Evaluation of novel SexedULTRA-4M technology for in vitro bovine embryo production

SexedULTRA-4M™ is made using an improved method of sex-sorting sperm in a less damaging environment for better retaining sperm integrity throughout the sorting process. The objective of this research was to compare conventional (CONV) and SexedULTRA-4M™ (ULTRA-4M) semen for bovine IVP using four Angus bulls. Matured slaughterhouse oocytes (n = 4000) were divided into the CONV group and the ULTRA-4M group (2000 COCs for each semen type). The IVF process was implemented with CONV and ULTRA-4M semen from the same bull. The cleavage rates, eight cell embryos and blastocysts on day 7 of culture were evaluated for each semen type and each bull. The statistical analysis was carried out with the ANOVA procedure SAS software. The results were 54.45% ± 1.03 and 58.10% ± 1.07; 35% ± 1.57 and 39.15% ± 1.62; 22.8% ± 1.09 and 27.15% ± 1.12 for CONV and ULTRA-4M, respectively, for cleavage rate, eight cell embryos and blastocysts on day 7 for the average of all bulls, comparing only the semen type. Concerning only the semen type, ULTRA-4M was significantly superior to CONV for cleavage rates (P = 0.01) and blastocysts on day 7 (P = 0.009). There were no significant differences between the CONV and ULTRA-4M groups (P>0.05) for all variables analyzed for Bull 1 and Bull 4, however, for Bull 2 ULTRA-4M was significantly superior to CONV for cleavage rates and blastocysts on day 7 (P< 0.05). In Bull 3, ULTRA-4M was significantly higher (P< 0.05) for blastocysts on day 7 compared to CONV. In conclusion, under the conditions of this research the ULTRA-4M and CONV semen produced similar bovine IVP results overall.(AU)

Heterologous in vitro fertilization and embryo production for assessment of jaguar (Panthera onca Linnaeus, 1758) frozen-thawed semen in different extenders

Heterologous in vitro fertilization (IVF) is an important tool for assessing fertility of endangered mammals such as the jaguar, considering difficult access to females for artificial insemination and to obtain homologous oocytes. We aimed to evaluate the fertility of jaguar sperm cryopreserved with different extenders, using domestic cat oocytes to assess the development of hybrid embryos. Semen from four captive jaguars was obtained by electroejaculation. Samples were cryopreserved in powdered coconut water (ACP-117c) or Tris extender containing 20% egg yolk and 6% glycerol. Thawed spermatozoa were resuspended (2.0 × 106 spermatozoa/mL) in IVF medium and co-incubated with cat oocytes matured in vitro for 18 h. Presumptive zygotes were cultured for 7 days. After 48 h, cleavage rate was evaluated, and non-cleaved structures were stained for IVF evaluation. On days 5 and 7, the rate of morula and blastocyst formation was assessed. Data were analyzed using the Fisher exact test (p < 0.05). No difference was observed between ACP-117c and Tris extenders, respectively, for oocytes with 2nd polar body (2/51, 3.9 ± 2.9% vs. 2/56, 3.6 ± 3.1%), pronuclear structures (5/51, 9.8 ± 4.7% vs. 8/56, 14.3 ± 8.0%), and total IVF rates (7/36, 19.4 ± 5.0% vs. 10/37, 27.0 ± 13.8%). All the samples fertilized the oocytes, with 22.9 ± 3.2% (16/70) and 16.7 ± 3.6% (12/72) cleavage of mature oocytes for ACP-117c and Tris extenders, respectively. Morula rates of 4.3 ± 2.3% (3/70) and 5.6 ± 2.2% (4/72) were observed for ACP-117c and Tris, respectively. Only the Tris extender demonstrated blastocyst production (2/12, 16.7 ± 1.5% blastocyst/cleavage). We demonstrated that jaguar ejaculates cryopreserved using ACP-117c and Tris were suitable for IVF techniques, with blastocyst production by ejaculates cryopreserved in Tris. This is a first report of embryos produced in vitro using jaguar sperm and domestic cat oocytes through IVF.(AU)

The effect of adding L-ergothioneine in culture medium on blastocyst development rates

Background: Oocytes and embryos produce energy through mitochondrial oxidative phosphorylation by using oxygen. The membrane structure of the embryo is mostly composed of unsaturated fatty acids, for this reason DNA fragmentation, apoptosis, and abnormal gene expression are shaped as a result of the lipid peroxidation during culture. Oxidative stress (OS) is one of the most important problems affecting the in vitro embryo development. Antioxidant supplementation to the culture medium has been an alternative way to reduce cell damage caused by oxidative stress in in vitro embryo production systems. In this study, it was aimed to determine the effect of L-ergothioneine on blastocyst development when added to the culture medium. Materials, Methods & Results: The material of the study consisted of oocytes aspirated from the ovaries of Holstein cows which were collected from the local slaughterhouse. The ovaries were delivered to the laboratory within 2-3 h in a thermos which provided a constant temperature of 25-30o C with physiological saline (0.9%) containing antibiotics. All follicles in the 3-8 mm range on the ovaries were aspirated using 20 G needle. The collected follicle fluid was filtered through filters with a pore diameter of 70 micrometers. Cells remaining in the filter were washed with OPU medium and transferred to the petri dishes. Fluids were examined under a stereomicroscope. The cumulus-oocyte complexes were classified, and A and B quality oocytes were included to the study (A, B, C, and D quality COC). Oocytes aspirated from the ovaries and collected later on were incubated in IVM medium for 22 h. After maturation, it was taken into IVF medium, semen was added and incubated for 20-22 h. Possible zygotes to be taken to the culture stage were transferred to culture (IVC) drops with (L-ergothioneine 100 µL/mL (n:121) added and without antioxidant (control (n:124)), and kept in the incubator for 6-7 days. Evaluated on the 7th day differences in in vitro embryo production stages were evaluated with the Chi-square test. The study was run in 5 replicates each time, with at least 20 possible zygotes for per group being cultured. It was determined that 262 (87.33%) of a total of 300 oocytes undergoing in vitro maturation were matured. It was determined that 245 of the mature oocytes were fertilized (93.51%). The cleavage rates of the groups were determined as 87.60% and 86.29%, respectively. Eighty-two (33.47%) blastocysts were obtained from 245 zygotes taken into the culture stage, and the blastocyst rates in the groups were found to be 40.50% and 26.61%, respectively. After the study, it was determined that the statistical difference between L-ergothioneine and control in cleavage rates was insignificant (P > 0.05) and blastocyst rates was significant (P < 0.05) Discussion: Oxygen content above normal ratios can increase the formation of reactive oxygen species (ROS), particularly hydrogen peroxide (H2 O2 ), hydroxyl radical (HO·), and peroxyl radicals (ROO·). The increased rate of ROS negatively affects the success of IVP in mammalian embryos. It was observed that L-ergothioneine, which has high antioxidant activity, improved blastocyst development rates, and higher blastocyst rates could be achieved compared to the control group. By investigating the use of L-ergothioneine in different doses, it was thought that the dose with the highest antioxidant activity could be added to the culture medium in in vitro embryo production and more blastocysts could be produced.

