Criopreservação e cultivo de tecido testicular em mamíferos - estado da arte, desafios e perspectivas / Cryopreservation and culture of testicular tissue in mammals - state of the art, challenges and perspectives

O tecido testicular contém células germinativas, que possuem potencial para se desenvolver em espermatozoides viáveis por meio do cultivo in vitro ou xenotransplante, sendo uma alternativa interessante a ser utilizada na formação de biobancos. Esta revisão compila as atualizações, desafios e perspectivas relacionadas às técnicas de criopreservação e cultivo de tecido testicular como estratégia para a conservação de espécies mamíferas. O tecido testicular pode ser obtido tanto de indivíduos adultos como pré púberes, seja após orquiectomia ou até mesmo após a sua morte. O tecido fragmentado pode ser criopreservado por congelação lenta ou rápida e por métodos de vitrificação. Os crioprotetores são indispensáveis durante a criopreservação e podem variar o tipo e concentração de acordo com a espécie. Com os avanços da criopreservação deste material, espermatozoides podem ser obtidos por transplante de fragmentos testiculares ou células germinativas isoladas em camundongos imunodeficientes. No entanto, a obtenção de espermatozoides no cultivo in vitro ainda é um desafio.(AU)

The testicular tissue contains germ cells, which have the potential to develop into viable spermatozoa through in vitro culture or xenotransplantation, being an interesting alternative to be used in the formation of biobanks. This review compiles updates, challenges and perspectives related to cryopreservation techniques and testicular tissue culture as a strategy for the conservation of mammalian species. Testicular tissue can be obtained from both adult and pre-pubertal individuals, either after orchiectomy or even after their death. Fragmented tissue can be cryopreserved by slow or fast freezing and by vitrification methods. Cryoprotectants are indispensable during cryopreservation and may vary in type and concentration according to the species. With advances in cryopreservation of this material, spermatozoa can be obtained by transplanting testicular fragments or isolated germ cells into immunodeficient mice. However, obtaining spermatozoa in in vitro culture is still a challenge.(AU)

Viability of in vitro produced embryos of gyr cattle (Bos indicus) after cryopreservation by vitrification under field conditions / Viabilidade de embriões gir (Bos indicus) produzidos in vitro após criopreservação em condições de campo pela vitrificação

The aim of this study was to evaluate the pregnancy rate of in vitro produced embryos of Gyr cattle (Bos indicus) after cryopreservation by the vitrification method under field conditions. Blastocysts in different developmental stages were transferred to recipient cows either fresh (n = 140) or warmed after vitrification (n = 138). The pregnancy rates obtained for fresh embryos were 46.15% (initial blastocyst), 46.93% (blastocyst) and 50.0% (expanded blastocyst) at 35 days post-fertilization, and 43.58% (initial blastocyst), 46.93% (blastocyst) and 50.0% (expanded blastocyst) at 60 days. The pregnancy rates after embryo vitrification were 35.0% (initial blastocyst), 42.30% (blastocyst) and 43.47% (expanded blastocyst) at 35 days post-fertilization, and 32.50% (initial blastocyst), 38.46% (blastocyst) and 43.47% (expanded blastocyst) at 60 days. Embryo vitrification or blastocyst developmental stage did not affect pregnancy rates or incidence of embryonic death. In conclusion, vitrification of Gyr (Bos indicus) embryos under field conditions is an efficient method that can be implemented to use surplus in vitro produced embryos without affecting pregnancy rates...

Objetivou-se com o trabalho avaliar a taxa de prenhez a partir de embriões de bovinos da raça Gir (Bos indicus) produzidos in vitro após criopreservação em condições de campo pelo método de vitrificação. Blastocistos em diferentes estádios de desenvolvimento foram transferidos a fresco (n = 140) ou aquecidos após a vitrificação (n = 138). As taxas de prenhez de embriões frescos foram 46,15% (blastocisto inicial), 46,93% (blastocisto) e 50,00% (blastocisto expandido) aos 35 dias e 43,58% (blastocisto inicial), 46,93% (blastocisto) e 50,00% (blastocisto expandido) aos 60 dias pós-fertilização, respectivamente. As taxas de prenhez após a vitrificação foram 35,00% (blastocisto inicial), 42,30% (blastocisto) e 43,47% (blastocisto expandido) aos 35 dias e 32,50% (blastocisto inicial), 38,46% (blastocisto) e 43,47% (blastocisto expandido) aos 60 dias pós-fertilização, respectivamente. A vitrificação do embrião ou estádio do desenvolvimento não afetaram as taxas de prenhez ou incidência de morte embrionária. Em conclusão, a vitrificação de embriões de bovinos da raça Gir (Bos indicus) sob condições de campo é um método eficiente que pode ser implementado para aproveitar os embriões produzidos in vitro excedentes sem afetar a taxa de prenhez...

