Cryopreservation of jaguar (Panthera onca) sperm cells using different cryoprotectants and different thawing temperatures

The cryopreservation of jaguar semen must be improved to produce high-quality biobanking doses. Until now, the rare studies of semen freezing in the species have only evaluated glycerol, always with a significant reduction in sperm quality in thawed semen. The purpose of this study was to assess the efficacy of three cryoprotectants, dimethylsulfoxide (DMSO), glycerol (GLY), and methanol (MET), in the cryopreservation of jaguar semen in an LDL-based extender, as well as the effect of thawing temperature on dosage quality. Five mature males with a history of reproduction were used. On the males, an infrared thermal image (IRT) was captured, the spicules and testes were analyzed, and the CASA system was used to evaluate the quality of fresh and thawed sperm. The superficial IRT was 4.6 ± 1.2 °C cooler than the anal sphincter, and the semen measured between 27.3 and 28.7 °C shortly after exiting the urethra. The total motility of fresh sperm was 55.3 ± 22.6%, and progressive motility was 36.3 ± 18%. The total motility of thawed sperm was 5.28 ± 2.51%, 4.49 ± %2.49, and 0.51 ± 0.62% for DMSO, GLY, and MET, respectively. DMSO and GLY performed better than MET, and there was no difference in thawing temperature (37°C 30 s vs. 50°C 12 s). All animals exhibit a considerable level of morphological changes in sperm. Low amounts of total and progressive motility were found in the thawed sperm. Males with a high level of sperm morphological changes were found to be fertile, but the lone male with normospermia was infertile. Thus, we contest the applicability of the commonly used morphological classification for bovines to felid species.(AU)

Effect of cryoprotectant on the motility, viability, fertilization, and DNA integrity of naleh fish Barbonymus sp. (Cyprinidae) sperm / Efeito do crioprotetor na motilidade, viabilidade, fertilização e integridade do DNA no sêmen de peixes naleh Barbonymus sp. (Cyprinidae)

Naleh fish Barbonymus sp. is a commercial freshwater fish, which is indigenous to Aceh, Indonesia. The population of this species has declined over the years as a result of habitat perturbations and overfishing. Hence, the crucial need to develop a cryopreservation method to support breeding programs. This involved the use of a cryoprotectant as an important component. The objective of this study, therefore, was to explore the best cryoprotectant for naleh fish spermatozoa, and a total of five types were tested. These include the DMSO, Methanol, Ethanol, Glycerol, and Ethylene Glycol at a similar concentration of 10%, which were individually combined with 15% egg yolk, and every treatment was performed in three replications. Conversely, Ringer's solution was adopted as an extender, and the sperm was cryopreserved in liquid nitrogen for 15 days. The results showed significant influence on sperm motility and viability, as well as egg fertility of naleh fish (P <0.05), although the DMSO provided the best outcome, compared to others at 47.17%, 50.13%, and 45.67%, respectively. Furthermore, DNA fragmentation had not occurred in the fresh and cryopreserved sperm samples, indicating the protective effect of tested cryoprotectants. It is concluded that the 10% DMSO and 15% egg yolk is the best cryoprotectant for naleh fish spermatozoa.(AU)

O peixe naleh Barbonymus sp. é um peixe comercial de água doce, originário de Aceh, Indonésia. Durante vários anos, as perturbações provocadas no seu habitat e a pesca predatória determinaram o declínio da sua população, cuja preservação deve apoiar-se em um programa de reprodução controlada, com o emprego de espermatozoides criopreservados. O presente trabalho realizou um estudo comparativo de cinco crioprotetores: dimetilsultóxido, metanol, etanol, glicerol e etileno glicol. Todos os crioprotetores foram testados na concentração de 10%, combinados a 15% de gema de ovo. Cada tratamento foi efetuado em triplicatas. A solução de ringer foi utilizada como extensor e o esperma foi criopreservado em nitrogênio líquido por 15 dias. Os resultados obtidos revelaram a existência de influência significante (P<0,05) na viabilidade e motilidade espermática bem como na fertilidade dos ovos do peixe naleh, em que o dimetilsulfóxido apresentou o melhor resultado com os valores de 47,17%, 50,13% e 45,67%, respectivamente. Por outro lado, a fragmentação do DNA não ocorreu nas amostras de esperma fresco e criopreservado, indicando o efeito protetor dos crioprotetores testados. A conclusão obtida foi que o dimetilsulfóxido e 15% de gema de ovo foram o melhor crioprotetor para os espermatozoides do peixe naleh.(AU)

Effect of cryoprotectant on the motility, viability, fertilization, and DNA integrity of naleh fish Barbonymus sp. (Cyprinidae) sperm / Efeito do crioprotetor na motilidade, viabilidade, fertilização e integridade do DNA no sêmen de peixes naleh Barbonymus sp. (Cyprinidae)

Naleh fish Barbonymus sp. is a commercial freshwater fish, which is indigenous to Aceh, Indonesia. The population of this species has declined over the years as a result of habitat perturbations and overfishing. Hence, the crucial need to develop a cryopreservation method to support breeding programs. This involved the use of a cryoprotectant as an important component. The objective of this study, therefore, was to explore the best cryoprotectant for naleh fish spermatozoa, and a total of five types were tested. These include the DMSO, Methanol, Ethanol, Glycerol, and Ethylene Glycol at a similar concentration of 10%, which were individually combined with 15% egg yolk, and every treatment was performed in three replications. Conversely, Ringer's solution was adopted as an extender, and the sperm was cryopreserved in liquid nitrogen for 15 days. The results showed significant influence on sperm motility and viability, as well as egg fertility of naleh fish (P <0.05), although the DMSO provided the best outcome, compared to others at 47.17%, 50.13%, and 45.67%, respectively. Furthermore, DNA fragmentation had not occurred in the fresh and cryopreserved sperm samples, indicating the protective effect of tested cryoprotectants. It is concluded that the 10% DMSO and 15% egg yolk is the best cryoprotectant for naleh fish spermatozoa.(AU)

O peixe naleh Barbonymus sp. é um peixe comercial de água doce, originário de Aceh, Indonésia. Durante vários anos, as perturbações provocadas no seu habitat e a pesca predatória determinaram o declínio da sua população, cuja preservação deve apoiar-se em um programa de reprodução controlada, com o emprego de espermatozoides criopreservados. O presente trabalho realizou um estudo comparativo de cinco crioprotetores: dimetilsultóxido, metanol, etanol, glicerol e etileno glicol. Todos os crioprotetores foram testados na concentração de 10%, combinados a 15% de gema de ovo. Cada tratamento foi efetuado em triplicatas. A solução de ringer foi utilizada como extensor e o esperma foi criopreservado em nitrogênio líquido por 15 dias. Os resultados obtidos revelaram a existência de influência significante (P<0,05) na viabilidade e motilidade espermática bem como na fertilidade dos ovos do peixe naleh, em que o dimetilsulfóxido apresentou o melhor resultado com os valores de 47,17%, 50,13% e 45,67%, respectivamente. Por outro lado, a fragmentação do DNA não ocorreu nas amostras de esperma fresco e criopreservado, indicando o efeito protetor dos crioprotetores testados. A conclusão obtida foi que o dimetilsulfóxido e 15% de gema de ovo foram o melhor crioprotetor para os espermatozoides do peixe naleh.(AU)

