-se efeito benéfico da cisteamina durante o cultivo de MIV, pois a maturação nuclear no grupo COC cisteamina foi maior do que a do COC controle (P<0,05). No grupo sem a adição de cisteamina, foi observado que a ausência de CC durante o cultivo de MIV prejudicou a maturação nuclear em DO, em relação ao COC (P<0,05), todavia a cisteamina restaurou a capacidade de progressão da meiose em DO, tornando-os semelhantes aos COC (P>0,05). O acoplamento entre oócitos e CC durante MIV demonstrou ser essencial para aquisição da competência do oócito para suportar o desenvolvimento embrionário inicial, pois COC apresentaram maior porcentagem de blastocistos e eclosão quando comparados a DO e DO+CC (P<0,05). A inclusão de cisteamina no cultivo de MIV não restaurou a aquisição da competência em DO e DO+CC, que permaneceram semelhantes aos do grupo-controle (P>0,05). Conclui-se que a cisteamina no meio de MIV melhora as taxas de maturação nuclear em COC e restaura a capacidade de progressão da meiose em DO. Todavia, na concentração utilizada neste estudo, não promove efeito benéfico no desenvolvimento embrionário.(AU)

Cumulus-oocyte complexes (COC), denuded oocytes (DO) and DO co-cultured with cumulus cells in suspension (DO+CC) were in vitro matured (IVM) in the presence or absence of cysteamine (50mM). A beneficial effect of cysteamine was observed during IVM, because the nuclear maturation in the COC cysteamine group was higher than in COC control (P<0.05). In the control group, the absence of CC during IVM impaired nuclear maturation in DO when compared to COC (P<0.05), but cysteamine restored the ability of meiosis progression in DO, making them similar to COC (P>0.05). The coupling between oocytes and CC during IVM proved to be essential for the acquisition of oocyte competence to support early embryonic development, as COC had higher percentages of blastocyst and hatching when compared to DO and DO+DC (P<0.05). However, the inclusion of cysteamine in the IVM culture did not restore the acquisition of competence in DO and DO+DC, which remained similar to the control group (P>0.05). It is concluded that cysteamine in the IVM culture improves the nuclear maturation in COC and restores the progression ability of meiosis in DO. However, in the concentration used in this study, cysteamine does not promote a beneficial effect on embryo development.(AU)

Efeito da quercetina na maturação in vitro de oócitos caprinos

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da quercetina como antioxidante alternativo à cisteamina na maturação in vitro. Ovários caprinos foram transportados do matadouro local para laboratório em solução salina a 0,9%, a 30°C, até três horas após o abate. Após a colheita, os oócitos foram avaliados e divididos em três grupos: Grupo CIS, onde os oócitos foram imersos em meio MIV base: TCM-199, suplementado com EGF (10 g/mL), FSH/LH (10 L/mL), soro de ovelha em estro (100 L/mL) e cisteamina (10 L/mL); nos Grupos Q4 ou Q8, os oócitos foram imersos em meio base isento de cisteamina, suplementado com 4 M ou 8 M de quercetina, respectivamente. A MIV dos oócitos foi realizada a 38,5°C em atmosfera umidificada de 5% de CO2 em ar, durante 24 horas. Os grupos CIS e Q4 apresentaram a mesma porcentagem de células cumulus expandidas, mas o grupo Q8 foi significativamente menor que os demais grupos (P<0,05). A taxa de retração de oócitos no grupo Q8 foi maior (P<0,05) do que os tratamentos adicionais. Em relação à expansão das células do cumulus, o tratamento com 8 M de quercetina apresentou menor proporção de oócitos expandidos com grau 1 (Total) do que os tratamentos adicionais (P<0,05). A percentagem de oócitos MII foi maior no grupo Q4 do que no grupo CIS (P<0,05), mas os grupos CIS e Q8 foram semelhantes. A taxa de apoptose foi maior no grupo CIS do que nos grupos adicionais (P<0,05). Os oócitos dos grupos CIS e Q4 apresentaram os mesmos níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO) e glutationa (GSH). Além disso, os oócitos maturados com 4 M de quercetina apresentaram maior atividade mitocondrial do que os oócitos maturados nos grupos CIS e Q8 (P<0,05). Em conclusão, 4 M de quercetina pode ser utilizada como alternativa à cisteamina na maturação in vitro de oócitos de caprinos, pois, a mesma resultou em taxas de maturação oocitária de caprinos maiores que àquelas obtidas com cisteamina, mantendo constantes os níveis de expansão das células do cumulus, glutationa, ERO, além, de elevar a atividade mitocondrial. Contudo, a concentração de 8 M, levou à redução dos níveis de ERO, GSH e atividade mitocondrial oocitária, demonstrando menor viabilidade celular.