Viability of in vitro produced embryos of gyr cattle (Bos indicus) after cryopreservation by vitrification under field conditions / Viabilidade de embriões gir (Bos indicus) produzidos in vitro após criopreservação em condições de campo pela vitrificação

The aim of this study was to evaluate the pregnancy rate of in vitro produced embryos of Gyr cattle (Bos indicus) after cryopreservation by the vitrification method under field conditions. Blastocysts in different developmental stages were transferred to recipient cows either fresh (n = 140) or warmed after vitrification (n = 138). The pregnancy rates obtained for fresh embryos were 46.15% (initial blastocyst), 46.93% (blastocyst) and 50.0% (expanded blastocyst) at 35 days post-fertilization, and 43.58% (initial blastocyst), 46.93% (blastocyst) and 50.0% (expanded blastocyst) at 60 days. The pregnancy rates after embryo vitrification were 35.0% (initial blastocyst), 42.30% (blastocyst) and 43.47% (expanded blastocyst) at 35 days post-fertilization, and 32.50% (initial blastocyst), 38.46% (blastocyst) and 43.47% (expanded blastocyst) at 60 days. Embryo vitrification or blastocyst developmental stage did not affect pregnancy rates or incidence of embryonic death. In conclusion, vitrification of Gyr (Bos indicus) embryos under field conditions is an efficient method that can be implemented to use surplus in vitro produced embryos without affecting pregnancy rates...(AU)

Objetivou-se com o trabalho avaliar a taxa de prenhez a partir de embriões de bovinos da raça Gir (Bos indicus) produzidos in vitro após criopreservação em condições de campo pelo método de vitrificação. Blastocistos em diferentes estádios de desenvolvimento foram transferidos a fresco (n = 140) ou aquecidos após a vitrificação (n = 138). As taxas de prenhez de embriões frescos foram 46,15% (blastocisto inicial), 46,93% (blastocisto) e 50,00% (blastocisto expandido) aos 35 dias e 43,58% (blastocisto inicial), 46,93% (blastocisto) e 50,00% (blastocisto expandido) aos 60 dias pós-fertilização, respectivamente. As taxas de prenhez após a vitrificação foram 35,00% (blastocisto inicial), 42,30% (blastocisto) e 43,47% (blastocisto expandido) aos 35 dias e 32,50% (blastocisto inicial), 38,46% (blastocisto) e 43,47% (blastocisto expandido) aos 60 dias pós-fertilização, respectivamente. A vitrificação do embrião ou estádio do desenvolvimento não afetaram as taxas de prenhez ou incidência de morte embrionária. Em conclusão, a vitrificação de embriões de bovinos da raça Gir (Bos indicus) sob condições de campo é um método eficiente que pode ser implementado para aproveitar os embriões produzidos in vitro excedentes sem afetar a taxa de prenhez...(AU)

Criopreservação de tecido testicular / Criopreservation of testicular tissue

O uso da criobiologia tem sido importante ferramenta para a preservação dos gametas. Atualmente, um dos desafios da área consiste na preservação do tecido ovariano e testicular por tempo prolongado e a criobiologia tem se mostrado como parte inerente no processo. Embora existam relatos sobre a criopreservação de tecido ovariano e obtenção de nascimentos em diferentes espécies, a criopreservação de tecido testicular ainda encontra-se limitada ao nível da experimentação. O desafio é promover um protocolo de criopreservação capaz de manter o potencial do tecido de completar a espermatogênese. A criopreservação de tecido testicular pode vir a ser um método utilizado quando técnicas como a congelação do ejaculado não é possível.(AU)

The use of cryobiology has been extremely important for gametes preservation. Nowadays, the challenge is the study of long-term preservation of ovarian and testicular tissue and the use of cryobiology is an important tool in this process. Although ovarian cryopreservation has successfully produced live births in different species, cryopreservation of testicular tissue is still restricted to a limited experimental level. The challenge is to provide a successful cryopreservation protocol for testis tissue capable of maintaining the potential of the tissue for completion spermatogenesis. Cryopreservation of testicular tissues theoretically offers a practical method when other techniques such as cryopreservation of ejaculated sperm are not available or applicable.(AU)

Criopreservação de tecido testicular / Criopreservation of testicular tissue

O uso da criobiologia tem sido importante ferramenta para a preservação dos gametas. Atualmente, um dos desafios da área consiste na preservação do tecido ovariano e testicular por tempo prolongado e a criobiologia tem se mostrado como parte inerente no processo. Embora existam relatos sobre a criopreservação de tecido ovariano e obtenção de nascimentos em diferentes espécies, a criopreservação de tecido testicular ainda encontra-se limitada ao nível da experimentação. O desafio é promover um protocolo de criopreservação capaz de manter o potencial do tecido de completar a espermatogênese. A criopreservação de tecido testicular pode vir a ser um método utilizado quando técnicas como a congelação do ejaculado não é possível.

The use of cryobiology has been extremely important for gametes preservation. Nowadays, the challenge is the study of long-term preservation of ovarian and testicular tissue and the use of cryobiology is an important tool in this process. Although ovarian cryopreservation has successfully produced live births in different species, cryopreservation of testicular tissue is still restricted to a limited experimental level. The challenge is to provide a successful cryopreservation protocol for testis tissue capable of maintaining the potential of the tissue for completion spermatogenesis. Cryopreservation of testicular tissues theoretically offers a practical method when other techniques such as cryopreservation of ejaculated sperm are not available or applicable.