Uso do DMSO a 3% e diferentes concentrações de glicerol na curva de resfriamento do sêmen suíno / Use of 3% DMSO and different glycerol concentrations in the swine semen cooling curve

Este trabalho teve como objetivo testar o crioprotetor Dimetilsulfóxido (DMSO-3%) e o glicerol, em cinco concentrações (0,5%, 1%, 3%, 5% e 7%) em uma nova curva de resfriamento. Foram feitas sete coletas de sete varrões (n=49) através da técnica da mão enluvada. O DMSO (3%) e o glicerol foram adicionados separadamente ao diluente de congelação. Durante a análise da curva, a menor média de vigor espermático foi observada à concentração de 7% de glicerol. Na concentração de 1% de glicerol obteve-se maior média de motilidade espermática (72±12,3), sem diferença em relação à concentração de 5%. Maiores médias de vigor e motilidade espermática pós-descongelação foram observadas a3% de glicerol, diferindo das concentrações de 0,5% de glicerol e 3% de DMSO quanto ao vigor e dos demais tratamentos quanto à motilidade espermática. No teste de resistência osmótica o glicerol a 3% como diluente de congelação proporcionou melhor proteção à membrana espermática, diferindo dos demais tratamentos, exceto do DMSO a 3% e glicerola 1%. Observou-se maior porcentagem de células vivas na concentração de 5% e 7% de glicerol, diferindo das demais concentrações. Já o maior percentual de espermatozoides com acrossomas intactos foi observado quando se utilizou o diluente de congelação contendo glicerol a 3% (73,8±11,9). Os resultados do presente estudo, sugeriram que o glicerol, ainda é a melhor opção de crioprotetor a ser utilizada nos processos de criopreservação do espermatozoide suíno.

This study aimed to test the cryoprotectant Dimethylsulfoxide (DMSO-3%) and glycerol, in five concentrations (0.5%, 1%, 3%, 5% and 7%) in a new cooling curve. Seven collections from seven boars (n=49) through the gloved hand technique were made. DMSO (3%) and glycerol were added separately to the freezing diluent. During the analysis of the curve, the lowest mean sperm count was observed at a concentration of 7% glycerol. The concentration of 1% glycerol obtained more sperm motility (72±12.3) but, did not differ in concentrations of 5% glycerol. Higher mean sperm motility and vigor after thawing were observed at 3%glycerol, differing from 0.5% glycerol and 3% DMSO concentrations regarding vigor and other treatments regarding sperm motility. In the osmotic resistance test, 3% glycerol as a freezing agent provided better protection to the spermatic membrane, differing from the other treatments except for 3% DMSO and 1% glycerol. A higher percentage of living cells was observed in the 5% and 7% glycerol concentration, differing from the other concentrations. The highest percentage of spermatozoa with intact acrosomes was observed when the freezing diluent containing 3% glycerol (73.8±11.9) was used. The results of this study suggested that glycerol is still the best cryoprotective option to be used in cryopreservation processes of swine sperm.

Uso do DMSO a 3% e diferentes concentrações de glicerol na curva de resfriamento do sêmen suíno / Use of 3% DMSO and different glycerol concentrations in the swine semen cooling curve

Este trabalho teve como objetivo testar o crioprotetor Dimetilsulfóxido (DMSO-3%) e o glicerol, em cinco concentrações (0,5%, 1%, 3%, 5% e 7%) em uma nova curva de resfriamento. Foram feitas sete coletas de sete varrões (n=49) através da técnica da mão enluvada. O DMSO (3%) e o glicerol foram adicionados separadamente ao diluente de congelação. Durante a análise da curva, a menor média de vigor espermático foi observada à concentração de 7% de glicerol. Na concentração de 1% de glicerol obteve-se maior média de motilidade espermática (72±12,3), sem diferença em relação à concentração de 5%. Maiores médias de vigor e motilidade espermática pós-descongelação foram observadas a3% de glicerol, diferindo das concentrações de 0,5% de glicerol e 3% de DMSO quanto ao vigor e dos demais tratamentos quanto à motilidade espermática. No teste de resistência osmótica o glicerol a 3% como diluente de congelação proporcionou melhor proteção à membrana espermática, diferindo dos demais tratamentos, exceto do DMSO a 3% e glicerola 1%. Observou-se maior porcentagem de células vivas na concentração de 5% e 7% de glicerol, diferindo das demais concentrações. Já o maior percentual de espermatozoides com acrossomas intactos foi observado quando se utilizou o diluente de congelação contendo glicerol a 3% (73,8±11,9). Os resultados do presente estudo, sugeriram que o glicerol, ainda é a melhor opção de crioprotetor a ser utilizada nos processos de criopreservação do espermatozoide suíno.(AU)

This study aimed to test the cryoprotectant Dimethylsulfoxide (DMSO-3%) and glycerol, in five concentrations (0.5%, 1%, 3%, 5% and 7%) in a new cooling curve. Seven collections from seven boars (n=49) through the gloved hand technique were made. DMSO (3%) and glycerol were added separately to the freezing diluent. During the analysis of the curve, the lowest mean sperm count was observed at a concentration of 7% glycerol. The concentration of 1% glycerol obtained more sperm motility (72±12.3) but, did not differ in concentrations of 5% glycerol. Higher mean sperm motility and vigor after thawing were observed at 3%glycerol, differing from 0.5% glycerol and 3% DMSO concentrations regarding vigor and other treatments regarding sperm motility. In the osmotic resistance test, 3% glycerol as a freezing agent provided better protection to the spermatic membrane, differing from the other treatments except for 3% DMSO and 1% glycerol. A higher percentage of living cells was observed in the 5% and 7% glycerol concentration, differing from the other concentrations. The highest percentage of spermatozoa with intact acrosomes was observed when the freezing diluent containing 3% glycerol (73.8±11.9) was used. The results of this study suggested that glycerol is still the best cryoprotective option to be used in cryopreservation processes of swine sperm.(AU)

Efeito do DMSO e glicerol na criopreservação de células tronco mesenquimais derivadas de líquido amniótico de fetos caprinos / Effect of DMSO and glycerol in criopreservation of mesenquimial trunk cells derived from amniotic fluid of caprine fetus

O objetivo do estudo foi avaliar a viabilidade e taxa de proliferação de células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do líquido amniótico (LA) após cultivo in vitro, e o efeito de dois agentes crioprotetores. Foram utilizadas 9 cabras prenhes. As amostras foram colhidas de fetos caprinos por laparotomia, e delas obtidos as (CTMs) e submetidas ao cultivo in vitro. Posteriormente, uma fração das células foi criopreservada em meio DMSO (dimetilsulfóxido) ou glicerol e vitrificadas para posterior avaliação da viabilidade. O meio DMSO promoveu melhores taxas de sobrevida celular preservando as características de pluripotencialidade e de replicação in vitro.

