Lab partners: oocytes, embryos and company. A personal view on aspects of oocyte maturation and the development of monozygotic twins

The present review addresses the oocyte and the preimplantation embryo, and is intended to highlight the underlying principle of the "nature versus/and nurture" question. Given the diversity in mammalian oocyte maturation, this review will not be comprehensive but instead will focus on the porcine oocyte. Historically, oogenesis was seen as the development of a passive cell nursed and determined by its somatic compartment. Currently, the advanced analysis of the cross-talk between the maternal environment and the oocyte shows a more balanced relationship: Granulosa cells nurse the oocyte, whereas the latter secretes diffusible factors that regulate proliferation and differentiation of the granulosa cells. Signal molecules of the granulosa cells either prevent the precocious initiation of meiotic maturation or enable oocyte maturation following hormonal stimulation. A similar question emerges in research on monozygotic twins or multiples: In Greek and medieval times, twins were not seen as the result of the common course of nature but were classified as faults. This seems still valid today for the rare and until now mainly unknown genesis of facultative monozygotic twins in mammals. Monozygotic twins are unique subjects for studies of the conceptus-maternal dialogue, the intra-pair similarity and dissimilarity, and the elucidation of the interplay between nature and nurture. In the course of in vivo collections of preimplantation sheep embryos and experiments on embryo splitting and other microsurgical interventions we recorded observations on double blastocysts within a single zona pellucida, double inner cell masses in zona-enclosed blastocysts and double germinal discs in elongating embryos. On the basis of these observations we add some pieces to the puzzle of the post-zygotic genesis of monozygotic twins and on maternal influences on the developing conceptus.(AU)

Parcelamento de doses da adubação nitrogenada na produtividade e qualidade fisiológica de sementes de trigo / Splitting of doses of nitrogen fertilization on the productivity and physiological quality of wheat seeds

A aplicação de nitrogênio (N) na dose correta e no momento adequado pode favorecer a produtividade e a qualidade das sementes de trigo. Neste sentido, objetivou-se avaliar o efeito do parcelamento da adubação nitrogenada sobre a produtividade e a qualidade fisiológica de sementes de cultivares de trigo. As sementes utilizadas no experimento foram produzidas no Centro Nacional de Pesquisa de Soja (Embrapa Soja), em Londrina-PR, em delineamento experimental de blocos casualizados em esquema fatorial 2×7, com quatro repetições. Os tratamentos constaram de duas cultivares e sete combinações de aplicação da adubação nitrogenada. Foram avaliados: produtividade, germinação, primeira contagem da germinação, comprimento e massa seca de plântulas, emergência de plântulas em areia e índice de velocidade de emergência. Os dados foram submetidos à análise de variância com comparação de médias pelo teste F, entre os genótipos, e Skott-Knott, entre as combinações de N. O efeito da fertilização nitrogenada sobre a produtividade de sementes varia com a cultivar utilizada. Para ambas as cultivares, a adubação nitrogenada aplicada em uma única dose eleva o potencial fisiológico de sementes. O suprimento inadequado de N prejudica a qualidade fisiológica sementes produzidas.(AU)

The application of nitrogen (N) in the correct dose and at the right time can favor the productivity and quality of wheat seeds. In this sense, the objective was to evaluate the effect of split nitrogen fertilization on the productivity and physiological quality of seeds of wheat cultivars. The seeds used in the experiment were produced at the National Soybean Research Center (Embrapa Soja), in Londrina-PR, in a randomized block experimental design in a 2 × 7 factorial scheme, with four replications. The treatments consisted of two cultivars and seven combinations of application of nitrogen fertilization. The following were evaluated: productivity, germination, first germination count, length and dry mass of seedlings, emergence of seedlings in sand and emergence speed index. The data were subjected to analysis of variance with comparison of means by the F test, between genotypes, and Skott-Knott, between N combinations. The effect of nitrogen fertilization on seed productivity varies with the cultivar used. For both cultivars, nitrogen fertilization applied in a single dose increases the physiological potential of seeds. The inadequate supply of N impairs the physiological quality of seeds produced.(AU)

