Resumo

The genus Streptomyces is associated with the ability to produce and excrete a variety of bioactive compounds, such as antibiotic, antifungal and antiviral. Biological active polyketide and peptide compounds with applications in medicine, agriculture and biochemical research are synthesized by PKS-I and NRPS genes. The evaluation of the presence of these genes associated with the biosynthesis of secondary metabolites in different phytopathogenic Streptomyces strains were performed using degenerated primers. The positive signal was observed in 58/63 Streptomyces strains for NRPS gene, 43/63 for PKS-I, and for PKS-II all the 63 strains showed positive signal of amplification. These strains also were tested with double layer agar-well technique against bacterial with clinical importance, and it was possible to observe the Streptomyces spp. strains were able to inhibit the growth of 14, 20, 13 and 3 isolates Gram-positive and Gram-negative bacteria, Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus cereus (ATCC 14579), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) and Escherichia coli (ATCC 11775) respectively. The Streptomyces sp. strains IBSBF 2019 and IBSBF 2397 showed antibacterial activity against all four bacteria-target tested.(AU)

O gênero Streptomyces apresenta alta capacidade de produzir e excretar uma grande variedade de compostos biologicamente ativos, como antibióticos, antifúngicos e antivirais. Compostos biologicamente ativos de policetídeos e peptídeos com aplicações na medicina, agricultura e pesquisas bioquímicas são sintetizados pelos genes PKS-I e NRPS. A avaliação da presença desses genes associados à biossíntese de metabólitos secundários em diferentes linhagens de Streptomyces fitopatogênicas foi realizada através do uso de primers degenerados. O sinal positivo foi observado em 58/63 linhagens de Streptomyces para o gene NRPS, 43/63 para o gene PKS-I e, para o gene PKS-II, todas as 63 linhagens apesentaram o sinal positivo de amplificação. Essas linhagens também foram testadas através da técnica de dupla camada contra bactérias de importância clínica e foi possível observar que as linhagens de Streptomyces spp. foram capazes de inibir o crescimento de 14, 20, 13 e 3 isolados de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus cereus (ATCC 14579), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Escherichia coli (ATCC 11775), respectivamente. As linhagens de Streptomyces sp. ISBSF 2019 e 2397 apresentaram atividade antibacteriana contra todas as bactérias-alvo testadas.(AU)

Resumo

O carcinoma de células escamosas (CCE) é uma neoplasia maligna oriunda dos queratinócitos altamente prevalente em equinos, afetando frequentemente o pênis e prepúcio. Sua contrapartida benigna, o papiloma, também é comum na região genital, e pode ser induzida pela infecção por papilomavírus (PVs). Embora se saiba que os papilomas genitais de equinos podem ter uma origem viral, a etiologia dos CCEs genitais não está completamente elucidada. Recentemente foi detectada a presença de um novo PV, o papilomavírus Equus caballus tipo 2 (EcPV-2), em meio a CCEs genitais de equinos machos. Acredita-se, a partir disso, que possa existir uma associação entre a infecção por EcPV-2 e a gênese de alguns papilomas e CCEs genitais em equinos. Desde a sua descoberta em 2010, o EcPV-2 já foi descrito em diferentes países da América do Norte e Europa, no entanto, sem relatos no Brasil. Com base nisso, o objetivo desse trabalho é investigar a presença de EcPV-2 em meio a CCEs e papilomas genitais de equinos machos brasileiros. Foram investigados 40 CCEs e papilomas acometendo pênis e/ou prepúcio recebidos na rotina de biópsias e necropsias do Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) e na rotina de biópsias do setor de Patologia Veterinária (SPV) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) (2000-2021). Dados relacionados à raça e à idade foram retirados dos laudos histopatológicos. Os blocos de parafina foram recuperados para confecção de lâminas de Hematoxilina e Eosina, imuno-histoquímica (IHQ) para PV (40/40) e reação de polimerase em cadeia (PCR) utilizando um par de primers específico para PV (40/40) e um par de primers específico para EcPV-2 (40/40). Casos positivos foram sequenciados. Dos casos incluídos, 34 eram CCEs invasivos, três eram carcinomas in situ (CIS) e três eram papilomas. A mediana de idade foi de 13,2 anos, e dos equinos com status reprodutivo informado, três eram garanhões e dois eram castrados. A raça Crioula foi a mais representada (16/40). Todos os tumores apresentaram graus variáveis de inflamação linfoplasmocítica, sendo que dois CCEs apresentaram invasão vascular linfática e dois apresentaram invasão sanguínea. Em meio aos carcinomas, ou na mucosa adjacente, também se observaram ceratinócitos tumefeitos, degenerados, com citoplasma fracamente basofílico, ocasionalmente contendo um vacúolo claro, e um núcleo grande. Inclusões estavam ausentes em todos os casos. Na IHQ utilizando anticorpo anti-BPV-1, quatro casos (dois CCEs, um CIS e um papiloma) tiveram imunomarcação positiva, observada no núcleo de ceratinócitos neoplásicos (CIS e papiloma) ou no epitélio adjacente ao tumor (CCEs). A análise molecular revelou sete casos positivos para PV e cinco desses positivos para EcPV-2. Três casos positivos para EcPV-2 e dois casos negativos para EcPV-2 e positivos para PV foram sequenciados, sendo todos compatíveis com EcPV-2. A partir desses resultados, podemos confirmar a presença de EcPV-2 em equinos brasileiros. Espera-se que esse estudo venha a estimular novas pesquisas relacionadas a esse novo vírus, contribuindo, por fim, para o melhor conhecimento das formas de transmissão do vírus, e para o desenvolvimento de medidas preventivas eficazes.