The objective of the study was to evaluate the viability and proliferation rate of mesenchymal stem cells (MTCs) derived from amniotic fluid (LA) after in vitro culture, and the effect of two cryoprotective agents. 9 pregnant goats were used. The samples were collected from goat fetuses by laparotomy, and from them (CTMs) were obtained and cultured in vitro. Subsequently, a fraction of the cells were cryopreserved in DMSO (dimethylsulfoxide) or glycerol medium and vitrified for further evaluation of viability. The DMSO medium promoted better cell survival rates while preserving the characteristics of pluripotency and replication in vitro.

Efeito do DMSO e glicerol na criopreservação de células tronco mesenquimais derivadas de líquido amniótico de fetos caprinos / Effect of DMSO and glycerol in criopreservation of mesenquimial trunk cells derived from amniotic fluid of caprine fetus

O objetivo do estudo foi avaliar a viabilidade e taxa de proliferação de células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do líquido amniótico (LA) após cultivo in vitro, e o efeito de dois agentes crioprotetores. Foram utilizadas 9 cabras prenhes. As amostras foram colhidas de fetos caprinos por laparotomia, e delas obtidos as (CTMs) e submetidas ao cultivo in vitro. Posteriormente, uma fração das células foi criopreservada em meio DMSO (dimetilsulfóxido) ou glicerol e vitrificadas para posterior avaliação da viabilidade. O meio DMSO promoveu melhores taxas de sobrevida celular preservando as características de pluripotencialidade e de replicação in vitro.(AU)

The objective of the study was to evaluate the viability and proliferation rate of mesenchymal stem cells (MTCs) derived from amniotic fluid (LA) after in vitro culture, and the effect of two cryoprotective agents. 9 pregnant goats were used. The samples were collected from goat fetuses by laparotomy, and from them (CTMs) were obtained and cultured in vitro. Subsequently, a fraction of the cells were cryopreserved in DMSO (dimethylsulfoxide) or glycerol medium and vitrified for further evaluation of viability. The DMSO medium promoted better cell survival rates while preserving the characteristics of pluripotency and replication in vitro.(AU)

Effects of cryoprotectants and low temperatures on hatching and abnormal embryo development of Prochilodus lineatus (Characiformes: Prochilodontidae)

This study evaluated the effect of the cryoprotectants and the low temperatures on the embryonic development of Prochilodus lineatus, describing their main morphological alterations. On chilling sensitivity test, the survival rates at the twenty somites stage (20S) were 53.6% at 0ºC, and 100% in 5ºC. To test toxicity, the embryos were exposed to a graded series of 1,2-Propanediol (PROP), dimethyl sulfoxide (Me2SO4) and glycerol (GLY), terminating in a solution of high osmolarity. There was no significant difference in the embryos survival of toxicity test between series of PROP and Me2SO4 in the 6S and 20S. In the cooling protocols, were evaluated the effects of low temperature associated with cryoprotectants. At 5ºC, PROP showed survival rates above 75% in the gastrula stage (G) and above 90% in the 6S and 20S stages. High rates of abnormalities were observed, and the most recurrent were: small bodies, fins presenting uncontrolled cell growth, membrane rupture, and retraction. These results demonstrate the need to use cryoprotectant solutions, even when there is no ice nucleation, and, on the other hand, shows that high cryoprotectant concentrations promote numerous morphological lesions, compromising normal embryonic development.(AU)

Este estudo avaliou os efeitos dos crioprotetores e das baixas temperaturas no desenvolvimento embrionário de Prochilodus lineatus, descrevendo suas principais alterações morfológicas. Nos testes de sensibilidade ao frio, as taxas de sobrevivência, no estágio de vinte somitos (20S), foram de 53,6% a 0ºC e 100% a 5ºC. Nos testes de toxicidade, os embriões foram expostos a uma série graduada dos crioprotetores: 1,2-Propanediol (PROP), dimetilsulfóxido (Me2SO4) e glicerol (GLY), terminando em uma combinação de alta osmolaridade. Não houve diferença significativa na sobrevivência dos embriões nas séries do PROP e Me2SO4 nos estágios de 6S e 20S. Nos protocolos de resfriamento, foram avaliados os efeitos da baixa temperatura associados as séries crioprotetoras. A 5ºC, o PROP apresentou taxas de sobrevivência acima de 75% no estádio de gástrula (G) e acima de 90% nos estádios 6S e 20S. Foram observadas altas taxas de anormalidades sendo as mais recorrentes: corpos pequenos, nadadeiras apresentando crescimento celular descontrolado, ruptura da membrana e retração vitelínica. Estes resultados demonstram a necessidade do uso das soluções crioprotetoras, mesmo não havendo nucleação de gelo e, em contrapartida, demonstra que as elevadas concentrações crioprotetoras promovem numerosas lesões morfológicas, comprometendo o desenvolvimento embrionário.(AU)

Efeito de vitaminas adicionadas ao diluente ACP-104 sobre a qualidade do sêmen criopreservado de carpa comum (Cyprinus carpio) / Effect of vitamins added to the ACP-104 extender on the quality of cryopreserved semen of common carp (Cyprinus carpio)

O objetivo da presente pesquisa foi alcançado com a divisão da pesquisa em dois experimentos: (1) aperfeiçoar o protocolo de congelação utilizando água de coco em pó (ACP-104) como diluente para a criopreservação seminal de carpa comum; (2) avaliar o efeito da suplementação das vitaminas C (ácido ascórbico) ou E (α-tocoferol) sobre os melhores diluidores testados no experimento 1 na qualidade do sêmen pós-descongelado da espécie. Para o experimento 1, foram formados oito pools de sêmen, provenientes de 14 machos selecionados. As amostras seminais coletadas foram avaliadas quanto à motilidade total, à velocidade, ao percentual de espermatozoides normais e à vitalidade espermática antes e depois da criopreservação seminal. Esta foi realizada em meio ACP-104 acrescido de dimetilsulfóxido (DMSO), ou etilenoglicol (EG), ou glicerol, ou metanol, todos à concentração de 10%, diluídos em 1:3 (sêmen:diluidor). As amostras foram, então, congeladas em vapor de nitrogênio líquido em dry shipper e estocadas em nitrogênio líquido (-196°C). Para o experimento 2, foram formados oito pools provenientes da coleta de sêmen de 15 machos. As amostras seminais foram avaliadas seguindo as mesmas análises do experimento 1, acrescentando-se a duração da motilidade total. A criopreservação seminal utilizou-se do meio ACP-104 acrescido de DMSO ou EG, suplementado ou não com vitamina C ou E. Os melhores resultados encontrados no experimento 1 foram obtidos com o DMSO e o EG. Estes não diferiram significativamente entre si para a motilidade total (24% e 28%; P>0,05) e a normalidade espermática (32% e 26%; P>0,05), respectivamente. Para o experimento 2, o EG suplementado com vitamina E produziu significativamente resultados superiores de motilidade total, normalidade espermática e duração da motilidade em relação ao DMSO, concluindo-se que o EG deve ser, portanto, o crioprotetor de escolha a ser utilizado com o ACP-104 suplementado ou não com vitamina E.(AU)