O POTENCIAL CRIOPROTETOR DO ALGINATO DE SÓDIO NA CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO

A criopreservação de gametas é uma das ferramentas mais promissoras para a preservação de material genético, útil tanto na conservação de espécies ameaçadas de extinção quanto de interesse econômico e agropecuário. Embora a criopreservação de sêmen de peixes já esteja consolidada, são restritos os relativos sucessos na criopreservação de gametas femininos de peixes. Muitos são os problemas acarretados pela não perda de material genético materno tais como, redução na variabilidade genética, perda do material genético mitocondrial e RNAs mensageiros indispensáveis para o desenvolvimento inicial do embrião. Há muitas décadas, pesquisadores tentam encontrar o equilíbrio necessário entre as substâncias utilizadas como crioprotetores e a técnica adequada de resfriamento e aquecimento. No entanto, mesmo com as diversas variações experimentadas, os problemas ainda parecem ser os mesmos: injúrias celulares causadas pela variação de temperatura, estresse osmótico e o alto grau de citotoxicidade dos crioprotetores, além de problemas reportados mais recentemente como a mutagênese, fragmentação de DNA e cromossomos. Alguns criobiologistas e cientistas de áreas afins pesquisam novas alternativas e diferentes conceitos e etapas da criopreservação que vão desde a intensificação das curvas de resfriamento e aquecimento, quanto a busca por novas soluções crioprotetoras que de fato protejam as células. Nesse contexto, o objetivo desse estudo foi avaliar a capacidade crioprotetora do Alginato de Sódio. Trata-se de um polissacarídeo natural extraído de algas marrons, e foi escolhido com agente crioprotetor não permeável por possuir a capacidade de absorver e reter líquidos além de ser uma substância atóxica. Pela primeira vez utilizado na criopreservação de tecido ovariano de peixes, utilizamos o zebrafish como modelo animal. Além disso, avaliamos o potencial comportamento crioprotetor do Alginato de Sódio tanto isoladamente como crioprotetor, quanto em combinações com outros agentes crioprotetores convencionas como o Tese de Doutorado em Zootecnia Produção animal, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil. (89p.) Dezembro, 2020. C2H6OS (DMSO), propilenoglicol, metanol e sacarose. E os resultados obtidos com a utilização do Alginato de Sódio foram surpreendentes, dado que houve resultados positivos para a criopreservação de folículos em estágios I e II, além de ocorrências, mesmo que isoladas, de oócitos em elevado grau de maturação, sem alterações morfológicas. Embora haja a necessidade de estudos massivos acerca dessa biomolécula na criobiologia, o conteúdo deste estudo sugere que o uso do Alginato de Sódio pode ser uma escolha saudável de agente crioprotetor não permeável, além de torná-lo objeto de pesquisa na área.

Gamete cryopreservation is one of the most promising tools for preserving genetic material, useful both for the conservation of endangered species and for economic and agricultural interest. Although the cryopreservation of fish semen is already consolidated, relative successes in the cryopreservation of female fish gametes are restricted. There are many problems caused by the non-loss of maternal genetic material such as, reduction in genetic variability, loss of mitochondrial genetic material and mRNAs indispensable for the initial development of the embryo. For many decades, researchers have tried to find the necessary balance between the substances used as cryoprotectants and the appropriate cooling and heating technique. However, even with several variations experienced, the problems still seem to be the same, cell injuries caused by temperature variation, osmotic stress and the high level of cryoprotectants cytotoxicity, in addition to other problems that new studies discover with each new result, such as example mutagen, fragmentation of DNA and chromosomes. Some cryobiologists and scientists from related fields are researching new alternatives and different concepts and stages of cryopreservation process, ranging from intensifying the cooling and heating curves, to the search for new cryoprotective solutions that actually protect cells. In this context, the aim of this study was to evaluate the cryoprotective capacity of sodium alginate. Because it is one natural polysaccharide extracted from brown algae, and was chosen as a non-permeable cryoprotective agent because it has the ability to absorb and retain liquids in addition to being a non-toxic substance. For the first time used in the cryopreservation in fish ovarian tissue, we used zebrafish as an animal model. In addition, we evaluated the potential cryoprotective behavior of sodium alginate both alone and with cryoprotectant, and in combinations with other conventional cryoprotectants such as C2H6OS (DMSO), propylene glycol, methanol and sucrose. And the results obtained with the use of sodium alginate were surprising, given that there were positive results for the cryopreservation of follicles in stages I and II, in Doctoral thesis in Animal Science, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. (89 p.) Dezember, 2020. addition to occurrences even if isolated from oocytes in a high degree of maturation, without morphological changes. Although there is a need for massive studies about this biomolecule in cryobiology, the content of this study suggests that the use of sodium alginate may be a healthy choice of non-permeable cryoprotective agent, in addition to making it an object of research in this area.

Cryopreservation of Prochilodus lineatus semen: effect of cryoprotectants combination / Criopreservação do sêmen do Prochilodus lineatus: efeito da combinação de crioprotetores

The study was conducted with the objective of comparing the toxicity and the effect of the combination of intra and extracellular cryoprotectants in curimba Prochilodus lineatus sperm cells subjected to cryopreservation. Semen from 19 males were analyzed and diluted in four solutions comprise of intra and extracellular cryoprotectants in the following combinations: methanol+lactose, methanol+egg yolk, DMSO+lactose and DMSO+egg yolk. A portion of the diluted semen was frozen while the remaining fraction was kept in repose and evaluated after 10 min. For freezing, the diluted samples were packaged in 0.50 mL straws and placed into liquid nitrogen vapor for 24 h and, after this time, submerged into liquid nitrogen for 10 days. The combination of DMSO+lactose was less toxic to the diluted semen, resulting in higher motility rates and durations when compared to the other treatments. After thawing, the highest motility rate and duration were obtained using lactose as extracellular cryoprotectant, regardless of its combination. There was no significant difference between treatments when analyzing sperm morphology after thawing. Considering the effects of the tested treatments, the use of lactose as an extracellularcryoprotectant added with DMSO or methanol is the most suitable, since these combinations presented the highest motility rates and durations and low morphological change rate after thawing.(AU)

