Identification and validation of novel EST-SSR markers in olives

The olive (Olea europaea L.) is a leading oil crop in the Mediterranean area. Limited information on the inheritance of agronomic significant traits hinders progress in olive breeding programs, which encourages the development of markers linked to the traits. In this study, we report on the development of 46 olive simple sequence repeat (SSR) markers, obtained from 577,025 expressed sequence tags (ESTs) in developing olive fruits generated in the framework of the Slovenian national olive transcriptome project. Sequences were de novo assembled into 98,924 unigenes, which were then used as a source for microsatellites searching. We identified 923 unigenes that contained 984 SSRs among which dinucleotide SSRs (36 %) were the most abundant, followed by tri- (33 %) and hexa- (21 %) nucleotides. Microsatellite repeat motif GA (37 %) was the most common among dinucleotides, while microsatellite repeat motif GAA was the most abundant trinucleotide SSR motif (16 %). Gene ontology annotations could be assigned to 27 % of the unigenes. A hundred and ten expressed sequence tag-derived-simple sequence repeats (EST-SSRs) with annotated genes were selected for primer designing and finally, 46 (42 %) polymorphic EST-SSRs were successfully amplified and used to validate genetic diversity among 24 olive varieties. The average number of alleles per locus, observed heterozygosity, expected heterozygosity, and polymorphic information content were 4.5, 0.649, 0.604 and 0.539, respectively. Twenty-seven EST-SSRs showed good diversity properties and were recommended for further olive genome investigation.

Identification and validation of novel EST-SSR markers in olives

The olive (Olea europaea L.) is a leading oil crop in the Mediterranean area. Limited information on the inheritance of agronomic significant traits hinders progress in olive breeding programs, which encourages the development of markers linked to the traits. In this study, we report on the development of 46 olive simple sequence repeat (SSR) markers, obtained from 577,025 expressed sequence tags (ESTs) in developing olive fruits generated in the framework of the Slovenian national olive transcriptome project. Sequences were de novo assembled into 98,924 unigenes, which were then used as a source for microsatellites searching. We identified 923 unigenes that contained 984 SSRs among which dinucleotide SSRs (36 %) were the most abundant, followed by tri- (33 %) and hexa- (21 %) nucleotides. Microsatellite repeat motif GA (37 %) was the most common among dinucleotides, while microsatellite repeat motif GAA was the most abundant trinucleotide SSR motif (16 %). Gene ontology annotations could be assigned to 27 % of the unigenes. A hundred and ten expressed sequence tag-derived-simple sequence repeats (EST-SSRs) with annotated genes were selected for primer designing and finally, 46 (42 %) polymorphic EST-SSRs were successfully amplified and used to validate genetic diversity among 24 olive varieties. The average number of alleles per locus, observed heterozygosity, expected heterozygosity, and polymorphic information content were 4.5, 0.649, 0.604 and 0.539, respectively. Twenty-seven EST-SSRs showed good diversity properties and were recommended for further olive genome investigation.(AU)

Development and validation of new SSR markers from expressed regions in the garlic genome

Only a limited number of simple sequence repeat (SSR) markers is available for the genome of garlic (Allium sativum L.) despite the fact that SSR markers have become one of the most preferred DNA marker systems. To develop new SSR markers for the garlic genome, garlic expressed sequence tags (ESTs) at the publicly available GarlicEST database were screened for SSR motifs and a total of 132 SSR motifs were identified. Primer pairs were designed for 50 SSR motifs and 24 of these primer pairs were selected as SSR markers based on their consistent amplification patterns and polymorphisms. In addition, two SSR markers were developed from the sequences of garlic cDNA-AFLP fragments. The use of 26 EST-SSR markers for the assessment of genetic relationship was tested using 31 garlic genotypes. Twenty six EST-SSR markers amplified 130 polymorphic DNA fragments and the number of polymorphic alleles per SSR marker ranged from 2 to 13 with an average of 5 alleles. Observed heterozygosity and polymorphism information content (PIC) of the SSR markers were between 0.23 and 0.88, and 0.20 and 0.87, respectively. Twenty one out of the 31 garlic genotypes were analyzed in a previous study using AFLP markers and the garlic genotypes clustered together with AFLP markers were also grouped together with EST-SSR markers demonstrating high concordance between AFLP and EST-SSR marker systems and possible immediate application of EST-SSR markers for fingerprinting of garlic clones. EST-SSR markers could be used in genetic studies such as genetic mapping, association mapping, genetic diversity and comparison of the genomes of Allium species.

