Cutaneous mast cell tumor in a captive Bush dog (Speothos venaticus): pathological and immunophenotypical aspects - case report / Mastocitoma cutâneo em um cachorro-do-mato vinagre (Speothos venaticus) de cativeiro: aspectos patológicos e imunofenotípicos - relato de caso

A senile male captive bush dog (Speothos venaticus) presented a small perianal cutaneous nodule. Histologically, there was an ulcerated round cell tumor composed of well differentiated mast cells with abundant intracytoplasmic purple Giemsa-positive granules, with a diffuse eosinophilic infiltrate. Immunohistochemistry revealed that 30% of the neoplastic cells were positive for Kit in the cytoplasm and cell membrane, and all neoplastic cells were negative for MAC and CD3. Less than 10% of the neoplastic cells were positive for Ki67. At necropsy other primary tumors were identified in this animal, including an intestinal adenoma, an adrenal cortex adenoma and a testicular interstitial cell tumor.(AU)

Um cachorro-vinagre (Speothos venaticus) apresentou um nódulo cutâneo pequeno na região perianal. Histologicamente havia neoplasia cutânea de células redondas e ulcerada, constituída por mastócitos bem diferenciados, com abundantes grânulos citoplasmáticos metacromáticos na coloração de Giemsa e infiltrado eosinofílico difuso. A imuno-histoquímica demonstrou que 30% das células neoplásicas eram positivas para a proteína Kit no citoplasma e na membrana celular. As células foram negativas para MAC e CD3. Menos de 10% das células neoplásicas foram positivas para Ki67. Durante a necropsia, foram identificados outros tumores primários, como adenoma intestinal, adenoma cortical da adrenal e tumor de células intersticiais do testículo.(AU)

Maturação in vitro de oócitos bovinos é negativamente afetada por CHIR99021, inibidor específico de GSK3 / In vitro maturation of bovine oocytes is negatively affected by CHIR99021, a specific inhibitor of GSK3

A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) atua em várias vias de sinalização pela fosforilação e desfosforilação de proteínas, participando de várias funções celulares. Poucos estudos descrevem sua participação na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos, mas sabe-se que sua inibição inespecífica tem um impacto negativo nesse processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de CHIR99021, inibidor específico da GSK3, em diferentes aspectos da MIV de complexos de cumulusoócito (CCOs) bovino e seu impacto na produção in vitro. Os CCOs foram aspirados de ovários de vacas abatidas e maturados em meio suplementado com 0; 1,5; 3,0 e 6,0 μM de CHIR99021. A análise estatística dos resultados por regressão linear (p≤0,01) mostrou que após 22 h de MIV, o tratamento causou redução dose-dependente no grau de expansão das células cumulus; na viabilidade de oócitos avaliada por coloração com calceína-AM e iodeto de propídio; nas taxas de maturação nuclear, e migração de grânulos corticais avaliadas por marcação com orceína acética a 2% e com lectina Lens culinaris-FITC (LCA), respectivamente, além de uma redução na produção de blastocistos. Assim, conclui-se que o CHIR99021 interfere negativamente, de forma dose-dependente na MIV de oócitos bovinos, sugerindo a importância da GSK3 na maturação nuclear e citoplasmática, com consequente impacto para a produção in vitro de embriões bovinos.

The enzyme glycogen synthase kinase-3 (GSK3) acts in several signaling pathway through phosphorylation and protein dephosphorylation, participating in various cellular functions. Few studies describe its participation in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes, but its nonspecific inhibition is known to have a negative impact on this process. The objective of this work was to evaluate the effect of CHIR99021, specific inhibition of GSK3, on different aspects of the in vitro maturation of bovine cumulus-oocyte (COCs) complexes. COCs were aspirated from ovaries of slaughtered cows and matured in medium supplemented with0; 1.5; 3.0 and 6.0 μM CHIR99021. Statistical analysis of the results by linear regression (p≤0.01) showed that after 22 hours of IVM the treatment caused dose-dependent reduction in the degree of cumulus cell expansion; oocyte viability evaluated by staining with calcein-AM and propidium iodide; rates of nuclear maturation and migration of cortical granules evaluated by labeling with 2% acetic orcein and Lens culinaris-FITC (LCA), respectively; and a reduction in the of blastocyst rate. It is concluded that CHIR99021 interferes negatively, in a dose-dependent manner in the IVM of bovine oocytes, suggesting the importance of GSK3 in nuclear and cytoplasmic maturation, with a consequent impact on the in vitro bovine embryos production.

Maturação in vitro de oócitos bovinos é negativamente afetada por CHIR99021, inibidor específico de GSK3 / In vitro maturation of bovine oocytes is negatively affected by CHIR99021, a specific inhibitor of GSK3

A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) atua em várias vias de sinalização pela fosforilação e desfosforilação de proteínas, participando de várias funções celulares. Poucos estudos descrevem sua participação na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos, mas sabe-se que sua inibição inespecífica tem um impacto negativo nesse processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de CHIR99021, inibidor específico da GSK3, em diferentes aspectos da MIV de complexos de cumulusoócito (CCOs) bovino e seu impacto na produção in vitro. Os CCOs foram aspirados de ovários de vacas abatidas e maturados em meio suplementado com 0; 1,5; 3,0 e 6,0 μM de CHIR99021. A análise estatística dos resultados por regressão linear (p≤0,01) mostrou que após 22 h de MIV, o tratamento causou redução dose-dependente no grau de expansão das células cumulus; na viabilidade de oócitos avaliada por coloração com calceína-AM e iodeto de propídio; nas taxas de maturação nuclear, e migração de grânulos corticais avaliadas por marcação com orceína acética a 2% e com lectina Lens culinaris-FITC (LCA), respectivamente, além de uma redução na produção de blastocistos. Assim, conclui-se que o CHIR99021 interfere negativamente, de forma dose-dependente na MIV de oócitos bovinos, sugerindo a importância da GSK3 na maturação nuclear e citoplasmática, com consequente impacto para a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

The enzyme glycogen synthase kinase-3 (GSK3) acts in several signaling pathway through phosphorylation and protein dephosphorylation, participating in various cellular functions. Few studies describe its participation in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes, but its nonspecific inhibition is known to have a negative impact on this process. The objective of this work was to evaluate the effect of CHIR99021, specific inhibition of GSK3, on different aspects of the in vitro maturation of bovine cumulus-oocyte (COCs) complexes. COCs were aspirated from ovaries of slaughtered cows and matured in medium supplemented with0; 1.5; 3.0 and 6.0 μM CHIR99021. Statistical analysis of the results by linear regression (p≤0.01) showed that after 22 hours of IVM the treatment caused dose-dependent reduction in the degree of cumulus cell expansion; oocyte viability evaluated by staining with calcein-AM and propidium iodide; rates of nuclear maturation and migration of cortical granules evaluated by labeling with 2% acetic orcein and Lens culinaris-FITC (LCA), respectively; and a reduction in the of blastocyst rate. It is concluded that CHIR99021 interferes negatively, in a dose-dependent manner in the IVM of bovine oocytes, suggesting the importance of GSK3 in nuclear and cytoplasmic maturation, with a consequent impact on the in vitro bovine embryos production.(AU)

Reproductive biology, morphology, and morphometry of ovaries and oviducts of Trachemys scripta elegans in Brazilian Cerrado / Biologia reprodutiva, morfologia e morfometriade ovários e ovidutos de Trachemys scripta elegans no Cerrado Brasileiro