O estudo foi realizado com o objetivo de comparar a toxicidade e o efeito da combinação de crioprotetoresintra e extracelulares em espermatozóides de curimba Prochilodus lineatus submetidos à criopreservação. O sêmen de 19 machos foi analisado e diluído em quatro soluções com crioprotetores intra e extracelulares nas seguintes combinações: metanol+lactose, metanol+gema de ovo, DMSO+lactose e DMSO+gema de ovo. Uma porção do sêmen diluído foi congelada enquanto que a fração remanescente foi mantida em repouso e avaliada após 10 min. Para o congelamento, as amostras diluídas foram envasadas em palhetas de 0,50 mL e colocadas em vapor de nitrogênio líquido durante 24 h e, após este tempo, submersas em nitrogênio líquido durante 10 dias. A combinação de DMSO+lactose se mostrou menos tóxica para o sêmen diluído, resultando em taxas mais elevadas de motilidade e duração espermática quando comparadas com os outros tratamentos. Após descongelamento, as maiores taxas de motilidade e duração foram obtidas usando lactose como crioprotector extracelular, independentemente da sua combinação. Não houve diferença significativa entre os tratamentos ao analisar a morfologia espermática após a descongemento. Considerando-se os efeitos dos tratamentos utilizados, o uso de lactose como crioprotector extracelular, adicionada ao DMSO ou metanol, é o mais adequado, uma vez que estascombinações apresentaram maiores taxas de motilidade e duração espermática, e baixa taxa de alteração morfológica após o descongelamento.(AU)

Cryopreservation of Prochilodus lineatus semen: effect of cryoprotectants combination / Criopreservação do sêmen do Prochilodus lineatus: efeito da combinação de crioprotetores

The study was conducted with the objective of comparing the toxicity and the effect of the combination of intra and extracellular cryoprotectants in curimba Prochilodus lineatus sperm cells subjected to cryopreservation. Semen from 19 males were analyzed and diluted in four solutions comprise of intra and extracellular cryoprotectants in the following combinations: methanol+lactose, methanol+egg yolk, DMSO+lactose and DMSO+egg yolk. A portion of the diluted semen was frozen while the remaining fraction was kept in repose and evaluated after 10 min. For freezing, the diluted samples were packaged in 0.50 mL straws and placed into liquid nitrogen vapor for 24 h and, after this time, submerged into liquid nitrogen for 10 days. The combination of DMSO+lactose was less toxic to the diluted semen, resulting in higher motility rates and durations when compared to the other treatments. After thawing, the highest motility rate and duration were obtained using lactose as extracellular cryoprotectant, regardless of its combination. There was no significant difference between treatments when analyzing sperm morphology after thawing. Considering the effects of the tested treatments, the use of lactose as an extracellularcryoprotectant added with DMSO or methanol is the most suitable, since these combinations presented the highest motility rates and durations and low morphological change rate after thawing.

O estudo foi realizado com o objetivo de comparar a toxicidade e o efeito da combinação de crioprotetoresintra e extracelulares em espermatozóides de curimba Prochilodus lineatus submetidos à criopreservação. O sêmen de 19 machos foi analisado e diluído em quatro soluções com crioprotetores intra e extracelulares nas seguintes combinações: metanol+lactose, metanol+gema de ovo, DMSO+lactose e DMSO+gema de ovo. Uma porção do sêmen diluído foi congelada enquanto que a fração remanescente foi mantida em repouso e avaliada após 10 min. Para o congelamento, as amostras diluídas foram envasadas em palhetas de 0,50 mL e colocadas em vapor de nitrogênio líquido durante 24 h e, após este tempo, submersas em nitrogênio líquido durante 10 dias. A combinação de DMSO+lactose se mostrou menos tóxica para o sêmen diluído, resultando em taxas mais elevadas de motilidade e duração espermática quando comparadas com os outros tratamentos. Após descongelamento, as maiores taxas de motilidade e duração foram obtidas usando lactose como crioprotector extracelular, independentemente da sua combinação. Não houve diferença significativa entre os tratamentos ao analisar a morfologia espermática após a descongemento. Considerando-se os efeitos dos tratamentos utilizados, o uso de lactose como crioprotector extracelular, adicionada ao DMSO ou metanol, é o mais adequado, uma vez que estascombinações apresentaram maiores taxas de motilidade e duração espermática, e baixa taxa de alteração morfológica após o descongelamento.

Princípios básicos da criomicrobiologia: enfoque nos tipos de micro-organismos e nos principais agentes crioprotetores / Basic principles of criomicrobiologia: focus in kind of microorganisms and principals cryoprotectants agents

O reconhecimento da grande relevância da biodiversidade microbiana para o desenvolvimento humano tem conduzido ao aprimoramento de técnicas destinadas à conservação dos mais diversos espécimes microbiológicos. Contudo, ainda não existe uma fórmula singular, ideal ou universal que possibilite a eficiência da estocagem e preservação microbiana a longo prazo. Consequentemente, diversos micro-organismos para os quais há uma crescente demanda, ainda esperam pelo desenvolvimento de metodologias adequadas à sua conservação, fazendo da criobiologia um campo de vasto potencial para o desenvolvimento de pesquisas. Nesse contexto, a proposta dessa revisão é discutir os princípios básicos da criomicrobiologia, com enfoque na preservação dos variados tipos de micro-organismos e nos principais agentes crioprotetores, tomando como base estudos disponíveis na literatura científica.