Parcelamento de doses da adubação nitrogenada na produtividade e qualidade fisiológica de sementes de trigo / Splitting of doses of nitrogen fertilization on the productivity and physiological quality of wheat seeds

A aplicação de nitrogênio (N) na dose correta e no momento adequado pode favorecer a produtividade e a qualidade das sementes de trigo. Neste sentido, objetivou-se avaliar o efeito do parcelamento da adubação nitrogenada sobre a produtividade e a qualidade fisiológica de sementes de cultivares de trigo. As sementes utilizadas no experimento foram produzidas no Centro Nacional de Pesquisa de Soja (Embrapa Soja), em Londrina-PR, em delineamento experimental de blocos casualizados em esquema fatorial 2×7, com quatro repetições. Os tratamentos constaram de duas cultivares e sete combinações de aplicação da adubação nitrogenada. Foram avaliados: produtividade, germinação, primeira contagem da germinação, comprimento e massa seca de plântulas, emergência de plântulas em areia e índice de velocidade de emergência. Os dados foram submetidos à análise de variância com comparação de médias pelo teste F, entre os genótipos, e Skott-Knott, entre as combinações de N. O efeito da fertilização nitrogenada sobre a produtividade de sementes varia com a cultivar utilizada. Para ambas as cultivares, a adubação nitrogenada aplicada em uma única dose eleva o potencial fisiológico de sementes. O suprimento inadequado de N prejudica a qualidade fisiológica sementes produzidas.

The application of nitrogen (N) in the correct dose and at the right time can favor the productivity and quality of wheat seeds. In this sense, the objective was to evaluate the effect of split nitrogen fertilization on the productivity and physiological quality of seeds of wheat cultivars. The seeds used in the experiment were produced at the National Soybean Research Center (Embrapa Soja), in Londrina-PR, in a randomized block experimental design in a 2 × 7 factorial scheme, with four replications. The treatments consisted of two cultivars and seven combinations of application of nitrogen fertilization. The following were evaluated: productivity, germination, first germination count, length and dry mass of seedlings, emergence of seedlings in sand and emergence speed index. The data were subjected to analysis of variance with comparison of means by the F test, between genotypes, and Skott-Knott, between N combinations. The effect of nitrogen fertilization on seed productivity varies with the cultivar used. For both cultivars, nitrogen fertilization applied in a single dose increases the physiological potential of seeds. The inadequate supply of N impairs the physiological quality of seeds produced.

VIABILIDADE TÉCNICA DA BIPARTIÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO.

Objetivou-se verificar a viabilidade operacional e eficiência da técnica de bipartição num programa de produção in vitro de embriões bovinos, e estudar aspectos relacionados à capacidade de desenvolvimento de hemi-embriões, comparando com embriões intactos. Foram utilizados oócitos oriundos de ovários de abatedouro de animais sem raça e idade definidas, para a produção dos embriões. No dia 6 do cultivo foram realizadas as avaliações dos embriões, sendo classificados, de acordo com o estádio de desenvolvimento e qualidade, para posterior micromanipulação embrionária. O estudo foi dividido em dois experimentos. Inicialmente, foi determinada a viabilidade operacional da técnica de PIVE na bipartição, utilizando 243 embriões. E posteriormente em um segundo experimento, foi avaliado o estádio embrionário e sua viabilidade após a bipartição, utilizando 481embriões. Com o auxílio de um esteromicroscópio acoplado ao dispositivo de micromanipulação mecânico (Leitz) cada estrutura foi individualmente posicionada e segmentada, no intuito de produzir duas metades com maior semelhança. Este procedimento simplificado de bipartição embrionária utilizou lâmina de aço inoxidável de politetrafluoroetileno (Wilkinson Sword). Quando a bipartição não ocorreu de forma a constituir dois hemi-embriões semelhantes estas estruturas não foram consideradas. Os hemi-embriões, imediatamente após a micromanipulação, retornaram ao meio de cultivo original a condições controladas (38,8ºC, atmosfera de 5 % de CO2 e umidade saturada). Permaneceram em cultivo até o 10º dia, mas foram reavaliados a cada 24 horas. Os resultados mostraram que no experimento 1, os embriões foram bipartidos sem considerar o estádio de desenvolvimento prévio, incluindo Mórula (Mo), Blastocisto inicial (Bi), Blastocisto (Bl) e Blastocisto expandido (Bx). Utilizando embriões em todos os estádios de desenvolvimento encontrados no D6, a técnica de bipartição não disponibilizou (P>0,05) um maior número de embriões com potencial para serem transferidos no D7 ou D8, quando comparado ao grupo controle. No segundo experimento, somente embriões em estádio de Bi e Bl foram incluídos. Procedendo desta forma, o grupo bipartido disponibilizou aproximadamente 20% a mais (p<0,008) de embriões com potencial de transferência, quando comparado com o controle (120,2 ± 46,6 vs.98,3 ± 4,3%, respectivamente). Esta diferença se deveu basicamente dentro do grupo bipartido, a recuperação pós-bipartição dos embriões classificados previamente como Bls (129,9±45,5 vs. 109,5±4,7%, respectivamente, para Bl e Bi). Adicionalmente, o estudo revelou que o grupo tratado apresentou comportamento semelhante ao grupo controle, não havendo diferença estatística quanto à viabilidade embrionária entre os grupos. Conclui-se que a viabilidade após bissecção de embriões produzidos in vitro é dependente do estádio de desenvolvimento e, blastocistos aparentemente são mais resistentes ao processo.