The objective of this study was to evaluate the effect of quercetin as an alternative antioxidant to cysteamine during in vitro maturation. Ovary goats were transported from the local slaughterhouse to the laboratory in 0.9% saline at 30 ° C until three hours after slaughter. After collection, the oocytes were evaluated and divided into three groups: CIS Group, where the oocytes were immersed in MIV medium: TCM-199, supplemented with EGF (10 g / mL), FSH / LH (10 L / mL), Estrus sheep serum (100 L / mL) and cysteamine (10 L / mL); In Groups Q4 or Q8, oocytes were immersed in cysteamine-free base medium, supplemented with 4 M or 8 M quercetin, respectively. The IVM of the oocytes was performed at 38.5 ° C in humidified atmosphere of 5% CO2 in air for 24 hours. The CIS and Q4 groups presented the same percentage of expanded cumulus cells, but the Q8 group was significantly lower than the other groups (P <0.05). The oocyte retraction rate in the Q8 group was higher (P <0.05) than the additional treatments. In relation to the expansion of cumulus cells, treatment with 8 M quercetin presented a lower proportion of expanded oocytes with grade 1 (Total) than the additional treatments (P <0.05). The percentage of MII oocytes was higher in the Q4 group than in the CIS group (P <0.05), but the CIS and Q8 groups were similar. The rate of apoptosis was higher in the CIS group than in the additional groups (P <0.05). Oocytes from the CIS and Q4 groups showed the same levels of reactive oxygen species (ROS) and glutathione (GSH). In addition, oocytes matured with 4 M quercetin showed higher mitochondrial activity than mature oocytes in the CIS and Q8 groups (P <0.05). In conclusion, 4 M of quercetin can be used as an alternative to cysteamine in the in vitro maturation of goat oocytes, as it resulted in rates of oocyte maturation of goats larger than those obtained with cysteamine, maintaining constant levels of cell expansion Of the cumulus, glutathione, ERO, in addition to elevating mitochondrial activity. However, the concentration of 8 M led to the reduction of ROS levels, GSH and oocyte mitochondrial activity, demonstrating lower cell viability.