The recognizing the great importance of microbial biodiversity for human development has led to the improvement of techniques for the conservation of diverse microbiological specimens. However, there isn't a singular, ideal or universal method to provice the efficiency of the long-term microorganisms stock and preservation. Many microorganisms for which there is a growing demand still wait for the development of satisfactory methodologies to their conservation, making the cryobiology a field of vast potential for the development of researches. Then, the proposal of this review is to discuss the basic principles of cryomicrobiology, focusing the preservation of kinds microorganisms and principals agents cryoprotectants, using the available studies in the comtemporary scientific literature as base.

Isolamento de células derivadas da pele de macacos Sapajus apella (Linnaeus, 1758) e de bovinos para fins de aplicação em biotécnicas da reprodução

Células-tronco presentes nos compartimentos da pele são indispensáveis para a manutenção da homeostase, regeneração, reparação tecidual e reconstrução da integridade e funcionalidade após lesões. Em 2001 um protocolo de isolamento de precursores neurais foi adaptado para o isolamento de células-tronco da pele, referidas como precursores derivados da pele (SKPs), as quais foram diferenciadas, posteriormente, em células da linhagem germinativa, abrindo, assim, uma via de exploração para aplicações em biotecnologias da reprodução. Outro relevante aspecto sobre a pele, são as metodologias desenvolvidas para sua conservação e manutenção por longos períodos, o que permite a estocagem de suprimento biológico para inúmeras pesquisas, inclusive em biologia da conservação e criobiologia. Nesse contexto, considerando-se a necessidade de novas técnicas que contribuam para a preservação de espécies de primatas neotropicais e ungulados silvestres, este trabalho teve como objetivo o isolamento de células derivadas da pele de macacos Sapajus apella e de bovinos, buscando-se, em acréscimo, o estabelecimento de um protocolo de criopreservação das amostras, para posterior utilização em biotécnicas da reprodução. Inicialmente, implementou-se um protocolo otimizado de isolamento enzimático de precursores derivados da pele, com o qual foi possível obter SKPs de fetos bovinos, as quais foram positivas para a atividade da enzima fosfatase alcalina, marcadora de pluripotência. Em Sapajus apella foi possível isolar e cultivar células por essa metodologia até a formação de aglomerados. Em seguida, células resistentes a estresse conhecidas como células Muse, foram isoladas de fibroblastos de macaco Sapajus apella e de bovino adulto e em idade fetal. As células resistentes a estresse formaram aglomerados semelhantes a SKPs em amostras dos três animais, indicando a técnica como um método com potencial para a obtenção de esferas multipotentes. Por fim, estabeleceu-se um protocolo para vitrificação de biópsias de pele de macacos Sapajus apella, o qual foi efetivo para manter a integridade de até 88% das células epidermais, preservar boa densidade de fibroblastos e viabilizar a obtenção de células através do cultivo primário por explante. O protocolo de vitrificação proposto nesse estudo, associado às técnicas de isolamento de células derivadas da pele executadas, constituem em valiosa metodologia para a formação de bancos de germoplasma que viabilizem a realização de biotécnicas da reprodução como a clonagem e a geração de gametas in vitro e contribuam para a preservação de espécies silvestres em risco de extinção.

Stem cells present in the skin compartments are indispensable for the maintenance of homeostasis, regeneration, tissue integrity repair and functionality recovering after injury. In 2001 a protocol for the isolation of neural precursors was adapted for the isolation of skin stem cells, referred as "skin derived precursors" (SKPs), which were able to differentiate into germline cells, thus opening up a line of research in the field of reproduction biotechnology.Another relevant aspect about the skin are the methodologies developed for its conservation and maintenance for long periods, which allows the storage of biological supplies for numerous researches, including conservation biology and cryobiology. In this context, considering the need for new techniques that contribute to the preservation of neotropical primates and wild ungulates species, this work aimed to isolate skin derived cells of Sapajus apella monkeys and bovines. In addition, it was stablished a cryopreservation protocol for the skin samples. Initially, an optimized protocol of enzymatic isolation of skin derived precursors was implemented. It was possible to obtain alkaline phosphatase positive SKPs from bovine fetuses and to isolate and cultures cells from Sapajus apella until cluster formation. Next, stress-tolerant cells also known as Muse cells, were isolated from fibroblastsof Sapajus apella, adult bovine and bovine fetus. The stress-tolerant cells isolated from all three animals generated SKP-like spheres, indicating the technique as a potential method for multipotent spheres obtention. Finally, a protocol for Sapajus apella skin biopsies vitrification was established, which was effective to maintain the integrity of up to 88% of epidermal cells, preserve good fibroblast density and to be established a primary culture of skin explants.The vitrification protocol proposed in this study, associated with the techniques of skin derived cells isolation, constitute a valuable methodology for the formation of germplasm banks that enable the performance of reproductive biotechniques such as cloning and in vitro gametes generation and contribute to the preservation of endangered or threatened wild species.