Squamous cell carcinoma (SCC) is a malignant neoplasm arising from keratinocytes. It is highly prevalent in horses, often affecting the penis and prepuce. Its benign counterpart, the papilloma, is also common in the genital region, and can be induced by infection with papillomaviruses (PVs). Although it is known that equine genital papillomas may have a viral origin, the etiology of genital SCCs is not fully understood. The presence of a new PV, Equus caballus papillomavirus type 2 (EcPV-2), was recently detected among genital SCCs in male horses. Based on this, it is believed that there may be an association between EcPV-2 infection and the genesis of some equine genital papillomas and SCCs. Since its discovery in 2010, EcPV-2 has been described in different countries in North America and Europe, however, with no reports in Brazil. The objective of this research is to investigate the presence of EcPV-2 within genital papillomas and SCCs of male Brazilian horses. We investigated 40 SCCs and papillomas involving the penis and/or prepuce, diagnosed in the biopsy or necropsy routine of the Laboratório de Patologia Veterinária (LPV), Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), and in the biopsy routine of the Setor de Patologia Veterinária (SPV), Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) (2000-2021). Data related to breed and age were taken from the histopathological reports. The paraffin blocks were recovered for the preparation of Hematoxylin and Eosin slides, immunohistochemistry (IHC) for PV (40/40) and polymerase chain reaction (PCR) using a pair of primers specific for PV (23/40) and another pair specific for EcPV-2 (40/40). Positive cases were sequenced. Of the included cases, 34 were invasive SCCs, three were carcinomas in situ (CIS), and three were papillomas. The median age was 13.2 years, and of the horses with informed reproductive status, three were stallions and two were geldings. The breed Crioula was the most represented (16/40). All tumors showed varying degrees of lymphoplasmacytic inflammation, with two SCC's showing lymphatic vascular invasion and two showing blood invasion. Within the carcinomas, or in the tumor-adjacent mucosa, swollen, degenerated keratinocytes with a weakly basophilic cytoplasm, occasionally containing a clear vacuole and a large nucleus, were ocasionally observed. Viral inclusions were absent in all cases. In the IHC using anti-BPV-1 antibody, four cases (two SCCs, one CIS and one papilloma) had positive immunostaining, observed in the nucleus of neoplastic keratinocytes (CIS and papilloma) or in the epithelium adjacent to the tumor (SCCs). PCR revealed seven positive cases for PV and five of these positive for EcPV-2. Three EcPV2-positive cases and two PVpositive and EcPV2-negative were sequenced, and compatible with EcPV-2. With this study, we can confirm the presence of EcPV-2 in Brazilian horses. We hope this study stimulates further research related to this new virus, ultimately contributing to a better understanding of transmission routes, and to the development of effective preventive measures

