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O objetivo do trabalho foi avaliar parâmetros de qualidade seminal in vitro de diferentes garanhões correlacionando com o tempo, com finalidade de se obter uma técnica com maior repetibilidade, e que auxilie no incremento dos resultados no uso de sêmen congelado equino. Foram utilizadas amostras criopreservadas de sêmen de 4 garanhões da raça Quarto de Milha, em 5 repetições, submetidos a TTR nos tempos 0, 30, 60 e 90 minutos. Foram avaliadas a cinética espermática, a integridade de membrana e acrossômica, a morfologia espermática,e realizada comprovação de viabilidade in vivo. A análise dos dados foi realizada pelo StatisticalAnalysis System (SAS), em modelos lineares mistos com parcelas repetidas no tempo, adotando estrutura de covariância autoregressiva. E as médias comparadas pelo teste de Tukey Kramer. As correlações entre as variáveis em estudo foram avaliadas pelo coeficiente de correlação de Spearman. Foi observada uma interação significativa nos parâmetros Reprodutor, Tempo e interação Reprodutor x tempo (p < 0,001) na cinética espermática, indicando individualidade entre garanhões em termos de longevidade espermática. Essa individualidade se repetiu na integridade de membrana, onde apenas um dos garanhões manteve membrana íntegra sem diferença significativa até os 90 minutos pósTTR, enquanto os demais reprodutores obtiveram diferença na integridade de membrana aos 30 e aos 60 minutos, respectivamente. Não houve diferença nas anormalidades espermáticas ou na integridade de acrossoma entre tempos ou reprodutores. Das éguas inseminadas 50% (5/10) apresentaram embrião ou prenhez e todos as amostras seminais apresentaram pelo menos 1 égua prenhe ou produziram embriões. O estudo demonstrou claramente a individualidade dos reprodutores e a necessidade de mais conhecimento das características seminais de longevidade espermática de cada garanhão a fim de se padronizar protocolos de IA levando-se em consideração a individualidade do garanhão para se determinar o momento mais adequado para a inseminação de acordo com o tempo da ovulação, mantendo-se índices de fertilidade favoráveis.(AU)

The aim of this study was to evaluate parameters of seminal quality in vitro of different stallions correlating with time, in order to obtain a technique with greater repeatability, and that helps to increase results in the use of frozen equine semen. Cryopreserved semen samples from 4 Quarter Horses stallions were used, in 5 replicates submitted to TTR at times 0, 30, 60, and 90 minutes. Sperm kinetics, membrane and acrosome integrity, sperm morphology were evaluated, and in vivo viability was demonstrated. Data analysis was performed by the Statistical Analysis System (SAS), in mixed linear models with plots repeated over time, adopting autoregressive covariance structure. And the means compared by the Tukey Kramer test. The correlations between the variables under study were assessed using Spearman's correlation coefficient. A significant interaction was observed also in the parameters Breeder, Time and Breeder x time interaction (p <0.001) in sperm kinetics, indicating individuality between stallions in terms of sperm longevity. This individuality was observed also in the membrane integrity, where only one of the stallions preserved intact membrane without significant difference until 90 minutes after TTR, while the other breeders obtained a difference in membrane integrity at 30 and 60 minutes, respectively. There was no difference in sperm abnormalities (or acrosome integrity) among time or stallions. Of the inseminated mares 50% (5/10) presented embryo or pregnancy and all seminal samples presented at least 1 pregnant mare or produced embryos. The study clearly demonstrated the individuality among breeders and the need for more studies on semen characteristics of sperm longevity in order to standardize AI protocols taking into account the individuality of the stallion to determine the most appropriate time for insemination according to the time of ovulation, in order to maintain favorable fertility rates.(AU)

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The morphological characteristics of the autologous platelet concentrate (APC) of 31 dogs were evaluated after cooling and freezing in 6% DMSO. Blood from the jugular vein of each patient was collected and centrifuged at 191g for six minutes to obtain APC. In the fresh sample, the platelet count, MPV, PDW and cell morphology were evaluated. Four samples of each animal were sent for storage, one refrigerated at 4°C for seven days, another for 30 days and two more stored in a freezer at -80°C in the same time interval, using 6% DMSO as cryoprotectant. The conserved samples were submitted to the same laboratory analysis as the fresh sample. There was a difference between fresh and preserved samples for platelet count, cell concentration, MPV and PDW (P<0.05), except in the 30-day refrigerated group, which showed severe morphological changes. In the frozen group for seven days, no difference was observed in the percentage of activation (P>0.05). The results obtained lead to the conclusion that cryopreservation with 6% DMSO at -80°C for seven days is a favorable option for the maintenance of platelet concentrations and the morphological characteristics of APC in dogs.(AU)

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Objetivou-se com o estudo investigar o efeito de diferentes osmolaridades do diluidor Triscitrato em espermatozóides epididimários de gatos domésticos (Feliscatus) e a congelação com glicerol ou etilenoglicol. Foram realizados dois experimentos, com 10 gatos. No Experimento 1, avaliou-se a manutenção dos parâmetros espermáticos em diluidor tris-citrato com osmolaridades 275, 325, 375, 425, 475 e 525mOsm, nos tempos (T0= 0, T1= 30 e T2= 60 min). No Experimento 2 a congelação foi realizada utilizando as osmolaridades 325 e 375 do glicerol a 4% ou etilenoglicol a 3%, 6%. Dentre as osmolaridades, quanto à motilidade a 325 mOsm não diferiu estatisticamente com o fluido epidídimal (controle) nos três tempos e a 375 mOsm no T0 e T1, e ambas não apresentaram diferenças estatísticas entre si e entre os tempos em todos os parâmetros espermáticos. O uso de 4% de glicerol em diluidor com 375 mOsm foi superior, apresentando motilidade de 25% ± 6, vigor 4, integridade de membrana plasmática de 48% ± 9, sem diferenças estatísticas com o resfriamento e na morfologia não foram encontradas diferenças estatísticas entre as duas osmolaridades. Portanto, o Tris-citrato com 325 e 375 mOsm entre as osmolaridades testadas e pós congelação com 375 mOsm e glicerol 4% manteve os parâmetros espermáticos.