Development and validation of new SSR markers from expressed regions in the garlic genome

Only a limited number of simple sequence repeat (SSR) markers is available for the genome of garlic (Allium sativum L.) despite the fact that SSR markers have become one of the most preferred DNA marker systems. To develop new SSR markers for the garlic genome, garlic expressed sequence tags (ESTs) at the publicly available GarlicEST database were screened for SSR motifs and a total of 132 SSR motifs were identified. Primer pairs were designed for 50 SSR motifs and 24 of these primer pairs were selected as SSR markers based on their consistent amplification patterns and polymorphisms. In addition, two SSR markers were developed from the sequences of garlic cDNA-AFLP fragments. The use of 26 EST-SSR markers for the assessment of genetic relationship was tested using 31 garlic genotypes. Twenty six EST-SSR markers amplified 130 polymorphic DNA fragments and the number of polymorphic alleles per SSR marker ranged from 2 to 13 with an average of 5 alleles. Observed heterozygosity and polymorphism information content (PIC) of the SSR markers were between 0.23 and 0.88, and 0.20 and 0.87, respectively. Twenty one out of the 31 garlic genotypes were analyzed in a previous study using AFLP markers and the garlic genotypes clustered together with AFLP markers were also grouped together with EST-SSR markers demonstrating high concordance between AFLP and EST-SSR marker systems and possible immediate application of EST-SSR markers for fingerprinting of garlic clones. EST-SSR markers could be used in genetic studies such as genetic mapping, association mapping, genetic diversity and comparison of the genomes of Allium species.(AU)

Expressed sequence tags in venomous tissue of Scorpaena plumieri (Scorpaeniformes: Scorpaenidae)

Species of the family Scorpaenidae are responsible for accidents and sporadic casualties by the shore they inhabit. The species Scorpaena plumieri from this family populate the Northeastern and Eastern coast of Brazil causing human envenomation characterized by local and systemic symptoms. In experimental animals the venom induces cardiotoxic, hypotensive, and airway respiratory effects. As first step to identify the venom components we isolated gland mRNA to produce a cDNA library from the fish gland. This report describes the partial sequencing of 356 gland transcripts from S. plumieri. BLAST analysis of transcripts showed that 30% were unknown sequences, 17% hypothetical proteins, 17% related to metabolic enzymes, 14% belonged to signal transducing functions and the remaining groups (7-8%) composed by gene related with expressing proteins, regulatory proteins and structural proteins. A considerable number of these EST were not found in available databases suggesting the existence of new proteins and/or functions yet to be discovered. By screening the library with antibodies against a lectin fraction from S. plumieri venom we identified several clones whose DNA sequence showed similarities with lectins found in fish. In silico analysis of these clones confirm the identity of these molecules in the venom gland of S. plumieri. .(AU)