SUPLEMENTAÇÃO DO MEIO DE TRANSPORTE COM ANTIOXIDANTES E MODULADORES DE AMP CÍCLICO COMO ESTRATÉGIA PARA MELHORAR A QUALIDADE DE OÓCITOS BOVINOS DESTINADOS À PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES

O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da suplementação do meio com diferentes fontes de macromoléculas, com bloqueadores da meiose e com antioxidantes durante o transporte de oócitos bovinos por 6 horas sobre: 1) progressão da maturação nuclear; 2) maturação citoplasmática e 3) competência no desenvolvimento e criotolerância dos embriões produzidos. Para tanto, o meio de transporte de oócitos foi suplementado com bloqueadores da meiose (forscolina e IBMX; Experimento 1) ou com diferentes tipos de macromoléculas (SFB ou BSA; Experimento 2), sendo que estes tratamentos ainda receberam ou não a suplementação com antioxidantes (mistura de cisteína, cisteamina e catalase). Os oócitos foram incubados em incubadora portátil (Minitub®) para simulação de transporte. Posteriormente, foram submetidos à maturação in vitro (MIV) em incubadora a 5% de CO2 em ar até completar 24h e, em seguida, foram fecundados e os prováveis zigotos foram cultivados in vitro durante 7 dias. Foi feito um grupo controle adicional no experimento I: MIV em incubadora com 10% de SFB por 24h. No experimento II foram feitos dois grupos controle adicionais MIV em incubadora com 10% de SFB por 24h sem e com antioxidantes (cisteína, cisteamina e catalase). Nos experimentos 1 e 2 foi avaliada a cinética da maturação nuclear e a maturação citoplasmática (através do posicionamento de mitocôndrias, do potencial de membrana mitocondrial e do conteúdo intracelular de espécies reativas do oxigênio) após o transporte e após a MIV. Avaliou-se a taxa de clivagem (48 hpi) e de desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (168 hpi) e re-expansão após 24 horas de re-cultivo. No experimento 1, a taxa de oócitos em GV foi maior nos oócitos (P<0,05) do grupo Transporte com bloqueador (37,9%) e menor no grupo Transporte sem bloqueador (10,1%), ambos estes grupos difeririam do grupo Controle (20,0%). Enquanto a taxa de GVBD foi maior (P<0,05) no grupo Transporte sem bloqueador (82,8%) e menor nos grupos Controle (77,0%) e Transporte com bloqueador (62,0%). Nos oócitos dos grupos tratados com antioxidantes, após 6h de transporte, a concentração intracelular de ROS foi maior (P<0,05) no grupo Transporte sem antioxidantes (1,5) e menor nos grupos Controle (1,0) e Transporte com antioxidantes (1,1). Com relação ao tratamento com bloqueadores, a contração de ROS foi maior (P<0,05) nos oócitos do grupo Transporte sem bloqueador (1,5) e menor nos grupos Controle (1,0) e Transporte com bloqueador (1,2). Após 24 horas de MIV houve interação entre os tratamentos (bloqueadores+antioxidantes), sendo que os oócitos dos grupos Transporte Pré-MIV com antioxidantes (1,0) e Controle (1,0) apresentaram a maior concentração de ROS (P<0,05), enquanto que os grupos Transporte controle (0,6) e Transporte Pré-MIV sem antioxidantes (0,5) exibiram as menores concentrações de ROS. Com relação ao potencial de membrana de mitocondrial (PMM), houve interação entre os tratamentos quando os oócitos foram valiados após 6 e 24 horas. Após 6 horas Transporte Pré-MIV sem antioxidantes (1,00) e Controle (0,9±0,08) apresentaram o maior PMM, que diferiu (P<0,05) dos grupos Transporte Pré-MIV com antioxidantes (0,6) e Transporte controle (0,6). Após 24 horas, os grupos Controle (1,00) e Transporte Pré-MIVcom antioxidantes (0,8) apresentaram o maior PMM, e diferiram (P<0,05) dos demais grupos (0,5-0,6). No experimento 2, a taxa de oócitos em GVBD foi maior (P<0,05) no grupo Transporte SFB (86,8%) e menor em Controle (77,0%), ambos os grupos foram semelhantes a Transporte BSA (82,8%). Nos oócitos dos grupos tratados com antioxidantes após 6 horas as concentrações de ROS foi maior (P<0,05) no grupo Transporte sem antioxidantes (1,6) e menor nos grupos Controle sem antioxidantes (1,0), Controle com antioxidantes (1,1) e Transporte com antioxidantes (1,2) e após a MIV foi maior no controle (1,0) diferindo (P<0,05) dos demais grupos (0,5-0,7). Com relação ao PMM, após 6 horas de transporte houve interação entre os tratamentos (macromoléculas+antioxidantes), o grupo Controle (1,0) apresentou maior (P<0,05) PMM, e nos grupos Controle com antioxidantes (0,6), Transporte SFB com antioxidantes (0,6) e Transporte BSA (0,6) foi observado menor PMM. Após 24 horas não foi verificado interação entre os tratamentos, nos oócitos tratados com antioxidantes, o grupo Controle (1,0) mostrou maior (P<0,05) PMM, os grupos Transporte sem antioxidantes (0,4) e Transporte com antioxidantes (0,5) apresentaram menor PMM. A adição de bloqueadores da meiose (IBMX associado à forscolina) ao meio de transporte de oócitos bovinos permite um transporte adequado por 6h, preservando a qualidade e integridade dos oócitos e permitindo uma produção embrionária semelhante à obtida in vitro a partir de oócitos que não foram submetidos ao transporte.