The aim of this study was to investigate the effect of different osmotic potentials of Tris-citrate extender in epididymal spermatozoa of domestic cats (Felis catus), frozen with glycerol or ethyleneglycol. Two experiments were carried out, with ten cats. In the first experiment, the influence of extender with the osmolarityof 275, 325, 375, 425, 475 and 525 mOsm on sperm parameters were evaluated. In the second experiment, slow freezing was performed using glycerol at 4% or ethyleneglycolat 3% and 6% added to extender with 325and 375 mOsm. Among the osmolarities, the motilityat 325 mOsm did not differ statistically with epididymal fluid (control) at all times evaluated and at 375 mOsmat T0 and T1, and both showed no statistical differences between each other and between the times in all sperm parameters. Glycerol 4% added to extender with 475 mOsm was superior, presenting motilityof 25% ± 6, vigor 4, plasma membrane integrity of 48% ± 9, without statistical differences with cooling and in morphology, no statistical differences were found between the two osmolarities. Therefore, 325 and 375 mOsm Triscitrate between the osmolarities tested and after freezing with 375 mOsm and 4%, glycerol maintained the sperm parameters.

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O objetivo do estudo foi avaliar a viabilidade e taxa de proliferação de células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do líquido amniótico (LA) após cultivo in vitro, e o efeito de dois agentes crioprotetores. Foram utilizadas 9 cabras prenhes. As amostras foram colhidas de fetos caprinos por laparotomia, e delas obtidos as (CTMs) e submetidas ao cultivo in vitro. Posteriormente, uma fração das células foi criopreservada em meio DMSO (dimetilsulfóxido) ou glicerol e vitrificadas para posterior avaliação da viabilidade. O meio DMSO promoveu melhores taxas de sobrevida celular preservando as características de pluripotencialidade e de replicação in vitro.

The objective of the study was to evaluate the viability and proliferation rate of mesenchymal stem cells (MTCs) derived from amniotic fluid (LA) after in vitro culture, and the effect of two cryoprotective agents. 9 pregnant goats were used. The samples were collected from goat fetuses by laparotomy, and from them (CTMs) were obtained and cultured in vitro. Subsequently, a fraction of the cells were cryopreserved in DMSO (dimethylsulfoxide) or glycerol medium and vitrified for further evaluation of viability. The DMSO medium promoted better cell survival rates while preserving the characteristics of pluripotency and replication in vitro.

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A gema de ovo é utilizada como agente crioprotetor em diluentes de congelação de sêmen visando à proteção contra o choque térmico, apesar de apresentar uma possibilidade de contaminação microbiológica. Autores buscam no Aloe vera, um meio alternativo para a conservação do sêmen. O objetivo foi avaliar o uso do crioprotetor Aloe vera na criopreservação do sêmen de suíno. Foram utilizados 25 ejaculados, coletados através da técnica da mão enluvada. As amostras foram diluídas no diluente de refrigeração (gema de ovo 10,0%, Aloe vera 10, 20 e 30%) a 17 °C, diluente de congelação (diluente de refrigeração + glicerol 6,0%) 5 °C e armazenados em palhetas. As palhetas foram avaliadas quanto ao vigor, motilidade, funcionalidade da membrana, vitalidade, integridade de acrossoma e na análise de sêmen assistida (CASA). Os dados foram avaliados quanto à normalidade, em seguida analisados utilizando ANOVA e comparações múltiplas, as análises foram realizadas com nível significância de 5,0%, utilizando o programa R3.4.0. Utilizou-se estatística descritiva para dados de vigor, motilidade e CASA. Na avaliação do sêmen descongelado para a funcionalidade da membrana, vitalidade e integridade de acrossoma, os maiores valores foram encontrados para as amostras com a gema de ovo (p0,05). Os dados de vigor, motilidade e CASA, das amostras utilizando o Aloe vera, apresentaram valores de 0,0. Os resultados mostraram que as diferentes concentrações de Aloe vera não exerceram o efeito crioprotetor desejado sobre a célula espermática, sendo assim, entende-se que são necessários maiores estudos sobre a sua ação na conservação de sêmen, bem como uma possível interação com os espermatozoides suínos...

Egg yolk is used as a cryoprotective agent in semen freezing diluents for protection against thermal shock, despite the possibility of microbiological contamination. Authors search for Aloe vera, an alternative medium for the conservation of semen. The objective was to evaluate the use of the cryoprotectant Aloe vera in the cryopreservation of swine semen. We used 25 ejaculates, collected through the gloved hand technique. The samples were diluted in the coolant diluent (10.0% egg yolk, Aloe vera 10, 20 and 30%) at 17 °C, freezing diluent (refrigerant diluent + glycerol 6.0%) at 5 °C and stored in vales. The vanes were evaluated for vigor, motility, membrane functionality, vitality, acrosome integrity and assisted semen analysis (CASA). The data were evaluated for normality, then analyzed using ANOVA and multiple comparisons, the analyzes were performed with a significance level of 5.0%, using the program R3.4.0. Descriptive statistics were used for data on vigor, motility and CASA. In the evaluation of thawed semen for membrane functionality, acrosome integrity and vitality, the highest values were found for the egg yolk samples (p0.05). The data of vigor, motility and CASA, of the samples using Aloe vera presented values of 0.0. The results showed that the different concentrations of Aloe vera did not exert the desired cryoprotective effect on the sperm cell, so it is understood that further studies are needed on its action on semen conservation, as well as a possible interaction with swine spermatozoa. On the other hand, it is believed that additional studies on the cooling curve of the porcine semen are still necessary, aiming at its cryopreservation.

