Segunda opinião diagnóstica na anatomia patológica / Second opinion on pathological anatomy

A anatomia patológica, veterinária e humana, no contexto mundial, adota, com cada vez mais frequência, a prática de segunda opinião diagnóstica, como método de verificação e confirmação de pareceres técnicos, objetivando uma maior acurácia e precisão dos diagnósticos fornecidos. Este trabalho tem por objetivo discorrer sobre a importância da segunda opinião diagnóstica na anatomia patológica e seus aspectos éticos. A segunda opinião reflete uma medida de precisão diagnóstica e, apesar de alguns sítios anatômicos ou áreas de subespecialidade apresentarem maiores frequências de grandes discordâncias diagnósticas, quase todas as áreas no âmbito da anatomia patológica podem ser clinicamente afetadas pela segunda opinião. Dadas as variações entre as instituições, recomenda-se a revisão de segunda opinião de todos os locais anatômicos em todas as instituições, públicas e privadas, para maximizar a descoberta de divergências clinicamente relevantes.

Human and veterinary medicine pathological Anatomy in the world context, increasingly adopts the practice of second diagnostic opinion, as a method of verification and confirmation of technical opinions, aiming at greater accuracy and precision of the diagnoses provided. This work aims to discuss the importance of the second diagnostic opinion in pathological anatomy and its ethical aspects. The second opinion reflects a measure of diagnostic accuracy, and although some anatomical sites or areas of subspecialty have higher frequencies of major diagnostic disagreements, almost all areas within the pathological anatomy can be clinically affected by the second opinion. Given the variations between institutions, a second opinion review of all anatomic sites in all institutions, public and private, is recommended to maximize the discovery of clinically relevant discrepancies.

Avaliação do impacto do processo de congelamento nos parâmetros macro e microscópicos tegumentares do biomodelo Macaca mulatta (Zimmermann, 1780)

O uso de primatas não humanos (PNH) em pesquisas constitui ferramenta excepcional no conhecimento sobre inúmeras patologias que afetam os humanos. É imperioso que o seu emprego como biomodelos esteja em consonância com as normas vigentes, priorizando os métodos de substituição, refinamento e redução na busca de minimizar ao máximo o uso dos animais de laboratório. Neste intuito, o estudo morfológico das diferentes espécies envolvidas na Ciência em Animais de Laboratório (CAL) é de extrema relevância para a evolução do processo científico. Apesar dos PNH serem modelos amplamente utilizados na CAL, existem poucos estudos sobre as diferentes estruturas morfológicas de órgãos e tecidos, surgindo possíveis vieses e resultados falso-positivos na rotina histopatológica. Em criadouros científicos, em situações em que esses animais têm como desfecho o óbito, muitas vezes, não há possibilidade de realizar um exame necroscópico imediato, havendo a necessidade de congelar a carcaça do animal para posterior análise. Diante dessa abordagem e tendo em vista que o tegumento é o maior órgão dos organismos vivos, este trabalho objetivou descrever a estrutura morfológica de diferentes regiões anatômicas do sistema tegumentar de macacos rhesus (Macaca mulatta), verificar a influência do congelamento na arquitetura celular da pele destes animais, bem como estudar potenciais efeitos autolíticos do tecido cutâneo. Os animais foram divididos em três grupos: G1 - animais submetidos à eutanásia, tendo sido feita a necropsia imediatamente; G2 - animais submetidos à eutanásia e imediatamente congelados a - 20ºC, para posterior análise necroscópica; e G3 - animais que vieram ao óbito e expostos a condições ambientais por até 24h e posteriormente congelados a -20ºC. Foram coletadas seis regiões do tegumento: parietal superior medial, cervical posterior, torácica intermamária, torácica interescapular, ventral quadrante esquerdo inferior e sacral. As amostras foram processadas por técnicas histológicas habituais de inclusão em parafina e coradas pelo método Hematoxilina-Eosina, mensurando 30 regiões da epiderme e da camada córnea de forma randomizada. A quantificação do colágeno na derme foi feita pelo método Picrosírius Red, com captura de 10 regiões da derme. Os resultados mostraram que o processo de congelamento foi capaz de preservar as carcaças dos animais dos grupos G2 e G3, sem alterações histopatológicas, com exceção das regiões ventral e cervical. Evidenciou-se uma tendência de dermatite nas regiões palmar, plantar e calosidade isquiática, constatando-se que estas não são consideradas regiões viáveis para submissão de estudo histológico. Os achados sugerem que o congelamento é um importante processo de preservação do sistema tegumentar, podendo inferir, por conseguinte, uma possível preservação dos demais sistemas.

The use of nonhuman primates (NHP) in research is an exceptional tool in the knowledge of pathologies that affect humans. It is imperative that their use as biomodels are in line with current regulations, prioritizing replacement, refinement and reduction methods in order to minimize the use of laboratory animals as much as possible. In this regard, the morphological study of the different species involved in Laboratory Animal Science (LAS) is extremely important to the evolution of the scientific process. Despite the fact that NHP are models widely used in the LAS, there are few studies on the different morphological structures of organs and tissues, resulting in possible biases and false-positive results in the histopathological routine. In scientific breeding sites, in situations where these animals have death as an outcome, there is often no possibility of carrying out an immediate necroscopic examination, with the need to freeze the animal's carcass for further analysis. Given this approach and considering that the integument is the largest organ of living organisms, this study aimed to describe the morphological structure of different anatomical regions of the integumentary system of rhesus monkeys (Macaca mulatta), to verify the influence of freezing on the skin cell architecture of these animals, as well as to study potential autolytic effects of the cutaneous tissue. The animals were divided into three groups: G1 - animals that were submitted to euthanasia and the necropsy was performed immediately; G2 - animals that were submitted to euthanasia and immediately frozen at -20ºC, for subsequent necroscopic analysis; and G3 - animals that died and exposed to environmental conditions for up to 24 hours and then frozen at -20ºC. Six regions of the integument were collected: medial superior parietal, posterior cervical, intermammary thoracic, interscapular thoracic, ventral left inferior quadrant and sacral. Samples were processed by usual histological techniques of embedding in paraffin and stained by the Hematoxylin-Eosin method, measuring 30 regions of the epidermis and stratum corneum in a random way. The collagen quantification in the dermis was performed using the Picrosirius Red method, capturing 10 regions of the dermis. Results showed that the freezing process was able to preserve the animal carcasses in G2 and G3 groups, with no histopathological changes, except for the ventral and cervical regions. A trend of dermatitis was evidenced in the palmar, plantar and sciatic callosity regions, noting that these are not considered viable regions for histological study submission. The findings suggest that freezing is an important process of preservation of the integumentary system, which can therefore infer a possible preservation of the other systems.