The objective of this study was to evaluate the effects of supplementation of the medium with different sources of macromolecules with blockers of meiosis and antioxidants during transport of bovine oocytes for 6 hours on: 1) progression of nuclear maturation; 2) cytoplasmic maturation and 3) competence in the development and cryotolerance of embryos produced. Therefore, the medium of transport oocytes was supplemented with blocking of meiosis (forskolin and IBMX; Experiment 1) or with different types of macromolecules (FCS or BSA; Experiment 2), and these treatments yet received or not antioxidant supplementation (mixture of cysteine, cysteamine and catalase). Oocytes were incubated in a portable incubator (Minitub®) for transport simulation. Posteriorly were submitted in vitro maturation (IVM) in incubator at 5% CO2 in air until to complete 24 hours and then were fertilized and presumptive zygotes were cultured in vitro for 7 days. Has been made an additional control group in the experiment I: MIV incubator with 10% FCS for 24 hours (Control). In the second experiment were performed two additional control groups: IVM incubator with 10% FCS for 24 hours (Control); and IVM in an incubator with 10% FCS and antioxidants (cysteine, cysteamine and catalase) for 24 hours (Contr+Atx). In Experiments 1 and 2 were evaluated after nuclear maturation kinetics and cytoplasmic maturation (made by positioning mitochondria, the mitochondrial membrane potential and intracellular content of reactive oxygen species) of transport and after IVM. We evaluated the cleavage (48 hpi), embryo development to the blastocyst stage (168 hpi), and the re-expansion rate after 24 hours of re-cultivation. In experiment 1, the GVBD rate was higher (P<0.05) in Transport group (82.8%) and lower in control group (77.0%) and Transport with blocker (62.0%). In oocytes treated groups antioxidants, after 6 hours of transport, the intracellular concentration of ROS was higher (P<0.05) in Transport group (1.5) and lower in group Control (1.0) and Transport with Antioxidants (1.1). Regarding the treatment with blockers, ROS contraction was higher (P <0.05) in the oocytes Transport group (1.5) and lower in groups Ccontrol (1.0) and Transport with Blocker (1.2). After 24 hours of IVM interaction was observed between treatments (blockers+antioxidants), and the groups of oocytes Transport Pre-IVM + Atx(1.0) and Control (1.0) had the highest concentration of ROS (P<0.05), while Transport Control (0.6) and Transport Pre-IVM (0.5) groups exhibited the lowest concentrations of ROS. Regarding the mitochondrial membrane potential (MMP), there was an interaction between treatments when the oocytes were evaluated after 6 and 24 hours. After 6 hours Transport Pre-IVM (1.00) and Control (0.9 ± 0.08) had the highest MMP, which differed (P<0.05) Transport Pre-IVM + Atx (0.6) and Transport Control (0.6) groups. After 24 hours, the Control (1.0) and Transport Pre-IVM + Atx (0.8) groups had the highest MMP and differ (P<0.05) from the others groups (0.5 to 0.6). In experiment 2, the GVBD oocyte rate was higher (P<0.05) in the Transport FCS group (86.8%) and lowest in Control FCS (77.0%), both groups were similar Transport BSA (82.8%). With respect to the concentration of ROS in the groups supplemented with macromolecules, after 6 hours was higher (P<0.05) in the TB group (1.5) and TS (1.3) and lower in CS (1.0). In oocytes groups treated with antioxidants after 6 hours ROS concentration was higher (P <0.05) in Transport group (1.6) and lower in Control (1.0), Control with Antioxidants (1.1) and Transport with Antioxidants (1.2) groups and after IVM was higher in Control (1,0) differ (P<0.05) from the other groups (0.5 to 0.7). Regarding PMM, after 6 hours of transport was no interaction between treatments (macromolecules+antioxidants), Control (1,0) group had higher (P<0.05) MMP, and Transport BSA (0.6) was observed less MMP. After 24 hours was not verified interaction between treatments, in oocytes treated with antioxidants, the Control (1.0) group demonstrate higher (P<0.05) MMP, Transport (0.4) and Transport with Antioxidants (0.5) groups had a lower MMP. The addition of blocking meiosis (IBMX associated with forskolin) in oocytes transport medium permits adequate transport for 6h, preserving the quality and integrity of the oocyte and allowing embryo production similar to that obtained in vitro from oocytes that were not subjected to transport.