Papel de agentes antioxidantes na criopreservação de células germinativas e embriões / Role of Antioxidants Agents in Germ Cells and Embryos Cryopreservation

Background: Antioxidants are molecules or substances able to convert the reactive oxygen species (ROS) in water, preventing its overproduction. In an attempt to reduce or eliminate oxidative stress during cryopreservation, antioxidants, especially catalase and trolox®, have been added to the freezing medium to maximize cell survival after the process of freezing / thawing. These substances have been used mainly in the cryopreservation of semen, embryos and oocytes. Given the importance of adding these agents in cryopreservation of mammal germ cells, this review aims to describe issues related to the addition of catalase and trolox® for maintaining the viability of these cells in the cryopreservation process. Review: Numerous protocols for germ cells cryopreservation have achieved satisfactory results in different species, although some points of these protocols still require adjustments in order to succeed in the repeatability of results. Cryopreservation can affect negativelly cell and / or tissues viability by several factors, including the formation of intracellular ice crystals, solution effect and toxicity caused by the inappropriate use of cryoprotective agents. Currently, several studies have emphasized the damage caused by the formation of ROS during cryopreservation processes, leading to oxidative stress. ROS formed during the cryopreservation process can degrade essential molecules to cells, including the polyunsaturated lipids present in the cell membrane (lipid peroxidation), leading them to death. In order to prevent oxidative stress that occurs during cryopreservation, some researchers have tested the addition of antioxidants to the freezing medium in order to achieve higher rates of cell survival after the thawing process. Antioxidants are substances that can neutralize ROS, thus reducing its power of chemical reaction.[...]

Papel de agentes antioxidantes na criopreservação de células germinativas e embriões / Role of Antioxidants Agents in Germ Cells and Embryos Cryopreservation

Background: Antioxidants are molecules or substances able to convert the reactive oxygen species (ROS) in water, preventing its overproduction. In an attempt to reduce or eliminate oxidative stress during cryopreservation, antioxidants, especially catalase and trolox®, have been added to the freezing medium to maximize cell survival after the process of freezing / thawing. These substances have been used mainly in the cryopreservation of semen, embryos and oocytes. Given the importance of adding these agents in cryopreservation of mammal germ cells, this review aims to describe issues related to the addition of catalase and trolox® for maintaining the viability of these cells in the cryopreservation process. Review: Numerous protocols for germ cells cryopreservation have achieved satisfactory results in different species, although some points of these protocols still require adjustments in order to succeed in the repeatability of results. Cryopreservation can affect negativelly cell and / or tissues viability by several factors, including the formation of intracellular ice crystals, solution effect and toxicity caused by the inappropriate use of cryoprotective agents. Currently, several studies have emphasized the damage caused by the formation of ROS during cryopreservation processes, leading to oxidative stress. ROS formed during the cryopreservation process can degrade essential molecules to cells, including the polyunsaturated lipids present in the cell membrane (lipid peroxidation), leading them to death. In order to prevent oxidative stress that occurs during cryopreservation, some researchers have tested the addition of antioxidants to the freezing medium in order to achieve higher rates of cell survival after the thawing process. Antioxidants are substances that can neutralize ROS, thus reducing its power of chemical reaction.[...](AU)

CRIOPRESERVAÇÃO A CAMPO DE EMBRIÕES BOVINOS (Bos Indicus) PRODUZIDOS In vitro

Foram conduzidos dois experimentos para avaliar a eficiência da vitrificação, em condições de campo, de embriões Nelore e Gir (Bos Indicus) produzidos in vitro (PIV) através da porcentagem de prenhez. No primeiro estudo, embriões PIV da raça Nelore, em diferentes estádios de blastocisto (n = 264), foram transferidos a fresco (n = 137) e após desvitrificação (n = 127). As taxas de prenhez aos 35 dias com embriões transferidos a fresco foram de 75,0% (Bi), 38,6% (Bl) e 60,9% (Bx), observando-se que a taxa de Bl foi menor do que as demais (P < 0,05). Com os desvitrificados obteve-se 30,9% (Bi), 42,8% (Bl) e 47,6% (Bx), não existindo diferença (P > 0,05) entre os estádios de desenvolvimento. A taxa de prenhez obtida com Bi transferido a fresco foi maior (P < 0,05) do que a observada em embriões desvitrificados. As taxas de prenhez aos 60 dias em embriões transferidos a fresco foram de 37, 5% (Bi), 38,6% (Bl) e 56,0% (Bx), não ocorrendo diferença (P > 0,05) entre os estádios de desenvolvimento. Com os desvitrificados, as taxas de prenhez foram de 30,9% (Bi), 39,6% (Bl) e 42,8% (Bx), não havendo diferença (P > 0,05) entre os estádios . A taxa de prenhez do estádio Bi transferido a fresco (75,0%) foi superior (P < 0,05) aquela obtida com os desvitrificados aos 35 dias de prenhez, bem como daqueles transferidos a fresco (37,5%) e desvitrificados (30,9%) aos 60 dias. No segundo estudo, embriões PIV da raça Gir, em diferentes estádios de blastocisto, foram transferidos a fresco (n = 140) e após desvitrificação (n = 138). As taxas de prenhez a partir de embriões a fresco foram de 46,15% (Bi), 46,93% (Bl) e 50,00% (Bx) aos 35 dias e de 43,58% (Bi), 46,93% (Bl) e 50,00% (Bx) aos 60 dias da transferência e aquelas a partir de embriões desvitrificados foram de 35,00% (Bi), 42,30% (Bl) e 43,47% (Bx) aos 35 dias e de 32,50% (Bi), 38,46% (Bl) e 43,47% (Bx) aos 60 dias da transferência. Os resultados permitem concluir que a vitrificação de embriões Bos Indicus, em condições de campo, é um metodo de criopreservação eficiente e que deve ser adotado na rotina dos programas de reprodução assistida em bovinos por minimizar o descarte de embriões excedentes.