The aim of this study was to verify the operational viability and efficiency of splitting in a bovine embryo in vitro production program, and to evaluate the aspects related to the hemi-embryo development capacity, compared to intact embryos. Oocytes from slaughtered cow ovaries from mixed breed and undefined age, were used for the production of embryos. At the 6th of cultivation, the embryos evaluations were carried out and they were classified according to the stage of development and quality for subsequent embryo micromanipulation. The study was divided into two experiments. Initially, it was determined the operational viability of IVP technique in splitting using 243 embryos. And later, in a second experiment, it was evaluated the embryo stage and its viability after splitting using 481 embryos. With a use of a stereomicroscope coupled to mechanical micromanipulation device (Leitz), each structure was segmented and individually positioned in order to produce two halves with higher similarity. This simplified procedure of embryo splitting was performed using stainless steel blade polytetrafluoroethylene (Wilkinson Sword). When splitting does not occur forming two hemi-embryos, these structures were not considered similar. The hemi-embryos, immediately after micromanipulation, returned to the original culture medium at controlled conditions (38.8ºC, atmosphere of 5% CO2 and saturated humidity). The embryos were kept in culture until the 10th day, but they were re-evaluated every 24 hours. The results showed that in experiment 1, the embryos were split without considering the previous stage of development, including Morula (Mo), early blastocyst (Bi), blastocyst (Bl) and expanded blastocyst (Bx). Using embryos at all stages of development found in D6, the splitting technique did not provide (P> 0.05) a higher number of embryos with the potential to be transferred in D7 or D8, when compared to the control group. In the second experiment, only embryos in Bi and Bl stage were included. With this procedure, the split group provided about 20% higher (p <0.008) embryos with transfer potential compared to the control (120.2 ± 46.6 vs. 98.3 ± 4.3%, respectively ). This difference is due primarily within the bipartite group and the post-splitting recovery of embryos previously classified as Bls (129.9 ± 45.5 vs. 109.5 ± 4.7% for Bl and Bi). Additionally, the study showed that the treated group presented similar behavior to the control group, with no statistical difference in embryo viability between groups. It can be concluded that the viability after embryo bisection is dependent on the developmental stage, and blastocysts are apparently more resistant to the process.

