Resumo
investigação do proteoma é um componente essencial para fornecer informações acerca das proteínas envolvidas em estresses. O presente trabalho tem o objetivo de determinar possíveis alterações no perfil de expressão de proteínas induzidas por estresse com amônia, em tecido hepático e branquial de Oreochromis niloticus (Tilápia do Nilo) e identificar possíveis biomarcadores relacionados a esse estresse, bem como, isolar e caracterizar uma lectina identificada no tecido hepático de tilápia. Os peixes foram cultivados em sistema outdoor e divididos em dois grupos: grupo experimental (que não recebeu aeração mecânica) grupo controle (que recebeu aeração mecânica da água). Foram utilizados 10 peixes de cada grupo para análise proteômica. O perfil das proteínas foi obtido através da técnica de eletroforese bidimensional e a identificação por espectrometria de massas. Para o isolamento e caracterização da lectina foi utilizado peixes comercialmente disponíveis. A análise proteômica comparativa revelou alteração na expressão de 24 spots no fígado e 6 spots em brânquias do grupo experimental. Os spots diferencialmente expressos foram submetidos à análise de espectrometria de massas, com identificação resultante de 5 proteínas para fígado e nenhuma para brânquias. As proteínas com nível de expressão alterado no fígado estão envolvidas na estrutura celular, transdução de sinal, modificação proteica, metabolismo e transporte, as quais podem ser fortes candidatas a biomarcadores de estresse por amônia. Estas podem estar relacionadas à recuperação e proteção celular, evitando danos severos na célula. Esses resultados podem fornecer uma melhor compreensão sobre as proteínas que estão envolvidas na resposta ao estresse estudado. Também foi isolada uma lectina do fígado de tilápia a partir da combinação das cromatografias de afinidade e troca iônica, apresentando um peso molecular estimado por SDS-PAGE em 26 kDa, foi inibida com mais eficiência pelo açúcar 4-Nitrofenil ß-Galactopironosídeo, inibindo a atividade lectínica a uma concentração de 1.562 mM, exibiu toxicidade a náuplios de Artemia sp após 48 horas e apresentou interferência na formação de biofilmes nas concentrações de 31,25 e 62, 5 g/mL para Staphylococcus aureus e de 125 e 250 g/mL para Escherichia coli e inibiu significantemente o número de células viáveis nas bactérias testadas.
The investigation of the proteome is an essential component to provide information about the proteins involved in stress. This study aims to determine possible changes in the expression profile of proteins induced by stress with ammonia in liver and gill tissues of Oreochromis. niloticus (Nile tilapia) and identify potential biomarkers related to stress, as well, purify a lectin identified in the liver of tilapia. The fish were grown in outdoor system and divided into two groups: negative control (they received no mechanical aeration) positive control (which received mechanical aeration of water). 10 fishes from each group were used for proteomic analysis. The proteins profiles were obtained by two-dimensional electrophoresis and identified by mass spectrometry. Lectin was isolated from liver of commercially available fish. Comparative proteomic analysis revealed changes in the expression of 24 spots in the liver and 6 spots in the gills at the negative control. The differentially expressed spots were subjected to analysis of mass spectrometry, with resulting identification of 5 proteins for liver and in gills were not identified. The altered expression levels proteins in the liver are involved in cell structure, signal transduction, protein modification, metabolism and transport, which can be strong candidates for ammonia biomarkers stress. This may be related to the recovery and cell protection by preventing severe damage to the cell. These results may provide a better understanding of the proteins that are involved in the stress response studied. It has also been isolated lectin of tilapia liver from the combination of affinity and ion exchange chromatographies, having a molecular weight estimated by SDS-PAGE at 26 kDa, was inhibited more efficiently by the 4-Nitrophenyl ß-Galactopironoside sugar, inhibiting the lectin activity at a concentration of 1,562 mM, exhibited toxicity at Artemia sp after 48 hours and showed interference in the formation of biofilms in concentrations of 31,25 and 62 5 µg/mL for Staphylococcus aureus and 125 and 250 µg/mL for Escherichia coli and inhibited significantly the number of viable cells in the tested bacteria.