ESTUDO DA ASSOCIAÇÃO CLÍNICA E TOMOGRÁFICA NA DETERMINAÇÃO DE ESCORES CORPORAIS EM PAPAGAIOS-VERDADEIROS (Amazona aestiva)

A magreza e a obesidade estão entre os problemas nutricionais mais comuns em psitacídeos sob cuidados humanos. A avaliação clínica desses pacientes é complexa, sendo essencial a análise do escore de condição corporal (ECC). Assim, o estudo objetivou avaliarclinicamente e por meio da tomografia computadorizada (TC) a condição corporal de papagaios-verdadeiros, Amazona aestiva, correlacionando áreas de musculatura e de gordura com o ECC e sexo. Clinicamente o ECC dos papagaios foi classificado de acordo com a conformação da musculatura peitoral na região de quilha e a visualização de gordura na região celomática: ECC 1 (muito magros), ECC 2 (magros), ECC 3 e ECC 4 (ideal) e ECC 5 (obesos). Foram analisadas quatro metodologias diferentes para determinação da composição corporal na TC. Para a mensuração manual, método 1, foram utilizados 42 papagaios hígidos e quatro imagens de cada ave. Outras três técnicas foram mensuradas pelo solfware ImageJ em 44 papagaios-verdadeiros hígidos, considerando pontos anatômicos pré-determinados. O método 2 consistiu na análise de sete segmentos no plano transversal distribuídos simetricamente no celoma. Os métodos 3 e 4 examinaram imagens no plano transversal, situadas, respectivamente, na região de início do sinsacro e na entrada da cavidade celomática. O Método 1 revelou um local específico ainda não delimitado na espécie para o acúmulo de gordura, a região da glândula uropígea, e demonstrou que a TC pode ser utilizada para verificar o ECC de papagaios-verdadeiros, com destaque para a musculatura peitoral em plano transversal. Dentre os locais de deposição de gordura da espécie, o principal foi o celoma caudal, seguido das regiões de glândula uropígea e axila. O método 2 foi o mais representativo da quantidade de gordura. Os métodos 3 e 4 apresentaram correlação moderada do ECC com a musculatura, porém o método 4 se destacou apontando diferença em todos os escores. Concluiu-se que a TC auxilia na avaliação da condição nutricional de Amazona aestiva, devendo-se selecionar segmentos de imagens de acordo com o tecido de interesse.

Thinness and obesity are among the most common nutritional problems in parrots under human care. The clinical assessment of these patients is complex, and the analysis of the body condition score (ECC) is essential. Thus, the study aimed to evaluate clinically and by means of computerized tomography (CT) the body condition of the Blue fronted amazon parrot, Amazona aestiva, correlating muscle and fat areas with ECC and sex. Clinically, the ECC of parrots was classified according to the conformation of the pectoral muscles in the keel region and the visualization of fat in the coelomatic region: ECC 1 (very thin), ECC 2 (thin), ECC 3 and ECC 4 (ideal) and ECC 5 (obese). Four different methodologies for determination of body composition at CT were analyzed. For manual measurement, method 1, 42 healthy parrots and four images of each bird were used. Three other techniques were measured by ImageJ solfware in 44 healthy parrots, considering predetermined anatomical points. Method 2 consisted of the analysis of seven segments in the transverse plane distributed symmetrically in the coelom. Methods 3 and 4 examined images in the transverse plane, located, respectively, at the beginning of the synsacral region and at the entrance to the coelomic cavity. Method 1 revealed a specific location not yet defined in the species for the accumulation of fat, the uropigeal gland region, and demonstrated that CT can be used to verify the ECC of true parrots, with emphasis on the pectoral musculature in the transverse plane. Among the fat deposition sites of the species, the main one was the caudal coelom, followed by the uropigeal gland and armpit regions. Method 2 was the most representative of the amount of fat. Methods 3 and 4 showed moderate correlation of the ECC with the musculature, but method 4 stood out, pointing out a difference in all scores. In conclusion, CT helps to assess the nutritional status of Amazona aestiva, and image segments should be selected according to the tissue of interest.

A Lactobacillus rhamnosus strain induces protection in different sites after Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium challenge in gnotobiotic and conventional mice / Uma cepa de Lactobacillus rhamnosus induz proteção em diferentes sítios em camundongos gnotobióticos e convencionais após desafio com Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium

The ability of a Lactobacillus rhamnosus strain isolated from a healthy breast-fed human newborn to reduce the pathological consequences for the host due to an experimental oral infection with Salmonella enterica subsp. enterica serov. Typhimurium in vivo was determined using gnotobiotic and conventional mice. Conventional mice received 0.1mL probiotic milk (8.0 log colony-forming unit) daily for 10 days before the oral pathogenic challenge (5.0 log colony-forming unit). Then probiotic treatment was continued until the end of the experiment. Probiotic treatment in germ-free mice consisted of a single dose of the probiotic milk at the beginning of the experiment and a challenge with S. Typhimurium 10 days later (3.0 log colony-forming unit). A protective effect was observed in both gnotobiotic and conventional animals in terms of histopathologic and morphometric data, but in different anatomical sites. This protection was observed in liver and intestines, respectively, for gnotobiotic and conventional mice. However, S. Typhimurium populations were similar in the feces of both treated and control gnotobiotic mice. We conclude that a protective effect of L. rhamnosus against experimental S. Typhimurium was observed. This protection was not due to the reduction of the population of pathogenic bacteria in the intestine.(AU)