Although Trachemys scripta elegans is an exotic species popular as a pet in Brazil, studies on reproductive biology and capacity are non-existent in the Brazilian Cerrado. This study analyzed ovarian and oviduct characteristics and the egg production capacity of T. scripta elegans grown in this biome. The findings will associate with the size of the specimens and the sexual maturity, aiming at comparisons with native and exotic populations, as well as interspecific and contributing to the understanding of its impact on the invaded ecosystems and the establishment of eradication programs. Thus, 39 females had evaluated the body biometry and the morphology and morphometry of the ovaries and oviducts. G2 (N=20): with Class I (>5-10mm) follicles, with Class I and Class II (>10-fold) follicles, 25mm) and G3 (N=9) with Class I, Class II and Class III (>25mm) follicles. Analysis of variance, Scott-Knott's test, and Pearson's correlation analysis showed that there was no significant difference between the groups in body biometry; in the mean gonadosomatic index and gonadal morphometry, only the width of the oviducts in the right antimer and the mass and width in the left antimer were higher in G3, the only one that presented eggs. There was positive and harmonic development between body mass, carapace, and plastron, and gonadal growth occurred concomitantly with body growth, indicating a higher reproductive potential and a positive relationship between the size of the litter and the female litter. The gonadosomatic index proved to be an excellent reproductive indicator, and the ovarian evaluation was a better indicator of sexual maturity than the maximum carapace length. Ovaries were irregular structures, without delimitation between the cortical and medullary regions and filled with vitelogenic follicles of different diameters, atresic follicles, and corpora lutea, which reflected the ovarian complexity of the species and the presence of follicular hierarchy. In the scarce stroma, two germinative beds were observed per ovary and the presence of gaps very close to the follicles and associated with the blood vessels. Analysis of gonadal tissue revealed three types of oocytes according to cytoplasmic characteristics: homogeneous, vesicular or vesicular in the cortex with apparent granules. Oviducts were functional and separated, joining only in the final portion to form the cloaca and subdivided into infundibulum, tuba, isthmus, uterus, and vagina. The structure of the uterine tube was composed of serosa, muscular and mucous, which was full of glands. The presence of eggs in the oviducts indicated that the specimens can reproduce in the Brazilian Cerrado. This study provides necessary and relevant information on the reproductive biology and capacity of T. scripta elegans in the Brazilian Cerrado and can contribute to the understanding of its impact on the invaded ecosystems and the establishment of eradication programs. The extraction of females with capacity can reduce the annual reproductive yield of the species and decrease its effect on local biodiversity.(AU)

Embora Trachemys scripta elegans seja uma espécie exótica popular como animal de estimação no Brasil, estudos sobre biologia e capacidade reprodutivas são inexistentes no Cerrado brasileiro. Este estudo analisou características ovarianas e do oviduto e a capacidade de produção de ovos em T. scripta elegans criadas neste bioma, correlacionando estes achados ao tamanho dos espécimes e a maturidade sexual, visando comparações com populações nativas e exóticas, bem como interespecíficas e contribuir para a compreensão de seu impacto nos ecossistemas invadidos e com o estabelecimento de programas de erradicação. Assim, 39 fêmeas tiveram avaliadas a biometria corporal e a morfologia e morfometria dos ovários e ovidutos. De acordo com o tamanho dos folículos ovarianos as fêmeas foram separadas em G1 (N= 10): com folículos Classe I (>5-10 mm), G2 (N= 20): com folículos Classe I e Classe II (>10-25 mm) e G3 (N= 9) com folículos Classe I, Classe II e Classe III (>25 mm). À análise de variância, teste de Scott-Knott e à análise de correlação de Pearson verificou-se que não houve diferença significativa entre os grupos na biometria corporal; no índice gonadossomático médio e na morfometria gonadal, apenas a largura dos ovidutos no antímero direito e a massa e a largura no antímero esquerdo foram maiores no G3, o único que apresentou ovos. Houve desenvolvimento positivo e harmônico entre massa corporal, carapaça e plastrão e o crescimento gonadal ocorreu concomitante ao crescimento corporal, indicando maior potencial reprodutivo e relação positiva entre o tamanho da ninhada de ovos e o da fêmea. O índice gonadossomático mostrou-se um bom indicador reprodutivo e a avaliação ovariana um melhor indicador da maturidade sexual que o comprimento máximo da carapaça. Ovários foram estruturas irregulares, sem delimitação entre a região cortical e medular e repletos de folículos vitelogênicos de diferentes diâmetros, folículos atrésicos e corpos lúteos, que refletiram a complexidade ovariana da espécie e a presença de hierarquia folicular. No estroma escasso foram observados dois leitos germinativos por ovário e a presença de lacunas muito próximas aos folículos e associadas aos vasos sanguíneos. A análise do tecido gonadal revelou três tipos de oócitos de acordo com as características do citoplasma: homogêneo, vesicular ou vesicular no córtex com grânulos aparentes. Ovidutos eram funcionais e separados, unindo-se apenas na porção final para formar a cloaca e subdividiam-se em infundíbulo, tuba uterina, istmo, útero e vagina. A estrutura da tuba uterina era constituída de serosa, muscular e mucosa, a qual era repleta de glândulas. A presença de ovos nos ovidutos indicou que os espécimes podem se reproduzir no cerrado brasileiro. Este estudo fornece informações básicas e relevantes da biologia e capacidade reprodutivas de T. scripta elegans no Cerrado brasileiro e pode contribuir com a compreensão de seu impacto nos ecossistemas invadidos e com o estabelecimento de programas de erradicação, uma vez que a extração de fêmeas com capacidade reprodutiva pode contribuir com a diminuição do rendimento reprodutivo anual da espécie e diminuir seu efeito sobre a biodiversidade local.(AU)

Effect of environmental contamination on female and male gametes – A lesson from bovines

Endocrine-disrupting compounds (EDCs) and foodborne contaminants are environmental pollutants that are considered reproductive toxicants due to their deleterious effects on female and male gametes. Among the EDCs, the phthalate plasticizers are of growing concern. In-vivo and in-vitro models indicate that the oocyte is highly sensitive to phthalates. This review summarizes the effects of di(2-ethylhexyl) phthalate and its major metabolite mono(2-ethyhexyl) phthalate (MEHP) on the oocyte. MEHP reduces the proportion of oocytes that fertilize, cleave and develop to the blastocyst stage. This is associated with negative effects on meiotic progression, and disruption of cortical granules, endoplasmic reticulum and mitochondrial reorganization. MEHP alters mitochondrial membrane polarity, increases reactive oxygen species levels and induces alterations in genes associated with oxidative phosphorylation. A carryover effect from the oocyte to the blastocyst is manifested by alterations in the transcriptomic profile of blastocysts developed from MEHP-treated oocytes. Among foodborne contaminants, the pesticide atrazine (ATZ) and the mycotoxin aflatoxin B1 (AFB1) are of high concern. The potential hazards associated with exposure of spermatozoa to these contaminants and their carryover effect to the blastocyst are described. AFB1 and ATZ reduce spermatozoa's viability, as reflected by a high proportion of cells with damaged plasma membrane; induce acrosome reaction, expressed as damage to the acrosomal membrane; and interfere with mitochondrial function, characterized by hyperpolarization of the membrane. ATZ and AFB1-treated spermatozoa show a high proportion of cells with fragmented DNA. Exposure of spermatozoa to AFB1 and ATZ reduces fertilization and cleavage rates, but not that of blastocyst formation. However, fertilization with AFB1- or ATZ-treated spermatozoa impairs transcript expression in the formed blastocysts, implying a carryover effect. Taken together, the review indicates the risk of exposing farm animals to environmental contaminants, and their deleterious effects on female and male gametes and the developing embryo.

Effect of environmental contamination on female and male gametes A lesson from bovines

Endocrine-disrupting compounds (EDCs) and foodborne contaminants are environmental pollutants that are considered reproductive toxicants due to their deleterious effects on female and male gametes. Among the EDCs, the phthalate plasticizers are of growing concern. In-vivo and in-vitro models indicate that the oocyte is highly sensitive to phthalates. This review summarizes the effects of di(2-ethylhexyl) phthalate and its major metabolite mono(2-ethyhexyl) phthalate (MEHP) on the oocyte. MEHP reduces the proportion of oocytes that fertilize, cleave and develop to the blastocyst stage. This is associated with negative effects on meiotic progression, and disruption of cortical granules, endoplasmic reticulum and mitochondrial reorganization. MEHP alters mitochondrial membrane polarity, increases reactive oxygen species levels and induces alterations in genes associated with oxidative phosphorylation. A carryover effect from the oocyte to the blastocyst is manifested by alterations in the transcriptomic profile of blastocysts developed from MEHP-treated oocytes. Among foodborne contaminants, the pesticide atrazine (ATZ) and the mycotoxin aflatoxin B1 (AFB1) are of high concern. The potential hazards associated with exposure of spermatozoa to these contaminants and their carryover effect to the blastocyst are described. AFB1 and ATZ reduce spermatozoa's viability, as reflected by a high proportion of cells with damaged plasma membrane; induce acrosome reaction, expressed as damage to the acrosomal membrane; and interfere with mitochondrial function, characterized by hyperpolarization of the membrane. ATZ and AFB1-treated spermatozoa show a high proportion of cells with fragmented DNA. Exposure of spermatozoa to AFB1 and ATZ reduces fertilization and cleavage rates, but not that of blastocyst formation. However, fertilization with AFB1- or ATZ-treated spermatozoa impairs transcript expression in the formed blastocysts, implying a carryover effect. Taken together, the review indicates the risk of exposing farm animals to environmental contaminants, and their deleterious effects on female and male gametes and the developing embryo.(AU)