In vitro toxicity of Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa on bovine embryos / Toxicidade in vitro da Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa em embriões bovinos

Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa, a vine plant found in Brazil, has been correlated to outbreaks of poisoning in cattle and buffaloes, generating economic losses related to the death due to heart failure, miscarriage, abortion, stillbirth, and neonatal mortality. The aim of this study was to examine the embryotoxic potential of the aqueous plant extract on in vitro bovine embryos. In vitro study was performed in five replicates of bovine embryo culture assigned in two groups: control, in vitro embryo culture medium without the aqueous plant extract; treated group, with addition of 2.7mg/mL of aqueous plant extract (10%) to the embryo culture on the sixth day of culture. Cleavage rate was evaluated at day 2 of the cell culture. Viability, hatchability and underdevelopment of blastocysts on the seventh, eighth, and ninth days (D7, D8, and D9, respectively) of culture were assessed under stereoscopic microscope. On day 7, blastocysts were submitted to TUNEL assay to determine apoptotic index. In vitro exposure of bovine embryos to of N. multiglandulosa resulted in reduced embryo development and survival, evaluated by dark cytoplasm indicating poor morphology and poor quality with marked reduction of hatchability. We observed a significant reduction of blastocyst production/number of cleaved embryos (60.6% vs 41.5%); reduction of blastocysts production/total number of matured bovine oocytes (35.1% vs 21.3%); and embryonic hatching rates (38.0% vs 10.0%). However, no effects were observed on the apoptotic rate. In conclusion, aqueous extract of N. multiglandulosa leaves reduces bovine embryo viability in vitro, suggesting possible detrimental effects on embryo development.(AU)

Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa, uma videira encontrada no Brasil, tem sido correlacionada a surtos de intoxicações em bovinos e búfalos, gerando perdas econômicas relacionadas à morte por insuficiência cardíaca, aborto, natimorto e mortalidade neonatal. O objetivo deste estudo foi examinar o potencial embriotóxico do extrato vegetal aquoso em embriões bovinos in vitro. O estudo in vitro foi realizado em cinco repetições de cultura de embriões bovinos distribuídos em dois grupos: controle, meio de cultura de embriões in vitro sem o extrato aquoso da planta; grupo tratado, com adição de 2,7mg / mL de extrato vegetal aquoso (10%) à cultura do embrião no sexto dia de cultivo. A taxa de clivagem foi avaliada no dia 2 da cultura de células. Viabilidade, eclodibilidade e subdesenvolvimento de blastocistos no sétimo, oitavo e nono dia (D7, D8 e D9, respectivamente) de cultura foram avaliados em microscópio estereoscópico. No dia 7, os blastocistos foram submetidos ao ensaio TUNEL para determinar o índice apoptótico. Observamos redução significativa da produção de blastocisto / número de embriões clivados (60,6% vs 41,5%); redução da produção de blastocistos / número total de oócitos bovinos maturados (35,1% vs 21,3%); e taxas de eclosão embrionária (38,0% vs 10,0%). No entanto, nenhum efeito foi observado na taxa de apoptose. Em conclusão, o extrato aquoso das folhas de N. multiglandulosa reduz a viabilidade do embrião bovino in vitro, sugerindo possíveis efeitos prejudiciais no desenvolvimento embrionário.(AU)

Relationships of morphological and phototextural attributes of presumptive ovine zygotes and early embryos to their developmental competence in vitro: a preliminary assessment using timelapse imaging

The assessment of morphology and digital image opacity may provide valuable information on the present embryo quality. Time-lapse imaging has been employed in research to establish a means of monitoring the dynamic nature of preimplantation embryo development. The aim of present study was to use time-lapse imaging for assessing various prospective morphometric and phototextural markers of the developmental potential of in vitro-derived ovine embryos. Oocytes were obtained by scarification of ovaries from nine Polish Longwool ewes. After in vitro maturation (IVM) and fertilization (IVF) of oocytes with fresh ram semen, the development of embryos to the blastocyst stage was monitored and evaluated using Primo Vision time-lapse imaging technology. Commercially available Image-Pro® Plus software was used to measure zona pellucida thickness, embryo diameter, total area of the perivitelline space, cellular grey-scale pixel intensity and cellular pixel heterogeneity. Statistical assessment of all attributes was done at various time points during embryo development (i.e., presumptive zygote stage: t(0); first cleavage detected at t(2) or t(3); and second cleavage detected at t(4) or t(6)). Out of thirty-seven zygotes analyzed in this study, five did not divide, 26 arrested before and six developed to the blastocyst stage. Our present results indicate that most parameters analyzed did not differ among embryos varying in their developmental fate except for the perivitelline space area that was greater (P<0.05) for non-dividing zygotes than future blastocysts at the presumptive zygote stage (4040±1850 vs. 857±262 µm2, respectively; means±SEM). Consequently, the measurement of perivitelline space at t(0) can potentially be used to prognosticate developmental potential of in vitro-produced ovine embryos albeit further confirmational studies are needed.(AU)

Morphometry of bovine blastocysts produced in vitro in culture media with antioxidants cysteamine or oily extract of Lippia origanoides / [Morfometria de blastocistos bovinos produzidos in vitro em meio de cultura com antioxidantes cisteamina ou extrato oleoso de Lippia origanoides]