CRIOPRESERVAÇÃO DE OÓCITOS DE Prochilodus lineatus (VALENCIENNES, 1836) (TELEOSTEI, PROCHILODONTIDAE)

A décadas a criobiologia busca a conservação do genoma materno em peixes por meio da conservação de gametas, porém as técnicas disponíveis atualmente esbarram em problemas como a baixa permeabilidade das membranas, o grande volume de vitelo e a sensibilidade dos gametas ao frio. Trabalhos acerca do assunto vem sendo realizados, contudo de forma não sistemática e de forma majoritária com espécies de clima temperado a frio. Devido a carência de informações sobre o tema com peixes neotropicais, objetivou-se neste trabalho desenvolver um protocolo para o congelamento de oócitos de Prochilodus lineatus, para isso, foi avaliado o uso de diferentes soluções salinas (solução de Ringer e Ringer lactato, solução salina balanceada de Hank (HBSS) com e sem cálcio, e solução para ovos de salmonídeos) como meio de manutenção e extensão da viabilidade dos oócitos. Também foi avaliado a toxicidade de três agentes crioprotetores (ACPs) o Dimetilsulfóxido (DMSO), Propilenoglicol (PG), e Metanol (MET), visando (1) a elaboração de protocolos de vitrificação, com exposição de 2,5, 5 e 7,5 min. em molaridades de 6 M, 8 M e 10 M de ACP; e (2) para a construção de protocolos de congelamento lento com incorporação dos ACPs em banhos crescentes avaliado os efeitos tóxicos sobre a fertilização em 0,5 M, 1 M, 2 M e 4 M. Avaliou-se a sensibilidade dos oócitos a baixa temperatura (2,5°C) em quatro tempos de estocagem 30, 60, 90 e 120 minutos. Oócitos foram submetidos ao congelamento lento em vapor de nitrogênio avaliando as injúrias morfológicas geradas pela exposição aos ACPs e ao congelamento. Os resultados obtidos mostraram que somente a HBSS com e sem cálcio foram capazes de manter o estado não ativado dos gametas, porém, as mesmas não proporcionaram a extensão da viabilidade dos oócitos, permitindo a que estes continuassem a sofrer a degradação pelo tempo de estocagem, de forma similar aos oócitos mantidos somente em fluido ovariano. Foi constatado a alta sensibilidade dos oócitos aos ACPs e ao frio. A toxicidade apresentada nas molaridades mais altas dos ACPs (6 M, 8 M e10 M) em todos os tempos de exposição, inviabiliza o congelamento por vitrificação. Foi observado certa toxicidade em molaridades mais baixas (0.5, 1, 2 e 4 M), contudo foi possível obter taxas de viabilidade que permitem a exploração novos protocolos de congelamento lento. Injúrias foram observadas durante a exposição aos ACPs e após o descongelamento dos oócitos, entretanto os mesmos apresentaram capacidade de hidratação de forma aparentemente normal. Hipóteses foram levantadas sobre as etapas em que ocorrem os maiores danos nos oócitos e sugestões foram apresentadas sobre novas avaliações.

The decades cryobiology seeks to conserve the maternal genome in fish through gamete preservation, but the techniques currently available run into problems such as low permeability of the membranes, the large the amount of yolk and the sensitivity of gametes to cold. Work on the subject has been carried out, however unsystematically and majority form with cold temperate species. Due to lack of information on the subject with Neotropical fish, the aim of this work is to develop a protocol for the freezing of Prochilodus lineatus oocytes for this, was evaluated using different salt solutions (Ringer and Ringers lactate solution, Hank's balanced salt solutions (HBSS) with and without calcium, and the solution for salmonid eggs) as a means of maintaining and extending the viability of oocytes. We also assessed the toxicity of three cryoprotectants agents (ACPs) the Dimethyl sulfoxide (DMSO), Propylene glycol (PG), and Methanol (MET), to (1) the development of vitrification protocols with exposure, 2.5, 5.0 and 7.5 min. in molarities the 6 M 8 M 10 M CPA; and (2) for the construction of slow cooling protocols with CPAs with increasing incorporation of the baths evaluated toxic effects on fertility in 0.5 M, 1 M, 2 M and 4 M. It was evaluated the lower the sensitivity of oocytes temperature (2.5 ° C) storage on four 30, 60, 90 and 120 minutes. Oocytes underwent slow cooling in nitrogen steam evaluating the morphological injuries due to exposure to the CPAs and freezing. The results showed that only with HBSS without calcium and were able to maintain the state of gametes not activated, however, they do not provide the extent of viability of oocytes, allowing that they continue to suffer from degradation by storage time, similarly to the oocytes retained only in ovarian fluid. The high sensitivity of oocytes to the CPAs and the cold was found. The toxicity of the higher molarities of CPAs (6 M, 8 M and 10 M) at all exposure times, precludes freezing for vitrification. Some toxicity was observed at lower molarities (0.5 M, 1 M, 2 M and 4 M), but was possible to obtain viability rates used to open new slow freezing protocols. Injuries were observed during exposure to CPAs and after thawing of oocytes, however they showed hydration capacity of apparently normal. Hypotheses have been raised about the steps that occur in the greatest damage in oocytes and suggestions have been made on new reviews.