ESTRATÉGIAS PARA MINIMIZAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO EM SISTEMAS DE PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS DESTINADOS À VITRIFICAÇÃO

O objetivo desse estudo foi avaliar diferentes estratégias para minimizar os efeitos do estresse oxidativo induzido pela menadiona durante o cultivo in vitro sobre o potencial de desenvolvimento embrionário in vitro. Para tanto, no Experimento I, os oócitos foram MIV em meio suplementado com 0,6 mM de cisteína e 100 µM de cisteamina (C+C), 100 UI de catalase (CAT), 0,6 mM de cisteína associado à 100 µM de cisteamina e 100 UI de catalase (C+C+CAT), ou sem a suplementação com antioxidantes (Controle). Posteriormente, foram fecundados e os prováveis zigotos cultivados in vitro durante 7 dias. Oócitos imaturos (0h) e após 22 h de MIV foram avaliados quanto ao conteúdo intracelular de ROS e de GSH, potencial de membrana mitocondrial, maturação nuclear e ocorrência de apoptose. No Experimento II, oócitos foram MIV em meio suplementado com C+C+CAT (ATX) e os prováveis zigotos foram CIV em meio SOF. Do Dia 6 até o final do CIV os embriões foram cultivados na presença ou ausência de 5 µM de menadiona (MD). No dia 7 foi avaliada a taxa de blastocistos e os mesmos destinados às avaliações quanto ao conteúdo intracelular de ROS e GSH, atividade de caspases 3 e 7 e ocorrência de apoptose. Por fim, no Experimento III, oócitos foram MIV e os prováveis zigotos foram CIV em meio SOF suplementado com 100 ng/mL de IGF-I (IGF). Do Dia 6 até o final do CIV os embriões foram cultivados na presença ou ausência de 5 µM de menadiona (MD). No dia 7 foi avaliada a taxa de blastocistos e os mesmos foram destinados às avaliações previamente descritas no Experimento II além da avaliação da taxa de re-expansão após vitrificação/aquecimento e expressão dos genes CASP3, GPX-1 e SOD-1. No experimento I, a taxa de maturação nuclear não foi afetada pelos tratamentos (P> 0,05). A porcentagem de apoptose do grupo C+C+CAT foi superior (P<0,05) ao grupo CAT, porém os grupos Controle e C+C não diferiram dos demais (P>0,05). O conteúdo intracelular de ROS nos grupos C+C e C+C+CAT foi semelhante ao observado em oócitos imaturos (0h), e o maior (P<0,05) nível de ROS foi encontrado no grupo Controle. O conteúdo intracelular de GSH foi reduzido (P<0,05) em todos os grupos quando comparados aos oócitos imaturos, no entanto os grupos Controle, CAT e C+C+CAT apresentaram menores (P<0,05) concentrações de GSH quando comparado ao grupo C+C. O potencial de membrana mitocondrial aumentou em todos os grupos (P<0,05) comparado com os oócitos imaturos (0h), com exceção do grupo C+C. A taxa de blastocistos foi maior (P<0,05) no grupo C+C+CAT comparada aos demais grupos. No