Espécies da família Scorpaenidae são responsáveis por acidentes e mortes esporádicas ao longo da costa que habitam. A espécie Scorpaena plumieri desta família povoam a costa Leste e Nordeste do Brasil, causando envenenamento humano caracterizado por sintomas locais e sistêmicos. Em modelos experimentais animais a peçonha induz cardiotoxicidade, efeitos hipotensivos e alterações nas vias aéreas respiratórias. Como primeiro passo para identificar os componentes da peçonha foram isolados os mRNA das glândulas do peixe para produzir uma biblioteca de cDNAs. Esse artigo descreve o sequenciamento parcial de 356 transcritos das glândulas de S. plumieri. Análises em bancos de dados (BLAST) dos transcritos demonstraram que 30% eram sequências desconhecidas, 17% proteínas hipotéticas, 17% relacionadas às enzimas do metabolismo, 14% pertenciam a funções de transdução de sinais e os demais grupos (7-8%) formados por genes relacionados com a expressão de proteínas, proteínas regulatórias e estruturais. Um número considerável destes EST não foi encontrado em bases de dados disponíveis, sugerindo a existência de novas proteínas e/ou funções ainda a serem descobertas. Ao fazer um barrido da biblioteca com anticorpos produzidos contra uma fração das lectinas do veneno de S. plumieri, identificamos vários clones, cuja sequência de DNA mostram semelhanças com lectinas encontradas em peixes. A análise in silico destes clones confirmam a identidade destas moléculas na glândula de peçonha de S. plumieri.(AU)

Experimental infection of rabbits with a recombinant bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) gI, gE and US9-negative / Infecção experimental de coelhos com um recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 defectivo na gI, gE e US9

Bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) is a major cause of viral meningoencephalitis in cattle. The expression of different viral proteins has been associated with BoHV-5 neuropathogenesis. Among these, gI, gE and US9 have been considered essential for the production of neurological disease in infected animals. To evaluate the role of gI, gE and US9 in neurovirulence, a recombinant from which the respective genes were deleted (BoHV-5 gI-/gE-/US9-) was constructed and inoculated in rabbits of two age groups (four and eight weeks-old). When the recombinant virus was inoculated through the paranasal sinuses of four weeks-old rabbits, neurological disease was observed and death was the outcome in 4 out of 13 (30.7 percent) animals, whereas clinical signs and death were observed in 11/13 (84.6 percent) of rabbits infected with the parental virus. In eight weeks-old rabbits, the BoHV-5 gI-/gE-/US9- did not induce clinically apparent disease and could not be reactivated after dexamethasone administration, whereas wild type BoHV-5 caused disease in 55.5 percent of the animals and was reactivated. These findings reveal that the simultaneous deletion of gI, gE and US9 genes did reduce but did not completely abolish the neurovirulence of BoHV-5 in rabbits, indicating that other viral genes may also play a role in the induction of neurological disease.(AU)

O herpesvírus bovino tipo 5 é uma das principais causas de meningoencefalite viral em bovinos. A expressão de diferentes proteínas virais tem sido associada à neuropatogenia do BoHV-5. Entre estas, a gI, gE e US9 têm sido consideradas essenciais para a indução de sinais neurológicos nos animais infectados. Para avaliar o papel das proteínas gI, gE e US9 na neurovirulência, construiu-se um recombinante no qual os genes que codificam estas proteínas foram deletados, denominado BoHV-5 gI-/gE-/US9-. Este vírus foi inoculado em coelhos de idades diferentes (quatro e oito semanas de idade). Quando o vírus recombinante foi inoculado nos seios paranasais de coelhos de quatro semanas de idade, doença neurológica e morte foram observadas em 4 dos 13 (30,7 por cento) animais, enquanto que sinais clínicos e morte foram observados em 11/13 (84,6 por cento) dos coelhos infectados com o vírus parental. Em coelhos de oito semanas de idade, o BoHV-5 gI-/gE-/US9- não induziu sinais clínicos aparentes e, após tentativa de reativação viral por tratamento com dexametasona, o vírus não foi re-excretado. Por outro lado, o vírus selvagem causou doença clínica em 55,5 por cento dos coelhos e foi re-excretado após tratamento com dexametasona. Estes achados revelam que a deleção simultânea dos genes gI, gE e US9 reduziu mas não aboliu completamente a neurovirulência do BoHV-5 em coelhos, indicando que outros genes virais possam ter papel na indução da doença neurológica.(AU)

Putative metabolic pathway of mannitol and sorbitol and in sugarcane

Until the mid 1950s, boron was believed to play an important role in the transport of sugars in plants. However, boron actually depends on sugar alcohols to be taken up by the plant. In some cases, the main sugars involved in this process are sorbitol and mannitol which form stable complexes with boron. In this study, the sequences of the SugarCane EST Genome Project (SUCEST) database were searched for enzymes involved in the metabolism of these sugars by comparing them with enzymes from other organisms. Eighteen contigs from sugarcane (Saccharum sp.) presented high similarity with 11 enzymes involved in the putative biosynthetic pathway of sorbitol and mannitol from fructose in sugarcane. Seven of these contigs had high homology with sequences deposited in GenBank.