Resumo
O protozoário parasita Cryptosporidium parvum tem sido reconhecido como um importante patógeno emergente. Para estudos moleculares, a maioria das técnicas para extração do DNA requer o uso de kits importados para concentrar, romper a parede muito resistente do oocisto e purificar o DNA das matrizes das amostras. O objetivo do estudo foi desenvolver um método simples e rápido, baseado na reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detectar Cryptosporidium em fezes preservadas. Oocistos foram concentrados das amostras fecais pela flutuação em gradiente de sacarose. Dos oocistos purificados foi extraído o DNA genômico através de incubação em tampão de lise contendo 70 mM -mercaptoetanol, digerido com proteinase K e extraído com fenol-clorofórmio-álcool isoamílico. A padronização foi iniciada com a PCR única para detectar Cryptosporidium spp usando um par de primer genérico (AWA). Para identificar C. parvum foi realizada a PCR única com o par de primer especifico (LAX). Para aumentar a sensibilidade do método, foi testada a nested-PCR, usando o primer externo XIA. Foram analisadas 39 amostras de DNA do bezerro padrão, 52 amostras de 17 pacientes e 45 amostras de 14 animais. Os resultados foram: 54,28% de positividade na PCR AWA, e 71,42% na nested-PCR XIA/AWA, 67,74% na PCR LAX e 44,44% na nested-PCR XIA/LAX das amostras do bezerro. A positividade geral nas amostras de pacientes e
The protozoan parasite Cryptosporidium parvum has become recognised as important emerging human pathogens. For molecular studies, most of the techniques to extract genomic DNA require the use of imported kits to concentrate, rupture the very resistant oocyst wall, and purify the DNA from the samples matrix. The aim of this study was to develop a simple and rapid method based on polymerase chain reaction (PCR) to detect Cryptosporidium in preserved faeces. Oocysts were concentrated from faecal specimens by flotation on sucrose gradient. Genomic DNA was prepared from purified oocysts by adding a lysis buffer containing 70 mM -mercaptoethanol, digested with proteinase K and extracted with phenol-chlorophorm-isoamyl. The standardization was started by performing a one step PCR to detect Cryptosporidium spp. using a generic set of primer (AWA). To detect C. parvum a one step PCR was assayed using the specific primer (LAX). To increase the sensitivity of the method, were tested nested-PCR assays, using an outer primer (XIA). Thirty nine DNA samples were analysed from the standard calf, 52 samples from 17 patients and 45 samples from 14 animals. The results were: 54.28% positive samples by single PCR AWA, 71.42% by nested-PCR, 67.74% by single PCR LAX and 44.44% by nested-PCR for the standard calf. The overall positivity for human and animal samples were: 34.48% by single PCR and 54.
Resumo
O protozoário parasita Cryptosporidium parvum tem sido reconhecido como um importante patógeno emergente. Para estudos moleculares, a maioria das técnicas para extração do DNA requer o uso de kits importados para concentrar, romper a parede muito resistente do oocisto e purificar o DNA das matrizes das amostras. O objetivo do estudo foi desenvolver um método simples e rápido, baseado na reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detectar Cryptosporidium em fezes preservadas. Oocistos foram concentrados das amostras fecais pela flutuação em gradiente de sacarose. Dos oocistos purificados foi extraído o DNA genômico através de incubação em tampão de lise contendo 70 mM -mercaptoetanol, digerido com proteinase K e extraído com fenol-clorofórmio-álcool isoamílico. A padronização foi iniciada com a PCR única para detectar Cryptosporidium spp usando um par de primer genérico (AWA). Para identificar C. parvum foi realizada a PCR única com o par de primer especifico (LAX). Para aumentar a sensibilidade do método, foi testada a nested-PCR, usando o primer externo XIA. Foram analisadas 39 amostras de DNA do bezerro padrão, 52 amostras de 17 pacientes e 45 amostras de 14 animais. Os resultados foram: 54,28% de positividade na PCR AWA, e 71,42% na nested-PCR XIA/AWA, 67,74% na PCR LAX e 44,44% na nested-PCR XIA/LAX das amostras do bezerro. A positividade geral nas amostras de pacientes e
The protozoan parasite Cryptosporidium parvum has become recognised as important emerging human pathogens. For molecular studies, most of the techniques to extract genomic DNA require the use of imported kits to concentrate, rupture the very resistant oocyst wall, and purify the DNA from the samples matrix. The aim of this study was to develop a simple and rapid method based on polymerase chain reaction (PCR) to detect Cryptosporidium in preserved faeces. Oocysts were concentrated from faecal specimens by flotation on sucrose gradient. Genomic DNA was prepared from purified oocysts by adding a lysis buffer containing 70 mM -mercaptoethanol, digested with proteinase K and extracted with phenol-chlorophorm-isoamyl. The standardization was started by performing a one step PCR to detect Cryptosporidium spp. using a generic set of primer (AWA). To detect C. parvum a one step PCR was assayed using the specific primer (LAX). To increase the sensitivity of the method, were tested nested-PCR assays, using an outer primer (XIA). Thirty nine DNA samples were analysed from the standard calf, 52 samples from 17 patients and 45 samples from 14 animals. The results were: 54.28% positive samples by single PCR AWA, 71.42% by nested-PCR, 67.74% by single PCR LAX and 44.44% by nested-PCR for the standard calf. The overall positivity for human and animal samples were: 34.48% by single PCR and 54.