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O objetivo do presente estudo foi testar a dimetilacetamida (DMA) em diferentes concentrações, associada ou não ao glicerol (GL), sobre a viabilidade espermática do sêmen ovino congelado. Foram utilizados 10 ejaculados de dois carneiros adultos da raça Santa Inês. Os ejaculados foram divididos em sete grupos experimentais, respeitando o limite máximo de 5% de DMA, sendo eles: GL6%, DMA3%, GL5%+DMA1%, GL4%+DMA2%, GL3%+DMA3%, GL2%+DMA4%, GL1%+DMA5%. Os espermatozoides criopreservados nos diferentes tratamentos foram analisados quanto à cinética subjetiva, integridade estrutural da membrana plasmática (EOS), integridade funcional da membrana plasmática (CO) e morfologia espermática, observando defeitos totais (DT) e defeitos maiores (DM). A motilidade total (MT) e a progressiva (MP) pós-descongelação nos grupos GL5%+DMA1%; GL4%+DMA2% e GL3%+DMA3%, foram semelhantes (P>0,05) ao tratamento controle (GL6%). Destes, o diluidor GL4%+DMA2% foi o único que promoveu a manutenção da MT e MP pós-descongelação, quando comparado com o sêmen in natura (P>0,05). Não foram observadas diferenças significativas (P>0,05) para os parâmetros de EOS, CO, DT e DM nos diferentes grupos avaliados. A dimetilacetamida associada ao glicerol mostrou-se eficaz na manutenção da viabilidade espermática em ovinos, avaliada pós-descongelação. Entretanto, foi observado efeito deletério da DMA nas concentrações mais elevadas ou quando não esteve associada ao glicerol.

The objective of the present study was to test dimethylacetamide (DMA) at different concentrations, associated or not to glycerol (GL), on the sperm viability of frozen sheep semen. Ten ejaculates of two adult sheep of Santa Ines breed were used. The ejaculates were divided into seven experimental groups, respecting the maximum limit of 5% of DMA: GL6%, DMA3%, GL5%+DMA1%, GL4%+DMA2%, GL3%+DMA3%, GL2%+DMA4%, and GL1%+DMA5%. The sperm cryopreserved in the different treatments was analyzed based on the subjective kinetic, structural integrity of the plasma membrane (EOS), functional integrity of the plasma membrane (OS) and sperm morphology, observing total defects (TD) and major defects (MD). The post-thawed total mortality (TM) and progressive mortality (PM) in the GL5%+DMA1% groups; GL4%+DMA2% and GL3%+DMA3% were similar (P> 0.05) to the control treatment (GL6%). Of these, the diluent GL4%+DMA2% was the only one that promoted the maintenance of post-thawed TM and PM when compared to in natura semen (P> 0.05). No significant differences (P> 0.05) were observed for the EOS, OS, TD and MD parameters, in the different groups evaluated. Dimethylacetamide associated to glycerol were effective in maintaining sperm viability in post-thawed sheep semen. However, a deleterious effect of DMA was observed at the highest concentrations or when it was not associated with glycerol.

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Background: Prochilodus brevis is a rheophilic fish of economic and ecological importance. However, anthropic action has made its population vulnerable. Thus, the development of reproductive biotechnologies, such as seminal conservation, is necessary to subsidize their fish farming. However, seminal collections are often performed in places with few laboratory resources, demanding studies to determine the maximum time for which sperm can be cooled, as well as its process until frozen. Thus, the present study aimed to evaluate the influence of cooling time and the presence of dilution solutions on cryopreservation of P. brevis semen.Material, Methods & Results: After seminal collection, nine pools were formed and analyzed for seminal pH, concentration, membrane integrity, morphology and spermatic kinetics - motility, curvilinear velocity (VCL), average path velocity (VAP) and straight line velocity (VSL). After the analysis of the pools in natura (control 1), they were processed as follows: 1)- immediate freezing (control 2); 2)- cooling: undiluted, diluted in coconut water powder (ACP-104) or diluted in 5% glucose, followed by cooling at different times (6, 12, 24 or 48 h); 3)- Post-refrigeration freezing: the pools were diluted in their respective diluents and 10% dimethyl sulfoxide. After 15 days, the samples were thawed and analyzed for the aforementioned parameters. For

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Background: Prochilodus brevis is a rheophilic fish of economic and ecological importance. However, anthropic action has made its population vulnerable. Thus, the development of reproductive biotechnologies, such as seminal conservation, is necessary to subsidize their fish farming. However, seminal collections are often performed in places with few laboratory resources, demanding studies to determine the maximum time for which sperm can be cooled, as well as its process until frozen. Thus, the present study aimed to evaluate the influence of cooling time and the presence of dilution solutions on cryopreservation of P. brevis semen.Material, Methods & Results: After seminal collection, nine pools were formed and analyzed for seminal pH, concentration, membrane integrity, morphology and spermatic kinetics - motility, curvilinear velocity (VCL), average path velocity (VAP) and straight line velocity (VSL). After the analysis of the pools in natura (control 1), they were processed as follows: 1)- immediate freezing (control 2); 2)- cooling: undiluted, diluted in coconut water powder (ACP-104) or diluted in 5% glucose, followed by cooling at different times (6, 12, 24 or 48 h); 3)- Post-refrigeration freezing: the pools were diluted in their respective diluents and 10% dimethyl sulfoxide. After 15 days, the samples were thawed and analyzed for the aforementioned parameters. For the cooled and post-thawed semen, a completely randomized design with 2 (diluent × cooling time) and 3 (storage form × cooling time and storage form × diluent) factors, respectively, was utilized. ANOVA and Dunnett tests were applied to compare the means. In case of seminal cooling, there was no difference (P > 0.05) in sperm motility between control 1 and the undiluted and diluted treatments in ACP-104 for up to 24 h. After 48 h, only the VCL of the sample diluted in ACP-104 was similar (P > 0.05) to that of control 1.[...]