Até meados da década de 50 acreditava-se que o boro tinha uma importante função no transporte de açúcares em plantas. Na verdade, o boro depende de açúcares álcoois para serem mobilizados dentro da planta. Em alguns organismos os principais açúcares envolvidos neste processo são o sorbitol e o manitol, que formam complexos estáveis com o micronutriente. O objetivo deste estudo foi procurar seqüências no banco de dados SugarCane EST Genome Project (SUCEST) que codificam enzimas participantes na via metabólica destes açúcares através da comparação de enzimas de outros organismos. Dezoito "contigs" de cana-de-açúcar (Saccharum sp.) apresentaram similaridade com onze seqüências de enzimas que compõem a provável via metabólica de sorbitol e manitol a partir de frutose. Destes "contigs", sete apresentaram uma alta similaridade entre as seqüências depositadas no GenBank.

Putative metabolic pathway of mannitol and sorbitol and in sugarcane

Until the mid 1950s, boron was believed to play an important role in the transport of sugars in plants. However, boron actually depends on sugar alcohols to be taken up by the plant. In some cases, the main sugars involved in this process are sorbitol and mannitol which form stable complexes with boron. In this study, the sequences of the SugarCane EST Genome Project (SUCEST) database were searched for enzymes involved in the metabolism of these sugars by comparing them with enzymes from other organisms. Eighteen contigs from sugarcane (Saccharum sp.) presented high similarity with 11 enzymes involved in the putative biosynthetic pathway of sorbitol and mannitol from fructose in sugarcane. Seven of these contigs had high homology with sequences deposited in GenBank.

Até meados da década de 50 acreditava-se que o boro tinha uma importante função no transporte de açúcares em plantas. Na verdade, o boro depende de açúcares álcoois para serem mobilizados dentro da planta. Em alguns organismos os principais açúcares envolvidos neste processo são o sorbitol e o manitol, que formam complexos estáveis com o micronutriente. O objetivo deste estudo foi procurar seqüências no banco de dados SugarCane EST Genome Project (SUCEST) que codificam enzimas participantes na via metabólica destes açúcares através da comparação de enzimas de outros organismos. Dezoito "contigs" de cana-de-açúcar (Saccharum sp.) apresentaram similaridade com onze seqüências de enzimas que compõem a provável via metabólica de sorbitol e manitol a partir de frutose. Destes "contigs", sete apresentaram uma alta similaridade entre as seqüências depositadas no GenBank.

Expressão da proteína S1 recombinante do vírus da bronquite infecciosa em Saccharomyces cerevisiae para aplicação no imunodiagnóstico

A glicoproteína de superfície (8) do vírus da bronquite infecciosa (VBI) em aves; é um alvo antigênico importante para a indução de imunidade e como antígeno utilizado no imunodiagnóstico da infecção causada por este vírus. Nesse estudo, a forma recombinante da subunidade 81 da glicoproteína 8 da estirpe M41 do VBI foi clonada e expressa como proteína de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o epítopo V-5 em células da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador dessa proteína foi amplificado a partir do RNA genômico da estirpe M41 do VBI, por meio das técnicas da reação de transcrição reversa (RT) e da reação da polimerase em cadeia (PCR). Foi amplificada toda a seqüência codificadora de interesse e fossem geradas extremidades compatíveis com a inserção no vetor pYE82.1N5-His-TOPO. Este vetor foi usado na transformação de leveduras, tendo sido obtidos os clones transformantes específicos portadores do inserto gênico. A expressão da proteína de fusão foi então induzida, em células de S. cerevisiae, sendo produzida a proteína recombinante 81 de fusão com peso molecular 95 kDa. Essa proteína apresentou com uma elevada reatividade cruzada para a proteína 8 do próprio vírus, tal como demonstraram os resultados das análises pelo Western blotting e ELl8A. Essa proteína de fusão foi, devido à presença da cauda de poli¬histidina, prontamente purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel ¬agarose e, posteriormente utilizada com sucesso no desenvolvimento de um método indireto de ELl8A para a detecção de anticorpos específicos de galinhas infectadas com o VBI