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A sexagem de embriões equinos através do fluido da blastocele (FB), é uma biotecnologia recente, e associada ao transporte de embriões têm boas perspectivas no campo. Objetivos:(1) testar a técnica de sexagem por PCR do FB de embriões pré-implantacionais produzidos in vivo coletado a partir do colapso embrionário com agulha hipodérmica; (2) avaliar a capacidade de re-expansão embrionária após acondicionamento destes embriões produzidos in vivo colapsados; (3) avaliar a qualidade e tamanho de embriões produzidos in vivo, colapsados e íntegros, após simulação de transporte sob acondicionamentos em temperatura ambiente (25ºC) e refrigeração à 5ºC por 24 horas. As condições experimentais visaram mimetizar condições aplicáveis à rotina de campo. Métodos: I -Foram coletados 42 embriões e distribuídos aleatoriamente entre quatro grupos experimentais: CTA (n=11 embriões colapsados acondicionados em temperatura ambiente), CTR (n=11 embriões colapsados acondicionados sob refrigeração), NCTA (n=10 embriões não colapsados acondicionados em temperatura ambiente) e NCTR (n=10 embriões não colapsados acondicionados sob refrigeração), e todos armazenados por um período de 24 horas. II -As amostras de FB (n=19) foram coletadas após o colapso dos embriões com agulha hipodérmica 26G, dos grupos CTA e CTR, e foram submetidas as duas PCR sequenciadas com os primers específicos TSPY e AMEL para a identificação dos sexos. III - Apenas três embriões (n=1 CTA, n=1 CTR, e n=1 imediatamente após o colapso) foram submetidos a microscopia por fluorescência com marcador DAPI e microscopia de interferência de contraste (DIC) para uma análise descritiva da lesão. Resultados: (I)Todos os embriões submetidos ao colapso sofreram redução no tamanho após as 24h, mas os acondicionados em temperatura ambiente (25ºC) apresentaram uma melhor qualidade morfológica após as 24h. Dos embriões íntegros, apenas o grupo NCTA obtiveram uma taxa de crescimento positiva (+25,95%) e mantiveram sua qualidade de grau 1 excelente em M24, enquanto que os refrigerados a 5ºC apresentou uma queda na classificação com 20% de embriões degenerados após as 24h. (II) A técnica de sexagem por FB mostrou-se eficiente com o diagnóstico de 57,90% de machos, através da amplificação de bandas especificas para TSPY com as duas PCR sequenciadas. (III) A lesão embrionária causada pelo colapso manual com a agulha hipodérmica 26G foi visualizada por microscopia de fluorescência. É possível realizar a sexagem embriões equinos através de amostras do FB por PCR. Conclusões: Os embriões colapsados com a agulha hipodérmica 26G são capazes de se recuperar parcialmente das lesões, principalmente quando acondicionados em meio de manutenção em temperatura ambiente por até 24h. A temperatura ambiente (25ºC) demonstrou ser a melhor temperatura de acondicionamento para o transporte de embriões equinos íntegros e colapsados por até 24h, dentro das condições apresentadas, por atuar diretamente otimizando a qualidade morfológica durante as 24hrs. Estudos complementares são necessários para comprovar a viabilidade das células embrionárias pós-colapso como teste in vitro, e a aplicabilidade de inovulação desses embriões para obtenção de suas possíveis taxas de prenhez e perdas embrionárias como teste in vivo.