Short-term culture of bovine bisected embryos effects on pregnancy rates, sex ratio and birth weight of calves / Cultivo in vitro temporário de embriões bovinos bipartidos. Efeito na posterior taxa de prenhez, sexo e peso dos bezerros

This study evaluated pregnancy rate, gestation length, calving rate, and also sex proportion and birth weight of calves derived from in vitro reconstructed bovine demi-embryos. Recovered embryos (grade I morulae) from superovulated cows were bisected with a steel blade and transferred to recipient heifers either immediately (group 1, n=38) or after a 24h period in culture medium (EARLE + 10% FCS) at 38.5 C and 5% CO2 (group 2, n=34) when showed a reconstituted appearance. Intact, uncultured embryos immediately transferred to recipients after collection (group 3, n=36) were used as control. Data were analyzed by ANOVA and Chi-square test. In vitro cultured demi-embryos that developed from morulae to blastocyst (78%, 44/56) were considered viable. Pregnancy rate at day 45 was 47.4%, 52.9%, and 52.8% for groups 1, 2, and 3 respectively (P> 0.05). Calving rate reached 26.3% in group 1. 29.4% in group 2, and 30.6% in group 3 (P> 0.05). No difference was found regarding pregnancy length (280.8 ± 1.8, 285.5 ± 1.7 and 285.3 ± 1.7 days), male proportion (60%, 50% and 54.5%) and birth weight of calves (38 ± 4.2, 32.4 ± 2.5 and 36.2 ± 2.6 kg) among groups 1, 2 and 3, respectively. It was concluded that even though in vitro reconstructed demi-embryos transfer can be of some utility to select the viability of demi-embryos, this procedure is not able to improve pregnancy rates since i

O presente estudo objetivou avaliar a taxa de prenhez, a duração da prenhez e a taxa de parição após a transferência de embriões bipartidos e reconstituídos in vitro, bem como algumas características (proporção de sexo e peso ao nascimento) dos bezerros produzidos. Embriões (mórulas grau 1) recuperados de vacas superovuladas foram bipartidos com uma lâmina metálica e transferidos em novilhas receptoras logo em seguida (grupo 1, n=38) ou após 24 horas de cultivo (meio EARLE + 10% SFB) a 38,5C e atmosfera de 5% de CO2 (grupo 2, n=34). Como controle foram utilizados embriões intactos, não cultivados, transferidos logo após a coleta (grupo 3, n=36). Os dados foram analisados utilizando ANOVA e teste de x2. Os hemi-embriões cultivados que evoluíram ao estágio de blastocisto (78%, 44/56) foram considerados viáveis. A taxa de prenhez no dia 45 após a transferência foi de 47,4%, 52,9% e 52,8% para os grupos 1, 2 e 3, respectivamente (P> 0,05). A taxa de parição foi de 26,3% no grupo 1, 29,4% no grupo 2 e 30,6% no grupo 3 (P> 0,05). Não houve diferença (P>0,05) na duração da prenhez (280,8 ± 1,8, 285,5 ± 1,7 e 285,3 ± 1,7 dias), na proporção de machos (60,0%, 50,0% e 54,5%) e no peso dos bezerros ao nascimento (38,0 ± 4,2, 32,4 ± 2,5 e 36,2 ± 2,6kg) entre os grupos 1, 2 e 3, respectivamente. Foi concluído que o cultivo in vitro dos hemi-embriões durante 24 horas pode ser uma b

A bipartição como alternativa para melhorar os índices de gestação na transferência de embriões eqüinos

Embryo transfer (ET) has been used in horses for at least twenty years, always from a single ovulation. In order to increase reproductive efficiency this study evaluated embryo splitting as an alternative, to improve pregnancy rates in horse embryo transfer. Twenty-one mares of different genetic groups, aged between 4 and 15 yrs, and weighing 270 to 480kg were used. Estrus was identified using a teaser and the animals were monitored with transrectal ultrasonography exams until ovulation (donors were examined three times a day and recipients once a day). The recipients ovulated one day prior, or up to 3 days after, the donors. Donors were collected between 144 and 155 hours after ovulation. A total of 20 embryos (morulas) in 29 collections (68.96%) were recovered, 10 embryos were transferred intact (T1) and 10 split in two (T2), giving rise to 20 half-embryos, which were then transferred to 20 recipients. No differences in pregnancy rates were found between groups (T1: 70% (7/10) and T2: 50% (10/20) P>0.05). Looking at the original number of embryos, there was a significant difference in pregnancy rate (70% vs 100% for T1 and T2 respectively P 0.05). These results show the possibility of increasing the number of gestations using embryo splitting and transfer in horses per embryo collected. This technique may improve pregnancy indices for ET in horses.