The objective was achieved by dividing the research into two experiments: (1) improving the freezing protocol using powdered coconut water (ACP-104) as a diluent for the cryopreservation seminal of common carp; (2) evaluating the effect of supplementation of vitamins C (ascorbic acid) or vitamin E (α-tocoferol) with the best extenders tested in experiment 1 on the quality of post-thawed. For experiment 1, semen pools from 14 selected males were formed. Seminal samples were evaluated for total motility, velocity, percentage of normal sperm and sperm vitality before and after the seminal cryopreservation. This was done in ACP-104 extender plus dimethyl sulfoxide (DMSO), or ethylene glycol (EG), or glycerol or methanol all at concentration 10% diluted in 1:3 (semen:extender). The samples were frozen in vapors of nitrogen into dry shippers and stored in liquid nitrogen (-196 °C). For experiment 2, eight pools were formed from the 15 males. The semen samples were evaluated following the same analysis of experiment 1 adding duration of total motility. The sperm cryopreservation was performed in extenders ACP-104 plus DMSO or EG supplemented or not with vitamin C or E. The best results found in Experiment 1 were obtained with DMSO and EG. They do not differ significantly for total motility (24% and 28%; P>0.05) and normal sperm (32% and 26%; P>0.05) respectively. For experiment 2, EG supplemented with vitamin E, produced significantly better results overall motility, sperm normality and duration of motility relative to DMSO. In conclusion, EG should be the cryoprotectant of choice for use with the ACP-104 supplemented or not with vitamin E.(AU)

Effects of cryoprotectants and low temperatures on hatching and abnormal embryo development of Prochilodus lineatus (Characiformes: Prochilodontidae)

This study evaluated the effect of the cryoprotectants and the low temperatures on the embryonic development of Prochilodus lineatus, describing their main morphological alterations. On chilling sensitivity test, the survival rates at the twenty somites stage (20S) were 53.6% at 0ºC, and 100% in 5ºC. To test toxicity, the embryos were exposed to a graded series of 1,2-Propanediol (PROP), dimethyl sulfoxide (Me2SO4) and glycerol (GLY), terminating in a solution of high osmolarity. There was no significant difference in the embryos survival of toxicity test between series of PROP and Me2SO4 in the 6S and 20S. In the cooling protocols, were evaluated the effects of low temperature associated with cryoprotectants. At 5ºC, PROP showed survival rates above 75% in the gastrula stage (G) and above 90% in the 6S and 20S stages. High rates of abnormalities were observed, and the most recurrent were: small bodies, fins presenting uncontrolled cell growth, membrane rupture, and retraction. These results demonstrate the need to use cryoprotectant solutions, even when there is no ice nucleation, and, on the other hand, shows that high cryoprotectant concentrations promote numerous morphological lesions, compromising normal embryonic development.(AU)

Este estudo avaliou os efeitos dos crioprotetores e das baixas temperaturas no desenvolvimento embrionário de Prochilodus lineatus, descrevendo suas principais alterações morfológicas. Nos testes de sensibilidade ao frio, as taxas de sobrevivência, no estágio de vinte somitos (20S), foram de 53,6% a 0ºC e 100% a 5ºC. Nos testes de toxicidade, os embriões foram expostos a uma série graduada dos crioprotetores: 1,2-Propanediol (PROP), dimetilsulfóxido (Me2SO4) e glicerol (GLY), terminando em uma combinação de alta osmolaridade. Não houve diferença significativa na sobrevivência dos embriões nas séries do PROP e Me2SO4 nos estágios de 6S e 20S. Nos protocolos de resfriamento, foram avaliados os efeitos da baixa temperatura associados as séries crioprotetoras. A 5ºC, o PROP apresentou taxas de sobrevivência acima de 75% no estádio de gástrula (G) e acima de 90% nos estádios 6S e 20S. Foram observadas altas taxas de anormalidades sendo as mais recorrentes: corpos pequenos, nadadeiras apresentando crescimento celular descontrolado, ruptura da membrana e retração vitelínica. Estes resultados demonstram a necessidade do uso das soluções crioprotetoras, mesmo não havendo nucleação de gelo e, em contrapartida, demonstra que as elevadas concentrações crioprotetoras promovem numerosas lesões morfológicas, comprometendo o desenvolvimento embrionário.(AU)

Efeito de vitaminas adicionadas ao diluente ACP-104 sobre a qualidade do sêmen criopreservado de carpa comum (Cyprinus carpio) / Effect of vitamins added to the ACP-104 extender on the quality of cryopreserved semen of common carp (Cyprinus carpio)

O objetivo da presente pesquisa foi alcançado com a divisão da pesquisa em dois experimentos: (1) aperfeiçoar o protocolo de congelação utilizando água de coco em pó (ACP-104) como diluente para a criopreservação seminal de carpa comum; (2) avaliar o efeito da suplementação das vitaminas C (ácido ascórbico) ou E (α-tocoferol) sobre os melhores diluidores testados no experimento 1 na qualidade do sêmen pós-descongelado da espécie. Para o experimento 1, foram formados oito pools de sêmen, provenientes de 14 machos selecionados. As amostras seminais coletadas foram avaliadas quanto à motilidade total, à velocidade, ao percentual de espermatozoides normais e à vitalidade espermática antes e depois da criopreservação seminal. Esta foi realizada em meio ACP-104 acrescido de dimetilsulfóxido (DMSO), ou etilenoglicol (EG), ou glicerol, ou metanol, todos à concentração de 10%, diluídos em 1:3 (sêmen:diluidor). As amostras foram, então, congeladas em vapor de nitrogênio líquido em dry shipper e estocadas em nitrogênio líquido (-196°C). Para o experimento 2, foram formados oito pools provenientes da coleta de sêmen de 15 machos. As amostras seminais foram avaliadas seguindo as mesmas análises do experimento 1, acrescentando-se a duração da motilidade total. A criopreservação seminal utilizou-se do meio ACP-104 acrescido de DMSO ou EG, suplementado ou não com vitamina C ou E. Os melhores resultados encontrados no experimento 1 foram obtidos com o DMSO e o EG. Estes não diferiram significativamente entre si para a motilidade total (24% e 28%; P>0,05) e a normalidade espermática (32% e 26%; P>0,05), respectivamente. Para o experimento 2, o EG suplementado com vitamina E produziu significativamente resultados superiores de motilidade total, normalidade espermática e duração da motilidade em relação ao DMSO, concluindo-se que o EG deve ser, portanto, o crioprotetor de escolha a ser utilizado com o ACP-104 suplementado ou não com vitamina E.(AU)