The surface glycoprotein of infectious bronchitis virus (IBV) is a important antigenic target for the induction of immunity and as antigen in the immunodiagnosis of infection caused by this virus. In this study, the gene of 51 glycoprotein of M41 strain of the IBV was cloned and expressed as a fusion protein containing a poly-histidine and epitope V-5 tags in the yeast cells of Saccharomyces cerevisiae. The 51 gene was amplified from genomic RNA of the M41 strain of VBI, by reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR). The entire coding sequence of 51 gene was amplified and inserted in the vector pYE52.1N5-His-TOPO. This construct was used for transforming yeast cells, and to obtain specific clones carrying the inserted gene. The expression of the fusion protein was induced in transformed cells of S. cerevisiae, and a recombinant 51 protein was produced with a molecular weight of 95 kDa. A high cross¬reactivity with the original 51 protein from the virus was detected by Western blotting and ELl5A. The presence of the poly-histidine tail in the fusion recombinant protein favored their prompt purification by affinity chromatography in a column of nickel¬sepharose. This recombinant 51 protein was successfully used in the development of an indirect method of ELl5A for the detection of specific anti-IBV antibodies in chickens experimentally infected or vaccinated with this virus

Descoberta e estudo de genes envolvidos na resposta a endoparasitas gastrintestinais em bovinos / Descovery and study of genes involved in immune response against gastrointestinal nematodes in cattle

Este trabalho teve por objetivo identificar e estudar a expressão de genes envolvidos na resposta imune a endoparasitas gastrintestinais em bovinos. Contagem periódica de ovos por grama de fezes (OPG) e análises de coproculturas foram realizadas para identificar animais resistentes e susceptíveis a endoparasitas gastrintestinais. A contagem de OPG permitiu identificar estes animais, sendo que o grupo susceptível apresentou uma contagem 20 vezes superior ao grupo resistente (P<0,001). Análises de coproculturas permitiram concluir que a infestação em bovinos foi mista, com a predominância dos gêneros Cooperia e Haemonchus e menor incidência de Oesophagostomum. Para a identificação dos genes, foi utilizada a metodologia EST (Expressed Sequence Tag) e foram construídas duas bibliotecas de clones de cDNA obtidos a partir da mucosa do abomaso, intestino delgado e nódulos linfáticos abomasais de bovinos resistentes (ER1) e susceptíveis (ES1) a nematódeos gastrintestinais. Foram geradas 2496 ESTs de cada biblioteca. Destas, 1664 e 1898 foram válidas para as bibliotecas ER1 e ES1, respectivamente. Dentre as 2323 sequências únicas obtidas foram identificados vários produtos gênicos relacionados à resposta imune, tais como moléculas de classe I e II do MHC, imunoglobulinas, interleucinas, lisozima e pepsinogênio. Para a quantificação da expressão de RNA mensageiro, foi utilizada a metodologia de transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase em tempo real, onde foram analisados 10 genes relacionados à polarização da resposta imune (as interleucinas IL- 2, IL-4, IL-8, IL-12p35 e IL-13, as citocinas TNF-α, IFN-γ, MCP-1α e MCP-2 e a glicoproteína mucina 1-MUC1). As análises de expressão gênica realizadas na mucosa do abomaso revelaram aumento nos níveis de RNAm para IL-4 (P<0,018), IL-13 (P<0,002) e diminuição de TNF-? (P<0,0001) nos animais resistentes; nos nódulos linfáticos abomasais houve aumento de IL-4 (P<0,019) nos animais resistentes e de IFN-γ (P<0,007) nos animais susceptíveis; no intestino delgado houve aumento de IL-4 (P<0,01) e IL-13 (P<0,045) nos animais resistentes, ao contrário de IL-2 (P<0,047), IL-12p35 (P<0,029), IFN-γ (P<0,004) e MCP-1 (P<0,03), cujos níveis de RNAm foram maiores nos animais susceptíveis. No abomaso dos animais resistentes houve menor expressão de pepsinogênio (P<0,025) e maior de lisozima (P<0,042). Em conclusão, a estratégia utilizada permitiu a identificação de vários genes envolvidos na resposta imune e a descoberta inédita de que Bos indicus resistentes a parasitas gastrintestinais apresentam uma resposta TH2 polarizada, em contraste aos animais susceptíveis, que apresentam uma resposta TH1