The sexing of equine embryos through the blastocoel fluid (BF) is a recent biotechnology, and associated with embryo transport has good prospects in the field. Objectives:(1) to test the technique of PCR sexing the FB of pre-implantation embryos produced in vivo collected from embryonic collapse with a hypodermic needle; (2) to evaluate the capacity of embryonic re-expansion after packaging these collapsed in vivo produced embryos; (3) to evaluate the quality and size of embryos produced in vivo, collapsed and intact, after simulation of transport under packaging at room temperature (25ºC) and refrigeration at 5ºC for 24 hours. The experimental conditions aimed to mimic conditions applicable to the field routine. Methods: I - Forty-two embryos were collected and randomly distributed among four experimental groups: CTA (n=11 collapsed embryos conditioned at room temperature), CTR (n=11 collapsed embryos conditioned under refrigeration), NCTA (n=10 non-collapsed embryos conditioned at room temperature) and NCTR (n=10 non-collapsed embryos stored under refrigeration), and all stored for a period of 24 hours. II - The FB samples (n=19) were collected after the embryos collapsed with a 26G hypodermic needle, from the CTA and CTR groups, and were submitted to two PCR sequenced with the specific primers TSPY and AMEL to identify the sexes. III - Only three embryos (n=1 CTA, n=1 CTR, and n=1 immediately after collapse) were submitted to fluorescence microscopy with DAPI marker and contrast interference microscopy (DIC) for a descriptive analysis of the lesion. Results: (I) All embryos submitted to collapse suffered a reduction in size after 24h, but those conditioned at room temperature (25ºC) showed a better morphological quality after 24h. Of the intact embryos, only the NCTA group achieved a positive growth rate (+25.95%) and maintained their excellent grade 1 quality in M24, while those refrigerated at 5ºC showed a decrease in classification with 20% of embryos degenerated after at 24h. (II) The FB sexing technique proved to be efficient with the diagnosis of 57.90% of males, through the amplification of specific bands for TSPY with the two sequenced PCRs. (III) The embryonic lesion caused by manual collapse with the 26G hypodermic needle was visualized by fluorescence microscopy. It is possible to sex equine embryos using FB samples by PCR. Conclusions: Embryos collapsed with the 26G hypodermic needle are able to partially recover from the lesions, especially when placed in a maintenance medium at room temperature for up to 24 hours. Room temperature (25ºC) proved to be the best packaging temperature for the transport of intact and collapsed equine embryos for up to 24 hours, under the conditions presented, by acting directly optimizing the morphological quality during the 24 hours. Complementary studies are needed to prove the viability of post-collapse embryonic cells as an in vitro test, and the applicability of inovulation of these embryos to obtain their possible pregnancy and embryo loss rates as an in vivo test.

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A raiva, causada pelo rabies virus (RABV), caracteriza-se por ser uma encefalomielite viral aguda. O RABV pertence ao gênero Lyssavirus, que contempla outros 17 vírus. Como a raiva é uma doença que apresenta letalidade próxima a 100%, as técnicas de diagnóstico devem se mostrar precisas e fidedignas, para que possa ser realizado o controle da doença. A prova padrão ouro para o diagnóstico é a imunofluorescência direta (IFD), uma vez que apresenta alta sensibilidade e especificidade. Porém, problemas como o estado avançado de autólise das amostras, baixa carga viral, qualidade inapropriada dos insumos e até mesmo a inexperiência de profissionais para a leitura das lâminas, podem diminuir a acurácia dos resultados. O ensaio LN34 Pan-Lyssavirus para RT-PCR em tempo real (RT-qPCR), que combina primers degenerados e múltiplos com sonda de hidrólise do tipo Locked Nucleic Acid (LNA), é um candidato para ser prova confirmatória da IFD, devido a sua facilidade de manuseio e capacidade de detectar as diferentes espécies de vírus dentro do gênero Lyssavirus, e por apresentar alta especificidade e sensibilidade. Esse ensaio detecta e amplifica porção leader 3 do genoma e a região inicial do gene codificador da nucleoproteína, considerada a mais conservada entre os Lyssavirus. Esse estudo visa a padronização e implementação do ensaio LN34 Pan-Lyssavirus de RT-qPCR para detecção das diferentes linhagens genéticas e variantes antigênicas do RABV descritas no Brasil. Para isso, foram coletadas 324 amostras positivas e compatíveis com as diferentes variantes antigênicas e linhagens genéticas do RABV presentes no Brasil, e testadas na RT-qPCR utilizando o ensaio LN34 Pan-Lyssavirus. A RT-qPCR two-steps com ensaio LN34 Pan-Lyssavirus apresentou uma positividade de 87,3%, e 41 amostras obtiveram resultado falso negativo. Estas amostras, que tiveram resultado falso-negativo na RT-qPCR two-steps, foram testadas na técnica de RT-qPCR one-step com ensaio LN34 Pan-Lyssavirus, e todas tiveram o resultado verdadeiro positivo confirmado. Diante desses resultados, é possível inferir que a utilização do ensaio LN34 com a RT-qPCR em duas etapas apresenta dificuldade de detecção das diferentes linhagens genéticas e variantes antigênicas do RABV, possivelmente devido ao não anelamento do primer senso durante a transcrição reversa. Por outro lado, a RT-qPCR em uma etapa com o ensaio LN34 Pan-Lyssavirus foi capaz de detectar e amplificar aquelas amostras falso negativas pela reação em duas etapas, se mostrando um teste altamente sensível, e com potencial para ser utilizado como prova confirmatória à IFD para o diagnóstico da raiva no Brasil.