The objective was achieved by dividing the research into two experiments: (1) improving the freezing protocol using powdered coconut water (ACP-104) as a diluent for the cryopreservation seminal of common carp; (2) evaluating the effect of supplementation of vitamins C (ascorbic acid) or vitamin E (α-tocoferol) with the best extenders tested in experiment 1 on the quality of post-thawed. For experiment 1, semen pools from 14 selected males were formed. Seminal samples were evaluated for total motility, velocity, percentage of normal sperm and sperm vitality before and after the seminal cryopreservation. This was done in ACP-104 extender plus dimethyl sulfoxide (DMSO), or ethylene glycol (EG), or glycerol or methanol all at concentration 10% diluted in 1:3 (semen:extender). The samples were frozen in vapors of nitrogen into dry shippers and stored in liquid nitrogen (-196 °C). For experiment 2, eight pools were formed from the 15 males. The semen samples were evaluated following the same analysis of experiment 1 adding duration of total motility. The sperm cryopreservation was performed in extenders ACP-104 plus DMSO or EG supplemented or not with vitamin C or E. The best results found in Experiment 1 were obtained with DMSO and EG. They do not differ significantly for total motility (24% and 28%; P>0.05) and normal sperm (32% and 26%; P>0.05) respectively. For experiment 2, EG supplemented with vitamin E, produced significantly better results overall motility, sperm normality and duration of motility relative to DMSO. In conclusion, EG should be the cryoprotectant of choice for use with the ACP-104 supplemented or not with vitamin E.(AU)

Criopreservação do espermatóforo e da massa espermática do camarão branco Litopenaeus schmitti post-mortem / Post-mortem spermatophore and sperm cryopreservation of the white shrimp Litopenaeus schmitti

This study was carried out in two phases; the first to evaluate the viability of two cooling protocols (A and B) using glycerol (10%) as a cryoprotectant and the second, the efficiency of two cryoprotectants (10% glycerol and DMSO) and times (30, 60 and 90 days of storage in liquid nitrogen) for the cryopreservation of post-mortem sperm mass and spermatophores of the shrimp Litopenaeus schmitti. The protocol A presented a cooling rate of 0.5C min-1 until reaching -32ºC and protocol B, 20ºC min-1 until reach -120ºC, after which the samples were transferred to liquid nitrogen (N2L). The sperm viability was assessed by smearing the semen stained with eosin-nigrosin. The curve resulted in higher mean sperm survival was Protocol A (50.9%). Therefore, for the second experiment, the protocol A was used, however there was no difference between the cryoprotectants for sperm mass, although the influence on survival time. Difference was observed between the cryoprotectants and the influence of time on sperm survival of cryopreserved spermatophores. Glycerol 10% was more efficient for cryopreservation of spermatophore, but for the masses sperm, both can be used.(AU)

O presente trabalho foi realizado em duas etapas; a primeira para avaliar a eficiência de dois protocolos de resfriamento (A e B) utilizando glicerol (10%) como crioprotetor e, a segunda, a eficiência de dois crioprotetores (glicerol e dimetilsulfóxido - DMSO a 10%) e o tempo (30, 60 e 90 dias de estocagem em nitrogênio líquido) para a criopreservação da massa espermática e espermatóforo de camarões post mortem da espécie Litopenaeus schmitti. O protocolo A apresentou velocidade de resfriamento de 0,5ºC min-1 até alcançar -32ºC e o protocolo B, 20ºC min-1 até alcançar -120ºC, sendo os materiais posteriormente transferidos para o nitrogênio líquido (N2L). A viabilidade espermática foi avaliada por meio do esfregaço de sêmen corado com eosina-nigrosina. A curva que resultou na maior média de sobrevivência espermática foi a do protocolo A (50,9%). Portanto, para o segundo experimento foi utilizado o protocolo A; entretanto, neste não houve diferença entre os crioprotetores para a massa espermática, contudo, o tempo influenciou na sobrevivência. Foi observada diferença entre os crioprotetores e a influência do tempo na sobrevivência espermática dos espermatóforos criopreservados. O glicerol a 10% foi mais eficiente para a criopreservação dos espermatóforos, porém, para as massas espermáticas, ambos podem ser utilizados.(AU)

Criopreservação do espermatóforo e da massa espermática do camarão branco Litopenaeus schmitti post-mortem / Post-mortem spermatophore and sperm cryopreservation of the white shrimp Litopenaeus schmitti

This study was carried out in two phases; the first to evaluate the viability of two cooling protocols (A and B) using glycerol (10%) as a cryoprotectant and the second, the efficiency of two cryoprotectants (10% glycerol and DMSO) and times (30, 60 and 90 days of storage in liquid nitrogen) for the cryopreservation of post-mortem sperm mass and spermatophores of the shrimp Litopenaeus schmitti. The protocol A presented a cooling rate of 0.5C min-1 until reaching -32ºC and protocol B, 20ºC min-1 until reach -120ºC, after which the samples were transferred to liquid nitrogen (N2L). The sperm viability was assessed by smearing the semen stained with eosin-nigrosin. The curve resulted in higher mean sperm survival was Protocol A (50.9%). Therefore, for the second experiment, the protocol A was used, however there was no difference between the cryoprotectants for sperm mass, although the influence on survival time. Difference was observed between the cryoprotectants and the influence of time on sperm survival of cryopreserved spermatophores. Glycerol 10% was more efficient for cryopreservation of spermatophore, but for the masses sperm, both can be used.

O presente trabalho foi realizado em duas etapas; a primeira para avaliar a eficiência de dois protocolos de resfriamento (A e B) utilizando glicerol (10%) como crioprotetor e, a segunda, a eficiência de dois crioprotetores (glicerol e dimetilsulfóxido - DMSO a 10%) e o tempo (30, 60 e 90 dias de estocagem em nitrogênio líquido) para a criopreservação da massa espermática e espermatóforo de camarões post mortem da espécie Litopenaeus schmitti. O protocolo A apresentou velocidade de resfriamento de 0,5ºC min-1 até alcançar -32ºC e o protocolo B, 20ºC min-1 até alcançar -120ºC, sendo os materiais posteriormente transferidos para o nitrogênio líquido (N2L). A viabilidade espermática foi avaliada por meio do esfregaço de sêmen corado com eosina-nigrosina. A curva que resultou na maior média de sobrevivência espermática foi a do protocolo A (50,9%). Portanto, para o segundo experimento foi utilizado o protocolo A; entretanto, neste não houve diferença entre os crioprotetores para a massa espermática, contudo, o tempo influenciou na sobrevivência. Foi observada diferença entre os crioprotetores e a influência do tempo na sobrevivência espermática dos espermatóforos criopreservados. O glicerol a 10% foi mais eficiente para a criopreservação dos espermatóforos, porém, para as massas espermáticas, ambos podem ser utilizados.

Effect of different types of cryoprotectants on developmental capacity of vitrified-thawed immature buffalo oocytes

Studies were conducted to compare viability of immature buffalo oocytes vitrified in different types of cryoprotectants on the post-thaw morphological appearance, the in vitro maturation and developmental competence of buffalo oocytes. The vitrification solution (VS) consisted of Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) supplemented with 0.5 M sucrose, 0.4% bovine serum albumin (BSA) and different types of molar (M) concentrations of the cryoprotectants which were composed of either glycerol (G), ethylene glycol (EG) or dimethyl sulfoxide (DMSO) in order to determine the best type of vitrification cryoprotectants. The concentrations tested were 4 M, 7 M and 7M concentration of G, EG and DMSO, respectively. Cumulus oocyte complexes (COCs) were obtained from slaughterhouse ovaries. OocytesAnd their cumulus cells were vitrified immediately after collection .The COCs were pre-equilibrated in 50% of the VS for 3-5 min, then kept in VS for 1 min and loaded in pre-sterilized 0.25 ml straws for 7-10 days of storage in liquid nitrogen. The straws were thawed in warm water at 37°C for 10 s. The COCs were equilibrated in 0.5 M sucrose in modified phosphate buffer (M-PBS) for 5 min and then washed in washing medium (TCM-199 plus 10% FCS). Oocyte-cumulus cells were evaluated for morphological damage. Morphologically normal COCs (Oocyte-cumulus cells) were cultured in vitro and evaluated for maturation. Oocytes were fertilized with frozen-thawed semen capacitated in Brackett and Oliphant (BO) medium containing heparin and caffeine and were evaluated for cleavage and embryonic development. The results revealed that the proportion of buffalo oocytes found to be morphologically normal was significantly (P < 0.05) higher in EG and DMSO than those obtained in G (85.0 and 83.33 vs. 65.0%, respectively). Among the damaged oocytes, cracking of zona pellucida was the most frequent abnormality observed.