A transferência de embriões (TE) já vem sendo utilizada em eqüinos há pelo menos duas décadas, sempre a partir de ovulação simples. Para aumentar a eficiência reprodutiva, este estudo avaliou a bipartição embrionária como uma alternativa para melhorar os índices de gestação na transferência de embriões em eqüinos. Foram utilizadas 21 éguas de diferentes padrões raciais, com idade variando entre 4 e 15 anos de idade, pesando entre 270 a 480kg. A partir da identificação do cio (rufiação), os animais foram monitorados através de exames ultra-sonográficos trans-retais até o momento da ovulação, sendo as receptoras, uma vez ao dia e as doadoras três vezes ao dia. As receptoras utilizadas ovularam um dia antes ou até três dias depois das doadoras. As doadoras foram coletadas entre 144 e 156 horas após a ovulação (D0). Foram recuperados 20 embriões (mórulas) em 29 coletas (68,96%), sendo que 10 embriões foram transferidos inteiros (T1), e 10 embriões foram bipartidos (T2), originando 20 hemi-embriões e transferidos para 20 receptoras. Não houve diferença na taxa de prenhez entre os grupos, T1, 70% (7/10), e T2, 50% (10/20) (P>0,05). Em relação ao número inicial de embriões em cada grupo (10), houve diferença na taxa de prenhez entre os grupos, T1, 70% (7/10) e T2, 100% (10/10) (P 0,05). Estes resultados indicam um incremento no número de gestações obtidas quando é utilizada a técnica de bipartição embrionária na transferência de embriões eqüinos em função do número inicial de embriões coletados. Desta forma, esta técnica pode melhorar os índices de prenhez na transferência de embriões em eqüinos.

A bipartição como alternativa para melhorar os índices de gestação na transferência de embriões eqüinos

Embryo transfer (ET) has been used in horses for at least twenty years, always from a single ovulation. In order to increase reproductive efficiency this study evaluated embryo splitting as an alternative, to improve pregnancy rates in horse embryo transfer. Twenty-one mares of different genetic groups, aged between 4 and 15 yrs, and weighing 270 to 480kg were used. Estrus was identified using a teaser and the animals were monitored with transrectal ultrasonography exams until ovulation (donors were examined three times a day and recipients once a day). The recipients ovulated one day prior, or up to 3 days after, the donors. Donors were collected between 144 and 155 hours after ovulation. A total of 20 embryos (morulas) in 29 collections (68.96%) were recovered, 10 embryos were transferred intact (T1) and 10 split in two (T2), giving rise to 20 half-embryos, which were then transferred to 20 recipients. No differences in pregnancy rates were found between groups (T1: 70% (7/10) and T2: 50% (10/20) P>0.05). Looking at the original number of embryos, there was a significant difference in pregnancy rate (70% vs 100% for T1 and T2 respectively P 0.05). These results show the possibility of increasing the number of gestations using embryo splitting and transfer in horses per embryo collected. This technique may improve pregnancy indices for ET in horses.

A transferência de embriões (TE) já vem sendo utilizada em eqüinos há pelo menos duas décadas, sempre a partir de ovulação simples. Para aumentar a eficiência reprodutiva, este estudo avaliou a bipartição embrionária como uma alternativa para melhorar os índices de gestação na transferência de embriões em eqüinos. Foram utilizadas 21 éguas de diferentes padrões raciais, com idade variando entre 4 e 15 anos de idade, pesando entre 270 a 480kg. A partir da identificação do cio (rufiação), os animais foram monitorados através de exames ultra-sonográficos trans-retais até o momento da ovulação, sendo as receptoras, uma vez ao dia e as doadoras três vezes ao dia. As receptoras utilizadas ovularam um dia antes ou até três dias depois das doadoras. As doadoras foram coletadas entre 144 e 156 horas após a ovulação (D0). Foram recuperados 20 embriões (mórulas) em 29 coletas (68,96%), sendo que 10 embriões foram transferidos inteiros (T1), e 10 embriões foram bipartidos (T2), originando 20 hemi-embriões e transferidos para 20 receptoras. Não houve diferença na taxa de prenhez entre os grupos, T1, 70% (7/10), e T2, 50% (10/20) (P>0,05). Em relação ao número inicial de embriões em cada grupo (10), houve diferença na taxa de prenhez entre os grupos, T1, 70% (7/10) e T2, 100% (10/10) (P 0,05). Estes resultados indicam um incremento no número de gestações obtidas quando é utilizada a técnica de bipartição embrionária na transferência de embriões eqüinos em função do número inicial de embriões coletados. Desta forma, esta técnica pode melhorar os índices de prenhez na transferência de embriões em eqüinos.