Human exhaled air can efficiently support in vitro maturation of porcine oocytes and subsequent early embryonic development

Air phase is an indispensable environmental factor affecting oocyte maturation and early embryo development. Human exhaled air was previously proved to be a reliable and inexpensive atmosphere that sustains normal early development of mouse and bovine embryos. However, whether human exhaled air can support in vitro maturation (IVM) of porcine oocytes is not yet known. To evaluate the feasibility of maturing oocytes in human exhaled air, we examined oocyte morphology, BMP15 expression, nuclear and cytoplasmic maturation. We found that cumulus expansion status, expression levels of BMP15 important for cumulus expansion and the rate of first polar body emission were similar among human exhaled air, 5% O2 or 20% O2 in air after IVM of 44 h. Furthermore, the percentage of metaphase II (MII) oocytes showing normal cortical and sub-membranous localization of cortical granules and diffused mitochondrial distribution patterns is comparable among groups. The cleavage, blastocyst rate and total cell number were not apparently different for parthenogenetic activated and somatic cloned embryos derived from MII oocytes matured in three air phases, suggesting oocytes matured in human exhaled air obtain normal developmental competence. Taken together, human exhaled air can efficiently support in vitro maturation of porcine oocytes and subsequent early embryonic development.(AU)

Human exhaled air can efficiently support in vitro maturation of porcine oocytes and subsequent early embryonic development

Air phase is an indispensable environmental factor affecting oocyte maturation and early embryo development. Human exhaled air was previously proved to be a reliable and inexpensive atmosphere that sustains normal early development of mouse and bovine embryos. However, whether human exhaled air can support in vitro maturation (IVM) of porcine oocytes is not yet known. To evaluate the feasibility of maturing oocytes in human exhaled air, we examined oocyte morphology, BMP15 expression, nuclear and cytoplasmic maturation. We found that cumulus expansion status, expression levels of BMP15 important for cumulus expansion and the rate of first polar body emission were similar among human exhaled air, 5% O2 or 20% O2 in air after IVM of 44 h. Furthermore, the percentage of metaphase II (MII) oocytes showing normal cortical and sub-membranous localization of cortical granules and diffused mitochondrial distribution patterns is comparable among groups. The cleavage, blastocyst rate and total cell number were not apparently different for parthenogenetic activated and somatic cloned embryos derived from MII oocytes matured in three air phases, suggesting oocytes matured in human exhaled air obtain normal developmental competence. Taken together, human exhaled air can efficiently support in vitro maturation of porcine oocytes and subsequent early embryonic development.

ORGANIZAÇÃO MORFOLÓGICA E AVALIAÇÃO ULTRAESTRUTURAL DO PACOTE E GAMETAS DO CORAL Mussismilia harttii

O declínio crescente das espécies construtoras de recifes em todo o mundo reforça a urgência de mais informações sobre a biologia reprodutiva em corais. Levando em consideração que metade das espécies de corais existentes na natureza nunca tiveram sua biologia reprodutiva investigada, a lacuna no conhecimento acerca do tema é realmente preocupante. Nesse estudo nós investigamos a ultraestrutura dos pacotes, oócitos e espermatozoides do coral endêmico do Atlântico Sul Mussismilia harttii. Nossos resultados mostraram que os pacotes são compostos por muco amorfo, sem constituição estrutural e com densidade de elétrons semelhante aos grânulos presentes no citoplasma dos oócitos. Não existe um padrão de distribuição de espermatozóides e oócitos no pacote. Os espermatozóides estão localizados em estruturas de formato hexagonal. Os oócitos são arredondados, recobertos por muco e apresentam microvilosidades por toda a sua superfície. Eles apresentam vesículas corticais próximas ou fundidas à membrana oocitária. Grânulos de lipídios esféricos, corpos de vitelo, um material fino granular disperso no citoplasma e inúmeras mitocôndrias foram identificadas no citoplasma. A presença das células Symbiodinium-like. Os espermatozoides possuem comprimento total de 6,25 ± 1,34 núcleo está localizado na região central da cabeça e os axonemas exibem o arranjo dos microtúbulos (9+2). Vesículas elétron densas (semelhantes às do complexo de Golgi) foram observadas próximas à membrana plasmática. Abaixo de cada complexo de Golgi há uma única e grande mitocôndria, que parece ter se formado a partir da fusão de outras menores. Os achados aqui detalhados darão suporte para futuros e necessários estudos que buscam compreender melhor a gametogênese, a formação do pacote de gametas e a fecundação em corais escleractíneos.

The growing decline in reef-building species worldwide reinforces the urgency for more information on coral reproductive biology. Taking into account that half of the species of coral existing in nature have never had their reproductive biology investigated, the gap in knowledge on the subject is worrying. In this study, we investigated the ultrastructure of the bundles, oocytes and spermatozoa of the South Atlantic endemic coral Mussismilia harttii. Our results showed that the bundles are composed of amorphous mucus, without structural constitution and with an electron density similar to the granules present in the cytoplasm of oocytes. There is no pattern of distribution of sperm and oocytes in the bundle. Sperm are located in hexagonal shaped structures. Oocytes are rounded, covered with mucus and have microvilli throughout their surface. They have cortical vesicles close to or fused to the oocyte membrane. Spherical lipid granules, yolk bodies, a fine granular material dispersed in the cytoplasm and numerous mitochondria have been identified in the cytoplasm. There is a presence of Symbiodinium-like cells. The spermatozoa have a total length of 6.25 ± 1.34 m, have an oval head (0.40 ± 0.11 m) and a long flagellum (5.53 ± 1.25 m). The nucleus is located in the central region of the head and the axonemes exhibit the arrangement of the microtubules (9 + 2). Dense electron vesicles (similar to those of the Golgi complex) were observed close to the plasma membrane. Below each Golgi complex is a single and large mitochondria, which appears to have formed from the merger of smaller ones. The findings detailed here will support future and necessary studies that seek to better understand gametogenesis, the formation of the gamete package and fertilization in scleractine corals.

EFEITOS DO FSH, AMPc, hCG E COMBINAÇÕES, NO MEIO DE MATURAÇÃO E INFLUÊNCIA NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

A maturação oocitária é um complexo bem orquestrado que culmina na liberação de um oócito capaz de ser fertilizado, permitindo assim, o desenvolvimento embrionário. A maturação in vitro (MIV) é uma das etapas determinantes para o sucesso da produção in vitro de embriões (PIVE) e a não competência oocitária nesta fase altera drasticamente a taxa de produção embrionária. Apesar de todos os esforços para a melhoria da PIVE, apenas uma parcela de 35 a 40% dos oócitos bovinos maturados in vitro, desenvolvem-se até o estádio de blastocisto. Acredita-se que a falta de sincronia existente entre a maturação nuclear e a maturação citoplasmática oocitária seja um fator limitante na qualidade da PIVE. Dessa forma, o uso de reguladores durante a MIV, tem se destacado e melhorado a sincronia da maturação nuclear e citoplasmática dos oócitos, e consequentemente, a taxa de produção embrionária. Nesse contexto, o presente estudo teve como finalidade avaliar a influência dos reguladores de maturação - hormônio folículo estimulante (FSH), monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) e gonadotrofina coriônica humana (hCG), e suas combinações - na presença de albumina sérica bovina (BSA) como fonte protéica, sobre a MIV de oócitos bovinos, comparados ao grupo controle, com soro fetal bovino (SFB) sem adição dos reguladores. Foram formados dez grupos experimentais (T1: SFB, T2: FSH, T3: AMPc, T4: hCG, T5: FSH+AMPc, T6: FSH+hCG, T7: AMPc+hCG, T8: FSH+AMPc+hCG e T9: (FSH+AMPC) por 12 horas + hCG nas outras 12 horas, T10: BSA). Foram avaliadas as taxas de maturação nuclear e citoplasmática, de acordo com a presença de metáfase II (MII), migração dos grânulos corticais e mitocôndrias, capacidade em produzir embriões e acúmulo lipídico embrionário. Os resultados demonstraram que o uso do BSA durante a MIV provocou atraso na retomada da meiose em todos os grupos experimentais analisados, comparados à maturação com SFB (p < 0,05). Porém, a distribuição de grânulos corticais e de mitocôndrias no ooplasma, bem como a taxa de produção embrionária, apresentaram melhores resultados quando o SFB foi utilizado (p < 0,05). Além disso, a substituição do SFB pelo BSA na MIV não reduz os níveis lipídicos dos embriões produzidos in vitro (PIV) (p > 0,05). Conclui-se que, o uso do BSA durante a MIV de oócitos bovinos, permite o atraso da reativação da meiose, contudo, a presença do SFB nessa etapa é de suma importância para a maturação das organelas citoplasmáticas e na produção in vitro de embriões bovinos.