experimento II, o conteúdo intracelular de GSH foi similar (P>0,05) entre os grupos experimentais. O conteúdo intracelular de ROS encontrado no grupo MD foi superior (P<0,05) aos observados nos grupos Controle e Controle ATX, já o grupo ATX MD não diferiu (P>0,05) dos grupos anteriormente mencionados. A atividade de caspases não diferiu (P>0,05) entre os grupos. No entanto, as porcentagens de apoptose encontradas nos grupos MD e ATX MD foram superiores (P<0,05) comparadas aos grupos Controle e Controle ATX. A taxa de blastocisto foi menor (P<0,05) no grupo MD comparados aos grupos Controle e Controle ATX, porém o grupo ATX MD não diferiu (P>0,05) dos demais grupos experimentais. No experimento III, o conteúdo intracelular de GSH foi similar (P>0,05) entre os grupos experimentais. O conteúdo intracelular de ROS encontrado no grupo MD foi superior (P<0,05) ao observado no grupo Controle, já os grupos IGF e IGF MD não diferiram (P>0,05) dos grupos anteriormente mencionados. Com relação à atividade de caspases 3 e 7 não houve diferença (P>0,05) entre os grupos. O número total de blastômeros não diferiu (P>0,05) entre os grupos experimentais. No entanto, as maiores porcentagens de apoptose foram encontradas no grupo MD e foram superiores (P<0,05) aos grupos Controle, IGF e IGF MD. Níveis intermediários de porcentagem de apoptose foram encontrados nos grupos Controle e IGF MD, que não diferiram entre si (P>0,05), porém tais grupos foram superiores (P<0,05) comparado ao grupo IGF, que apresentou as menores porcentagens (P<0,05). A taxa de blastocisto foi menor (P<0,05) no grupo MD comparados aos grupos Controle e IGF, porém o grupo IGF MD não diferiu (P>0,05) dos demais grupos experimentais. A taxa de re-expansão foi inferior (P<0,05) no grupo MD comparada aos grupos Controle e IGF, que não diferiram entre si (P>0,05). O grupo IGF MD não diferiu (P>0,05) dos grupos IGF e MD, porém foi inferior (P<0,05) quando comparado ao grupo Controle. Não houve diferença (P>0,05) na expressão relativa dos genes CASP3 e GPX-1 entre os grupos experimentais. No entanto, a expressão do gene SOD-1 foi maior (P<0,05) no grupo IGF MD comparado ao grupo IGF, porém estes grupos não diferiram (P>0,05) dos grupos Controle e MD. Em conclusão, a suplementação com antioxidantes intra- e extracelulares durante a MIV melhorou a competência oocitária para o desenvolvimento embrionário e minimizou os efeitos deletérios do estresse oxidativo induzido pela menadiona. Ainda, a adição de IGF-1 durante o CIV aumentou a resistência ao estresse oxidativo induzido pela menadiona, visto que aumentou a expressão do gene antioxidante SOD-1, o que resultou em redução da apoptose e melhorou o desenvolvimento e criotolerância de blastocistos bovinos.