This study aimed to evaluate the ultrastructural morphometry of bovine embryos produced in vitro grown at different concentrations of antioxidants. After in vitro maturation and fertilization, the presumptive zygotes were assigned into five treatments. T1) without the addition of any antioxidants (negative control); T2) addition of 50µM/mL cysteamine; and T3, T4 and T5) adding 2.5µg/mL, 5.0µg/mL or 10.0µg/mL of the antioxidants derived from the oily extract from Lippia origanoides, respectively. On D7 of culture, the embryos in the blastocyst stage were fixed and prepared for electron transmission microscopy. These were evaluated for the proportion of cytoplasm-to-nucleus, cytoplasm-to-mitochondria, cytoplasm-to-vacuoles, cytoplasm-to-autophagic vacuoles and cytoplasm-to-lipid droplets. Blastocysts cultured in media containing oily extract of Lippia origanoides presented morphological characteristics such as high cell:mitochondria ratio and low cell:vacuoles and cell:autophagic vacuole ratio, possibly been morphological indicators of embryonic quality. Inner cell mass (ICM) from blastocysts cultured in media without any antioxidants had the highest cell:vacuole ratio. Similar results were found in the trophectoderm (TE) cells of blastocysts from treatment 2. Embryo culture media supplemented with antioxidants derived from Lippia origanoides oil produced embryos with a higher cytoplasmic proportion of organelles, such as mitochondria. Also, treatments without any antioxidants or with the addition of cysteamine presented cytoplasmic vacuolization, a characteristic related to production of poor-quality embryos.(AU)

Este estudo teve como objetivo avaliar a morfometria ultraestrutural de embriões bovinos produzidos in vitro e cultivados em diferentes concentrações de antioxidantes. Após a maturação e a fertilização in vitro, os possíveis zigotos foram divididos em cinco tratamentos: T1) sem adição de antioxidantes (controle negativo); T2) adição de 50µM/mL de cisteamina; e T3, T4 e T5) adição de 2,5µg/mL, 5,0µg/mL ou 10,0µg/mL dos antioxidantes derivados do extrato oleoso de Lippia origanoides, respectivamente. No D7 de cultivo, os embriões em estágio de blastocisto foram fixados e preparados para microscopia eletrônica de transmissão. Estes foram avaliados para a proporção entre citoplasma e núcleo, citoplasma e mitocôndria, citoplasma e vacúolos, citoplasma e vacúolos autofágicos e citoplasma e gotículas lipídicas. Blastocistos cultivados em meio contendo extrato oleoso de Lippia origanoides apresentaram características morfológicas como alta relação célula:mitocôndria e baixa relação célula:vacúolos e célula:vacúolo autofágico, possíveis indicadores morfológicos de qualidade embrionária. A massa celular interna (MCI) de blastocistos cultivados em meio sem quaisquer antioxidantes teve a maior razão célula:vacúolo. Resultados semelhantes foram encontrados nas células do trofectoderma (TE) de blastocistos do tratamento 2. Portanto, o meio de cultivo embrionário suplementado com antioxidantes derivados do óleo de Lippia origanoides produziu embriões com maior proporção citoplasmática de organelas, como mitocôndrias. Além disso, tratamentos sem antioxidantes ou com adição de cisteamina apresentaram vacuolização citoplasmática, característica relacionada à produção de embriões de baixa qualidade.(AU)

A L-arginina na produção in vitro de embriões bovinos: perspectivas para o futuro / L-arginine in the in vitro production of bovine embryos: perspectives for the future

A L-arginina (L-arg) é o principal precursor da síntese do NO, contudo, é precursora também da síntese de creatina, agmatina, ureia, síntese proteica, L-ornitina, poliaminas, L-prolina e L-glutamato. Nesta breve revisão, vamos falar de alguns resultados que estão sendo obtidos sobre o papel da L-arg na capacitação de espermatozoides bovinos e seu impacto na produção in vitro de embriões. Estudos in vitro mostraram que a adição de L-arg ao meio de capacitação espermática está associada a um aumento na produção de NO, que se correlaciona com aumento da motilidade e vigor, integridade da membrana plasmática e acrossomal, atividade mitocondrial, capacitação espermática, peroxidação lipídica, bem como com a produção de blastocistos. Além disso, a adição da L-arg ao meio de capacitação in vitro, altera o perfil de proteínas importantes ligadas ao processo de capacitação, fertilização e desenvolvimento embrionário inicial. Estes efeitos da L-arg são GMPc dependentes e independentes. Na maturação in vitro, entretanto, embora já tenham sido encontrados bons resultados com o uso do L-arg, mais estudos são necessários para determinar a concentração ideal a ser adicionada ao meio de maturação in vitro e seu impacto na produção de blastocistos. Visto que a pré-capacitação de espermatozoides induzida pela heparina em presença de L-arg foi o método mais eficiente na produção in vitro de embriões, sugerimos sua utilização. Mais pesquisas sobre o metabolismo da L-arg no espermatozoide e CCOs de bovinos durante eventos ligados à fertilização são necessários para se identificar novas vias que atuem nestas etapas in vitro visando o aumento da percentagem e qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro.

L-arginine (L-arg) is the main source of NO synthesis; however, it is also a precursor of the synthesis of creatine, agmatine, urea, protein synthesis, L-ornithine, polyamines, L-proline, and Lglutamate. In this brief review, we will discuss some results obtained previously about the role of L-arg in the capacitation of bovine sperm and its impact on in vitro embryo production. In vitro studies have shown that the addition of L-arg to the sperm capacitation medium is associated with an increase in NO production, which in controlled levels is related to an increased motility and vigor, plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial activity, sperm capacitation, peroxidation lipids, as well as with the blastocyst production. Furthermore, the addition of L-arg to the in vitro capacitation medium alters the profile of important proteins linked to the capacitation process, fertilization, and early embryonic development. These effects of L-arg are cGMP dependent and independent. In in vitro maturation, however, although good results have already been found with the use of L-arg, further studies are needed to determine the ideal concentration to be added to the in vitro maturation medium and its impact on the production of blastocysts. Since heparin-induced pre-capacitation of spermatozoa in the presence of L-arg was the most efficient method for in vitro embryo production, we suggest its use. More research on L-arg metabolism in bovine sperm and OCCs during events related to fertilization is needed to identify new pathways that act in these in vitro steps aiming to increase the percentage and quality of bovine embryos produced in vitro.