Oocyte maturation is a well-orchestrated complex that culminates in the release of an oocyte capable of being fertilized, thus allowing embryonic development. In vitro maturation (IVM) is one of the determining steps for the success of in vitro production of embryos (IVPE) and the lack of oocyte competence in this phase dramatically changes the rate of embryonic production. Despite all efforts to improve IVPE, only a portion of 35 to 40% of bovine oocytes matured in vitro, develop until the blastocyst stage. It is believed that the lack of synchrony between nuclear maturation and oocyte cytoplasmic maturation is a limiting factor in the quality of IVPE. Thus, the use of regulators during IVM, has highlighted and improved the synchrony of oocyte nuclear and cytoplasmic maturation, and consequently, the rate of embryonic production. In this context, the present study aimed to evaluate the influence of maturation regulators - follicle stimulating hormone (FSH), cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and human chorionic gonadotropin (hCG), and their combinations - in the presence of bovine serum albumin (BSA) as a protein source, on the bovine oocyte IVM, compared to the control group, with fetal bovine serum (FBS) without the addition of regulators. Ten experimental groups were formed (T1: FBS, T2: FSH, T3: cAMP, T4: hCG, T5: FSH + cAMP, T6: FSH + hCG, T7: cAMP + hCG, T8: FSH + cAMP + hCG and T9: (FSH + cAMP) for 12 hours + hCG in the other 12 hours, T10: BSA). Nuclear and cytoplasmic maturation rates were evaluated according to the presence of metaphase II (MII), migration of cortical granules and mitochondrias, ability to produce embryos and embryonic lipid accumulation. The results demonstrated that the use of BSA during IVM caused a delay in the resumption of meiosis in all experimental groups analyzed, compared to maturation with FBS (p < 0,05). However, the distribution of cortical granules and mitochondrias in the ooplasm, as well as the rate of embryonic production, showed better results when FBS was used (p < 0,05). In addition, the replacement of FBS by BSA in IVM does not reduce the lipid levels of embryos produced in vitro (IVP) (p> 0.05). It is concluded that the use of BSA during IVM of bovine oocytes allows the delay of meiosis reactivation, however, the presence of FBS in this stage is of paramount importance for the maturation of cytoplasmic organelles and in vitro production of embryos bovine.

TRANSFERÊNCIA DE GENOMA EM OVÓCITOS BOVINOS FRESCOS E VITRIFICADOS: PRODUÇÃO DE EMBRIÕES.

A transferência de genoma (TG), o qual permite substituir um citoplasma danificado por um integro, pode ser uma alternativa para melhorar a eficiência da criopreservação de ovócitos bovinos. Neste trabalho objetivou-se estabelecer a técnica de TG utilizando a placa metafásica (PM) e corpúsculo polar (CP) de ovócitos bovinos como fontes do material genético. Para isso foram realizados quatro experimentos. No primeiro foi estabelecida a TG utilizando a PM (TG-PM) avaliando a concentração espermática a ser utilizada, a taxa de fecundação, a de polispermia e a de embriões. Na avaliação da concentração espermática, a taxa de fecundação foi maior (P<0,05) no grupo controle (76,1%) do que no TG-PM fecundados com 1x106 sptz/ml (46,9%) e com 0,5x106 sptz/ml (46%), que não diferiram entre si. Com relação à produção de embriões o grupo TG-PM apresentou taxas de clivagem (50%) e blastocisto (13,6%) inferiores ao grupo controle (80,2% e 32,6%,). No segundo experimento foram avaliados os mesmos parâmetros do primeiro, porém com estruturas submetidas à transferência de corpúsculo polar (TG-CP). Os resultados mostraram que o grupo TG-CP apresentou taxa de fecundação (82,3% x 96,2%) e de blastocisto (7,7% x 36,8%) inferiores, mas a taxa de clivagem (88,5% x 85,3%) semelhante ao grupo controle. No terceiro experimento foi avaliado o efeito da TG-PM e TG-CPna quantidade e distribuição de Grânulos Corticais (GC), Mitocôndrias (MT) e numero de cópias de DNA mitocondrial (mtDNA). A quantificação do GC foi semelhante (p> 0,05) entre as estruturas reconstruídas GT-PM (n = 22) e GT-CP (n = 20). No entanto, ambos os grupos apresentaram menos GC (p <0,05) que os grupos controle (n = 22) e enucleados (n = 20). Para distribuição do GC, o grupo GT-PM apresentou menos estruturas com distribuição periférica, diferente dos grupos controle e enucleado (p<0,05), mas não apresentou diferença significativa em relação ao grupo GT-CP (p> 0,05). Não foi observado diferença entre os grupos quanto a quantidade e distribuição de MT e quantidade de mtDNA. No quarto experimento foi realizada a TG-PM utilizando ovócitos vitrificados (TG-PMV) como fonte de material genético. Para isso, forma utilizados 3 grupos, TG-PMV, controle vitrificado (VIT) e controle PIVE. A taxa de clivagem do grupo TG-PMV (70,34%) foi semelhante ao grupo controle PIVE e superior (p<0,05) ao grupo controle VIT (60%). Já a taxa de blastocisto não se diferiu do grupo controle VIT (9,1% e 5%) porem foram menores que o grupo controle PIVE (33%). Os resultados obtidos sugerem que as estruturas reconstruídas pela técnica de TG-PM e TG-CP são capazes de se desenvolver em embrião, e podem ser fecundados usando o mesmo protocolo utilizado na PIVE, sem aumento na taxa de polispermia. Além disso, os resultados mostraram que é possível produzir embriões por TG a partir de ovócitos vitrificados, possibilitando o uso de material genético armazenado em banco de germoplasma.

A genome transfer (GT), which allows replacing this damaged cytoplasm with an integer, is presented as an alternative for the use of these structures in PIVE. Therefore, this work aims to define the GT technique using the metaphasic plate (MP) and the polar body (PB) of bovine oocytes as sources of genetic material. For this, four experiments were carried out. In the first experiment, GT was established using MP (GT-MP). In the evaluation of sperm concentration, the fertilization rate in the control group (76.1%) was higher (p <0.05) than that of GT-MP fertilized with 1x106 sptz/ml (46.9%) and GT-MP fertilized with 0.5x106 sptz/ml (46%), which did not differ between them. However, the rate of polyspermia was similar (p> 0.05) between groups. Regarding the production of embryos, the GT-MP group showed cleavage rates (50%) and blastocyst (13.6%) lower than the PIVE control group (80.2% and 32.6%, respectively). In the second experiment, the same parameters as the first were evaluated, but with structures submitted to polar body transfer (GT-PB). The results showed that the GT-PB group had a lower fertilization rate (82.3% x 96.2%) and a blastocyst (7.7% x 36.8%), but the cleavage rate (88.5% x 85.3%) similar to the control group. In the third experiment, the effect of micromanipulation on the amount and distribution of Cortical Granules (CG), Mitochondria (MT) and number of copies of mitochondrial DNA (mtDNA) was evaluated. CG quantification was similar (p> 0.05) between the reconstructed structures GT-MP (n = 22) and GT-PB (n = 20). However, both groups had less CG (p<0.05) than the control (n = 22) and enucleated (n = 20) groups. For CG distribution, the GT-MP group had fewer structures with peripheral distribution, different from the control and enucleated groups (p<0.05), but there was no significant difference in relation to the GT-PB group (p> 0.05). The GT-PB was the only group that did not differ from the others (p> 0.05). There was no difference between groups regarding the amount and distribution of MT and the amount of mtDNA. In the fourth experiment, GT-MP was performed using vitrified oocytes (GT-VMP) as a source of genetic material. The cleavage rate of the TG-PMV group (70.34%) was similar to the IVP control group and higher (p<0.05) than the control VIT group (60%). The blastocyst rate did not differ from the control VIT group (9,1% and 5%) but were lower than the control group PIVE (33%). The results obtained so far suggest that the structures reconstructed by the TG-PM and TG-CP technique are capable of developing in embryo, and can be fertilized using the same protocol used in IVEP, without increasing the rate of polyspermia. In addition, the results showed that it is possible to produce embryos by TG from vitrified oocytes, enabling the use of genetic material stored in a germplasm bank.