The study aimed to evaluate different strategies to minimize the effects of oxidative stress induced by menadione during in vitro culture on the potential for in vitro embryonic development. Therefore, in Experiment I, the oocytes were IVM in medium supplemented with 0.6 mM cysteine and 100 mM cysteamine (C+C), 100 IU catalase (CAT), 0.6 mM cysteine associated with 100 uM cysteamine and 100 IU catalase (C+C+CAT) or without antioxidants supplementation (Control). Then, were fertilized and the presumptive zygotes were in vitro cultured for 7 days. Immature oocytes (0h) and oocytes after 22 h of IVM were evaluated for intracellular levels of GSH and ROS, mitochondrial membrane potential, nuclear maturation and apoptosis. In Experiment II, oocytes were IVM in medium supplemented with C+C+ CAT (ATX) and the presumptive zygotes were IVC in SOF medium. From Day 6 to the end of the IVC, embryos were cultured in the presence or absence of 5 uM menadione (MD). On day 7, embryo development to the blastocyst rate was evaluated. Blastocysts were subjected to evaluations for intracellular GSH and ROS content, caspases 3 and 7 activity and apoptosis. Finally, Experiment III, oocytes were IVM and the presumptive zygotes were IVC in SOF medium supplemented with 100 ng/mL IGF-I (IGF). From Day 6 to the end of the IVC, embryos were cultured in the presence or absence of 5 uM menadione (MD). On day 7, embryo development to the blastocyst rate was evaluated. Blastocysts were subjected to evaluations for intracellular GSH and ROS content, caspases 3 and 7 activity, apoptosis, re-expansion rates after vitrification/thawing and expression of CASP3, GPX-1 and SOD-1 genes. In the first experiment, nuclear maturation rate was not affected by treatments (P>0.05). The percentage of apoptosis in C+C+CAT group was higher (P<0.05) compared to CAT group, but the Control and C+C groups did not differ from other groups (P>0.05). Intracellular ROS levels in C+C and C+C+CAT groups were similar to that observed in immature oocytes (0h) and higher (P<0.05) ROS levels were found in Control group. The intracellular GSH stocks was reduced (P<0.05) in all groups compared to immature oocytes, however the Control, CAT and C+C+CAT groups had lower (P<0.05) GSH concentrations compared to C+C group. The mitochondrial membrane potential was increased in all groups (P<0.05) when compared to immature oocytes (0h), with the only exception of C+C group. The blastocyst rate was higher (P<0.05) in the C+C+CAT group compared to the other groups. In the second experiment, the intracellular GSH levels was similar (P>0.05) between the experimental groups. The intracellular ROS levels found in the MD group was higher (P<0.05) than Control and Control ATX groups, ATX MD group did not differ (P>0.05) from the groups mentioned above. The caspases 3 and 7 activity did not differ (P>0.05) between groups. However, the percentage of apoptosis found in MD and MD ATX groups were higher (P<0.05) compared to Control and Control ATX groups. The blastocyst rate was lower (P<0.05) in the MD group compared to Control and Control ATX groups, but the ATX MD group did not differ (P>0.05) from the other experimental groups. In Experiment III, the intracellular GSH levels were similar (P>0.05) between the experimental groups. The intracellular ROS levels found in the MD group was higher (P<0.05) than observed in the Control group, however IGF and IGF MD groups did not differ (P>0.05) from the groups mentioned above. Caspases 3 and 7 activities and the total number of blastomeres did not differ (P>0.05) between experimental groups. However, the highest apoptotic percentages were found in the MD group and were higher (P<0.05) than Control, IGF and IGF MD groups. Intermediate apoptosis percentage levels were found in Control and IGF MD groups, which did not differ (P>0.05), but these groups were higher (P<0.05) compared to IGF group, which had the lowest percentages (P<0.05). The blastocyst rate was lower (P<0.05) in the MD group compared to Control and IGF groups, but IGF MD group did not differ (P>0.05) from the other experimental groups. The re-expansion rates was lower (P<0.05) in the MD group compared to Control and IGF groups, which did not differ (P>0.05). The IGF MD group did not differ (P>0.05) of the IGF and MD groups, but was lower (P<0.05) when compared to the Control group. There was no difference (P>0.05) in the relative expression of CASP3 and GPX-1 genes between experimental groups. However, expression of the SOD-1 gene was higher (P<0.05) in the IGF MD compared to IGF group, however these groups did not differ (P>0.05) from Control and MD groups. In conclusion, supplementation with intra- and extracellular antioxidants during IVM improved oocyte competence for embryonic development and minimized the deleterious effects of oxidative stress induced by menadione. Furthermore, the addition of IGF-1 for the IVC increased resistance to oxidative stress induced by menadione, whereas increased the expression of the antioxidant gene SOD-1, which resulted in reduction of apoptosis and improvement of blastocyst development and cryotolerance.