In vitro performance of Zebu (Bos indicus) and Taurus (Bos taurus) donor cow embryos / Desempenho de vacas doadoras zebuínas (Bos indicus) e taurinas (Bos taurus) na produção de embrião in vitro

In this study, the in vitro production of bovine embryos from zebu and taurine donors was compared. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were obtained from 167 Bos taurus and 161 Bos indicus donors by ovum pick-up. COCs were classified based on their morphological quality, matured in incubators for 22 to 24 h in maturation medium, and then fertilized for 18 to 22 h. The zygotes were transferred to the culture medium for seven days. The embryos were classified as morula (OM), initial blastocyst (BI), blastocyst (BL), and expanded blastocyst (BX), before being transferred to synchronized recipient cows. Pregnancy was diagnosed 30-45 days post-transfer. The Bos indicus donors had a higher oocyte yield (n = 2556) than Bos taurus donors (n = 1903) (P = 0.008). The COCs from zebu donors had a better morphological quality than those from taurine donors (n = 689 vs. 444 for grade 1 COC, P < 0.0001; n = 681 vs. 509 for grade 2 COC, P = 0.010, for zebu and taurine donors, respectively). There were differences in embryo production percentages obtained from OM (0.44% from zebu and 6.42% from taurine, P = 0.017), BL (14.18% from zebu and 3.74% from taurine, P < 0.0001), and BX (81.43% from zebu and 75.13% from taurine, P < 0.0001). No significant difference was observed for embryo production from BI and pregnancy rate (P > 0.05). The Bos indicus cows showed greater oocyte recovery, number of viable oocytes, and production of viable embryos than the Bos taurus cows.(AU)

O objetivo foi avaliar a produção in vitro de embriões bovinos a partir de doadoras zebuína e taurina. Os complexos cumulus oócitos (COCs) foram obtidos de 167 doadoras Bos taurus e 161 Bos indicus, por meio de Ovum pick-up. Os COCs foram classificados quanto à qualidade morfológica, maturados em incubadora por 22 a 24h em meio de maturação, e encaminhados à fertilização entre 18 e 22h. Os zigotos foram transferidos para meio de cultivo, onde permaneceram durante sete dias. Os embriões foram classificados em mórula (MO), blastocisto inicial (BI), blastocisto (BL) e blastocisto expandido (BX), envasados em palhetas contendo meio de cultivo, e inovulados em receptoras sincronizadas. Após 30 e 45 dias da inovulação, realizou-se o diagnóstico de gestação. Os animais Bos indicus apresentaram maior produção oocitária (n = 2556) em comparação aos Bos taurus (n = 1903) (P = 0,008). Os COCs das doadoras zebu apresentaram melhor qualidade morfológica do que das doadoras taurina (n = 689 vs. 444 para COCs grau I, P < 0,0001; n = 681 vs. 509 para COCs grau II, P = 0,010, para doadoras zebu e taurina, respectivamente). Quanto à produção de embriões, houve diferença nas porcentagens obtidas de MO (0,44% zebuínas e 6,42% taurinas, P = 0,017), BL (14,18% zebuínas e 3,74% taurinas, P < 0,0001) e BX (81,43% zebuínas e 75,13% taurinas, P < 0,0001). Não foi observado diferença para BI e taxa de prenhez (P > 0,05). Os animais Bos indicus apresentaram maior recuperação oocitária e maior número de oócitos viáveis em comparação às vacas Bos taurus, como também, maior produção de embriões viáveis.(AU)

In vitro performance of Zebu (Bos indicus) and Taurus (Bos taurus) donor cow embryos / Desempenho de vacas doadoras zebuínas (Bos indicus) e taurinas (Bos taurus) na produção de embrião in vitro

In this study, the in vitro production of bovine embryos from zebu and taurine donors was compared. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were obtained from 167 Bos taurus and 161 Bos indicus donors by ovum pick-up. COCs were classified based on their morphological quality, matured in incubators for 22 to 24 h in maturation medium, and then fertilized for 18 to 22 h. The zygotes were transferred to the culture medium for seven days. The embryos were classified as morula (OM), initial blastocyst (BI), blastocyst (BL), and expanded blastocyst (BX), before being transferred to synchronized recipient cows. Pregnancy was diagnosed 30-45 days post-transfer. The Bos indicus donors had a higher oocyte yield (n = 2556) than Bos taurus donors (n = 1903) (P = 0.008). The COCs from zebu donors had a better morphological quality than those from taurine donors (n = 689 vs. 444 for grade 1 COC, P 0.05). The Bos indicus cows showed greater oocyte recovery, number of viable oocytes, and production of viable embryos than the Bos taurus cows.

O objetivo foi avaliar a produção in vitro de embriões bovinos a partir de doadoras zebuína e taurina. Os complexos cumulus oócitos (COC’s) foram obtidos de 167 doadoras Bos taurus e 161 Bos indicus, por meio de Ovum pick-up. Os COC’s foram classificados quanto à qualidade morfológica, maturados em incubadora por 22 a 24h em meio de maturação, e encaminhados à fertilização entre 18 e 22h. Os zigotos foram transferidos para meio de cultivo, onde permaneceram durante sete dias. Os embriões foram classificados em mórula (MO), blastocisto inicial (BI), blastocisto (BL) e blastocisto expandido (BX), envasados em palhetas contendo meio de cultivo, e inovulados em receptoras sincronizadas. Após 30 e 45 dias da inovulação, realizou-se o diagnóstico de gestação. Os animais Bos indicus apresentaram maior produção oocitária (n = 2556) em comparação aos Bos taurus (n = 1903) (P = 0,008). Os COCs das doadoras zebu apresentaram melhor qualidade morfológica do que das doadoras taurina (n = 689 vs. 444 para COCs grau I, P 0,05). Os animais Bos indicus apresentaram maior recuperação oocitária e maior número de oócitos viáveis em comparação às vacas Bos taurus, como também, maior produção de embriões viáveis.

Correlation between insemination dose and bovine sperm traits on the in vitro embryo production outcomes / Correlação da dose inseminante e características do sêmen bovino no sucesso da produção in vitro de embriões

In the present study we aimed to test the best insemination dose for in vitro embryo production (IVEP) and to correlate sperm traits in bovine. In vitro matured oocytes were inseminated with three different sperm concentrations of the same bull: G1 (1*106 ), G2 (2*106 ) and G3 (4*106 ) sperm/mL. At 18 h post-insemination (hpi), presumptive zygotes [G1 (n=114), G2 (n=139) and G3 (n=136)] were stained to evaluate the pronuclei numbers, or continued to in vitro culture [G1 (n=102), G2 (n=111) and G3 (n=106)]. Sperm kinetics were analyzed using Computer-Assisted Semen Analysis (CASA). Sperm plasma membrane, acrosome integrity and mitochondrial activity were analyzed using fluorescent probes. In vitro fertilization (IVF) and IVEP data were compared using chisquare (P0.05) among the groups. In G3, the polyspermy rate was the highest (7.4%; P0.05) between G1 (0%) and G2 (0%). In G1, the early blastocyst rate was the highest (7.8%; P0.05) between G2 (1.8%) and G3 (0.9%). The IVF efficiency and total blastocyst rates were positively correlated with curvilinear velocity (VCL) (r≃+1; P<0,05). We concluded that the reduction of insemination dose may negatively affect embryo development and VCL may be used as a parameter to improve the IVEP outcomes.(AU)