A habilidade de uma cepa de Lactobacillus rhamnosus isolada de um recém-nascido saudável de reduzir as consequências patológicas para o hospedeiro após infecção experimental por Salmonella enterica subsp. enterica sorov. Typhimurium foi avaliada em camundongos gnotobióticos e convencionais. Os camundongos convencionais receberam 0,1mL de leite probiótico por dia (0,8 log unidade formadora de colônia), 10 dias antes do desafio oral com S. Typhimurium (5,0 log unidade formadora de colônia), e continuaram recebendo probiótico até o término do experimento. O tratamento com probiótico nos camundongos gnotobióticos consistiu em uma única dose de leite probiótico no início do experimento e desafio oral após 10 dias (3,0 log unidade formadora de colônia). Em termos histopatológicos e morfométricos, a proteção foi observada no fígado e nos intestinos nos animais gnotobióticos e convencionais, respectivamente. No entanto, a população de S. Typhimurium foi similar em ambos os grupos tratado e controle de animais gnotobióticos. Desta forma, conclui-se que a proteção conferida pela cepa de L. rhamnosus contra o desafio experimental S. Typhimurium foi observada em diferentes sítios anatômicos nos animais convencionais e gnotobióticos e que essa proteção não foi devido à redução da população de S. Typhimurium nos intestinos.(AU)

Contaminação fúngica no leite humano e em sítios anatômicos de lactantes e lactentes / Fungal contamination in human milk and in the anatomic sites of breastfeeding mothers and infants

As infecções bacterianas ou fúngicas causam quadro clínico de mastite, que motiva desmame precoce. Os micro-organismos patogênicos, como leveduras do gênero Candida , quando em número elevado no intestino, podem causar disbiose. Nesta pesquisa, foram realizadas a detecção e a identificação de microbiota fúngica nas amostras de leite humano e de sítios anatômicos de mulheres e crianças atendidas pelo Banco de Leite Humano do Instituto Fernandes Figueira. A virulência dos isolados de levedura foi determinada pelos testes de atividade proteolítica. De 64 amostras analisadas, 81% foram positivas para fungos, com maior prevalência de Candida albicans (73%), seguida do complexo C. parapsilosis (15,4%). Perfis semelhantes aos verificados no total de amostras foram encontrados nas amostras de leite, nas mamas e na cavidade oral, sugerindo-se a ocorrência de associação entre a infecção cutânea da mãe e do lactente com o leite ingerido. O perfil associado à virulência dos isolados de Candida foi determinado pelo teste de produção de proteases, e 100% das amostras mostraram resultados fortemente positivos, indicando alto grau de infecciosidade . A alta prevalência de C. albicans nas amostras coletadas de mamas, no leite e na cavidade oral, é importante fator de risco à saúde de lactentes.(AU)

Bacterial or fungal infections might produce a clinical feature of mastitis, which is one of the main causes of precocious breast-feeding discontinuity. In addition, when the potentially pathogenic microorganisms as yeast of Candida genera were in high counting in the intestine, might cause dysbiosis. This study aimed detecting and identifying fungi in human milk and anatomical sites of breast-feeding women and infants who were enrolled at Human Milk Bank of the Institute Fernandes Figueira. The virulence of the yeast isolates was evaluated by means of proteolytic activity tests. Eight-one percent of 64 analyzed samples showed positive results to fungi, with a highest prevalence of Candida albicans (73%) followed by C. parapsilosis complex (15.4%). Similar profiles were found in samples of milk, of breasts and of infants mouth cavity, suggesting a correlation between breast-feeding mothers and infants cutaneous infections with the ingested milk. The virulence of the isolated Candida was determined by the proteolytic activity test. All of the isolates (100%) were strongly positive, indicating a high degree of infectivity. The high prevalence of C. albicans in samples collected from breasts, mouth cavity and milk is a crucial risk factor for the infants health.(AU)

Ocorrência de miíases em animais de companhia no Distrito Federal, brasilimação cardiopulmonar / cerebral (RCPC) em cães / Occurrence of myiasis in pets from the Federal District, in Brazil

Background: Myiasis is one of the main causes of infestation by Diptera larvae in animals and human beings. This parasitic disease is frequently diagnosed at veterinary and medical practices. It is classified according to its anatomical location in the host or to its dependency relations and parasitic occurrence. In Brazil, the two diptera species with the highest myiasis incidence in domestic animals are Cochliomyia hominivorax (Calliphoridae) and Dermatobia hominis (Oestridae). These ectoparasites are primarily found in dogs and secondarily in cats, and they are often associated with omission or mistreatment by the owner. This study describes myiasis cases and the main predisposing factors in domestic animals that occurred in 2009 in the Federal District, Brazil. Materials, Methods & Results: Between January and December 2009, veterinary practitioners from 90 small animal practices were requested to supply the larvae collected from clinical myiasis cases. The larvae were kept alive inside biological containers containing vermiculite to preserve their integrity during transportation. Data on the collection month, age, gender, breed, color and type of coat, as well as lesion site, myiasis type and dwelling type were obtained. The larvae were identified in laboratory and then kept inside incubators, fed on rotten bovine meat during 24h. The resulting flies were again identified and sexed. Then the absolute and relative proportions of the clinical cases were obtained, based on the epidemiological factors and respective parasites. Forty cases were recorded (39 of which were dogs and one was a cat). Cochliomyia hominivorax was the most abundant parasite, with 37 cases observed in dogs and only one in a cat. The other two myiasis cases were caused by Lucilia eximia and Musca domestica. In dogs, the highest occurrence of myiasis was observed in males, especially in German Sheepdogs and Cocker Spaniels. The predominant anatomical sites of the disease in dogs were the front limbs and tail. The period in which the disease occurred most frequently was between March and May, period which corresponds to the rainy season in the Brazilian Cerrado. Dogs living in houses within urban areas had the highest parasitism occurrence. Discussion: Myiasis in companion animals is a common finding throughout practices in Brazil and around the world. However, this situation has been under control in North American countries, especially after erradication of myiases caused by C. hominivorax in bovines, which represented great economic losses. Therefore, the incidence of the parasitism in dogs and cats was reduced. In Brazil, obligatory and facultative cutaneous myiases in dogs and cats are caused by omission and mistreatment by the owner. The results presented in this study corroborate the characteristics of neotropical myiases in the Southeast and South region of Brazil in relation to the incidence period and preferential host characteristics, except that the disease has a preference for male light-colored animals, being predominantly observed on the hind limbs. New cases were observed in dogs, particularly in Central Brazil, such as the facultative cutaneous myiasis cases caused by Lucilia eximia and Musca domestica.