USO DE ANTIOXIDANTES NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

A técnica de fertilização in vitro se apresenta muito bem consolidada, porém a busca por novas ferramentas, para incrementar os resultados, são incessantes. As drogas antioxidantes vêm sendo estudadas por muitos pesquisadores, pois seus efeitos podem ser a chave para a diminuição do estresse oxidativo, que é uma realidade na produção in vitro (PIV) de embriões. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de cinco drogas antioxidantes (quercetina; cisteamina; carnitina; vitamina-C e resveratrol) na PIV de embriões, desde a clivagem, blastocistos, eclosão, número total de células e as mensurações dos níveis das espécies reativas de oxigênio (ROS) e da glutationa (GSH). As análises estatísticas foram realizadas pelo programa BioEstat 4.0 e, em seguida, pela análise de Bonferroni a 5% de significância. Os oócitos foram recuperados de ovários provenientes de abatedouro e selecionados como grau I e II para serem usados na PIV. Os oócitos foram divididos em seis grupos e submetidos a maturação por 22 horas em meio suplementado com antioxidante (tratamento) ou não (controle). Após a maturação os oócitos foram fecundados e cultivados in vitro. Todas as etapas foram em estufa de cultivo celular a 38,5ºC e atmosfera gasosa com 5% de CO2. A suplementação do meio de maturação com os antioxidantes não alterou significativamente a media nas taxas de clivagem (86.3%), de blastocistos (52%) e de blastocistos eclodidos (59,4%). Porém houve aumento no número total de células (blastômeros) nos grupos tratados com cisteamina (159), carnitina (148), vitamina-C (157) e resveratrol (148) em relação aos grupos controle (126) e o tratado com quercetina (131). Na avaliação dos níveis de ROS na maturação dos oócitos, houve redução de ROS nos grupos tratados com quercetina (0,86), vitamina-C (0,86) e resveratrol (0,91), em relação aos grupos cisteamina (0,98), carnitina (0,98) e controle (1,00). Já o nível de GSH aumentou nos grupos tratados cisteamina (1,25) e carnitina (1,11) em relação aos demais grupos: quercetina (1,02), vitamina-C (1,04), resveratrol (0,98) e ao grupo controle (1,00). De acordo com os resultados a suplementação da maturação in vitro com drogas antioxidantes pode interferir positivamente na produção in vitro de embriões bovinos.

The in vitro fertilization technique performs very well established, but the search for new tools to enhance the results are endless. The antioxidant drugs have been studied by many researchers because its effects can be the key to reduction of oxidative stress, which is a reality in vitro production (IVP) embryos. The objective of this study was to evaluate the effect of five antioxidant drugs (quercetin; cysteamine; carnitine; vitamin-C and resveratrol) in IVP embryos, from the cleavage, blastocyst, hatching, total number of cells and measurements of the levels of reactive species oxygen (ROS) and glutathione (GSH). Statistical analyzes were performed by BioEstat 4.0 program and then by Bonferroni analysis at 5% significance level. Oocytes were recovered from slaughterhouse ovaries and selected as a grade I and II for use in PIV. Oocytes were divided into six groups and subjected to aging for 22 hours in medium supplemented with antioxidant (treatment) or not (control). After maturation oocytes were fertilized and cultured in vitro. All steps were in cell culture incubator at 38.5 ° C and the gaseous atmosphere with 5% CO2. The supplementation of maturation medium with antioxidants did not significantly alter the media in cleavage rates (86.3%), blastocyst (52%) and hatched blastocyst (59.4%). But there was an increase in the total number of cells (blastomeres) in the groups treated with cysteamine (159), carnitine (148), vitamin-C (157) and resveratrol (148) compared to the control group (126) and treated with quercetin ( 131). In assessing the levels of ROS in the maturation of the oocytes, a reduction of ROS in groups treated with quercetin (0.86), vitamin-C (0.86) and resveratrol (0.91) groups compared to cysteamine (0, 98), carnitine (0.98) and control (1.00). But the level of GSH increased in cysteamine treated groups (1.25) and carnitine (1.11) compared to the other groups: quercetin (1.02), vitamin-C (1.04), resveratrol (0.98) and the control group (1.00). According to the results supplementation of maturation in vitro antioxidant drugs could positively affect the in vitro production of bovine embryos.