Effect of different types of cryoprotectants on developmental capacity of vitrified-thawed immature buffalo oocytes

Studies were conducted to compare viability of immature buffalo oocytes vitrified in different types of cryoprotectants on the post-thaw morphological appearance, the in vitro maturation and developmental competence of buffalo oocytes. The vitrification solution (VS) consisted of Dulbeccos phosphate buffered saline (DPBS) supplemented with 0.5 M sucrose, 0.4% bovine serum albumin (BSA) and different types of molar (M) concentrations of the cryoprotectants which were composed of either glycerol (G), ethylene glycol (EG) or dimethyl sulfoxide (DMSO) in order to determine the best type of vitrification cryoprotectants. The concentrations tested were 4 M, 7 M and 7M concentration of G, EG and DMSO, respectively. Cumulus oocyte complexes (COCs) were obtained from slaughterhouse ovaries. OocytesAnd their cumulus cells were vitrified immediately after collection .The COCs were pre-equilibrated in 50% of the VS for 3-5 min, then kept in VS for 1 min and loaded in pre-sterilized 0.25 ml straws for 7-10 days of storage in liquid nitrogen. The straws were thawed in warm water at 37°C for 10 s. The COCs were equilibrated in 0.5 M sucrose in modified phosphate buffer (M-PBS) for 5 min and then washed in washing medium (TCM-199 plus 10% FCS). Oocyte-cumulus cells were evaluated for morphological damage. Morphologically normal COCs (Oocyte-cumulus cells) were cultured in vitro and evaluated for maturation. Oocytes were fertilized with frozen-thawed semen capacitated in Brackett and Oliphant (BO) medium containing heparin and caffeine and were evaluated for cleavage and embryonic development. The results revealed that the proportion of buffalo oocytes found to be morphologically normal was significantly (P < 0.05) higher in EG and DMSO than those obtained in G (85.0 and 83.33 vs. 65.0%, respectively). Among the damaged oocytes, cracking of zona pellucida was the most frequent abnormality observed.(AU)

Cryopreservation and sperm storage of the white shrimp / Criopreservação e estocagem do sêmen do camarão branco

This study was performed to evaluate a protocol for sperm cryopreservation of the marine shrimp Litopenaeus schmitti, an important species in Brazilian commercial fisheries. No studies or protocols were found for cryopreservation of its spermatic mass. This paper provides information about the technique of semen storage based on protocols applied to other penaeids species. Two cryoprotectants, glycerol and dimetilsulfoxide (DMSO), were tested for sperm cells toxicity in two concentrations (5 and 10%), and two exposure times (10 and 30 minutes). Influence of liquid nitrogen storage in apparent sperm viability (ASV) was also tested in 1, 15 and 30 days of storage. The cryopreservation was performed in a two-step (2 and 0.5ºC min-1) freezing protocol. After freezing until the temperature -32C, sperm mass was immersed in liquid nitrogen (-196ºC). Thus, glycerol and DMSO was not toxic to sperm in both concentrations and equilibration times. For all toxicity tests ASV was up to 79.8% after exposure. Liquid nitrogen storage tests indicated no significant difference between glycerol 5 and 10%. Results were significantly different over timebetween days 15 and 30 of storage in liquid nitrogen, in which ASV was around 42.8% and 16.3%respectively. Thus, it is suggested glycerol 5% (10 minutes) as cryoprotectant for L. schmittispermatic mass cryopreservation. It is also suggested that the L. schmitti spermatic mass can be stored during 15 days in liquid nitrogen, using a two-step (2 and 0.5ºC min-1) freezing protocol.(AU)

Este estudo foi realizado ara avaliar um protocolo de criopreservação do sêmen do camarão marinho Litopenaeus schmitti, uma espécie importante para a pesca comercial no Brasil. Não foram encontrados estudos ou protocolos de criopreservação de sua massa espermática. Este estudo fornece informações sobre a técnica de armazenamento de sêmen com base em protocolos aplicados a outras espécies de peneídeos. Dois agentes crioprotectores, glicerol e dimetilsulfóxido (DMSO), foram testados quanto à toxicidade para as células espermáticas em duas concentrações (5 e 10%) e dois tempos de exposição (10 e 30 minutos). A influência da manutenção em nitrogênio líquido sobre a viabilidade espermática aparente (VEA) foi também testada em 1, 15 e 30 dias de armazenamento. Para criopreservação, utilizou-se um protocolo de congelamento em duas etapas (2 e 0,5ºC min-1). Após o resfriamento até a temperatura de -32°C, a massa espermática foi imersaem nitrogênio líquido (-196°C). Assim, glicerol e DMSO não foram tóxicos para o esperma em ambas as concentrações e tempos de equilíbrio. Para todos os testes de toxicidade a VEA foi de até79,8% após a exposição. Os testes de armazenamento em nitrogênio líquido não indicaram diferença significativa utilizando glicerol 5 e 10%, mas houve diferença significativa entre os dias 15(42,8%) e 30 (16,3%), para a VEA. Assim, sugere-se a utilização do glicerol 5 ou 10% (10 minutos) como crioprotetor para a criopreservação de massa espermática do camarão L. schmitti. Também é sugerido que a massa espermática do L. schmitti pode ser armazenada durante 15 dias emnitrogênio líquido, utilizando-se um protocolo de congelamento em duas etapas (2 e 0,5ºC min-1).(AU)

Cryopreservation and sperm storage of the white shrimp / Criopreservação e estocagem do sêmen do camarão branco

This study was performed to evaluate a protocol for sperm cryopreservation of the marine shrimp Litopenaeus schmitti, an important species in Brazilian commercial fisheries. No studies or protocols were found for cryopreservation of its spermatic mass. This paper provides information about the technique of semen storage based on protocols applied to other penaeids species. Two cryoprotectants, glycerol and dimetilsulfoxide (DMSO), were tested for sperm cells toxicity in two concentrations (5 and 10%), and two exposure times (10 and 30 minutes). Influence of liquid nitrogen storage in apparent sperm viability (ASV) was also tested in 1, 15 and 30 days of storage. The cryopreservation was performed in a two-step (2 and 0.5ºC min-1) freezing protocol. After freezing until the temperature -32C, sperm mass was immersed in liquid nitrogen (-196ºC). Thus, glycerol and DMSO was not toxic to sperm in both concentrations and equilibration times. For all toxicity tests ASV was up to 79.8% after exposure. Liquid nitrogen storage tests indicated no significant difference between glycerol 5 and 10%. Results were significantly different over timebetween days 15 and 30 of storage in liquid nitrogen, in which ASV was around 42.8% and 16.3%respectively. Thus, it is suggested glycerol 5% (10 minutes) as cryoprotectant for L. schmittispermatic mass cryopreservation. It is also suggested that the L. schmitti spermatic mass can be stored during 15 days in liquid nitrogen, using a two-step (2 and 0.5ºC min-1) freezing protocol.