O objetivo deste estudo foi testar a melhor dose inseminante para a produção de embriões in vitro (IVEP) e sua correlação com as características espermáticas na espécie bovina. Oócitos maturados in vitro foram inseminados com três concentrações diferentes de espermatozoides de único touro: G1 (1*106 ), G2 (2*106 ) e G3 (4*106 ) espermatozoides/mL. Às 18 h pós-inseminação (hpi), os presumíveis zigotos [G1 (114), G2 (139) e G3 (136)] foram corados para avaliar o número de pronúcleos, ou continuaram para o cultivo in vitro [G1 (102), G2 (111) e G3 (106)]. Os parâmetros da cinética espermática foram analisados usando o ComputerAssisted Semen Analysis (CASA). A integridade de membrana plasmática espermática, acrossomal e a atividade mitocondrial foram analisadas usando sondas fluorescentes. Os dados da fertilização in vitro (FIV) e IVEP foram comparadas com qui-quadrado (P=0,05) e correlacionados com dados de CASA e Fluorescência usando Correlação de Pearson (r=±1; P0,05) entre os grupos. Em G3, a taxa de polispermia foi a maior (7,4%; P0,05) entre G1 (0%) e G2 (0%). Em G1, a taxa de blastocisto inicial foi a maior (7,8%; P0,05) com G2 (1,8%) e G3 (0,9%). A eficiência de FIV e a taxa de blastocisto total foram positivamente correlacionadas com velocidade curvilinear (VCL) (P<0,05). Concluímos que a dose inseminante reduzida pode negativamente afetar o desenvolvimento embrionário e VCL pode ser usada como parâmetro para melhorar os resultados da PEIV.(AU)

Correlation between insemination dose and bovine sperm traits on the in vitro embryo production outcomes / Correlação da dose inseminante e características do sêmen bovino no sucesso da produção in vitro de embriões

In the present study we aimed to test the best insemination dose for in vitro embryo production (IVEP) and to correlate sperm traits in bovine. In vitro matured oocytes were inseminated with three different sperm concentrations of the same bull: G1 (1*106 ), G2 (2*106 ) and G3 (4*106 ) sperm/mL. At 18 h post-insemination (hpi), presumptive zygotes [G1 (n=114), G2 (n=139) and G3 (n=136)] were stained to evaluate the pronuclei numbers, or continued to in vitro culture [G1 (n=102), G2 (n=111) and G3 (n=106)]. Sperm kinetics were analyzed using Computer-Assisted Semen Analysis (CASA). Sperm plasma membrane, acrosome integrity and mitochondrial activity were analyzed using fluorescent probes. In vitro fertilization (IVF) and IVEP data were compared using chisquare (P0.05) among the groups. In G3, the polyspermy rate was the highest (7.4%; P0.05) between G1 (0%) and G2 (0%). In G1, the early blastocyst rate was the highest (7.8%; P0.05) between G2 (1.8%) and G3 (0.9%). The IVF efficiency and total blastocyst rates were positively correlated with curvilinear velocity (VCL) (r≃+1; P<0,05). We concluded that the reduction of insemination dose may negatively affect embryo development and VCL may be used as a parameter to improve the IVEP outcomes.

O objetivo deste estudo foi testar a melhor dose inseminante para a produção de embriões in vitro (IVEP) e sua correlação com as características espermáticas na espécie bovina. Oócitos maturados in vitro foram inseminados com três concentrações diferentes de espermatozoides de único touro: G1 (1*106 ), G2 (2*106 ) e G3 (4*106 ) espermatozoides/mL. Às 18 h pós-inseminação (hpi), os presumíveis zigotos [G1 (114), G2 (139) e G3 (136)] foram corados para avaliar o número de pronúcleos, ou continuaram para o cultivo in vitro [G1 (102), G2 (111) e G3 (106)]. Os parâmetros da cinética espermática foram analisados usando o ComputerAssisted Semen Analysis (CASA). A integridade de membrana plasmática espermática, acrossomal e a atividade mitocondrial foram analisadas usando sondas fluorescentes. Os dados da fertilização in vitro (FIV) e IVEP foram comparadas com qui-quadrado (P=0,05) e correlacionados com dados de CASA e Fluorescência usando Correlação de Pearson (r=±1; P0,05) entre os grupos. Em G3, a taxa de polispermia foi a maior (7,4%; P0,05) entre G1 (0%) e G2 (0%). Em G1, a taxa de blastocisto inicial foi a maior (7,8%; P0,05) com G2 (1,8%) e G3 (0,9%). A eficiência de FIV e a taxa de blastocisto total foram positivamente correlacionadas com velocidade curvilinear (VCL) (P<0,05). Concluímos que a dose inseminante reduzida pode negativamente afetar o desenvolvimento embrionário e VCL pode ser usada como parâmetro para melhorar os resultados da PEIV.

Avaliação da técnica de vitrificação de ovários de camundongos da linhagem B6D2F1, pertencentes ao Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos - ICTB/Fiocruz-RJ / Evaluation of ovary vitrification technique from B6D2F1 strain belonging to the Institute of Biomodels Science and Technology ICTB / Fiocruz-RJ

Objetivou-se testar a vitrificação de ovários de camundongos do ICTB/Fiocruz. Inicialmente, fez-se coleta e maturação in vitro dos oócitos de ovários a fresco e vitrificados, bem como avaliação de estruturas no cultivo embrionário, pós-fertilização in vitro. Fêmeas B6D2F1 foram eutanasiadas para remoção dos ovários (n=60) e divididas em três grupos: grupo 1 (n=30 animais) - oócito de ovários vitrificados, maturados e fertilizados in vitro (120 fragmentos); grupo 2 (n=15) (controle 1) - oócitos coletados a fresco, maturados e fertilizados in vitro; e grupo 3 (n=15) (controle 2) - oócitos maturados in vivo e fertilizados in vitro. A técnica foi verificada no desenvolvimento embrionário in vitro, que foi avaliado pelo teste de qui-quadrado (BioStat 5.0). Recuperaram-se 123, 224 e 328 oócitos nos G1, G2 e G3, respectivamente. Observaram-se diferenças significativas nas taxas de clivagem às 24 horas (embriões ≥ 2 células) entre G1 (8%) e G2 (32%) (P<0,1) e G1 e G3 (49%) (P<0,05), mas não entre G2 e G3 (P>0,05). Para blastocistos, às 96 horas, os grupos G1, G2 e G3 apresentaram, respectivamente, 6%, 11% e 46%, diferindo significativamente entre eles (P<0,05). A vitrificação de ovários, a maturação oocitária e a fertilização in vitro são alternativas para a produção de embriões de camundongos in vitro.(AU)