The aim of this work was identify genes related to immune response to gastrointestinal nematodes in cattle. The periodic counts of eggs per gram (EPG) of feces and coproculture analysis were done to identify the resistant and susceptible animals. The EPG counts allowed us to identify these animals. It was twenty-fold higher in susceptible group (P<0.001). The coproculture analysis allowed us to conclude that the infestation is predominantly characterized byCooperia spp. and Haemonchus spp. and a low incidency of Oesophagostomum. To identify the genes, it was used the EST (Expressed Sequence Tags) methodology and constructed two cDNA libraries from abomasum, abomasum lymph nodules and small intestine from resistant (ER1) and susceptible (ES1) cattle. It was generated 2496 ESTs from each library. From these, 1664 and 1898 ESTs were valids to ER1 and ES1 libraries, respectively. Among the 2323 unique sequences were identifyed several genes related to immune response, such as MHC class I and II molecules, immunoglobulins, interleukins, lysozyme and pepsinogen. To study the gene expression, it was used the reverse transcription and real-time polymerase chain reaction methodology to quantify the messager RNA expression of 10 genes related to polarization of immune response (the interleukins IL-2, IL-4, IL-8, IL-12p35 e IL-13, the cytokines TNF-β, IFN- γ, MCP-1β and MCP-2 and the glycoprotein mucin 1-MUC1). The gene expression analysis in the abomasum reveled that IL-4 (P<0,018) and IL-13 (P<0,002) were up-regulated and TNF-β (P<0,0001) was down-regulated in resistant group; in the abomasum lymph nodules IL-4 (P<0,019) and IFN-γ (P<0,007) were both up-regulated in resistant and susceptible group, respectively; in the small intestine IL-4 (P<0,01) and IL-13 (P<0,045) were up-regulated in resistant group and IL-2 (P<0,047), IL-12p35 (P<0,029), IFN-γ (P<0,004) and MCP-1 (P<0,03) were down-regulated in susceptible one. In the abomasum from resistant group, pepsinogen was down-regulated (P<0,025) and lysozyme was up-regulated (P<0,042). In conclusion, the strategy used allowed us to identify several genes involved in immune response and the inedit discovery that Bos indicus resistant to gastrointestinal nematodes present a TH2-type response, in contrast to susceptible animals that present a TH1-type response

Identificação e caracterização de transcritos associados ao desenvolvimento e crescimento da musculatura esquelética em frangos (Gallus gallus) / Identification and characterization of transcripts associated with skeletal muscle development and growth in chicken (Gallus gallus)