Efeitos da redução ou substituição do soro fetal bovino por outros compostos na maturação in vitro de oócitos bovinos / Effects of reduction or replacement of fetal calf serum by other compounds during in vitro maturation of bovine oocytes

A utilização do soro fetal bovino (SFB), embora bastante disseminada na produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, apresenta limitações por ser um meio indefinido e por causar efeitos que prejudicam a qualidade desses embriões. Por esse motivo, nos últimos anos, grande parte das pesquisas relacionadas à PIV está voltada para a substituição do SFB por outros compostos nos meios de cultura. No presente estudo, foram utilizados como compostos protéicos a albumina sérica bovina livre de ácidos graxos (BSA-FAF) e um produto comercial denominado fluido embriônico (FE) de maneira isolada ou em diferentes combinações e concentrações, com objetivo de substituir ou diminuir a concentração do SFB durante a maturação in vitro (MIV). [...] Ademais, o G3 também apresentou diminuição na taxa de maturação nuclear quando comparado ao G4. Quanto à maturação citoplasmática, nos grupos G2, G7, G6 e G3, houve redução (p<0,05) das taxas para 43,9por cento, 43,2 por cento, 43,1 por cento e 36,5 por cento, respectivamente, quando comparadas ao meio controle (G1), que permitiu a obtenção de valores médios de 62,4 por cento. Por outro lado, nos grupos G8, G4 e G5, a taxa de maturação citoplasmática não foi afetada com a redução do SFB, onde 59,3 por cento, 51,3 por cento e 50,8 por cento dos oócitos apresentaram os GC dispostos na periferia, respectivamente. Os resultados obtidos pelo teste de contrastes ortogonais complementam os obtidos na avaliação da maturação nuclear e migração de grânulos corticais, mostrando a necessidade do SFB durante a MIV, mesmo que em baixas concentrações, e a possibilidade de diminuir a sua concentração associando-o a BSA-FAF e/ou FE. Dessa forma, conclui-se que é possível reduzir a concentração de SFB no meio de MIV para até 3,5% sem prejuízo significativo aos índices de maturação nuclear e citoplasmática.(AU)

The use of fetal calf serum (FCS), although widely employed during in vitro production (IVP) of bovine embryos, has limitations. FCS is an undefined media and may have harmful effects on the quality of embryos. For this reason, in recent years, research efforts aimed at improving IVP of bovine embryos, have focused at the replacement of FCS by alternative compounds in culture media. In this study, fatty acid free bovine serum albumin (BSA-FAF) and embryonic fluid (EF) were used separately or in combination, in different concentrations, to replace or reduce the concentration of FCS during in vitro maturation (IVM). [...] Moreover, G3 also showed inferior nuclear maturation rate when compared to G4. Regarding cytoplasmic maturation, the rates were reduced to 43.9 percent, 43.2 percent, 43.1 percent and 36.5 percent in G2, G7, G6 and G3 groups, respectively, compared to the control group (G1; 62.4 percent). On the other hand, in the groups G8, G4 and G5, maturation rates were not affected by reduction of FCS, where 59.3 percent, 51.3 percent and 50.8 percent of the oocytes displayed CG arranged peripherally, respectively. The results obtained by the orthogonal contrast test are in accordance with the ones from the evaluation of the nuclear maturation and cortical granules migration. These data show the need of FCS on the MIV, even in low concentrations, and the possibility of decrease its concentration by associating it with BSA-FAF and/or EF. Therefore, we concluded that it is possible to reduce the concentration of FCS in IVM medium to a concentration of 3.5 percent without affecting nuclear and cytoplasmic maturation rates.(AU)

Efeito da triciribina, um inibidor seletivo da Akl na maturação n vitro de complexos cumulus oophutos e no desenvolvimento embrionário inicial de bovinos

A proteína quinase B ou Akt é uma serina treonina quinase que atua no metabolismo, no controle da sobrevivência e proliferação celular e no transporte de substâncias. Já foi demonstrado em algumas espécies que durante a maturação in vitro (MIV) a enzima está envolvida desde a retomada da maturação até a progressão ao estádio de metáfase II, mas poucos são os trabalhos que estudaram a participação da Akt durante a MIV de ovócitos bovinos. Por isso, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de triciribina, um inibidor seletivo da Akt, em diferentes aspectos da maturação ovocitária e na PIV de embriões bovinos. Os complexos cumulus oophuros (COCs) foram maturados in vitro por 22 horas em meio TCM 199, acrescido de 10% de SFB, 10g/mL de FSH, 5g/mL de LH e 1% de penicilina/estreptomicina e suplementados com: 0 (controle), 1, 5, 10 e 20 M de triciribina. O estádio de maturação nuclear e citoplasmática foram avaliados pela marcação com orceína acética e Lens culinaris-FITC, respectivamente. Os COCs foram fertilizados in vitro e cultivados por nove dias. As taxas de clivagem, produção de blastocisto e de eclosão foram determinadas nos dias três, sete e nove do cultivo in vitro, respectivamente. Ovócitos provenientes de COCs tratados com 1 M de triciribina foram corados às 3, 6 e 9 horas de MIV para determinar a participação do inibidor no rompimento da vesícula germinativa. Para a quantificação do AMPc nos ovócitos e nas células do cumulus (CCs) os COCs foram tratados com 1 e 20 M do inibidor. A exposição dos COCs a 1, 5 e 10 M de triciribina não alterou o número de ovócitos maturados (P<0,05), mas a concentração de 20 M reduziu o número de ovócitos em MII com um consequente aumento de ovócitos em MI (P<0,05). Esta concentração reduziu de forma pronunciada o número de ovócitos com grânulos corticais periféricos e as taxas de clivagem e de blastocistos (P<0,05). Por outro lado, quando os COCs foram maturados em presença de 1 M houve um aumento na PIVe (P<0,05), mas esta concentração não foi capaz de alterar o momento da retomada da meiose (P<0,05). Não houve diferença na concentração de AMPc intraovocitário entre os grupos experimentais nos tempos analisados (P<0,05). Por outro lado, as CCs apresentaram um aumento na concentração deste nucleotídeo às 3 horas de MIV (P=0,08) no grupo tratado com 1 M do inibidor, quando comparado ao controle. Conclui-se que a via Akt participa dos eventos nucleares e citoplasmáticos da maturação in vitro de ovócitos bovinos, mas por mecanismos que não interferem na quebra da vesícula germinativa. A modulação da atividade da Akt de COCs bovinos durante a MIV aumenta a PIV por mecanismos não elucidados neste trabalho, porém mais estudos são necessários para identificá-los.

Protein kinase B or Akt is a serine threonine kinase that acts in metabolism, control of cell survival and proliferation and substances transport. It has already been demonstrated in some species that during in vitro maturation (IVM), enzymes is involved since vesicle germinal break down (GVBD) until acquisition of metaphase II, but few studies evaluated the participation of Akt during bovine oocytes IVM. Therefore the aim of this study was to evaluate the effect of different concentrations of triciribine, a selective Akt inhibitor, on bovine oocyte maturation and IVP. Cumulus oophurus complexes (COCs) were matured in vitro in TCM 199 supplemented with 10% FCS, FSH 10 g/mL, LH 5 g/mL and 1% penicillin/streptomycin. This maturation medium was supplemented with 0 (control), 1, 5, 10 and 20 M of triciribine. IVM was performed in 100 L drop (20 COCs/drop), submerged in mineral oil and maintained in a humidified atmosphere containing 5% CO2 in air, at 38.5 °C, for 22 hours. Nuclear and cytoplasmic maturation were evaluated by acetic orcein and Lens culinaris staining, respectively. COCs were fertilized in vitro and cultured for nine days. The cleavage, blastocysts and hatch rates were determined on days three, seven and nine, respectively. Oocytes from COCs treated with 1 M of triciribine were stained at 3, 6 and 9 hours of IVM to determine the participation of inhibitor on vesicle germinal breakdown (VGBD). Oocytes and cumulus cells from COCs in vitro matured with 1 and 20 M of triciribine were used for AMPc quantification. COCs treated with 1, 5 and 10 M of triciribine did not influenced the number of mature oocytes (P>0.05), but the treatment with 20 M decreased the percentage of oocytes at MII and increases the number of oocytes at MI (P<0.05). This concentration also markedly reduced the number of oocytes with peripheral cortical granules (a characteristic of mature oocytes), cleavage and blastocyst rates (P<0.05). On the other hand, when COCs were matured in presence of 1 M there was an increase in IVP (P<0.05), but this concentration was not able to alter GVBD. There was no difference on intra-oocyte cAMP levels between experimental groups in analyzed times (P<0.05). However, cumulus cells showed an increase in cAMP levels at 3 hours of IVM (P = 0.08) in 1M treated group when compared to control. Therefore, it can be concluded that Akt participate of the nuclear and cytoplasmic maturation events. The modulation of Akt activity during IVM improves IVP by mechanisms not yet elucidated in this work. More studies are needed to identify them.