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A recuperação de espermatozoides epididimários após a morte possibilita a utilização do material genético de reprodutores de interesse zootécnico que morrem inesperadamente e de espécimes selvagens ou ameaçadas de extinção. O período máximo após a morte pelo qual os espermatozoides permanecem viáveis varia conforme a temperatura de armazenamento dos epidídimos. A refrigeração e a congelação são os métodos utilizados para preservação espermática, contudo os espermatozoides epididimários apresentam peculiaridades em seus processos de preservação. A refrigeração de espermatozoides epididimários pode ser realizada in situ ou in vitro, sendo que estas duas formas de refrigeração apresentam vantagens e desvantagens inerentes às técnicas. Os espermatozoides epididimários apresentam maior resistência à variações de temperatura e osmolaridade que tornam os processos de preservação diferentes dos aplicados ao sêmen colhido em vagina artificial ou eletroejaculação. Esta revisão visa foi compilar trabalhos referentes à recuperação e preservação espermática epididimária.

The recovery of epididymal spermatozoa after death is used to avail genetic material of breeding herders of zootechnical interest who die unexpectedly and of wild or endangered species. The maximum post mortem period by which sperm remain viable varies with the storage temperature of the epididymis. Refrigeration and cryopreservation are methods for sperm preservation, however, epididymal spermatozoa present peculiarities in their preservation processes. The cooling of epididymal spermatozoa can be performed in situ or in vitro, these two forms of refrigeration have advantages and disadvantages inherent in the techniques. The epididymal spermatozoa have greater resistance to variations in temperature and osmolarity that make conservation processes different from those applied to semen collected in an artificial vagina or electroejaculation. This review aims to compile works referring to epididymal sperm retrieval and preservation.

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This study to evaluate the effect of melatonin supplementation to TRIS-GEMA diluter in sperm viabilityof semen ram cryopreserved. Was used seven ejaculates of six ram,which were pooled in pool, according to theexperimental groups: T1 - control; T2 - 1x10-7 mol / L and T3 - 1x10-9 mol / L melatonin. Posteriorly thediluting the samples were packaged in straws of 0.25 ml and cryopreserved. After thawing at 37°C for 30seconds, the samples were analyzed for Test thermoresistance slow (TTR) and acrosomal membrane integrity.For statistical analysis we used the Duncan test (α = 0.05) for mean comparison. The results demonstrated thatto the TTR at time 0 min, T2 showed 54.28% motility, and T1obtained lower values in the times 0 and 60 minutesfor force. Supplementation of 1x10-9mol / L of melatonin improved total motility.

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This study evaluate the effect of melatonin supplementation to TRIS-GEMA diluter in plasmatic andmitochondria membrane integrity of semen ram cryopreserved. Was used seven ejaculates of six ram,whichwere pooled in pool, according to the experimental groups: Control; T1 - 1x10-7 mol / L and T2 - 1x10-9 mol / Lmelatonin. Posteriorly the diluting the samples were packaged in straws of 0.25 ml and cryopreserved. Afterthawing at 37°C for 30 seconds, the samples were analyzed for Test thermoresistance slow (TTR) andacrosomal membrane integrity. For statistical analysis we used the Duncan test (α = 0.05) for meancomparison. Treatments 1 and 2 differed statistically control for plasma membrane integrity at times 60, 120and 180min. It was concluded that supplementation 1x10-7mol / L and 1x10-9mol / L of melatonin increased theintegrity of the plasma membrane to 60,120 and 180 minutes.

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This study was conducted to evaluate the effect of different concentrations of Limoneno (S)-(-) (50 µM,100 µM and 150 µM) in supplementing the diluter of bulls freezing semen. Thirty-six ejaculated from fourCurraleiro-Pé-Duro bulls were used for cryopreservation. The cryopreserved spermatozoa were submitted to postthawmotility sperm of computer assisted analysis (CASA) to evaluate the characteristics of spermatic kinetics.Observed that The different concentrations of limonene (S) - (-) did not affect the parameters of kinetics spermaticexcept for linearity (LIN). The addition of 150 μM limonene (S) - (-) significantly increased (P <0.05) the LINcompared to the control. The results obtained in the present study allow us to conclude that the supplementationof limonene (S) - (-) in cryopreservation bovine semen diluent did not interfere in kinetics sperm.

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This study was conducted to evaluate the effect of different concentrations of limonene (R)-(+) (50 µM,100 µM and 150 µM) in supplementing the diluter of bulls freezing semen. Thirty-six ejaculated from fourCurraleiro-Pé-Duro bulls were used for cryopreservation. The epifluorescence microscopy was used todetermine the plasmatic integrity and mitochondrial activity potential. No was observed effect on the integrity ofplasma membrane nor mitochondrial activity potential when cryopreserved by adding limonene R - (+). Theresults obtained in this study allow to conclude that supplementation limonene (R) - (+) on diluter of bullsfreezing semen does not interfere with the integrity of the plasma membrane or the potential of spermmitochondrial activity.

