Resumo

A mastite bovina é a doença mais frequente em vacas leiteiras, o que resulta em significativas perdas econômicas. Staphyloccoccus aureus e Streptococcus uberis estão entre as principais causas de mastite clínica (MC) e subclínica (MSC), pois são de difícil controle por medidas convencionais, já que ambos possuem mecanismos de evasão do sistema imune, aderência e internalização nos tecidos mamários. Sendo assim, esta tese foi organizada em três experimentos: 1) Caracterização genotípica de S. aureus isolados de mastite de rebanhos brasileiros e de outros países; 2) Caracterização genotípica e sensibilidade aos antimicrobianos de isolados de S. aureus identificados antes e após o tratamento de MSC durante a lactação e 3) Diversidade genotípica e fatores de virulência de S. uberis cepas de infecções intramamárias de vacas leiteiras no Brasil. No experimento 1, 70 isolados de S. aureus (35 de MC e 35 de MSC) foram isoladas de amostras de leite de quartos mamários de vacas em 16 rebanhos do Brasil. Estes isolados foram agrupados à isolados provenientes da Argentina, Colômbia, Alemanha, Itália, EUA, África do Sul e Tunísia para genotipagem por RS-PCR, baseada na amplificação do espaço intergênico 16S-23S rRNA e investigados em relação a 26 fatores de virulência. No experimento 2, 79 isolados de S. aureus foram genotipados por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) e avaliados quanto à concentração inibitória mínima (CIM) para determinação dos perfis de resistência aos antimicrobianos. No experimento 3, 44 isolados de S. uberis foram avaliados por hibridização de DNA através da metodologia dot blot para determinação da diversidade genotípica. Os resultados do experimento 1 indicaram alta variabilidade genotípica de S. aureus de acordo com os países avaliados, e prevalência de genes relacionados à invasão ao organismo do hospedeiro (clfA, nuc, lukE, lukE-lukD, lukS/F-P, scn, chp, fmtB, sak, cna) e genes associados à evasão da resposta imune (tsst, eta, etb, sea, sec, sed, seg, seh, sei, sej, sel, mecA). Além disso, foi demonstrado que o padrão genotípico de isolados de S. aureus foi específico para cada país, sugerindo que as estratégias de controle devem ser formuladas de acordo com a região em questão e com a virulência das cepas envolvidas na infecção. No experimento 2, foi identificada alta similaridade entre os isolados de um mesmo rebanho indicando especificidade genotípica dentro de uma mesma região, mesmo após os tratamentos durante a lactação. Além disso, grande porcentagem dos isolados se mostrou suscetível à gentamicina, enrofloxacina, ciprofloxacina e tetraciclina, embora alta resistência para a amoxicilina e cefalexina tenha sido também observada. No experimento 3, foram observados nove padrões de dot blot, indicando alta heterogeneidade dos isolados de S. uberis. Foi possível observar alta prevalência dos genes reguladores de fatores de virulência, como sua e gapC, responsáveis pela aderência e internalização de S. uberis nos tecidos da glândula mamária. Assim, após a conclusão dos três experimentos desta tese, foi possível concluir que há alta diversidade genotípica em S. aureus e S. uberis isolados de infecções intramamárias no Brasil e em outros países. Além disso, foi confirmado que estas duas espécies apresentam inúmeros fatores de virulência que contribuem para sua permanência na glândula mamária e dificultam o controle da mastite por meio de medidas convencionais. As técnicas moleculares são eficientes na identificação e caracterização genética de isolados bacterianos e são ferramentas auxiliares no diagnóstico e epidemiologia da mastite.