Este estudo foi realizado ara avaliar um protocolo de criopreservação do sêmen do camarão marinho Litopenaeus schmitti, uma espécie importante para a pesca comercial no Brasil. Não foram encontrados estudos ou protocolos de criopreservação de sua massa espermática. Este estudo fornece informações sobre a técnica de armazenamento de sêmen com base em protocolos aplicados a outras espécies de peneídeos. Dois agentes crioprotectores, glicerol e dimetilsulfóxido (DMSO), foram testados quanto à toxicidade para as células espermáticas em duas concentrações (5 e 10%) e dois tempos de exposição (10 e 30 minutos). A influência da manutenção em nitrogênio líquido sobre a viabilidade espermática aparente (VEA) foi também testada em 1, 15 e 30 dias de armazenamento. Para criopreservação, utilizou-se um protocolo de congelamento em duas etapas (2 e 0,5ºC min-1). Após o resfriamento até a temperatura de -32°C, a massa espermática foi imersaem nitrogênio líquido (-196°C). Assim, glicerol e DMSO não foram tóxicos para o esperma em ambas as concentrações e tempos de equilíbrio. Para todos os testes de toxicidade a VEA foi de até79,8% após a exposição. Os testes de armazenamento em nitrogênio líquido não indicaram diferença significativa utilizando glicerol 5 e 10%, mas houve diferença significativa entre os dias 15(42,8%) e 30 (16,3%), para a VEA. Assim, sugere-se a utilização do glicerol 5 ou 10% (10 minutos) como crioprotetor para a criopreservação de massa espermática do camarão L. schmitti. Também é sugerido que a massa espermática do L. schmitti pode ser armazenada durante 15 dias emnitrogênio líquido, utilizando-se um protocolo de congelamento em duas etapas (2 e 0,5ºC min-1).

ESTEBELECIMENTO DE PROTOCOLOS PARA A CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO TESTICULAR DE CATETOS (Pecari tajacu LINNAEUS, 1758)

A criopreservação de tecido gonadal masculino pode ser usada na conservação de material genético, no intuito da formação de um banco de germoplasma permitindo a manutenção da variabilidade genética em animais pré-puberes e adultos. Diante disso, objetivou-se estabelecer um protocolo eficiente de criopreservação de tecido testicular de catetos. Para tanto, o estudo foi dividido em dois experimentos, sendo utilizados 10 animais adultos, 5 em cada experimento, oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres da UFERSA. No experimento I, cinco pares de testículos foram fragmentados (9 mm3) e alocados em grupos não-vitrificados (controle) e vitrificados em superfície sólida (VSS), após a exposição a diferentes crioprotetores (dimetilsulfóxido - DMSO 3,0 M, etileno glicol - EG 3,0 M e a combinação 1,5 M DMSO/1,5 M EG). As amostras não-vitrificadas e vitrificadas foram avaliadas quanto à histomorfologia, ultraestrutura, viabilidade e potencial de capacidade proliferativa. A conservação adequada da organização ultraestrutural do túbulo seminífero em termos de presença de lúmen e junções celulares foi observada somente com o uso da combinação DMSO/EG. Independentemente do crioprotetor, a vitrificação conservou efetivamente a visualização e a condensação nuclear das células de maneira semelhante à observada no grupo não vitrificado. Além disso, a combinação DMSO/EG proporcionou uma melhor conservação das membranas basais dos túbulos seminíferos que o DMSO (P < 0,05). Somente a combinação DMSO/EG manteve o potencial de capacidade proliferativa para espermatogônia (3,69 Regiões Organizadoras de Nucléolos - NORs/célula) e célula de Sertoli (3,19 NORs/célula) semelhantes aos controles (3,46 e 3,31 NORS/célula, respectivamente). Portanto, DMSO/EG é melhor que o DMSO ou o EG sozinho para VSS de tecido testicular de cateto adulto. No experimento II, cinco pares de testículos foram fragmentados (3 mm3) e alocados a grupos não-criopreservados (controle) e criopreservados usando três métodos de criopreservação: congelação lenta (CL), vitrificação em criotubos (VC) e VSS, sendo então expostos a diferentes combinações de crioprotetores (1,5 M DMSO/1,5 M EG, 1,5 M DMSO/1,5 M glicerol G, e 1,5 M G/1,5 M EG). As amostras, não-criopreservadas e criopreservadas foram avaliadas quanto à fragmentação de DNA, viabilidade, potencial de capacidade proliferativa e histomorfologia. Apenas no uso de DMSO/EG durante a CL e VC foi possível conservar a integridade do DNA de modo similar ao controle (P>0,05). Em adição, observou-se que, independentemente do método de criopreservação, as combinações DMSO/EG e DMSO/G foram capazes de conservar a viabilidade (P>0,05). Todos os tratamentos mantiveram o potencial de capacidade proliferativa para espermatogônia de modo similar; entretanto, apenas o G/EG, nos métodos de CL e VSS, foram inferiores ao controle para célula de Sertoli (P>0,05). Finalmente, o protocolo de CL usando as combinações DMSO/EG e DMSO/G foram melhores em evitar o aparecimento de edemas que G/EG CL e DMSO/G VSS (P<0.05). Assim, sugere-se a utilização da combinação DMSO/EG associada aos métodos de congelação lenta ou vitrificação para a criopreservação de tecido testicular de catetos adultos.