Os grandes avanços obtidos em quantidade de massa muscular nos animais domésticos foram alcançados por programas de melhoramento genético baseados na seleção de características fenotípicas observados na fase adulta do animal. No entanto, o número de precursores miogênicos e conseqüentemente, de fibras musculares, é determinado nos estádios embrionários do desenvolvimento. Este fato direcionou o programa miogênico como alvo de busca de potenciais transcritos candidatos que possam causar impacto sobre a deposição muscular em animais domésticos. Este trabalho objetivou identificar transcritos candidatos originais associados ao desenvolvimento e crescimento do tecido muscular esquelético em frangos (Gallus gallus). Um total de 4.534 transcritos (ESTs) identificados em trabalhos anteriores foram imobilizados em membrana de náilon (microarranjo) para permitir a investigação das diferenças no padrão de expressão entre genótipos e tecidos. O perfil transcricional do tecido muscular peitoral entre linhagens contrastantes para potencial de crescimento e deposição muscular da Embrapa Suíno Aves permitiu identificar 98 transcritos diferencialmente expressos, que foram validados por amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-PCRq), e localizados em regiões coincidentes às anteriormente mapeadas por QTLs. Estes transcritos são agora os candidatos preferenciais para a identificação de mutações e desenvolvimento de marcadores específicos que possam ser empregados em programas de melhoramento e seleção precoce ou indireta de aves. O mesmo microarranjo foi utilizado para caracterizar os transcritos desconhecidos pelo padrão de expressão entre cinco tecidos (cérebro, coração, fígado, músculo e pele). Esta abordagem permitiu identificar transcritos com padrão de expressão tecido-específico e tecido-preferencialmente expressos e caracterizar 24 transcritos desconhecidos como co-expressos aos transcritos músculo esquelético-específicos. Por fim, o orientador de axônio RGM-A (Repulsive guidance molecule A), identificado como músculo esquelético-específico, foi selecionado para ser funcionalmente analisado in vivo, para investigar uma possível função deste transcrito atípico no tecido muscular e comprovar a eficiência dos microarranjos em orientar a seleção de transcritos candidatos. O padrão de expressão de RGM-A em embriões de frango e os efeitos da super-expressão sobre Pax3 indicaram uma possível associação deste orientador de axônio com a formação da musculatura esquelética dos vertebrados superiores. Os transcritos candidatos indicados por análises de microarranjo deste trabalho serão úteis não apenas para que os programas de melhoramento sejam capazes de manter ou aumentar os índices de crescimento das aves, que atualmente buscam por informações adicionais para superar os limites impostos pelo próprio perfil genético alcançado em anos de seleção. Estes resultados também abriram novas perspectivas para a caracterização funcional in vivo de transcritos desconhecidos, tendo embriões de frango como modelo animal

by animal breeding programs along the years based on the observation of adult phenotypic characters. But, the number of myogenic precursor cells and, consequently, the number of muscle fibers is determined during the embryonic stages of development. Therefore, the embryonic myogenic program is an ideal target for searching potential candidate-transcripts, that can influence skeletal muscle deposition in domestic animals. This work aimed to identify original candidate-transcripts associated with skeletal muscle development and growth in chicken embryos (Gallus gallus). A total of previously identified 4,534 transcripts (Expressed Sequence Tags) were transferred to a nylon membrane (microarray) to investigate differences in expression patterns among genotypes and tissues. The pectoral skeletal muscle transcriptional pattern between broiler and layer chicken lines allowed the identification of 98 differentially expressed transcripts, whose expression were validated by quantitative RT-PCR (Reverse-transcription Polymerase Chain Reaction), and were co-localized in coincident regions with previously mapped QTLs (Quantitative Trait Loci). These transcripts are now preferential candidates to further identify mutations, and/or to develop specific markers to be used in breeding programs for early or indirect selection of superior animals. The same microarray was used to characterize unknown transcripts by expression patterns among five tissues (brain, heart, liver, muscle and skin). This approach allowed to identify tissue-specific and/or preferentially-expressed transcripts, and to characterize 24 unknown transcripts as co-expressed with skeletal musclespecific ones. Finally, the axon guidance molecule RGM-A, identified as skeletal muscle-specific transcript by microarrays, was selected to be functionally analyzed in vivo, to investigate the function of this atypical transcript in the skeletal muscle and to demonstrate the approach efficiency to guide selection of candidate transcripts. The RGM-A expression pattern and the Pax3 phenotype after over-expression in chicken embryos indicated a possible association of this axon guidance with the skeletal muscle formation. The candidate transcripts identified by mycroarray analyses may be useful in animal breeding programs to increase the present gains in chicken growth rate, since additional information is urgently required to surpass current limits of selection gains. The results have also opened a new range of possibilities to promote the functional characterization in vivo of unknown transcripts, having chicken embryos as models