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O uso da criobiologia tem sido importante ferramenta para a preservação dos gametas. Atualmente, um dos desafios da área consiste na preservação do tecido ovariano e testicular por tempo prolongado e a criobiologia tem se mostrado como parte inerente no processo. Embora existam relatos sobre a criopreservação de tecido ovariano e obtenção de nascimentos em diferentes espécies, a criopreservação de tecido testicular ainda encontra-se limitada ao nível da experimentação. O desafio é promover um protocolo de criopreservação capaz de manter o potencial do tecido de completar a espermatogênese. A criopreservação de tecido testicular pode vir a ser um método utilizado quando técnicas como a congelação do ejaculado não é possível.

The use of cryobiology has been extremely important for gametes preservation. Nowadays, the challenge is the study of long-term preservation of ovarian and testicular tissue and the use of cryobiology is an important tool in this process. Although ovarian cryopreservation has successfully produced live births in different species, cryopreservation of testicular tissue is still restricted to a limited experimental level. The challenge is to provide a successful cryopreservation protocol for testis tissue capable of maintaining the potential of the tissue for completion spermatogenesis. Cryopreservation of testicular tissues theoretically offers a practical method when other techniques such as cryopreservation of ejaculated sperm are not available or applicable.

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Quando se trata de biotecnologias da reprodução, é conhecido que o índice de fertilidade do sêmen congelado equino ainda é reduzido, uma vez que, os processos de congelação e descongelação levam a efeitos deletérios sobre o espermatozoide, diminuindo sua taxa de motilidade e vigor, modificando sua morfologia e, consequentemente, reduzindo o potencial fértil dos reprodutores. Por isso a necessidade de testes in vitro que avaliem a qualidade do sêmen equino descongelado, assim como sua viabilidade in vivo, levandose em consideração a possível influência da individualidade do animal sobre a forma de se comportar das células espermáticas frente aos processos de congelação e descongelação. Logo, o objetivo do presente estudo foi avaliar parâmetros de qualidade seminal in vitro de diferentes garanhões durante o teste de termorresistência, com o propósito de se obter uma técnica com maior repetibilidade, e que auxilie no incremento dos resultados no uso de sêmen congelado equino. Para isso, foram utilizadas amostras de sêmen de 4 garanhões da raça Quarto de Milha, em 5 repetições, submetidos a TTR nos tempos 0, 30, 60 e 90 minutos. A cinética espermática foi avaliada através do CASA. A integridade de membrana, foi avaliada pela coloração dupla (Diacetato de Carboxifluoresceína e Iodeto de Propídio), e a integridade do acrossoma, o Isotiocianeto de Fluoresceína conjugado a Peanut agglutin. A morfologia espermática foi analisada através de microscopia em câmara úmida com microscópio de contraste de fase. A viabilidade in vivo, foi testada pela inseminação de 10 éguas para gestação ou coleta de embriões distribuídos entre os reprodutores. Os dados foram analisados pelo Statistical Analysis System (SAS), com linearidade mista e parcelas repetidas no tempo, adotando covariância autorregressiva; e as médias comparadas pelo teste de Tukey Kramer. As correlações entre as variáveis foram avaliadas pelo coeficiente de correlação de Spearman. Foi observada uma interação significativa nos parâmetros Reprodutor, Tempo e interação reprodutor x tempo (p < 0,001) na cinética espermática, indicando individualidade entre garanhões em termos de longevidade espermática. Essa individualidade se repetiu na integridade de membrana, onde apenas um dos garanhões manteve membrana íntegra sem diferença significativa até os 90 minutos pós-TTR, enquanto que os demais reprodutores obtiveram diferença na integridade de membrana aos 30 e aos 60 minutos, respectivamente. Não houve diferença na patologia espermática ou na integridade de acrossoma entre tempos ou reprodutores. 50% das éguas inseminadas apresentaram embrião ou prenhez e todos as amostras seminais apresentaram pelo menos 1 égua prenhe ou embriões. Demonstrando nitidamente a individualidade dos reprodutores e a necessidade de mais conhecimento das características seminais de longevidade espermática dos mesmos, a fim de se padronizar protocolos de IA para poder determinar o momento mais adequado para a inseminação de acordo com o tempo da ovulação, mantendo-se índices de fertilidade melhores.

The aim of this study was to evaluate parameters of seminal quality in vitro of different stallions correlating with time, in order to obtain a technique with greater repeatability, and which helps to increase results in the use of frozen equine semen. Cryopreserved semen samples from 4 Quarter Horses stallions were used, in 5 repetitions, submitted to TTR at times 0, 30, 60 and 90 minutes. Sperm kinetics, membrane and acrosome integrity, sperm morphology were evaluated, and in vivo viability was demonstrated. Data analysis was performed by the Statistical Analysis System (SAS), in mixed linear models with plots repeated over time, adopting autoregressive covariance structure. And the means compared by the Tukey Kramer test. The correlations between the variables under study were assessed using Spearman's correlation coefficient. A significant interaction was observed in the parameters Breeder, Time and Breeder x time interaction (p <0.001) in sperm kinetics, indicating individuality between stallions in terms of sperm longevity. This individuality was repeated in the membrane integrity, where only one of the stallions maintained an intact membrane without significant difference until 90 minutes after TTR, while the other breeders obtained a difference in membrane integrity at 30 and 60 minutes, respectively. There was no difference in sperm pathology or acrosome integrity between times or reproducers. Of the inseminated mares 50% (5/10) presented embryo or pregnancy and all seminal samples presented at least 1 pregnant mare or produced embryos. The study clearly demonstrated the individuality of the breeders and the need for more knowledge of the semen characteristics of sperm longevity in order to standardize AI protocols taking into account the individuality of the stallion to determine the most appropriate time for insemination according to the time of ovulation, maintaining favorable fertility rates