Caracterização anatômica e histoquímica foliar de Desmanthus spp. em sequeiro no Semiárido pernambucano

Na região Nordeste do Brasil o clima predominante é o semiárido. Nesta região existem várias espécies endêmicas, destacando-se a jureminha (Desmanthus pernambucanus (L.) Thellung), leguminosa que apresenta características desejáveis para a produção animal. Objetivou-se caracterizar anatômica e histoquimicamente três acessos (7G, 50J e 13AU) de jureminha. O material foi coletado no campo experimental da Unidade Acadêmica de Serra Talhada (UAST/UFRPE) na estação seca. Os acessos foram selecionados com base na sua produção de biomassa, coletando-se as folhas dos de produção máxima (7G), intermediária (50J) e mínima (13AU). As folhas foram coletadas no 1º e 3º nó do ramo (sentido ápice-base), considerando as idades das folhas em jovem e madura, sendo fracionadas em 5 partes (pecíolo, nectário extrafloral, ráquis, peciólulo e foliólulo), fixadas em FAA 50%, posteriormente desidratadas em série alcóolica crescente, seguindo-se do emblocamento das amostras em historresina LEICA®. As lâminas foram coradas com azul de toluidina para padronização anatômica. Testes histoquímicos foram executados para identificar amido, grânulos proteicos, lipídeos, compostos fenólicos gerais, lignina, alcalóides, taninos condensados e terpenóides. A morfologia do pecíolo variou entre acessos e folhas com maior área total nas folhas do acesso 7G. O nectário extrafloral e peciólulo apresentaram morfologia semelhante nos acessos estudados. Na ráquis, a morfologia do 7G e 50J foi semelhante, em ambas as folhas, enquanto o 13AU diferiu destes. O foliólulo apresentou-se com uma única camada de células epidérmicas e mesofilo dorsiventral, exceto nas folhas jovens do acesso 7G e 50J, sendo caracterizado como homogêneo. Em todas as frações mensuradas, a área ocupada por feixes vasculares foi maior no acesso 7G se comparado aos demais. Os testes histoquímicos para alcalóides, taninos condensados e terpenóides foram negativos. Evidenciou-se a presença de amido, grânulos proteicos, lipídeos, compostos fenólicos gerais e lignina em vários tecidos nas frações estudadas. Observou-se a bainha amilífera rodeando o feixe vascular dos pecíolos, caracterizando a endoderme, além de sua presença no parênquima cortical e/ou medular das demais frações. Grânulos proteicos foram verificados em todos os acessos, exceto nos foliólulos do acesso 7G, no pecíolo e nectário da folha madura do acesso 50J e 13AU. Verificou-se a presença de lipídeos constituindo a cutícula em todas as frações estudadas. Compostos fenólicos gerais ocorreram majoritariamente na epiderme e/ou nas células do parênquima cortical do pecíolo, nectário extrafloral, ráquis e peciólulo. A lignina foi observada em todos os acessos estudados, exceto no foliólulo da folha jovem do acesso 7G. Este composto localizou-se nos elementos de condução do xilema e nas fibras esclerenquimáticas. Existem características anatômicas que justificam a maior produtividade do acesso 7G se comparado aos demais. Os resultados histoquímicos mostram a aclimatação das plantas nativas da Caatinga, levando em conta as várias fontes de estresse.

The Northeast region of Brazil has a predominance of semiarid climate. In this region there is a variety of endemic species, highlighting the jureminha (Desmanthus pernambucanus (L.) Thellung), legume forage that shows desirable characteristics to animal production. The aim of this study was characterize anatomic and histochemically three genotypes (7G, 50J and 13AU) to identify structures that explain the superior performance of 7G genotype. The material was collected in experimental field of the Academic Unit of Serra Talhada (UAST/UFRPE) in dry season. Biomass production of genotypes were the basis for selection, in which were collected the leaves of the maximum (7G), intermediate (50J) and minimum (13AU) production. The leaves were collected on the 1º and 3º branch node (apex-base direction), considering the ages in young and mature. These leaves were fractionated in 5 parts (petiole, extrafloral nectary, rachis, petiolule and leaflet), fixed in FAA 50%, dehydrated in increasing alcoholic series and embedding of samples in LEICA® historesin. The slides were stained with toluidine blue for anatomical description. It were made histochemical tests to identify starch, protein granules, lipids, phenolic compounds, lignin, condensed tannins, alkaloids and terpenoids. Petiole morphology was variable within genotypes and leaves studied, with higher total area in both leaves of 7G genotype. Extrafloral nectary and petiolule showed similar morphology in studied genotypes. The rachis was similar in 7G and 50J, in both leaves, whereas 13AU was different. The leaflet showed a single layer of epidermal cells and dorsiventral mesophyll, except in young leaflets of 7G and 50J genotypes, which was characterized as homogeneous. In all fractions measured the area occupied by vascular bundles was higher in 7G genotype when compared to others. Histochemical tests to alkaloids, condensed tannins and terpenoids were negative. It was observed the presence of starch, protein granules, lipids, phenolic compounds and lignin in several tissues studied. Amyliferous sheath was observed around vascular bundle of petiole in all genotypes, characterizing the endoderm as well as in cortical and/or pith parenchyma of other fractions. Protein granules were observed in all genotypes, except in leaflets of 7G, in petiole and extrafloral nectary of mature leaflet of 50J and 13AU. It was verified the presence of lipids constituting the in all fractions evaluated. Phenolic compounds occurred, mostly, in epidermis and/or cortical parenchyma of petiole, extrafloral nectary, rachis and petiolule. It was observed lignin in all the genotypes, except in leaflet of young leave from 7G. This compound was located in sieve elements of xylem and sclerenchyma fibers. There is anatomical characteristics that justify the higher productivity of 7G genotype in comparison to others. The histochemical results shows the acclimation of native plants from Caatinga, considering the many sources of stress in this environment.

Efeito da melatonina sobre a viabilidade e expressão gênica de oócitos suínos e células do cumulus maturados in vitro

A melatonina é um antioxidante muito eficaz e protege as células contra o estresse oxidativo causado pelas espécies reativas, e indiretamente, modula a expressão de genes associados ao ciclo celular, metabolismo oxidativo e apoptose celular. Deste modo, a suplementação da melatonina ao meio de maturação in vitro, a torna uma alternativa para promover melhorias na viabilidade das células germinativas e embrionárias. O estudo 1 avaliou o efeito da adição de melatonina ao meio de maturação por meio da maturação nuclear (progressão meiótica) e citoplasmática (migração de grânulos corticais) e dos níveis de ROS em oócitos suínos maturados in vitro. A suplementação do meio de maturação com melatonina estimulou a progressão da meiose, a migração de grânulos corticais e reduziu os níveis intracelulares de ROS nos oócitos. O estudo 2 avaliou o efeito da melatonina na expressão de genes antioxidantes (Catalase, SOD1, SOD2 e GPX) envolvidos na proteção celular de oócitos e células do cumulus. A adição da melatonina ao meio de maturação influenciou positivamente a expressão dos genes antioxidantes nos oócitos e células do cumulus. O estudo 3 avaliou o efeito da melatonina nos processos biológicos por meio do perfil de trascriptomas, via RNA-Seq, em células do cumulus oriundas de oócitos suínos maturados in vitro. A partir da análise de expressão diferencial foi possível identificar que a adição da melatonina ao meio de maturação influenciou 80 genes associados a nove processos biológicos (ciclo celular; proteólise; organização de citoesqueleto; via energética; adesão e transporte celular; via de sinalização; fator de transcrição; metabolismo oxidativo e apoptose; e componente celular). A suplementação do meio de maturação com melatonina potencialmente influencia a viabilidade e o funcionamento celular, uma vez que modulou a expressão de genes associados à processos fisiológicos essenciais, tais como: divisão celular, metabolismo energético e oxidativo, vias de sinalização e apoptose. O estudo 4, avaliou o efeito da melatonina sobre os genes associados à viabilidade oocitária e o subsequente desenvolvimento embrionário por meio do perfil de trascriptomas, via RNA-Seq, de células do cumulus oriundas de oócitos suínos. A adição da melatonina ao meio de maturação influenciou 59 genes associados a nove funções biológicas (expansão do cumulus, comunicação em COCs, maturação nuclear, maturação citoplasmática, reparo e integridade do DNA, viabilidade oocitária, esteroidogênese, fertilização e embriogênese). Em conclusão, a suplementação do meio de maturação com melatonina influencia positivamente a maturação oócitária, reduz os níveis intracelulares de ROS, aumenta a expressão de genes antioxidantes, em adição, interfere no transcriptoma de um número expressivo de genes associados à aquisição da competência oócitária, da viabilidade embrionária e desenvolvimento subsequente.