Ocorrência de miíases em animais de companhia no Distrito Federal, brasilimação cardiopulmonar / cerebral (RCPC) em cães / Occurrence of myiasis in pets from the Federal District, in Brazil

Background: Myiasis is one of the main causes of infestation by Diptera larvae in animals and human beings. This parasitic disease is frequently diagnosed at veterinary and medical practices. It is classified according to its anatomical location in the host or to its dependency relations and parasitic occurrence. In Brazil, the two diptera species with the highest myiasis incidence in domestic animals are Cochliomyia hominivorax (Calliphoridae) and Dermatobia hominis (Oestridae). These ectoparasites are primarily found in dogs and secondarily in cats, and they are often associated with omission or mistreatment by the owner. This study describes myiasis cases and the main predisposing factors in domestic animals that occurred in 2009 in the Federal District, Brazil. Materials, Methods & Results: Between January and December 2009, veterinary practitioners from 90 small animal practices were requested to supply the larvae collected from clinical myiasis cases. The larvae were kept alive inside biological containers containing vermiculite to preserve their integrity during transportation. Data on the collection month, age, gender, breed, color and type of coat, as well as lesion site, myiasis type and dwelling type were obtained. The larvae were identified in laboratory and then kept inside incubators, fed on rotten bovine meat during 24h. The resulting flies were again identified and sexed. Then the absolute and relative proportions of the clinical cases were obtained, based on the epidemiological factors and respective parasites. Forty cases were recorded (39 of which were dogs and one was a cat). Cochliomyia hominivorax was the most abundant parasite, with 37 cases observed in dogs and only one in a cat. The other two myiasis cases were caused by Lucilia eximia and Musca domestica. In dogs, the highest occurrence of myiasis was observed in males, especially in German Sheepdogs and Cocker Spaniels. The predominant anatomical sites of the disease in dogs were the front limbs and tail. The period in which the disease occurred most frequently was between March and May, period which corresponds to the rainy season in the Brazilian Cerrado. Dogs living in houses within urban areas had the highest parasitism occurrence. Discussion: Myiasis in companion animals is a common finding throughout practices in Brazil and around the world. However, this situation has been under control in North American countries, especially after erradication of myiases caused by C. hominivorax in bovines, which represented great economic losses. Therefore, the incidence of the parasitism in dogs and cats was reduced. In Brazil, obligatory and facultative cutaneous myiases in dogs and cats are caused by omission and mistreatment by the owner. The results presented in this study corroborate the characteristics of neotropical myiases in the Southeast and South region of Brazil in relation to the incidence period and preferential host characteristics, except that the disease has a preference for male light-colored animals, being predominantly observed on the hind limbs. New cases were observed in dogs, particularly in Central Brazil, such as the facultative cutaneous myiasis cases caused by Lucilia eximia and Musca domestica.(AU)

CARACTERIZAÇÃO DE COLÁGENO TIPO I E III NO ESTROMA DO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS CUTÂNEO EM CÃES

O carcinoma de células escamosas (CCE) é uma neoplasia epitelial maligna que acomete cães e diversas outras espécies, incluindo a humana. O CCE afeta vários sítios anatômicos e pode desenvolver metástase. Este trabalho teve como objetivo proporcionar informações sobre fatores de risco, manifestação clínica, diagnóstico, tratamento e prognóstico, assim como a caracterização das fibras colágenas tipo I e III no estroma de CCE cutâneo em cães. Este estudo utilizou 44 amostras de pele incluídas em parafina, provenientes de dois serviços de diagnóstico em patologia veterinária, com prévio diagnóstico de CCE cutâneo. As amostras foram avaliadas histologicamente utilizando coloração de hematoxilina e eosina para classificação segundo o grau de diferenciação tumoral e, por Picrosirius Red sob luz polarizada para quantificação da expressão de colágenos tipos I e III. O colágeno tipo III mostrou maior expressão nos CCE cutâneos bem diferenciados, porém, isto só foi evidente quando as amostras foram classificadas em apenas dois graus de diferenciação: bem diferenciadas ou pouco diferenciadas. Considerando a distribuição dos tipos de colágeno segundo a região do corpo, o colágeno tipo I não apresentou diferença estatística entre cabeça, tronco e membros. Entretanto, para o colágeno do tipo III, a análise revelou que a quantidade expressa no tronco é significativamente maior que no membro. O papel do colágeno do tipo III nas neoplasias não está bem esclarecido e outros fatores além do grau de diferenciação celular podem estar envolvidos em sua expressão e determinar sua importância na biologia tumoral.

Squamous cell carcinoma (SCC) is a malignant epithelial tumor that affects dogs and several other species, including human. The SCC occurs in various anatomical sites and can develop metastasis. This study aimed to provide information about risk factors, clinical presentation, diagnosis, treatment and prognosis, as well as the characterization of collagen type I and III in SCC stroma in dogs. This study used 44 canine skin biopsies paraffin-embedded previously diagnosed with cutaneous SCC from two veterinary pathology diagnostic services. The samples were evaluated histologically with hematoxylin and eosin staining to evaluate the degree of cell differentiation, and with Sirius Red staining under polarized light to quantify the expression of collagen types I and III. Type III collagen expression was higher in well-differentiated SCC, however, it was only evident when samples were classified into only two degrees of differentiation: well differentiated or poorly differentiated. Considering the distribution of collagen types according to body region, type I collagen showed no statistical difference between head, trunk and limbs. However, for type III collagen, the analysis showed that the quantity expressed in the trunk is significantly larger than the member. The role of type III collagen in cancer is not very clear and factors other than cell differentiation degree may be involved in its expression and determine its importance in tumor biology.