Short-term culture of bovine bisected embryos effects on pregnancy rates, sex ratio and birth weight of calves / Cultivo in vitro temporário de embriões bovinos bipartidos. Efeito na posterior taxa de prenhez, sexo e peso dos bezerros

This study evaluated pregnancy rate, gestation length, calving rate, and also sex proportion and birth weight of calves derived from in vitro reconstructed bovine demi-embryos. Recovered embryos (grade I morulae) from superovulated cows were bisected with a steel blade and transferred to recipient heifers either immediately (group 1, n=38) or after a 24h period in culture medium (EARLE + 10% FCS) at 38.5 C and 5% CO2 (group 2, n=34) when showed a reconstituted appearance. Intact, uncultured embryos immediately transferred to recipients after collection (group 3, n=36) were used as control. Data were analyzed by ANOVA and Chi-square test. In vitro cultured demi-embryos that developed from morulae to blastocyst (78%, 44/56) were considered viable. Pregnancy rate at day 45 was 47.4%, 52.9%, and 52.8% for groups 1, 2, and 3 respectively (P> 0.05). Calving rate reached 26.3% in group 1. 29.4% in group 2, and 30.6% in group 3 (P> 0.05). No difference was found regarding pregnancy length (280.8 ± 1.8, 285.5 ± 1.7 and 285.3 ± 1.7 days), male proportion (60%, 50% and 54.5%) and birth weight of calves (38 ± 4.2, 32.4 ± 2.5 and 36.2 ± 2.6 kg) among groups 1, 2 and 3, respectively. It was concluded that even though in vitro reconstructed demi-embryos transfer can be of some utility to select the viability of demi-embryos, this procedure is not able to improve pregnancy rates since i

O presente estudo objetivou avaliar a taxa de prenhez, a duração da prenhez e a taxa de parição após a transferência de embriões bipartidos e reconstituídos in vitro, bem como algumas características (proporção de sexo e peso ao nascimento) dos bezerros produzidos. Embriões (mórulas grau 1) recuperados de vacas superovuladas foram bipartidos com uma lâmina metálica e transferidos em novilhas receptoras logo em seguida (grupo 1, n=38) ou após 24 horas de cultivo (meio EARLE + 10% SFB) a 38,5C e atmosfera de 5% de CO2 (grupo 2, n=34). Como controle foram utilizados embriões intactos, não cultivados, transferidos logo após a coleta (grupo 3, n=36). Os dados foram analisados utilizando ANOVA e teste de x2. Os hemi-embriões cultivados que evoluíram ao estágio de blastocisto (78%, 44/56) foram considerados viáveis. A taxa de prenhez no dia 45 após a transferência foi de 47,4%, 52,9% e 52,8% para os grupos 1, 2 e 3, respectivamente (P> 0,05). A taxa de parição foi de 26,3% no grupo 1, 29,4% no grupo 2 e 30,6% no grupo 3 (P> 0,05). Não houve diferença (P>0,05) na duração da prenhez (280,8 ± 1,8, 285,5 ± 1,7 e 285,3 ± 1,7 dias), na proporção de machos (60,0%, 50,0% e 54,5%) e no peso dos bezerros ao nascimento (38,0 ± 4,2, 32,4 ± 2,5 e 36,2 ± 2,6kg) entre os grupos 1, 2 e 3, respectivamente. Foi concluído que o cultivo in vitro dos hemi-embriões durante 24 horas pode ser uma b