Melatonin is a very effective antioxidant and protects cells against oxidative stress caused by reactive species, and indirectly modulates expression of genes associated with cell cycle, oxidative metabolism, and apoptosis. Thus, melatonin supplementation to in vitro maturation media becomes an alternative to improve the viability of germ and embryonic cells. The first study assessed the effects of adding melatonin to the maturation medium on nuclear (meiotic progression) and cytoplasmic (cortical granules migration) maturation and ROS levels in in vitro matured porcine cumulus-oocyte complexes (COCs). Melatonin supplementation stimulated meiosis progression and cortical granules migration, and reduced intracellular ROS levels in oocytes. The second study evaluated the effects of melatonin on the expression of antioxidant genes (Catalase, SOD1, SOD2, and GPX) involved in cellular protection in oocytes and cumulus cells. The addition of melatonin to the maturation medium positivity influence the expression of antioxidant genes in oocytes and cumulus cells. The third study evaluated the effect of melatonin on genes associated with biological processes through transcriptomic profile via RNA-Seq in cumulus cells derived from porcine COCs in vitro matured. Melatonin addition to maturation medium differentially affected expression of 80 genes associated with nine biological processes (cell cycle, proteolysis, cytoskeletal organization, energy pathaway, cell adhesion and transport, signalling pathway, transcription factor, oxidative metabolism and apoptosis, and cell components). The fourth study assessed the effect of melatonin on genes associated with oocyte viability and subsequent embryo development through transcriptomic profile via RNA-Seq in cumulus cells derived from porcine COCs. Melatonin in the maturation medium affected 59 genes associated with nine biological functions related with oocyte viability and embryo development (cumulus expansion, communication between cumulus cells and oocytes, nuclear maturation, cytoplasmic maturation, DNA repair and integrity, oocyte viability, steroidogenesis, fertilization and embryogenesis). In conclusion, supplementation of melatonin to maturation environment influences oocyte nuclear and cytoplasmic maturation, reduces intracellular ROS levels, positivity influence the expression of antioxidant and also interferes in the transcriptome of a significant number of genes associated with oocyte competence acquisition, embryo viability and subsequent development.

Influência do fluido folicular e da proteína recombinante humana GDF9 no meio de maturação sobre a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro

Este estudo objetivou avaliar a influência do fluido folicular (FF) e da proteína recombinante humana GDF9 adicionados ao meio de maturação sobre a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro. Foram realizados três experimentos utilizando o meio TCM199 como meio básico de maturação. No primeiro experimento, os oócitos foram maturados em cinco diferentes meios (0%, 25%, 50%, 75% ou 100% de FF) em quatro tempos de maturação (22, 24, 26 ou 28 h). No segundo experimento, os oócitos foram maturados nos mesmos meios utilizados no primeiro experimento e fecundados em três diferentes tempos (24, 26 ou 28 h). No terceiro experimento, foram utilizados dois meios: controle (sem FF) ou com 25% de FF e quatro níveis de suplementação (0, 25, 100 ou 200 ng/mL) com GDF9. O FF promoveu retardo da progressão meiótica, afetando a maturação nuclear e a migração de grânulos corticais para a periferia dos oócitos. O FF em altas concentrações influenciou negativamente as taxas de clivagem e de blastocisto. O GDF9, com (25%) ou sem FF, não influenciou as taxas de clivagem e de blastocisto, no entanto, interferiu positivamente sobre o percentual de embriões considerados superiores. O percentual mais elevado (82,22%) de embriões classificados como superiores foi obtido com o uso de 200 ng de GDF9 em meio de maturação acrescido de 25% de FF. Em conclusão, a adição do fluido folicular (75% e 100%) ao meio de maturação in vitro retarda a progressão meiótica, sincronizando a maturação nuclear com a citoplasmática e a suplementação do meio de maturação com proteína recombinante humana GDF9 melhora a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro, baseando-se na avaliação da proporção do número de células da massa celular interna (MCI) em relação ao número total de células

This study aimed to evaluate the effects of follicular fluid (FF) and recombinant human GDF9 added to the maturation media on the quality of in vitro produced bovine embryos. Three experiments using TCM199 medium as basic maturation media were performed. In the first experiment oocytes were matured in five different media (0%, 25%, 50%, 75% or 100% of FF) during four maturation times (22, 24, 26 or 28 h). In the second experiment, the oocytes were matured in the same five media used in the first experiment and fertilized at three different times (24, 26 or 28 h). In the third experiment were used two media: control (without FF) or with 25% FF combined with four levels of supplementation (0, 25, 100 or 200ng/mL) with GDF9. The FF promoted delay of the meiotic progression, affecting nuclear maturation and cortical granules migration to the oocyte periphery. In addition FF influenced the cleavage and blastocyst rates. GDF9, without or added to FF did not affect the cleavage and blastocyst rates, however, a positive influence on the percentage of embryos considered superior was observed. The highest percentage (82.22%) of embryos considered superior was obtained with maturation media added with 25% of FF and supplemented with 200 ng of GDF9. In conclusion, addition follicular fluid (75% and 100%) to the in vitro maturation media delays meiotic progression, synchronizing nuclear to cytoplasmic maturation, and supplementation of maturation media with recombinant human GDF9 improves the quality of bovine embryos in vitro produced, based on inner cell mass cells (ICM) proportion, relative to the total cell number

Mistura de proteínas morfogenéticas ósseas, hidroxiapatita, osso inorgânico e colágeno envolta por membrana de pericárdio no preenchimento de defeito ósseo segmentar em coelhos / Mixture of bone morphogenetic protein, hydroxyapatite, inorganic bone and collagen interposed by pericardium barrier membrane in the filling of the segmental bone defect in rabbits

Avaliou-se o uso de biomaterial de origem bovina na regeneração de defeitos ósseos segmentares empregando-se 12 coelhos, fêmeas, da raça Norfolk, com idade de seis meses e pesos entre 3 e 4,5kg. Realizou-se falha segmentar bilateral de um centímetro de comprimento na diáfise do rádio, com inclusão do periósteo. No membro direito, o defeito foi delimitado por membrana de pericárdio liofilizada, contendo em seu interior mistura de proteínas morfogenéticas ósseas adsorvidas a hidroxiapatita, colágeno liofilizado e osso inorgânico. No membro esquerdo, o defeito não recebeu tratamento. Radiografias foram obtidas ao término do procedimento cirúrgico e aos sete, 30, 60, 90, 120 e 150 dias de pós-operatório. Após eutanásia de seis coelhos aos 60 dias e seis aos 150 dias de pós-cirúrgico, os resultados radiográficos e histológicos mostraram que a regeneração óssea foi inibida nos defeitos segmentares tratados com o biomaterial.(AU)

Biomaterials of bovine origin in regenerating segmental bone defects were evaluated. Twelve six-month old Norfolk rabbits, weighting 3 to 4.5kg were used. A 1cm long segmental defect was created in the radial diaphysis, including the periosteum, of both forelimbs. In the right forelimb, the defect was filled using a mixture of bone morphogenic proteins adsorbed to hydroxyapatite, agglutinant of lyophilized collagen in granules and anorganic cortical bone in granules delimited by a pericardial membrane. In the left forelimb, the defect did not receive treatment and served as a control. Radiographies were taken immediately after surgery and at seven, 30, 60, 90, 120 and 150 days post-operatively. Six rabbits were euthanized at 60 days and the other six at 150 days post-surgery for histological evaluation. Radiographic and histological results revealed that bone regeneration was inhibited in the segmental defects receiving biomaterials.(AU)