ATIVIDADE DE Moringa oleifera IN VITRO CONTRA FUNGOS ASSOCIADOS À CARCINICULTURA DE Macrobrachium amazonicum E ENVOLVIMENTO DE BOMBAS DE EFLUXO NO FENÔMENO DE RESISTÊNCIA A DERIVADOS AZÓLICOS EM Candida spp.

Espécies de fungos são isoladas com frequência da microbiota de diversos sítios anatômicos de animais sem causar danos ao hospedeiro, podendo ser encontradas também em ambientes terrestres e aquáticos, especialmente em áreas de cultivo animal. Espécies de Candida são comumente isoladas destes ambientes e de animais, sendo frequente a resistência a azólicos nestes isolados, por vezes, maior que o observado em isolados humanos. Este aparente paradoxo é mal compreendido, uma vez que a exposição de cepas ambientais e animais a estes antifúngicos não ocorre por tratamento/profilaxia dos hospedeiros animais. O presente estudo verificou a atividade antifúngica de extratos de Moringa oleifera frente 14 cepas de Candida spp. (3 C. ciferrii; 6 C. famata; 2 C. guilliermondii; 2 C. parapsilosis; e 1 C. tropicalis) e 10 cepas de Hortaea werneckii isolados da carcinicultura de M. amazonicum, assim como avaliou a toxicidade destes extratos in vitro. Ademais, foi investigada a expressão gênica das bombas de efluxo CDR1 e CDR2 em cepas de C. albicans resistentes a azólicos isoladas de animais (n=16) e humanos (n=2) e também a influência da exposição ao tetraconazol (azólico agrícola) e malathion (organofosforado) na ocorrência de resistência ao fluconazol, itraconazol e voriconazol em C. parapsilosis ATCC 22019. A partir dos dados obtidos no teste de microdiluição in vitro, evidenciou-se que o extrato clorofórmico de flores inibiu o crescimento de todas as cepas fúngicas associadas à carcinicultura de M. amazonicum. O extrato etanólico de folhas, flores e sementes inibiu o crescimento de 22/24, 21/24 e 20/24 cepas, respectivamente. O extrato de vagens inibiu somente cepas de Candida spp. (14/14) e, por sua vez, o extrato de caule inibiu apenas quatro cepas de H. werneckii (4/10). Os extratos de sementes, flores (fração clorofórmica), caules e folhas apresentaram baixa ou nenhuma toxicidade em larvas de M. amazonicum, enquanto que extratos de vagens e flores (fração etanólica) apresentaram toxicidade moderada. Quanto à expressão gênica analisada por qPCR, verificou-se que há correlação entre a resistência a fluconazol e a expressão de CDR1 em C. albicans resistentes a azólicos, uma vez que a expressão de CDR1 estava aumentada em 56,25% (9/16) destas cepas. Foi demonstrado ainda que a exposição, in vitro, ao tetraconazol, mas não ao malathion, diminui a sensibilidade aos azólicos clínicos, especialmente ao fluconazol. Este fenômeno é mediado, pelo menos em parte, pela atividade de bombas de efluxo dependentes de ATP, haja visto o aumento da sensibilidade das réplicas de C. parapsilosis, com o uso de prometazina; assim como o aumento no efluxo de rhodamina 6G e o aumento de expressão dos genes das bombas de efluxo CDR. Também há indícios de envolvimento de bombas MDR nas réplicas resistentes a fluconazol, sem alteração na biossíntese de ergosterol nem na expressão do gene ERG11. Portanto, ficou demonstrado na primeira parte deste trabalho, a potencialidade do uso de extratos de M. oleifera no controle de fungos associados a carcinicultura de M. amazonicum. Ademais, ficou evidente, na análise molecular, o envolvimento de bombas de efluxo CDR em C. albicans de origem animal resistentes a azólicos. Por fim, demonstrou-se que a exposição de C. parapsilosis ao tetraconazol, in vitro, induz resistência a azólicos de uso clínico também via superexpressão de CDR.

Fungal species are often isolated from microbiota of several anatomical sites from animals without causing harm to the host, and can also be found in terrestrial and aquatic environments, especially in animal farming areas. Candida species are opportunistic pathogens commonly isolated from these environments and animals, and azole resistance are frequent in these isolates, sometimes greater than that observed in human isolates. This apparent paradox is poorly understood, since exposure of environmental and animal strains to these antifungals does not occur during treatment/prophylaxis of animal hosts. This study investigated the antifungal activity of M. oleifera extracts against 14 strains of Candida spp. (3 C. ciferrii; 6 C. famata; 2 C. guilliermondii; 2 C. parapsilosis; and 1 C. tropicalis) and 10 strains of Hortaea werneckii isolated from shrimp Macrobrachium amazonicum, as well as the in vitro toxicity of these extracts. In addition, we investigated the gene expression of efflux pumps CDR1 and CDR2 in azole-resistant C. albicans strains from animals (n = 16) and humans (n = 2) and also the influence of exposure to tetraconazole (agricultural azole) and malathion (organophosphate) in the occurrence of resistance to fluconazole, itraconazole and voriconazole in C. parapsilosis ATCC 22019. Data from in vitro microdilution test demonstrated that the chloroform flower extract inhibits the growth of all tested fungal strains from shrimp M. amazonicum. The ethanolic extract of leaves, flowers and seeds inhibited the growth of 22/24, 21/24 and 20/24 of strains, respectively. The ethanolic extract of pods inhibited Candida spp. strains (14/14), in its turn, extracts of stem inhibited only four strains of H. werneckii (4/10). The extract of seed, flowers (chloroform fraction), stems and leaves showed low or no toxicity, while ethanolic pods and flowers extracts showed moderate toxicity. Concerning efflux pumps gene expression by qPCR, it was observed correlation between resistance to fluconazole and CDR1 expression in azole resistant C. albicans, since the CDR1 expression was increased in 56.25% (9/16) in these strains. Additionally, it was shown that exposure to tetraconazole, but not to malathion, decreases susceptibility to clinical azoles, particularly to fluconazole. This phenomenon is mediated, at least partially, by the increased activity of ATP-dependent efflux pumps, considering the increase in antifungal susceptibility after the addition of the efflux pump inhibitor promethazine, the increase in efflux of rhodamine 6G and in CDR gene expression. There is also evidence of involvement of MDR pumps in fluconazole-resistant replicas, with no change in ergosterol biosynthesis or in the expression of ERG11 gene. Therefore, the first part of this study showed the potential use of M. oleifera extracts in M. amazonicum shrimp farming fungal control. Moreover, in the molecular analysis, it was evident the involvement of CDR efflux pumps in azole resistance in C. albicans strains from animals. Finally, it was shown that in vitro exposure to tetraconazole in C. parapsilosis induces clinical azole resistance by CDR overexpression too.