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O uso do sêmen refrigerado proporciona maiores taxas de prenhez se comparado ao do sêmen congelado. Essa diferença parece estar relacionada às lesões mais severas das membranas espermáticas desencadeadas pelo processo de congelação. Por sua habilidade de se ligar às proteínas ligadoras de espermatozoides e ao íon cálcio, o caseinato de sódio vem sendo estudado como uma substância capaz de inibir a capacitação espermática precoce, uma importante causa de diminuição da taxa de prenhez quando do uso de sêmen congelado. O primeiro objetivo deste estudo foi avaliar a possibilidade de um diluente comercial a base de gema de ovo, destinado à congelação de sêmen bovino, ser empregado para a criopreservação de sêmen bubalino; o segundo objetivo foi investigar o efeito do uso desse diluente, suplementado com caseinato de sódio, na criopreservação de espermatozoides bubalinos, por meio da avaliação dos espermatozoides, por citometria de fluxo, e da cinética espermática, empregando-se o sistema CASA. Na primeira parte do estudo, quando comparados os resultados das avaliações da cinética espermática e integridade das membranas plasmática e acrossomal, observou-se que o processo de congelação seminal promoveu mais danos celulares que o processo de refrigeração. Na segunda parte do estudo, não foram observados efeitos da adição do caseinato de sódio ao diluente a base de gema de ovo. A partir dos resultados do presente estudo foi possível concluir que o diluente a base de gema de ovo testado foi adequado para a criopreservação de sêmen bubalino e que a adição do caseinato de sódio não diminuiu os efeitos deletérios relacionados à criopreservação seminal.

The use of cooled semen results in higher pregnancy rates compared than the use of frozen semen. This result seems to be related to the more severe damages triggered by the freezing process, when compared to those observed during the refrigeration. Due to its ability to bind to sperm-binding proteins and calcium ions, sodium caseinate has been studied as a ubstance capable to prevent early sperm capacitation, a major cause of decreased pregnancy rate after using frozen semen. The first objective of this study was to evaluate if a commercial egg yolk diluent developed for freezing bovine semen could be used for buffalo semen cryopreservation; the second objective was to investigate the effect of this diluent, added with sodium caseinate, during the procedures of buffalo sperm cryopreservation, using flow cytometry and computer-assisted sperm analysis. In the first part of the study, comparing the results of spermatic kinetics and plasma and acrosomal membranes integrity, it was observed that the freezing process resulted in more cell damage than the cooling process. In the second part of the study, no effects of the addition of sodium caseinate to the egg yolk diluent were observed. From the results of the present study it was possible to conclude that the egg yolk-based diluent was suitable for buffalo semen cryopreservation and that the addition of sodium caseinate did not decrease the deleterious effects related to seminal cryopreservation.

Resumo

MENEZES, G. F. O., Utilização da dimetilacetamida e da dimeltilformamida associadas ao glicerol para criopreservação do sêmen ovino, Salvador-BA, 2019. 62p. Tese (Doutorado em Ciência Animal dos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia - Universidade Federal da Bahia, 2019. Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar o efeito dos crioprotetores dimetilacetamida (DMA) e dimetilformamida (DMF) associadas ou não ao glicerol (GL), utilizados na formulação de meios diluidores para criopreservação do sêmen ovino, sobre os parâmetros espermáticos in vitro e fertilidade in vivo. Para tanto, foram realizados dois experimentos com sete tratamentos cada. No experimento 1 objetivou-se avaliar o efeito da utilização da dimetilacetamida, em diferentes concentrações, associada ou não ao glicerol, para confecção de diluidores para criopreservação espermática, sobre os parâmetros espermáticos e índice de fertilidade do sêmen ovino pós-descongelação. Os tratamentos foram divididos em G1: GL6%; G2: DMA3%; G3: GL5%+ DMA1%; G4: GL4%+DMA2%; G5: GL3%+DMA3%; G6: GL2%+DMA4% e G7: GL1%+DMA5%. O experimento 2 teve como objetivo estudar a eficiência da dimetilformamida em diferentes concentrações nos meios diluidores, associada ou não ao glicerol, para a manutenção da viabilidade espermática ovina in vitro e in vivo pós-descongelação. Os grupos foram divididos em G1: GL6%; G2: DMF3%; G3: GL5%+ DMF1%; G4: GL4%+DMF2%; G5: GL3%+DMF3%; G6: GL2%+DMF4%; G7: GL1%+DMF5%. As amostras de ambos os experimentos foram avaliadas, após a descongelação, quanto à cinética espermática através da análise computadorizada do sêmen - CASA e da integridade de membrana por citometria de fluxo. Os resultados obtidos foram analisados através do Statistical Analysis System - SAS com nível de significância de 5%. Não foi observada diferença (P>0,05) entre os tratamentos do experimento 1 utilizando o DMA nas avaliações in vitro e in vivo. No experimento 2 com o DMF, houve diferença na avaliação da integridade de membrana apenas entre o grupo G4 e G7 (P<0,05), que não foi demonstrada no teste in vivo. Conclui-se que os crioprotetores a base de dimetilacetamida e da dimetilformamida foram eficientes na criopreservação do sêmen ovino, podendo ser utilizado como um crioprotetor alternativo.