Expressão gênica das células do cumulus oophorus de bovinos após a vitrificação / Gene expression of bovine cumulus oophorus cells after vitrification

Um dos desafios da criobiologia continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione a manutenção da viabilidade após a criopreservação de oócitos imaturos na espécie bovina. A vitrificação tem sido a metodologia que proporciona resultados de sobrevivência após a criopreservação mais promissores para complexos cumulus-oócito (CCOs) imaturos bovinos. Entretanto, a ação dos crioprotetores sobre as células do cumulus oophorus, no que diz respeito à regulação da expressão de genes importantes nesta fase, ainda é pouco compreendida. O objetivo do trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e proteína de choque térmico HSP70-1 (HSP70-1) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação na solução crioprotetora (SV) composta por 20% de etileno glicol (EG) + 20% dimetil sulfóxido (DMSO) + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram selecionados e distribuídos em 4 grupos experimentais: G1, CCOs não submetidos a maturação in vitro (MIV); G2, CCOs submetidos à MIV; G3, CCOs maturados após a exposição à SV; e G4, CCOs maturados após a vitrificação com a SV. A MIV foi realizada em TCM 199, suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. A extração do RNA das amostras de células do cumulus foi realizada pelo método do fenol-clorofórmio seguido por uma etapa de captação específica do mRNA. Após a utilização da técnica de RT-PCR para a obtenção do cDNA e amplificação dos quatro fragmentos específicos, a análise dos resultados não mostrou diferença significativa entre os grupos para a abundância relativa dos transcritos de link protein (p=0,486), HAS2 (p=0,394), conexina 43 (p=0,116) e HSP70-1 (p=0,248).

A challenge of cryobiology remains in to develop a method that provides adequate results of viability after cryopreservation of immature bovine oocytes. Vitrification has been the methodology that provides most promising survival results after cryopreservation for immature bovine cumulus-oocyte complexes (COCs). However, the action of cryoprotectants on the gene expression regulation of cumulus oophorus cells is still poorly understood. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein, connexin 43 and heat shock protein 70 (HSP70-1) in cumulus oophorus cells of immature bovine oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solution (VS) containing 20% ethylene glycol (EG) + 20% dimethilsulfoxide (DMSO) + 0.5 M sucrose before in vitro maturation (IVM). The immature COCs were sellected, and allocated into four experimental groups: G1, COCs no submitted to IVM; G2, COCs submitted to IVM; G3, COCs exposed to VS and submitted to IVM; and G4, COCs vitrified with VS and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. The RNA extraction from cumulus cells samples was performed by using the phenol-chloroform followed by the specific capture of the mRNA. The mRNAs were transcribed into cDNA using RT-PCR to evaluate patterns of gene expression. The results showed no significant difference between the groups tested for the relative abundance of link protein (p=0.486), HAS2 (p=0.394), connexin 43 (p = 0.116) and HSP70-1 (p = 0.248) transcripts.

Expressão gênica das células do cumulus oophorus de bovinos após a vitrificação / Gene expression of bovine cumulus oophorus cells after vitrification

Um dos desafios da criobiologia continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione a manutenção da viabilidade após a criopreservação de oócitos imaturos na espécie bovina. A vitrificação tem sido a metodologia que proporciona resultados de sobrevivência após a criopreservação mais promissores para complexos cumulus-oócito (CCOs) imaturos bovinos. Entretanto, a ação dos crioprotetores sobre as células do cumulus oophorus, no que diz respeito à regulação da expressão de genes importantes nesta fase, ainda é pouco compreendida. O objetivo do trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e proteína de choque térmico HSP70-1 (HSP70-1) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação na solução crioprotetora (SV) composta por 20% de etileno glicol (EG) + 20% dimetil sulfóxido (DMSO) + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram selecionados e distribuídos em 4 grupos experimentais: G1, CCOs não submetidos a maturação in vitro (MIV); G2, CCOs submetidos à MIV; G3, CCOs maturados após a exposição à SV; e G4, CCOs maturados após a vitrificação com a SV. A MIV foi realizada em TCM 199, suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. A extração do RNA das amostras de células do cumulus foi realizada pelo método do fenol-clorofórmio seguido por uma etapa de captação específica do mRNA. Após a utilização da técnica de RT-PCR para a obtenção do cDNA e amplificação dos quatro fragmentos específicos, a análise dos resultados não mostrou diferença significativa entre os grupos para a abundância relativa dos transcritos de link protein (p=0,486), HAS2 (p=0,394), conexina 43 (p=0,116) e HSP70-1 (p=0,248).(AU)

A challenge of cryobiology remains in to develop a method that provides adequate results of viability after cryopreservation of immature bovine oocytes. Vitrification has been the methodology that provides most promising survival results after cryopreservation for immature bovine cumulus-oocyte complexes (COCs). However, the action of cryoprotectants on the gene expression regulation of cumulus oophorus cells is still poorly understood. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein, connexin 43 and heat shock protein 70 (HSP70-1) in cumulus oophorus cells of immature bovine oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solution (VS) containing 20% ethylene glycol (EG) + 20% dimethilsulfoxide (DMSO) + 0.5 M sucrose before in vitro maturation (IVM). The immature COCs were sellected, and allocated into four experimental groups: G1, COCs no submitted to IVM; G2, COCs submitted to IVM; G3, COCs exposed to VS and submitted to IVM; and G4, COCs vitrified with VS and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. The RNA extraction from cumulus cells samples was performed by using the phenol-chloroform followed by the specific capture of the mRNA. The mRNAs were transcribed into cDNA using RT-PCR to evaluate patterns of gene expression. The results showed no significant difference between the groups tested for the relative abundance of link protein (p=0.486), HAS2 (p=0.394), connexin 43 (p = 0.116) and HSP70-1 (p = 0.248) transcripts.(AU)