Bone changes caused by experimental Solanum malacoxylon poisoning in rabbits

The aim of this study was to describe the bone changes observed after a daily oral administration of the calcinogenic plant Solanum malacoxylon (syn. S. glaucophyllum) (Sm) during 9 days. The Sm-poisoned rabbits had an increase of bone resorption in the endosteal surface of the cortical zone and also in the surface covered by osteoblasts of the primary and secondary spongiosa of the trabecular bone compartment. Moreover, the epiphyseal growth plates in long bones appeared narrower than in the control rabbits, with reduction of the proliferative and hyperthrophic chondrocyte zones. The electron microscopic study revealed a significant decrease of proteoglycans in the hyperthrophic chondrocyte zone evidenced by a significant reduction of rutenium red positive granules in the poisoned rabbit. Altogether, these data suggest that cell differentiation may play a pivotal role in the pathogenesis of Sm-induced bone lesions.(AU)

Inibição da maturação nuclear pela butirolactona I durante o transporte de oócitos bovinos destinados à produção in vitro de embrões (PIV)

Butirolactona I (Bl-I) pode ser utilizada em sistemas PIV de embriões para bloquear a meiose durante o transporte de oócitos obtidos de OPU. O objetivo deste estudo foi verificar a concentração de BL-I eficaz durante o transporte de oócito bovinos. Oócitos (n=4581) foram pré-maturados em criotubos contendo meio com 10 ou 100?M de Bl-I, acrescido ou não de HEPES (20mM), no período de 5 horas em estufa portátil Minitub e transferidos para incubadora com atmosfera e temperatura controlada, permanecendo por mais 19 horas. Em seguida foram maturados a 38,5ºC em atmosfera de 5% de CO2 durante 20 horas, fecundados e os zigotos cultivados. Foram avaliadas a maturação nuclear e a maturação citoplasmática após pré-MIV e MIV (24h.-controles e 20h.-tratados). A fertilização foi avaliada após 18 h. da inseminação. Os embriões foram analisados quanto ao seu desenvolvimento e qualidade. Os dados foram avaliados por ANOVA (p

Butirolactone-I (Bl-I), can be used in systems for in vitro production (IVP) of embryos to block meiosis during the transport of oocytes from OPU. The objective of this study is to assess the concentration of BL-I more efficient during the transport of bovine oocytes. Oocytes (n = 4581) were prematured in criotubes containing medium with 10 or 100 ?M of Bl-I with or without HEPES (20mM) in a portable incubator at 38,5°C without CO2 equilibration in the first 5 h, being later transferred to a incubator at 38.5°C and 5% CO2 in humidified air during the 19 hours remaining. Following were matured, fertilized and the zygotes cultured at 38.5°C and 5% CO2. Were evaluated the nuclear maturation and the cytoplasmic maturation after pre-IVM and after IVM (24h. controls and 20 h. treatments). Fertilization was assessed 18 hours after insemination. The embryos development and quality were analyzed. The data were evaluated by ANOVA (P< 0, 05). Most remained in GV oocytes treated and after IVM was the reversal of the blockage, but the efficiency was lower with 10 ?M of Bl-I. The cytoplasmic maturation during the time of meiosis blockage was benefited from the distribution agreement and potential of mitochondria, however, about the distribution of cortical granules only blocking conducted with 100?M Bl-I had a complete maturation. The rate of fertilization was damage by the time of transport, and the meiosis blockage with Bl-I did not improve the percentage of fertilized oocytes. The occurrence of polispermia was correlated with the percentage of oocytes with immature cortical granules. The embryo developmentb was delayed by the use of 100?M of Bl-I, but a good percentage of blastocysts of good quality reached. So, the use of 100?M of Bl-I has beneficial effects on the IPV of embryos from oocytes transported at a long time

Efeito da tensão de oxigênio e do meio na maturação oocitária in vitro e sua influência no desenvolvimento embrionário em suínos / Effect of oxygen tension and media on in vitro oocyte maturation and its influence in the porcine embryonic development

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência da baixa tensão de oxigênio (5% de CO2; 5% de O2 e 90% de N2) na maturação oocitária in vitro em meio quimicamente definido (0,1% de PVA) ou suplementado com 10 % de PFF. Foram avaliados a migração dos grânulos corticais, a quantificação e distribuição da proteína HSP70, a maturação nuclear, as concentrações intracelulares da glutationa reduzida, a avaliação dos índices de penetração espermática e o desenvolvimento e qualidade de embriões fecundados in vitro em oócitos antes da maturação (0 hora) e após a maturação in vitro nos diferentes tratamentos (atmosfera = 5 ou 20% de O2 e suplementação do meio de maturação = 0,1% de PVA ou 10% de PFF). Para verificar a influência da atmosfera e da suplementação do meio no sistema de maturação foram avaliados o ciclo celular das células do cumulus, o número de células do cumulus por oócitos, as concentrações intracelulares de glutationa reduzida (GSH) das células do cumulus, as concentrações de TBARS no meio de maturação e a resistência das células do cumulus ao estresse oxidativo. Avaliações quanto às concentrações de GSH e HSP70 foram realizadas em oócitos in vivo, visando comparar a eficiência do sistema in vitro. Para a maioria dos parâmetros avaliados não houve interação entre a atmosfera e a suplementação do meio de maturação, indicando que o efeito da atmosfera independe do meio utilizado. Foi observado que em atmosfera com baixa tensão de O2 houve diminuição da concentração de glutationa nas células do cumulus, do índice de clivagem e do número total de blastômeros dos embriões e houve aumento do número de células por oócito após o período de maturação in vitro. A suplementação do meio de maturação com 0,1% de PVA diminuiu os índices de migração dos grânulos corticais, contudo não alterou os índices de penetração espermática. Os oócitos do grupo 0 hora apresentaram índices maiores de HSP70 do que cada um dos demais grupos, indicando provável diminuição dos estoques de HSP70 durante o período de maturação em todos os grupos de maturação in vitro. As células do cumulus provenientes de oócitos maturados em meio suplementado com 0,1% de PVA apresentaram maior número de células na fase S e G2/M do que o grupo 0 hora, entretanto isso não refletiu em aumento no número de células por oócito após a maturação. Este trabalho permite concluir que o uso de baixa tensão de oxigênio não melhora as condições do sistema de maturação oocitária in vitro em suínos, sendo que o efeito do uso desta atmosfera é, na maioria das variáveis avaliadas, independente do tipo de suplementação que se utiliza no meio de maturação in vitro

The aim of this study was to evaluate the efficiency of low oxygen tension (5% CO2, 5% O2 and 90% N2) on in vitro oocyte maturation using defined media (0.1% PVA) or supplemented with 10% PFF. To achieve this goal, oocytes were evaluated prior to in vitro maturation (0 hour) and after in vitro maturation on different treatments (atmosphere = 5 or 20% O2 and media supplementation = 0.1% PVA or 10% PFF) for cortical granules migration, quantification and distribution of HSP70 protein, nuclear maturation, intracellular concentrations of reduced glutathione, evaluation of sperm penetration and development and quality of in vitro-produced embryos. Furthermore, to evaluate the effects on maturation system, several factors were analyzed, such as: the cell cycle phase of cumulus cells, the number of cumulus cells per oocyte, the intracellular concentrations of reduced glutathione in cumulus cells, the concentrations of TBARS in maturation media and the resistance of cumulus cells to the oxidative stress. Some of these evaluations were performed on in vivo oocytes, aiming to analyze oocyte competence after in vitro maturation. Concerning the majority of the parameters analyzed, there were no interaction between atmosphere and the supplementation of maturation media, indicating that the effect of atmosphere is independent of the media used. It was possible to observe that low tension atmosphere of O2 decreased glutathione concentrations in cumulus cells, cleavage rate and total number of embryo blastomeres and increased the number of cells per oocyte after the period of in vitro maturation. The maturation media supplementation with 0.1% PVA decreased the migration of cortical granules; however this fact did not have effect on in vitro sperm penetration levels. The 0 hour oocytes showed higher levels of HSP70 than each one of the in vitro maturated groups, indicating decrease of this protein stock during the maturation period in all of the in vitro maturated groups. The cumulus cells originated from maturated oocytes in supplemented media with 0.1% PVA showed higher number of cells in S and G2/M phase than 0 hour group; however this fact did not reflect in increased cell numbers per oocyte after maturation. Therefore, the use of low oxygen tension does not improve the conditions of the in vitro porcine oocyte maturation system and their effect in most of the factors analyzed is not dependent on the supplementation of maturation media