SENSIBILIDADE ANTIFÚNGICA E FATORES DE VIRULÊNCIA DE Candida spp. ISOLADAS DO DUCTO NASOLACRIMAL E CONJUNTIVA OCULAR DE EQUINOS

O gênero Candida é composto por leveduras que vivem como comensais na microbiota de homens e diversas espécies de animais. As pesquisas acerca da microbiota de Candida spp. em equinos ainda são poucas quando comparados aos trabalhos em humanos. Dessa forma, o objetivo desta pesquisa foi identificar Candida spp. isoladas da mucosa conjuntival e ducto nasolacrimal de equinos e determinar a sensibilidade in vitro destas leveduras ante a anfotericina B, fluconazol, itraconazol e caspofungina, bem como avaliar a produção dos fatores de virulência proteases e fosfolipases, dos isolados oriundos do ducto nasolacrimal e de biofilme pelas cepas provenientes da mucosa conjuntival. Para a obtenção de Candida spp. foram coletadas amostras 103 equinos, escolhidos aleatoriamente, no Estado do Ceará, Nordeste do Brasil. Para coleta de amostras da conjuntiva ocular e saída do ducto nasolacrimal foram utilizados swabs estéreis de algodão e para o lúmen do ducto nasolarimal foi feita instilação de 2mL de solução salina, via sonda uretral. Os isolados foram avaliados separadamente conforme o sítio anatômico. Dessa forma, um total de 77 isolados de Candida foram obtidas a partir do ducto nasolacrimal, com C. famata como a espécie mais prevalente, seguida por C. tropicalis, C. guilliermondii e C. parapsilosis lato sensu. As cepas foram submetidas a teste de sensibilidade in vitro por meio do método de microdiluição em caldo, protocolo M27-A3, padronizado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Como resultado, um isolado de C. glabrata foi resistente a caspofungina, um isolado de C. parapsilosis lato sensu foi resistente apenas ao fluconazol, 11 foram resistentes somente a itraconazol (7 C. tropicalis, 2 C. guilliermondii, 1 C. famata, 1 C. parapsilosis sensu lato), enquanto oito C. tropicalis apresentaram resistência a ambos os azólicos. Nos testes de produção enzimática, 28 isolados produziram fosfolipases e 12 produziram proteases. No tocante a mucosa conjuntival foram isoladas 15 cepas de Candida, sendo C. tropicalis a espécie mais isolada, seguida por C. parapsilosis lato sensu, C. glabrata, C. rugosa, C. famata, C. ciferrii, C. guilliermondii, C. catenulata e C. krusei. Os isolados foram avaliados quanto a capacidade de formação de biofilme e sensibilidade do biofilme formado a drogas antifúngicas. Do total de isolados testados, somente oito cepas apresentaram-se capazes de produzir biofilme, 3 C. tropicalis, 2 C. glabrata, 1 C. parapsilosis lato sensu, 1 C. guilliermondii e 1 C. catenulate. Inicialmente foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) dos isolados em sua forma planctônica. Em seguida, a sensibilidade antifúngica dos biofilmes maduros foi avaliada utilizando a concentração de 10xCIM e 50xCIM das drogas testadas. Uma cepa de C. tropicalis não apresentou sensibilidade após a exposição a qualquer dos antifúngicos testados, enquanto que a atividade metabólica do biofilme de cinco isolados sofreu reduções apenas após exposição a anfotericina B na concentração de 50xCIM. Uma cepa de C. parapsilosis lato sensu e uma cepa de C. glabrata mostrou redução significativa do biofilme após a exposição ao fluconazol, itraconazol e caspofungina, mas não frente a anfotericina B. Estes resultados destacam a importância de se investigar a sensibilidade antifúngica e os fatores de virulência de Candida spp. da microbiota do ducto nasolacrimal e mucosa conjuntival de equinos visto que apresentam isolados resistentes as drogas antifúngicas mais comumente usadas na medicina humana e também por demonstrarem produção dos fatores de virulência.