MENEZES, G. F. O., Use of dimethylacetamide and dimeltilformamide associated with glycerol for criopreservation of ovine semen, Salvador-BA, 2019. 62p. Thesis (Doctorate in Animal Science of the Tropics) - School of Veterinary Medicine and Zootechnics - Federal University of Bahia, 2019. The objective of this work was to evaluate the effect of cryoprotectants dimethylacetamide (DMA) and dimethylformamide (DMF) associated or not to glycerol (GL) used in the formulation of diluent media for cryopreservation of ovine semen in vitro sperm parameters and fertility in vivo. For that, two experiments were carried out with seven treatments each. In the experiment 1 the objective was to evaluate the effect of the use of dimethylacetamide, in different concentrations, associated or not to glycerol, for the preparation of diluents for sperm cryopreservation, on sperm parameters and fertility index of post-thaw sheep semen. The treatments were divided into G1: GL6%; G2: DMA3%; G3: GL5% + DMA1%; G4: GL4% + DMA2%; G5: GL3% + DMA3%; G6: GL2% + DMA4% and G7: GL1% + DMA5%. Experiment 2 had the objective of studying the efficiency of dimethylformamide in different concentrations in the dilution media, associated or not to glycerol, for the maintenance of ovine sperm viability in vitro and in vivo after thawing. The groups were divided into G1: GL6%; G2: DMF3%; G3: GL5% + DMF1%; G4: GL4% + DMF2%; G5: GL3% + DMF3%; G6: GL2% + DMF4%; G7: GL1% + DMF5%. Samples from both experiments were evaluated after thawing, for sperm kinetics through computer assisted sperm analysis and membrane integrity by flow cytometry. The results were analyzed through the Statistical Analysis System - SAS with significance level of 5%. No difference (P> 0.05) was observed between the treatments of experiment 1 using DMA in the in vitro and in vivo evaluations. In experiment 2 with DMF, there was difference in membrane integrity only between G4 and G7 (P <0.05), which was not demonstrated in the in vivo test. It was concluded that cryoprotectants based on dimethylacetamide and dimethylformamide were efficient in the cryopreservation of ovine semen and could be used as an alternative cryoprotectant.

Resumo

Os efeitos deletérios causados às células espermáticas pela criopreservação ocorrem por esseprocedimento alterar a arquitetura estrutural da membrana plasmática, prejudicando a sobrevivência espermáticapós-descongelamento. Em razão disso, novas estratégias têm sido pesquisadas a fim de minimizar os danoscelulares inerentes ao choque térmico ocasionado no processamento do sêmen, entre as quais a incorporação docolesterol à membrana plasmática por ciclodextrina. Trata-se de uma técnica alternativa e que vem apresentando,in vitro, resultados promissores para ejaculados com baixa viabilidade pós-descongelamento devido amodificações na fluidez e na permeabilidade da membrana plasmática, incrementando a tolerância aos choquestérmico e osmótico. Porém, as taxas de prenhez obtidas a campo ainda se apresentam insatisfatórias,possivelmente em razão de alguma interferência da alta proporção de colesterol sobre o processo fisiológico decapacitação espermática e de reação acrossomal, fundamentais para a ocorrência de fertilização. Na presenterevisão, serão abordados aspectos relacionados ao uso de ciclodextrinas como carreadoras de colesterolpreviamente ao congelamento de sêmen.

The deleterious effects of seminal cryopreservation on sperm cells alter the structural architecture ofthe plasma membranedecreasing the survival of the sperm after thawing. As a result, new strategies have beenresearched in order to minimize the cell damage related to the thermal shock of semen processing, such ascholesterol-loaded cyclodextrins. This is an alternative technique that has shown,in vitro, promising results forejaculated with low viability after thawing due to the modifications on the fluidity and permeability of theplasma membrane, increasing the tolerance to thermal and osmotic shock. However, the pregnancy rates at thefield remain unsatisfactory, possibly due to some interference of high proportion of cholesterol on thephysiological process of sperm capacitation and acrosome reaction, essential for the occurrence of fertilization.This review will discuss some aspects related to the use of cyclodextrins as cholesterol carriers previously tosemen cryopreservation process.

Resumo

Objetivou-se avaliar a viabilidade de oócitos caprinos submetidos ao processo de criopreservação lenta em meio alternativo contendo ACP-407® após descongelação. Foram coletados 160 ovários, provenientes de 80 cabras púberes oriundas de abatedouros localizados na microrregião homogênea de Teresina. Após o abateos ovários foram imediatamente transportados para o laboratório em garrafa térmica com solução salina fisiológica a 35°C adicionada de 30ug/mL de sulfato de gentamicina. Os oócitos foram aspirados com agulha 21G acoplada a seringa de 5mL, posteriormente o aspirado foi colocado em tubos tipo falconde 15 mL, onde permaneceram durante 15 minutos para que ocorresse a decantação dos Complexos CumulusOócitos (CCOs).O sedimento foi aspirado com o auxílio de uma pipeta de 100L e colocados em placa de petri onde foram avaliados e classificados utilizando estereomicroscópio. Após a classificaçãoos CCOs foram separados em três grupos, Grupo I (Glicerol - Controle), Grupo II (Etilenoglicol) e Grupo III (Etilenoglicol e ACP-407®), e envasados em palhetas francesas de 0,25 mL no qual foramsubmetidos ao processo de criopreservação lenta, em curva de criopreservaçãoespecifica para embriões,em aparelho TK 3000®. Após o período mínimo de 10 dias os oócitos foram descongelados e avaliados através da associação de sondas fluorescentes (iodeto de propídeoediacetato de carboxifluresceina).Foram recuperados 139 CCOs, onde obteve-se uma taxa de recuperação de 1,73CCOs por par de ovários. Em relação a análise de viabilidade com a utilização de sondas fluorescentes o grupo contendo ACP-407® cometilenoglicol apresentou melhores resultados quando comparados ao grupo etilenoglicol ou glicerol, representado uma taxa de viabilidade de 16,6%, 7,4% e 6%, respectivamente. Portanto, a adição de ACP-407® ao crioprotetoretilenoglicolmelhora a viabilidade dos oócitos caprinos pós descongelação.