Identificação e caracterização de seqüências expressas (EST) na musculatura peitoral de frangos de corte / Identification and characterization of expressed sequence tags (EST) in broilers breast muscle

A produção de aves no Brasil vem crescendo na ordem de 10% a cada ano, o que se explica pela atualização constante da tecnologia do setor (http://www.abef.com.br). Sendo a carne de frango a fonte de proteína animal mais barata e acessível ao consumidor, há necessidade de se produzir cada vez mais animais com maior acúmulo de massa muscular. Para isso, o entendimento dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos na formação da musculatura esquelética é de extrema relevância. Os fatores miogênicos, genes responsáveis pela determinação e diferenciação de células musculares, foram clonados e progressos significativos foram desenvolvidos quanto ao controle da expressão dos mesmos. A utilização da técnica de seqüenciamento de DNA possibilita a identificação e caracterização de novos genes envolvidos na complexa rede de fatores que regulam a formação da musculatura esquelética em aves. Neste estudo, foram construídas duas bibliotecas de cDNA (fase embrionária e pós-eclosão) de músculo peitoral de uma linhagem de corte (TT) e uma biblioteca da fase embrionária de uma linhagem de postura (CC). A análise das seqüências EST (Expressed Sequence Tags) foi utilizada para identificar possíveis novos genes envolvidos no processo de formação da musculatura esquelética. As seqüências EST identificadas possibilitaram a construção de um banco com 6247 ESTs da musculatura peitoral das linhagens de corte e postura nas duas fases de desenvolvimento. Com o intuito de estabelecer uma relação entre o perfil de expressão dos fatores miogênicos: MyoD, MRF4 e miogenina; e dos genes Pax-3 e miostatina e a formação e maturação das fibras musculares, foi utilizada a técnica de PCR em tempo real. Em geral, a expressão dos fatores miogênicos foi maior na linhagem de corte em relação à de postura nas idades estudadas. Este estudo deverá contribuir para as áreas celular e molecular de desenvolvimento, além de fornecer recursos úteis aos programas de melhoramento genético de aves que visam obter animais com maior acúmulo de massa muscular

Brazilians chicken production is increasing annually around 10%, which can be explained by the current technology applied to this sector (http://www.abef.com.br). Being chickens meat the cheapest animal protein source for consumers, there is a need to produce even more animals with increased muscular mass. For this purpose, understanding the molecular and cellular mechanisms involved with the skeletal muscle development is of great relevance. The myogenic factors, genes responsible for the determination and differentiation of muscle cells, were cloned and significant progress was made on the control of their expression. The use of DNA sequencing technique allows the identification and characterization of new genes involved in the complex chain of factors signalling systems that regulates the expression of avian skeletal muscles. In this study, two cDNA libraries (embryonic and post-hatching phases) were constructed from the breast muscle of a chicken broiler line (TT) and one library, from the embryonic phase, from a chicken layer line (CC). The EST (Expressed Sequencing Tags) analysis was used to identify probable new genes involved in the skeletal muscle development. The identified ESTs were used to generate a database containing 6247 breast muscle ESTs from two chicken lines in two development phases. Real time PCR was employed with the aim of establishing a relationship among the expression profile of myogenic factors (MyoD, MFR4, and myogenin), Pax-3 and myostatin genes with the formation and maturation of muscle fibers. In general, the expression of myogenic factors was greater in the broiler than in the layer chicken line in the phases under study. These results should contribute to other cellular and molecular development studies besides providing useful resources for chicken breeding programs whose objective is the deposition of skeletal muscle mass