The genus Candida is composed of yeasts that inhabit as commensals in the microbiota of men and several animal species. Researches on the microbiota of Candida spp. in horses are still few compared to studies in humans. Thus, the objective of this research was to identify Candida spp. isolated from the conjunctival mucosa and nasolacrimal duct of horses, determine the in vitro susceptibility of these yeasts against amphotericin B, fluconazole, itraconazole, and caspofungin and evaluate the production of the virulence factors: proteases and phospholipases for the strains isolated from the nasolacrimal duct and biofilm for the strains isolated from the conjunctival mucosa. To obtain Candida spp., samples were collected from 103 horses, chosen ramdonly, in Ceará State, northeast Brazil. To collect the samples from ocular conjunctiva and from the region around the nasolacrimal duct, sterile swabs were used, and for the lumen of nasolarimal duct, instillation of 2 mL saline with aid of a urethral probe was performed. Isolates were evaluated separately according to the anatomical site. Thus, a total of 77 Candida isolates were obtained from the nasolacrimal duct, being C. famata the most prevalent species, followed by C. tropicalis, C. guilliermondii and C. parapsilosis lato sensu. As cepas foram submetidas a teste de sensibilidade in vitro por meio do método de microdiluição em caldo, protocolo M27-A3, padronizado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Strains were subjected to in vitro susceptibility testing by microdilution broth method, M27-A3 protocol, standardized by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). As result, an isolate of C. glabrata was resistant to caspofungin, an isolate of C. parapsilosis lato sensu was resistant only to fluconazole, 11 strains were resistant only to itraconazole (7 C. tropicalis, 2 C. guilliermondii, 1 C. famata, 1 C. parapsilosis sensu lato), and eight C. tropicalis were resistant to both tested azoles. Regarding the enzymatic production assay, 28 isolates produced phospholipases and 12 isolates produced proteases. As for the conjunctival mucosa, 15 strains of Candida were isolated, being C. tropicalis the most isolated specie, followed by C. parapsilosis lato sensu, C. glabrata, C. rugosa, C. famata, C. ciferrii, C. guilliermondii, C. krusei and C. catenulata. Isolates were evaluated for biofilm-forming ability and susceptibility of the formed biofilm against antifungal drugs. Of all isolates tested, only eight strains showed capacity of producing biofilm (3 C. tropicalis, 2 C. glabrata, 1 C. parapsilosis lato sensu, 1 C. guilliermondii and 1 C. catenulata). Initially, the minimum inhibitory concentration (MIC) was determinated for the isolates in their planktonic form. Then, the antifungal susceptiblity of mature biofilms was evaluated using concentrations of 10xMIC and 50xMIC of the antinfungal drugs. A strain of C. tropicalis did not show susceptibility to any of the tested antifungal agents, whereas the metabolic activity of the biofilm from five isolates had decrease only after exposure to amphotericin B at concentration of 50xMIC. A strain of C. parapsilosis lato sensu and a strain of C. glabrata showed a significant reduction of mature biofilm after exposure to fluconazole, itraconazole, and caspofungin, but not against amphotericin B. These results highlight the importance of investigating the antifungal susceptibility and virulence factors of Candida spp. from the microbiota of the nasolacrimal duct and conjunctival mucosa of horses once these sites can harbor isolates presenting resistance to the antifungal drugs most often used in human medicine and also demonstrate the production of virulence factors.

SDS-Page and numerical analysis of Candida albicans from human oral cavity and other anatomical sites

The aim of the present research was to evaluate the protein polymorphism degrees among forty-eight C. albicans isolates from fourteen anatomical sites of clinical patients by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and numerical analyzes, in order to identify subspecies and their similarities in some infectious niches. Cell cultures were grown in YEPD medium, collected by centrifugation, and washed in cold saline solution. The whole-cell proteins were extracted by cell disruption using glass beads and submitted to SDS-PAGE technique. After electrophoresis, the protein bands were stained with coomassie-blue and analyzed by statistics package NTSYS-pc version 1.70 software. Similarity matrixes and dendrograms were generated by application of similarity coefficient of simple matching and UPGMA algorithm, respectively. The results obtained showed several C. albicans subtypes and their similarity degrees (80% to 100%). Such data showed that same patients may be infected by two or more C. albicans subtypes in certain anatomical sites (i.e. only in oral cavity of immunocompromised patients, blood, or tracheal secretion), or yet, two or more patients can be infected in identical anatomical sites (i.e. bronchial washing, urine, oral cavity, tracheal secretion, vaginal secretion, and healthy saliva) with a same C. albicans subtype. However, two or more patients also can show infections in corresponding sites (i.e. oral cavity of immunocompromised patients, blood, oropharyngeal secretion, oral cavity, tracheal secretion, vaginal secretion, and healthy saliva) by different C. albicans subtypes. Besides, two or more patients also can be infected with identical or different C. albicans subtypes in different anatomical sites (i.e.1. identical subtypes in vaginal secretion, tracheal secretion, and urine; abdominal secretion and spittle; drainage and oral cavity; catheter and healthy saliva - i.e.2. subtypes different in bronchial washing, oropharyngeal secretion, pulmonary secretion, oral cavity of immunocompromised patients, and blood). Complementary studies involving C. albicans sample isolated from several anatomical sites of immunocompetent or immunocompromised patients (before, during and after specifics therapies) and their families or hospital workers must be done in order to establish the sources of C. albicans colonization. The whole-cell proteins profile performed by SDS-PAGE associated with computer-assisted numerical analysis may provide preliminary criteria for taxonomic and epidemiological studies of such microorganisms.

O objetivo da presente pesquisa foi analisar os graus de polimorfismos protéicos entre isolados de C. albicans provenientes de diversos sítios anatômicos de quarenta e dois pacientes clínicos, através do emprego da eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e análise numérica, a fim de se identificar subespécies e suas similaridades nos diversos nichos infecciosos. Culturas celulares foram desenvolvidas em meio YEPD, coletadas por centrifugação e lavadas com solução salina gelada. As proteínas celulares totais, foram extraídas por rompimento celular, usando pérolas de vidro e submetidas à técnica de SDS-PAGE. Após a eletroforese, as bandas de proteínas foram coradas com coomassie-blue e analisadas pelo conjunto de programas estatístico NTSYS-pc versão 1,70. Matrizes de similaridade e dendrogramas foram gerados pela aplicação do coeficiente de similaridade simple-matching e do algoritmo UPGMA, respectivamente. Os resultados obtidos revelaram vários subtipos de C. albicans e seus graus de similaridade (80% a 100%). Tais dados permitiram demonstrar que, certos pacientes podem estar infectados com dois ou mais subtipos de C. albicans em determinados sítios anatômicos (i.e. apenas na cavidade oral de pacientes imunocomprometidos, sangue ou secreção traqueal), ou ainda, dois ou mais pacientes podem estar infectados em sítios anatômicos idênticos (i.e. apenas em lavagem brônquica, urina, cavidade oral, secreção traqueal, secreção vaginal ou saliva saudável) com um mesmo subtipo de C. albicans. No entanto, dois ou mais pacientes também podem apresentar infecções em sítios correspondentes (i.e. apenas na cavidade oral de pacientes imunocomprometidos, sangue, secreção orofaríngea, cavidade oral, secreção traqueal, secreção vaginal e saliva saudável) por diferentes subtipos de C. albicans. Além disso, dois ou mais pacientes também podem estar infectados com subtipos idênticos ou não de C. albicans em diferentes sítios anatômicos (i.e.1. idênticos subtipos na secreção vaginal, secreção traqueal e urina; secreção abdominal e escarro; drenagem e cavidade oral; cateter e saliva saudável - i.e.2. diferentes subtipos em lavagem brônquica, secreção orofaríngea, secreção pulmonar, cavidade oral de pacientes imunocomprometidos e sangue). Dados complementares envolvendo amostras de C. albicans isoladas de vários sítios anatômicos de pacientes imunocompetentes ou imunocomprometidos (antes, durante e após terapias específicas) e seus familiares ou trabalhadores hospitalares, deverão ser obtidos a fim de se estabelecer as possíveis fontes de colonização por esses microrganismos. De modo geral, os perfis de proteínas totais obtidos por SDS-PAGE associados com análise numérica computadorizada, permitem a obtenção de critérios adicionais para os estudos epidemiológicos e taxonômicos de C. albicans.