This work aimed test ovarian vitrification of hybrid mouse from ICTB/Fiocruz. Protocol collection and oocyte in vitro maturation from fresh and vitrified ovaries was established and embryos were evaluated after fertilization. B6D2F1 females were euthanized for ovarian removal (n= 60) and divided into 3 groups: G1 (n= 30) - ovaries fragmented (n= 120), vitrified, matured and fertilized; G2 (n= 15) - in vitro fertilization of oocytes matured in vitro from fresh ovaries; G3 (n= 15) - ampulla region oocytes in vitro fertilizated. Viability was verified by thawing, oocyte in vitro maturation and fertilization. In vitro embryo development of each group was evaluated by Chi-square test (BioStat 5.0). 123, 224 and 328 oocytes were recovered from G1, G2 and G3, respectively. Significant differences were observed in cleavage rates at 24 hours (embryos with 2 cells or more) between G1 (8%) and G2 (32%) (P< 0.1) and G1 and G3 (49%) (P< 0.05) but not between G2 and G3 (P> 0.05). Blastocysts at 96 hours presented 6%, 11% and 46%, respectively for G1, G2 and G3, differing significantly (P< 0.05). Ovary vitrification, oocyte in vitro maturation and in vitro fertilization were available for the production of in vitro mouse embryos.(AU)

Avaliação da técnica de vitrificação de ovários de camundongos da linhagem B6D2F1, pertencentes ao Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos - ICTB/Fiocruz-RJ / Evaluation of ovary vitrification technique from B6D2F1 strain belonging to the Institute of Biomodels Science and Technology ICTB / Fiocruz-RJ

Objetivou-se testar a vitrificação de ovários de camundongos do ICTB/Fiocruz. Inicialmente, fez-se coleta e maturação in vitro dos oócitos de ovários a fresco e vitrificados, bem como avaliação de estruturas no cultivo embrionário, pós-fertilização in vitro. Fêmeas B6D2F1 foram eutanasiadas para remoção dos ovários (n=60) e divididas em três grupos: grupo 1 (n=30 animais) - oócito de ovários vitrificados, maturados e fertilizados in vitro (120 fragmentos); grupo 2 (n=15) (controle 1) - oócitos coletados a fresco, maturados e fertilizados in vitro; e grupo 3 (n=15) (controle 2) - oócitos maturados in vivo e fertilizados in vitro. A técnica foi verificada no desenvolvimento embrionário in vitro, que foi avaliado pelo teste de qui-quadrado (BioStat 5.0). Recuperaram-se 123, 224 e 328 oócitos nos G1, G2 e G3, respectivamente. Observaram-se diferenças significativas nas taxas de clivagem às 24 horas (embriões ≥ 2 células) entre G1 (8%) e G2 (32%) (P<0,1) e G1 e G3 (49%) (P<0,05), mas não entre G2 e G3 (P>0,05). Para blastocistos, às 96 horas, os grupos G1, G2 e G3 apresentaram, respectivamente, 6%, 11% e 46%, diferindo significativamente entre eles (P<0,05). A vitrificação de ovários, a maturação oocitária e a fertilização in vitro são alternativas para a produção de embriões de camundongos in vitro.(AU)

This work aimed test ovarian vitrification of hybrid mouse from ICTB/Fiocruz. Protocol collection and oocyte in vitro maturation from fresh and vitrified ovaries was established and embryos were evaluated after fertilization. B6D2F1 females were euthanized for ovarian removal (n= 60) and divided into 3 groups: G1 (n= 30) - ovaries fragmented (n= 120), vitrified, matured and fertilized; G2 (n= 15) - in vitro fertilization of oocytes matured in vitro from fresh ovaries; G3 (n= 15) - ampulla region oocytes in vitro fertilizated. Viability was verified by thawing, oocyte in vitro maturation and fertilization. In vitro embryo development of each group was evaluated by Chi-square test (BioStat 5.0). 123, 224 and 328 oocytes were recovered from G1, G2 and G3, respectively. Significant differences were observed in cleavage rates at 24 hours (embryos with 2 cells or more) between G1 (8%) and G2 (32%) (P< 0.1) and G1 and G3 (49%) (P< 0.05) but not between G2 and G3 (P> 0.05). Blastocysts at 96 hours presented 6%, 11% and 46%, respectively for G1, G2 and G3, differing significantly (P< 0.05). Ovary vitrification, oocyte in vitro maturation and in vitro fertilization were available for the production of in vitro mouse embryos.(AU)

Maturação in vitro de oócitos bovinos é negativamente afetada por CHIR99021, inibidor específico de GSK3 / In vitro maturation of bovine oocytes is negatively affected by CHIR99021, a specific inhibitor of GSK3

A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) atua em várias vias de sinalização pela fosforilação e desfosforilação de proteínas, participando de várias funções celulares. Poucos estudos descrevem sua participação na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos, mas sabe-se que sua inibição inespecífica tem um impacto negativo nesse processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de CHIR99021, inibidor específico da GSK3, em diferentes aspectos da MIV de complexos de cumulusoócito (CCOs) bovino e seu impacto na produção in vitro. Os CCOs foram aspirados de ovários de vacas abatidas e maturados em meio suplementado com 0; 1,5; 3,0 e 6,0 μM de CHIR99021. A análise estatística dos resultados por regressão linear (p≤0,01) mostrou que após 22 h de MIV, o tratamento causou redução dose-dependente no grau de expansão das células cumulus; na viabilidade de oócitos avaliada por coloração com calceína-AM e iodeto de propídio; nas taxas de maturação nuclear, e migração de grânulos corticais avaliadas por marcação com orceína acética a 2% e com lectina Lens culinaris-FITC (LCA), respectivamente, além de uma redução na produção de blastocistos. Assim, conclui-se que o CHIR99021 interfere negativamente, de forma dose-dependente na MIV de oócitos bovinos, sugerindo a importância da GSK3 na maturação nuclear e citoplasmática, com consequente impacto para a produção in vitro de embriões bovinos.