The bovine mastitis is the disease more frequent of dairy cows, which results in significant economic losses. Staphyloccoccus aureus and Streptococcus uberis are among the main causes of clinical (CM) and subclinical (MSC) mastitis, because they are difficult to control by conventional measures, since both have mechanisms of immune system evasion, adherence and internalization in the mammary tissues. Therefore, this thesis was organized in three experiments: 1) Genotypic characterization of S. aureus isolated from mastitis from Brazilian herds and from other countries; 2) Genotypic characterization and antimicrobial sensitivity of S. aureus isolates identified before and after treatment of MSC during lactation; and 3) Genotypic diversity and virulence factors of S. uberis isolated from intramammary infections of dairy cows in Brazil. In experiment 1, 70 S. aureus isolates (35 from MC and 35 from MSC) were identified in milk samples from cows' mammary quarters in 16 herds in Brazil. These isolates were grouped with isolates from Argentina, Colombia, Germany, Italy, USA, South Africa and Tunisia for genotyping by RS-PCR, based on the amplification of the 16S-23S rRNA intergenic space and investigated in relation to 26 virulence factors. In experiment 2, 79 S. aureus isolates were genotyped by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and evaluated by minimum inhibitory concentration (MIC) to assess antimicrobial resitance profiles. In experiment 3, 44 isolates of S. uberis were evaluated by DNA hybridization using the dot blot methodology, to determine the genotypic diversity. The results of experiment 1 indicated high genotypic variability of S. aureus according to the countries evaluated, prevalence of genes related to invasion to the host organism (clfA, nuc, lukE, lukE-lukD, lukS / FP, scn, chp, fmtB, sak, cna) and presence of genes associated to the evasion of the immune response (tsst, eta, etb, sea, sec, sed, sec, seh, sei, sej, sel, mecA). In addition, it was shown that the genotype pattern os S. aureus isolates were specific to each country, suggesting that control strategies should be formulated according to the region in question and the virulence of the strains involved in the infection. In experiment 2, a high similarity was identified between the isolates of the same herd, indicating genotypic specificity within the same region, even after treatments during lactation. In addition, a large percentage of the isolates were susceptible to gentamicin, enrofloxacin, ciprofloxacin and tetracycline, although high resistance to amoxicillin and cephalexin has also been observed. In experiment 3, nine dot blot patterns were observed, indicating high heterogeneity of S. uberis isolates. It was possible to observe a high prevalence of genes regulating virulence factors, such as sua and gapC, responsible for the adherence and internalization of S. uberis in the mammary gland tissues. Thus, after the conclusion of the three experiments in this thesis, it was possible to conclude that there is a high genotypic diversity in S. aureus and S. uberis isolated from intramammary infections in Brazil and other countries. In addition, it has been confirmed that these two species have numerous virulence factors that contribute to their permanence in the mammary gland and that hinder the conventional mastitis control measures. The molecular techniques are efficient in the identification and genetic characterization of bacterial isolates and are auxiliary tools in the diagnosis and epidemiology of mastitis.

Resumo

We analyzed cervical specimens of 202 women, aged 15 to 64 years, attended at Luis Antonio Hospital, Natal, Brazil, to determine the prevalence of HPV and identify the more frequent genotypes and risk factors for HPV infection in women attended at a cervical cancer screening service. Two specimens were collected from each patient: one for cytological examination and the other to detect HPV DNA by PCR, and typing by dot blot hybridization. A total of 54.5 percent of the sample had normal cytology and 45.5 percent had cytological alterations. HPV was detected in 24.5 percent of the cytologically normal women and in 59.8 percent of those with altered cytology. Both single and double HPV infection increased the likelihood of cytological alterations. Thirteen types of HPV were identified, most of which were high risk. HPV 16 was the most prevalent single-type infection, followed by HPV 58. The most frequent double infection was the association between HPV 56 and 57. The prevalence of HPV in cytologically normal women was greater than that reported for countries on all the continents except Africa. The inverse was observed in women with cytological alterations. The distribution of HPV types was similar to that described for the Americas, with some differences. Multiple sexual partners was the only risk factor showing an association with the presence of HPV infection.

Foram analisados espécimes cervicais de 202 mulheres, com idade variando de 15 e 64 anos, atendidas no Hospital Luis Antonio, Natal-RN, objetivando determinar a prevalência do HPV, identificar genotipos do vírus e possíveis fatores de risco para a infecção por esse patógeno, em mulheres atendidas em um serviço de rastreamento do câncer do colo do útero. De cada paciente foram coletados dois espécimes: um destinado ao exame citológico e outro para detecção do HPV por PCR, com tipagem por hibridização "dot blot". Das pacientes incluídas no estudo, 54,5 por cento apresentaram citologia normal e 45,5 por cento tinham alterações citológicas. HPV foi detectado em 24,5 por cento das mulheres com citologia normal, e em 59,8 por cento das que apresentaram citologia alterada. Tanto a infecção por um único tipo de HPV, quanto a infecção simultânea por dois tipos diferentes do vírus aumentaram a chance de ocorrência de alterações citológicas. Foram identificados treze tipos de HPV, a maioria de alto risco. Nas infecções por um único tipo, o HPV 16 foi o mais prevalente, seguido do HPV 58. Na infecção dupla a associação mais freqüente foi entre HPV 56 e 57. A prevalência do HPV nas mulheres com citologia normal foi superior a relatada para países de todos os continentes, exceto África. Nas mulheres com alterações citológicas observou-se resultado inverso. A distribuição dos tipos de HPV foi semelhante à descrita para Américas, com algumas diferenças. Dos fatores de risco analisados, o relacionamento sexual com múltiplos parceiros foi o único que apresentou associação com a presença de infecção por HPV.

Resumo

Acute and latent infections with the Brazilian LA031 strain of Aujeszky's disease virus (ADV) were established in mice. Ultraviolet irradiated ADV administered subcutaneously was a successful way to establish latent infection. The presence of ADV was detected by PCR. Two sets of 22-mer primers were synthesized and used to amplify gG glycoprotein gene sequences in acute and latent infected trigeminal nerve ganglia. The specificity of the amplification was verified by dot-blot hybridization.