SDS-Page and numerical analysis of Candida albicans from human oral cavity and other anatomical sites

The aim of the present research was to evaluate the protein polymorphism degrees among forty-eight C. albicans isolates from fourteen anatomical sites of clinical patients by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and numerical analyzes, in order to identify subspecies and their similarities in some infectious niches. Cell cultures were grown in YEPD medium, collected by centrifugation, and washed in cold saline solution. The whole-cell proteins were extracted by cell disruption using glass beads and submitted to SDS-PAGE technique. After electrophoresis, the protein bands were stained with coomassie-blue and analyzed by statistics package NTSYS-pc version 1.70 software. Similarity matrixes and dendrograms were generated by application of similarity coefficient of simple matching and UPGMA algorithm, respectively. The results obtained showed several C. albicans subtypes and their similarity degrees (80% to 100%). Such data showed that same patients may be infected by two or more C. albicans subtypes in certain anatomical sites (i.e. only in oral cavity of immunocompromised patients, blood, or tracheal secretion), or yet, two or more patients can be infected in identical anatomical sites (i.e. bronchial washing, urine, oral cavity, tracheal secretion, vaginal secretion, and healthy saliva) with a same C. albicans subtype. However, two or more patients also can show infections in corresponding sites (i.e. oral cavity of immunocompromised patients, blood, oropharyngeal secretion, oral cavity, tracheal secretion, vaginal secretion, and healthy saliva) by different C. albicans subtypes. Besides, two or more patients also can be infected with identical or different C. albicans subtypes in different anatomical sites (i.e.1. identical subtypes in vaginal secretion, tracheal secretion, and urine; abdominal secretion and spittle; drainage and oral cavity; catheter and healthy saliva - i.e.2. subtypes different in bronchial washing, oropharyngeal secretion, pulmonary secretion, oral cavity of immunocompromised patients, and blood). Complementary studies involving C. albicans sample isolated from several anatomical sites of immunocompetent or immunocompromised patients (before, during and after specifics therapies) and their families or hospital workers must be done in order to establish the sources of C. albicans colonization. The whole-cell proteins profile performed by SDS-PAGE associated with computer-assisted numerical analysis may provide preliminary criteria for taxonomic and epidemiological studies of such microorganisms.

O objetivo da presente pesquisa foi analisar os graus de polimorfismos protéicos entre isolados de C. albicans provenientes de diversos sítios anatômicos de quarenta e dois pacientes clínicos, através do emprego da eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e análise numérica, a fim de se identificar subespécies e suas similaridades nos diversos nichos infecciosos. Culturas celulares foram desenvolvidas em meio YEPD, coletadas por centrifugação e lavadas com solução salina gelada. As proteínas celulares totais, foram extraídas por rompimento celular, usando pérolas de vidro e submetidas à técnica de SDS-PAGE. Após a eletroforese, as bandas de proteínas foram coradas com coomassie-blue e analisadas pelo conjunto de programas estatístico NTSYS-pc versão 1,70. Matrizes de similaridade e dendrogramas foram gerados pela aplicação do coeficiente de similaridade simple-matching e do algoritmo UPGMA, respectivamente. Os resultados obtidos revelaram vários subtipos de C. albicans e seus graus de similaridade (80% a 100%). Tais dados permitiram demonstrar que, certos pacientes podem estar infectados com dois ou mais subtipos de C. albicans em determinados sítios anatômicos (i.e. apenas na cavidade oral de pacientes imunocomprometidos, sangue ou secreção traqueal), ou ainda, dois ou mais pacientes podem estar infectados em sítios anatômicos idênticos (i.e. apenas em lavagem brônquica, urina, cavidade oral, secreção traqueal, secreção vaginal ou saliva saudável) com um mesmo subtipo de C. albicans. No entanto, dois ou mais pacientes também podem apresentar infecções em sítios correspondentes (i.e. apenas na cavidade oral de pacientes imunocomprometidos, sangue, secreção orofaríngea, cavidade oral, secreção traqueal, secreção vaginal e saliva saudável) por diferentes subtipos de C. albicans. Além disso, dois ou mais pacientes também podem estar infectados com subtipos idênticos ou não de C. albicans em diferentes sítios anatômicos (i.e.1. idênticos subtipos na secreção vaginal, secreção traqueal e urina; secreção abdominal e escarro; drenagem e cavidade oral; cateter e saliva saudável - i.e.2. diferentes subtipos em lavagem brônquica, secreção orofaríngea, secreção pulmonar, cavidade oral de pacientes imunocomprometidos e sangue). Dados complementares envolvendo amostras de C. albicans isoladas de vários sítios anatômicos de pacientes imunocompetentes ou imunocomprometidos (antes, durante e após terapias específicas) e seus familiares ou trabalhadores hospitalares, deverão ser obtidos a fim de se estabelecer as possíveis fontes de colonização por esses microrganismos. De modo geral, os perfis de proteínas totais obtidos por SDS-PAGE associados com análise numérica computadorizada, permitem a obtenção de critérios adicionais para os estudos epidemiológicos e taxonômicos de C. albicans.