The enzyme glycogen synthase kinase-3 (GSK3) acts in several signaling pathway through phosphorylation and protein dephosphorylation, participating in various cellular functions. Few studies describe its participation in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes, but its nonspecific inhibition is known to have a negative impact on this process. The objective of this work was to evaluate the effect of CHIR99021, specific inhibition of GSK3, on different aspects of the in vitro maturation of bovine cumulus-oocyte (COCs) complexes. COCs were aspirated from ovaries of slaughtered cows and matured in medium supplemented with0; 1.5; 3.0 and 6.0 μM CHIR99021. Statistical analysis of the results by linear regression (p≤0.01) showed that after 22 hours of IVM the treatment caused dose-dependent reduction in the degree of cumulus cell expansion; oocyte viability evaluated by staining with calcein-AM and propidium iodide; rates of nuclear maturation and migration of cortical granules evaluated by labeling with 2% acetic orcein and Lens culinaris-FITC (LCA), respectively; and a reduction in the of blastocyst rate. It is concluded that CHIR99021 interferes negatively, in a dose-dependent manner in the IVM of bovine oocytes, suggesting the importance of GSK3 in nuclear and cytoplasmic maturation, with a consequent impact on the in vitro bovine embryos production.

Maturação in vitro de oócitos bovinos é negativamente afetada por CHIR99021, inibidor específico de GSK3 / In vitro maturation of bovine oocytes is negatively affected by CHIR99021, a specific inhibitor of GSK3

A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) atua em várias vias de sinalização pela fosforilação e desfosforilação de proteínas, participando de várias funções celulares. Poucos estudos descrevem sua participação na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos, mas sabe-se que sua inibição inespecífica tem um impacto negativo nesse processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de CHIR99021, inibidor específico da GSK3, em diferentes aspectos da MIV de complexos de cumulusoócito (CCOs) bovino e seu impacto na produção in vitro. Os CCOs foram aspirados de ovários de vacas abatidas e maturados em meio suplementado com 0; 1,5; 3,0 e 6,0 μM de CHIR99021. A análise estatística dos resultados por regressão linear (p≤0,01) mostrou que após 22 h de MIV, o tratamento causou redução dose-dependente no grau de expansão das células cumulus; na viabilidade de oócitos avaliada por coloração com calceína-AM e iodeto de propídio; nas taxas de maturação nuclear, e migração de grânulos corticais avaliadas por marcação com orceína acética a 2% e com lectina Lens culinaris-FITC (LCA), respectivamente, além de uma redução na produção de blastocistos. Assim, conclui-se que o CHIR99021 interfere negativamente, de forma dose-dependente na MIV de oócitos bovinos, sugerindo a importância da GSK3 na maturação nuclear e citoplasmática, com consequente impacto para a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

The enzyme glycogen synthase kinase-3 (GSK3) acts in several signaling pathway through phosphorylation and protein dephosphorylation, participating in various cellular functions. Few studies describe its participation in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes, but its nonspecific inhibition is known to have a negative impact on this process. The objective of this work was to evaluate the effect of CHIR99021, specific inhibition of GSK3, on different aspects of the in vitro maturation of bovine cumulus-oocyte (COCs) complexes. COCs were aspirated from ovaries of slaughtered cows and matured in medium supplemented with0; 1.5; 3.0 and 6.0 μM CHIR99021. Statistical analysis of the results by linear regression (p≤0.01) showed that after 22 hours of IVM the treatment caused dose-dependent reduction in the degree of cumulus cell expansion; oocyte viability evaluated by staining with calcein-AM and propidium iodide; rates of nuclear maturation and migration of cortical granules evaluated by labeling with 2% acetic orcein and Lens culinaris-FITC (LCA), respectively; and a reduction in the of blastocyst rate. It is concluded that CHIR99021 interferes negatively, in a dose-dependent manner in the IVM of bovine oocytes, suggesting the importance of GSK3 in nuclear and cytoplasmic maturation, with a consequent impact on the in vitro bovine embryos production.(AU)

Correlation between insemination dose and bovine sperm traits on the in vitro embryo production outcomes / Correlação da dose inseminante e características do sêmen bovino no sucesso da produção in vitro de embriões

In the present study we aimed to test the best insemination dose for in vitro embryo production (IVEP) and to correlate sperm traits in bovine. In vitro matured oocytes were inseminated with three different sperm concentrations of the same bull: G1 (1*106), G2 (2*106) and G3 (4*106) sperm/mL. At 18 h post-insemination (hpi), presumptive zygotes [G1 (n=114), G2 (n=139) and G3 (n=136)] were stained to evaluate the pronuclei numbers, or continued to in vitro culture [G1 (n=102), G2 (n=111) and G3 (n=106)]. Sperm kinetics were analyzed using Computer-Assisted Semen Analysis (CASA). Sperm plasma membrane, acrosome integrity and mitochondrial activity were analyzed using fluorescent probes. In vitro fertilization (IVF) and IVEP data were compared using chi-square (P<0.05) and correlated with CASA and fluorescence data using Person Correlation (P<0.05). The IVF efficiency, cleavage and total blastocyst rates did not show any significant difference (P>0.05) among the groups. In G3, the polyspermy rate was the highest (7.4%; P<0.05) without difference (P>0.05) between G1 (0%) and G2 (0%). In G1, the early blastocyst rate was the highest (7.8%; P<0.05), without significant difference (P>0.05) between G2 (1.8%) and G3 (0.9%). The IVF efficiency and total blastocyst rates were positively correlated with curvilinear velocity (VCL) (r≃+1; P<0.05). We concluded that the reduction of insemination dose may negatively affect embryo development and VCL may be used as a parameter to improve the IVEP outcomes.

O objetivo deste estudo foi testar a melhor dose inseminante para a produção de embriões in vitro (IVEP) e sua correlação com as características espermáticas na espécie bovina. Oócitos maturados in vitro foram inseminados com três concentrações diferentes de espermatozoides de único touro: G1 (1*106), G2 (2*106) e G3 (4*106) espermatozoides/mL. Às 18h pós-inseminação (hpi), os presumíveis zigotos [G1 (114), G2 (139) e G3 (136)] foram corados para avaliar o número de pronúcleos, ou continuaram para o cultivo in vitro [G1 (102), G2 (111) e G3 (106)]. Os parâmetros da cinética espermática foram analisados usando o Computer-Assisted Semen Analysis (CASA). A integridade de membrana plasmática espermática, acrossomal e a atividade mitocondrial foram analisadas usando sondas fluorescentes. Os dados da fertilização in vitro (FIV) e IVEP foram comparadas com qui-quadrado (P=0,05) e correlacionados com dados de CASA e Fluorescência usando Correlação de Pearson (r=±1; P<0,05). A eficiência da FIV, taxas de clivagem e blastocisto total não mostraram diferença significativa (P>0,05) entre os grupos. Em G3, a taxa de polispermia foi a maior (7,4%; P<0,05), sem diferença (P>0,05) entre G1 (0%) e G2 (0%). Em G1, a taxa de blastocisto inicial foi a maior (7,8%; P<0,05), sem apresentar diferença significativa (P>0,05) com G2 (1,8%) e G3 (0,9%). A eficiência de FIV e a taxa de blastocisto total foram positivamente correlacionadas com velocidade curvilinear (VCL) (P<0,05). Concluímos que a dose inseminante reduzida pode negativamente afetar o desenvolvimento embrionário e VCL pode ser usada como parâmetro para melhorar os resultados da PEIV.