Cryopreservation of male gonadal tissue can be used in the conservation of genetic material, in order to form a germplasm bank allowing the maintenance of genetic variability in prepubertal and adult animals. Therefore, the aim was to establish an efficient protocol for cryopreservation of testicular tissue of collared peccaries. Therefore, the study was divided into two experiments, using 10 adult animals, 5 for each experiment, from the UFERSA Center for Wild Animals Multiplication. In experiment I, five pairs of testicles were fragmented (9 mm3) and allocated to non-vitrified (control) and vitrified solid-surface (SSV) groups following exposure to different cryoprotectants (3.0 M dimethyl sulfoxide (DMSO), 3.0 M ethylene glycol (EG) or 1.5 M DMSO/1.5 M EG). After warming, samples were evaluated for histomorphology, ultrastructure, viability, and proliferative capacity potential. The appropriate conservation of the ultrastructural organization of the seminiferous tubule in terms of lumen presence and cell junctions was only observed at the use of DMSO/EG combination. Regardless of the cryoprotectant, the vitrification effectively preserved cell nuclear visualization and condensation similarly as observed at the non-vitrified group. Moreover, DMSO/EG combination provided a better preservation of basal membranes of seminiferous tubules than DMSO (P < 0.05). Only the DMSO/EG combination maintained the proliferative capacity potential for spermatogonia (3.69 Nucleolus Organizing Regions - NORs/cell) and Sertoli cell (3.19 NORs/cell) similar to controls (3.46 and 3.31 NORS/cell, respectively). In conclusion, DMSO/EG in combination is better than DMSO or EG alone for SSV of testicular tissue biopsies from adult collared peccaries. In experiment II, five pairs of testicles were also fragmented (3 mm3) and allocated to non-cryopreserved (control) and cryopreserved groups using three cryopreservation methods: slow freezing (SF), cryotube vitrification (CV) and solid surface vitrification (SSV), and then exposed to different combinations of cryoprotectants (1.5 M DMSO/1.5 M EG, 1.5 M DMSO/1.5 M glycerol - G, and 1.5 M G/1.5 M EG). Non-cryopreserved and cryopreserved samples were evaluated for histomorphology, viability, proliferative potential and DNA fragmentation. Only in the use of DMSO/EG during SF and CV, it was possible to preserve DNA integrity in a similar way to control (P> 0.05). In addition, it was observed that, regardless the cryopreservation method, the DMSO/EG and DMSO/G combinations were able to preserve viability (P> 0.05). All treatments maintained the proliferative capacity potential for spermatogonia in a similar manner; however, G/EG in the SF and SSV methods impaired the proliferative potential of Sertoli cells (P> 0.05). Finally, the SF protocol using the DMSO/EG or DMSO/G combinations were better at preventing edema than G/EG for SF and DMSO/ G for SSV (P <0.05). In conclusion, we suggest the use of a DMSO/EG combination associated with slow freezing or vitrification in cryotubes for cryopreservation of testicular tissue of adult peccaries.

TOXICIDADE DE AGENTES CRIOPROTETORES EM CÉLULAS ESPERMÁTICAS DE Macrobrachium amazonicum (Heller 1862) (Decapoda, Palaemonidae)

As técnicas de criopreservação têm se destacado na aquicultura por viabilizar a estocagem e o transporte de material genético. Para tanto o uso de agentes crioprotetores são comumente empregados, contudo, quando utilizados em altas concentrações podem apresentar efeitos tóxicos. Assim, testes prévios de toxicidade são capazes de estabelecer as concentrações mais eficazes para os protocolos de criopreservação. Este estudo avaliou os efeitos de toxicidade dos agentes crioprotetores dimetilsulfóxido (DMSO), etilenoglicol (EG) e glicerol (GLY) na massa espermática de M. amazonicum. Para o presente experimento, 150 espermatóforos foram coletados de 30 machos de M. amazonicum, usando uma adaptação da técnica de leve compressão abdominal. A massa espermática foi extrusada, formando pools e submetida em DMSO, GLY e EG nas concentrações de 5, 10 e 15% v/v, preparada em solução salina estéril livre de cálcio (Ca-F) durante 30 minutos de tempo de equilíbrio. O percentual de espermatozoides vivos foi determinado por um teste modificado de coloração com eosina-nigrosina e os espermatozoides foram contados em microscópio óptico (40x) com auxílio de um hemicitômetro (câmara de Neubauer). Os resultados foram analisados utilizando análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey HSD e Dunnett a um nível de significância de 5%. De acordo com o teste de toxicidade, o GLY foi o menos tóxico entre os crioprotetores testados em comparação com o controle (P < 0,05) com 47,5 ± 2,2 de espermatozoides vivos. Os testes de toxicidade de DMSO não revelaram diferença estatisticamente significativa (P < 0,05) nas concentrações de 5, 10 e 15% com 18,6 ± 1,8, 19,2 ± 2,0 e 16,5 ± 2,7 de espermatozoides vivos, respectivamente. Para testes com EG, a concentração de 15% resultou em 100% de mortalidade nas células espermáticas testadas. Este estudo sugere que a massa espermática de M. amazonicum pode ser criopreservado utilizando GLY 5% como agente crioprotetor.

The cryopreservation techniques have been highlighted in aquaculture by enabling the storage and transport of genetic material. For this, the use of cryoprotectants is commonly used, however, when used in high concentrations they may present toxic effects. Thus, prior toxicity tests are able to establish the most effective concentrations for cryopreservation protocols. This study evaluated toxicity effects of cryoprotectants agents dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG) and glycerol (GLY) on Macrobrachium amazonicum sperm mass. For the present experiment, 150 spermatophores were taken from 30 M. amazonicum males, collected using an adapting technique of gentle abdominal compression. The sperm mass were extruded in pools and submitted in DMSO, GLY and EG at concentrations of 5, 10 and 15% v/v, prepared in sterile Calcium Free saline (Ca-F saline) for 30 min of equilibration time. The survival of the sperm was determined by staining with eosin-nigrosin modified and sperm cells were counted in the optical microscope (40x) with the aid of a hemacytometer (Neubauer chamber). Results were analysed using analysis of variance (ANOVA), Tukeys and Dunnetts test at a 5% significance level. According cryoprotectant toxicity assay, GLY was less toxic among the tested cryoprotectants compared to control (P < 0.05) with 47.5 ± 2.2 of viability sperm. DMSO toxicity tests revealed no statistically significant difference (P < 0.05) between 5, 10 and 15% sperm viability with 18.6 ± 1.8, 19.2 ± 2.0 and 16.5 ± 2.7 respectively. For tests with EG, the concentration of 15% resulted in 100% mortality to tested sperm. This study suggests that sperm mass from M. amazonicum can be cryopreserved using GLY 5% as a cryoprotective agent.

Evaluation of different cryoprotective agents in maintenance of viability of Helicobacter pylori in stock culture media

Four different cryoprotective supplemented stock media were evaluated for maintaining better survival and recovery of H. pylori type strain NCTC 11637 at two different maintenance temperatures of -20°C and -80°C after one month preservation as frozen stocks. The spread plate colony count method was used to investigate the recovery rate of H. pylori from equally inoculated bacterial suspensions in differently prepared stock cultures. After the preservation of H. pylori for one month in different cryoprotectant-supplemented stock media, the recovery rates for -20°C obtained for stock cultures supplemented with dimethyl sulfoxide (DMSO), polyethylene glycol (PEG), glycerol and glycerol+sucrose, as well as controls with and without human serum alone were 7.13, 6.97, 7.93, 7.99, 6.95 and 0.0 log CFU/ml, respectively. Maintenance of bacteria at -80°C gave statistically higher recovery rates compared to preservation at -20°C with the values of 8.55, 8.24, 8.59, 8.66, 8.01 and 0.0 log CFU/ml for these above mentioned stock cultures. The stock cultures supplemented with glycerol+sucrose and glycerol showed the highest recovery rates, 7.99 and 7.93 for -20°C vs. 8.66 and 8.59 for -80°C respectively, which were statistically different from the others. Our study revealed that H. pylori type strain NCTC 11637 could be better preserved at -80°C than -20°C. The best stock media which supported viability or culturability of bacteria were brain heart infusion broth (BHI)+glycerol+human serum and BHI+glycerol+sucrose+human serum, where the latter yielded the higher recovery rate.