The aim of this study was to evaluate the viability of goat oocytes submitted to the slow cryopreservation process in an alternative medium containing ACP-407® after thawing. A total of 160 ovaries were collected from 80 pre - pubescent goats from slaughterhouses located in the homogeneous microregion of Teresina. After slaughter the ovaries were immediately transported to the laboratory in a thermos flask with physiological saline solution at 35°C added with 30ug/mL gentamicin sulfate. The oocytes were aspirated with a 21G needle attached to a 5mL syringe, and the aspirate was placed in 15mL falcon tubes, where they remained for 15 minutes for the decantation of Cumulus Oocyte Complexes (COCs). The sediment was aspirated with the aid of a 100L pipette and placed in petri dish where they were evaluated and classified using a magnifying glass. After classification, the COCs were separated into three groups, Group I (Glycerol - Control), Group II (Ethylene Glycol) and Group III (Ethylene Glycol and ACP-407®), and packed in 0.25mL vats in which they were submitted to the slow cryopreservation, in specific curve for embryos In TK 3000® apparatus. After the minimum period of 10 days the oocytes were thawed and evaluated through the association of Fluorescent probes (propionate iodide andcarboxyfluorescein diacetate). 139 COCs were recovered, where a recovery rate of 1.73 COCs per pair of ovaries was obtained. In relation to the feasibility analysis with the use of fluorescent probes the group containing ACP-407®with Ethylene glycol presented better results when compared with the group Ethylene glycol or Glycerol, representing a viability rate of 16.6%, 7.4% and 6%, respectively. Therefore, the addition of ACP-407® to the cryoprotectant ethylene glycol improvement the viability of oocytes goats thawing.

Resumo

Com este estudo objetivou-se avaliar o perfil proteômico total e diferencial do plasma seminal de garanhões da raça Mangalarga Marchador, que apresentam variações na motilidade espermática do sêmen após descongelamento, visando identificar proteínas candidatas a marcadores de congelabilidade. Foram utilizados quatro garanhões de fertilidade comprovada, divididos em dois grupos, com dois animais em cada grupo: T1: alta congelabilidade (n= 4 ejaculados) e T2: baixa congelabilidade (n= 4 ejaculados), sendo cada tratamento composto por dois ejaculados de cada garanhão. As análises físicas do sêmen foram realizadas antes e após a criopreservação espermática. Os grupos estudados foram divididos pós-descongelamento pela avaliação da motilidade espermática total. O perfil protéico do plasma seminal foi obtido por eletroforese bidimensional, as análises de imagem dos géis foram realizadas pelo programa ImageMaster 2D Platinum 6.0 (GE Healtcare®) e a identificação das proteínas foi por espectrometria de massas usando MALDI-TOF/TOF, com o software Mascot Daemon para a busca em banco de dados. A validação das proteínas identificadas entre os tratamentos foi realizada pelo programa SCAFFOLD (95%). Os dados foram analisados pela ANOVA com 5 % de probabilidade de erro, correlações simples de Pearson e análise de regressão linear. Observou-se diferença (p<0,05) em relação à motilidade espermática total do sêmen fresco e pós-descongelamento. No perfil protéico identificou-se 5 famílias de proteínas (HSP-1, HSP-2, CRISP-3, Calecreína e Albumina sérica). Destas famílias, algumas proteínas se apresentaram com diferenças em abundância (p<0,05) entre os grupos estudados, em que quatro destas podem ser consideradas possíveis candidatas a marcadores de congelabilidade (HSP-1: spot 175; HSP-2: spot 39; CRISP-3: spot 66 e 166). Conclui-se então que os garanhões da raça Mangalarga Marchador apresentam variação individual ao processo de criopreservação do sêmen e possuem possíveis proteínas candidatas a marcador de congelabilidade para raça.

This study aimed to evaluate the total and differential proteomic profile of the seminal plasma of proteomic profile of Mangalarga Marchador breed that presented variations in sperm motility after thawing, intending to identify candidate proteins as freezability markers. Four proven fertility stallions were used and splited in two groups with two animals in each group: T1: high freezability (n= 4 ejaculates) and T2: low freezability (n= 4 ejaculates) with two ejaculates of each stallion in each treatment. Semen analysis were made before and after criopreservation. The studied groups were divided after thawing by the evaluation of total sperm motility. The protein profile of the seminal plasma was obtained by bidimensional electrophoresis. The analyses of the images of the gels were performed by the ImageMaster 2D Platinum 6.0 (GE Healtcare®) program and the proteins identification were made by the mass spectrometry using MALDI-TOF/TOF with the software Mascot Daemon for database search. The validation of identified proteins between treatments was performed by SCAFFOLD (95%) program. The data were analyzed by ANOVA, Pearson's simple correlations and linear regression analysis with 5 % of error probability. Differences were observed (p<0.05) in relation to total sperm motility of fresh and after thawing semen. At protein profile, 5 protein families (HSP-1, HSP-2, CRISP-3, Kallikrein and Serum albumin) were identified. Of these families some proteins presented differences in abundance (p<0.05) between studied groups in which four of them can be considered as possible markers candidates of semen freezability (HSP-1: spot 175; HSP-2: spot 39; CRISP-3: spot 66 and 166). It can be concluded that stallions of Mangalarga Marchador breed present individual variation to semen cryopreservation process and have possible proteins as markers candidates of semen freezability.