Rabies, caused by rabies virus (RABV), is characterized by viral acute progressive encephalitis. The RABV belongs to Lyssavirus genus, that includes seventeen others virus. Due to the high lethality, almost 100%, diagnosis techniques for rabies must be accurate and reliable for the accomplishment of diseases control. The gold standard for rabies diagnostic is the direct fluorescent antibody test (dFAT), due to its high sensibility and specificity. Although, sample conservation, low viral title, poor quality inputs, and skilled technicians may hamper results accurate. The RT-qPCR LN34 Pan-Lyssavirus assay is a combination of degenerated and multiple primers with Locked Nucleic Acid (LNA) probe that can be used as secondary test for dFAT, due to its ease manipulation and capacity for detecting the different virus species within the Lyssavirus genus, and due its high sensitivity and specificity. This assay detects and amplifies the leader region 3 and the initial portion of nucleoprotein gene that is considered the most conserved gene within the Lyssavirus. This study aims the LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay standardization and implementation for detecting the different RABV genetic lineages and antigenic variants described in Brazil. Therefore, 324 positive samples compatible with different RABV genetic lineages or antigenic variants were collected and tested in RT-qPCR, using LN34 Pan-Lyssavirus assay. The two steps LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay, showed positivity of 87,3%, and 41 samples obtained false negative result. Those false negative samples in the two steps LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay were tested in the one step LN34 Pan-Lyssavirus RT-qPCR assay, and 100% of those samples confirmed the true positive result. Based in these results, is possible to infer that the two steps RT-qPCR assay may hamper the detection of different RABV genetic lineages and antigenic variants, probably due to mismatches between sense primer and the target region during the revere transcription technique. On the other hand, the one step RT-qPCR LN34 Pan-Lyssavirus assay were able to detect and amplify those false negative samples in two steps RT-qPCR, showing to be a highly sensitivity test, and showing potential to be used as confirmatory test to dFAT for rabies diagnosis.

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Given the causal relationship between specific types of HPV with cervical cancer and precursor lesions, it is important to identify the viral type involved. The aim of this study is to access the prevalence of HPV types in HIV seropositive and seronegative women. Accordingly, 77 HPV positive cervical samples were obtained from 284 women (seropositive (n=112) and seronegative (n=172) for HIV) who attended a Sexually Transmitted Infection clinic, in Vitoria, Southeastern Brazil. Viral DNA was amplified by PCR using MY09/MY11 degenerated primers and the genotyping was performed by Restriction Fragment Length Polymorphism. Seventy five out of the 77 HPV samples were genotyped: 6, 11, 13, 16, 18, 26, 31, 31b, 32, 33, 34, 35, 52, 53, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 71, 81, 83, 84. The most prevalent type was HPV16 followed by HPV types 6, 11 and 53. Fifty five percent and 45 percent belonged to high and low risk types, respectively. High risk types corresponded to 59 percent and 54.5 percent of the HPV detected in HIV seronegative and seropositive women, respectively. The uncommon HPV 13 type in cervical samples was also observed in this study. The oncogenic types were more common in the HIV seronegative samples and the number of cases with multiple infections was similar for the two groups. HPV typing is not only important clinically for the establishment of monitoring and treatment of a patient, it also provides knowledge of the viral types circulating in a population, which is of interest in the development of prevention and treatment programs for this disease.

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O objetivo deste trabalho foi analisar amostras de soro e de células sangüíneas de caprinos para detecçäo de anticorpos e DNA proviral do vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV), respectivamente. Utilizou-se a técnica de imunodifusäo em ágar (AGID) e a reaçäo em cadeia da polimerase (PCR) com "primers" degenerados. Foram analisadas amostras de diferentes procedências: 39 de Mato Grosso do Sul (MS), 19 de Säo Paulo (SP) e 22 do Ceará (CE), dessas últimas, 12 oriundas de animais importados do Canadá. Os resultados de AGID e PCR foram discordantes, pois o primeiro permitiu a detecçäo de 25 animais soropositivos, enquanto a PCR detectou DNA proviral de CAEV em 16 amostras. Pela PCR foi possível identificar animais infectados cujos testes sorológicos foram negativos pela AGID: oito amostras do MS e um do CE. Säo discutidos diferentes aspectos que poderiam estar envolvidos na discordância dos resultados