In vitro embryos production of oocytes selected based on follicular size and by brilliant cresyl blue staining / Produção in vitro de embriões de oócitos selecionados baseados no tamanho folicular e por coloração com azul cresil brilhante

We evaluated the competence of bovine oocytes via morphological selection associated with follicular diameter and by brilliant cresyl blue (BCB) staining, in order to improve oocyte selection and the efficiency of in vitro embryo production. Follicles with small (20,05) BCB+ rates, but both differed (p0,05) in MII rate in the mixed (respectively 86.7 ± 3.4 and 75.8 ± 2.2), large (respectively 89.4 ± 2.6 and 79.7 ± 2.3) and small (respectively 76.7 ± 2.9 and 67.2 ± 2.5) diameter groups. Comparing BCB (+ and -) oocytes, we observed (p>0,05) no change in the percentage of embryos in the large group (respectively 67.3 ± 3.3 and 53.5 ± 5.8) and in the small group (respectively 43.8 ± 5.3 and 33.9 ± 2.2), but there was a difference (p<0.05) in the mixed group (respectively 57.8 ± 3.9 and 39.6 ± 7.5). Furthermore, when we compared between follicular groups, the BCB+/large-diameter group (61.1 ± 3.9%) had a significant higher percentage of embryos (p<0.05) than the small-diameter BCB+ (43.8 ± 5.3) groups. To conclude, selection procedures that use follicle size and/or BCB staining may be used as an additional tool to improve the in vitro production of embryos.

Avaliou-se a competência de oócitos bovinos através da seleção morfológica associada ao diâmetro folicular e pela coloração azul cresil brilhante (BCB), a fim de melhorar a seleção de oócitos e a eficiência da produção in vitro de embriões. Folículos com diâmetro pequeno (20,05), mas ambos diferiram (p0,05) na taxa de MII nos grupos mistos (respectivamente 86,7 ± 3,4 e 75,8 ± 2,2), grande (respectivamente 89,4 ± 2,6 e 79,7 ± 2,3) e pequeno (respectivamente 76,7 ± 2,9 e 67,2 ± 2,5). Comparando os oócitos BCB (+ e -), não observamos alteração (p>0,05) na porcentagem de embriões no grupo grande (respectivamente 67,3 ± 3,3 e 53,5 ± 5,8) e no grupo pequeno (respectivamente 43,8 ± 5,3 e 33,9 ± 2,2), mas há houve diferença (p<0,05) no grupo misto (respectivamente 57,8 ± 3,9 e 39,6 ± 7,5). Além disso, quando comparamos os grupos foliculares, o grupo BCB+/grande (61,1 ± 3,9%) apresentou uma porcentagem significativamente maior de embriões (p<0,05) do que o grupo BCB+/pequeno (43,8 ± 5,3). Para concluir, os procedimentos de seleção que usam tamanho do folículo e/ou coloração com BCB podem ser usados como uma ferramenta adicional para melhorar a produção in vitro de embriões.

In vitro embryos production of oocytes selected based on follicular size and by brilliant cresyl blue staining / Produção in vitro de embriões de oócitos selecionados baseados no tamanho folicular e por coloração com azul cresil brilhante

We evaluated the competence of bovine oocytes via morphological selection associated with follicular diameter and by brilliant cresyl blue (BCB) staining, in order to improve oocyte selection and the efficiency of in vitro embryo production. Follicles with small (2<4 mm), large (4–8 mm) or mixed (2–8 mm) diameters were aspirated from slaughterhouse ovaries. Next, the morphologically categorized oocytes were stained and evaluated with 26 μM of BCB (90 min), followed by an assessment of in vitro maturation (MII) and blastocyst production. Oocytes from the large (61.1 ± 3.9%) and mixed (52.9 ± 4.6%) follicular groups showed comparable (p>0,05) BCB+ rates, but both differed (p<0.05) as compared to the small-diameter group (41.0 ± 4.5%). Between the BCB+ and BCB oocytes, there was no difference (p>0,05) in MII rate in the mixed (respectively 86.7 ± 3.4 and 75.8 ± 2.2), large (respectively 89.4 ± 2.6 and 79.7 ± 2.3) and small (respectively 76.7 ± 2.9 and 67.2 ± 2.5) diameter groups. Comparing BCB (+ and -) oocytes, we observed (p>0,05) no change in the percentage of embryos in the large group (respectively 67.3 ± 3.3 and 53.5 ± 5.8) and in the small group (respectively 43.8 ± 5.3 and 33.9 ± 2.2), but there was a difference (p<0.05) in the mixed group (respectively 57.8 ± 3.9 and 39.6 ± 7.5). Furthermore, when we compared between follicular groups, the BCB+/large-diameter group (61.1 ± 3.9%) had a significant higher percentage of embryos (p<0.05) than the small-diameter BCB+ (43.8 ± 5.3) groups. To conclude, selection procedures that use follicle size and/or BCB staining may be used as an additional tool to improve the in vitro production of embryos.(AU)

Avaliou-se a competência de oócitos bovinos através da seleção morfológica associada ao diâmetro folicular e pela coloração azul cresil brilhante (BCB), a fim de melhorar a seleção de oócitos e a eficiência da produção in vitro de embriões. Folículos com diâmetro pequeno (2<4 mm), grande (4-8 mm) ou misto (2-8 mm) foram aspirados de ovários de matadouro. Em seguida, os oócitos classificados morfologicamente foram corados e avaliados com 26 μM de BCB (90 min), seguido de uma avaliação da maturação in vitro (MII) e produção de blastocisto. Os oócitos dos grupos folículo grande (61,1 ± 3,9%) e misto (52,9 ± 4,6%) apresentaram taxas de BCB+ comparáveis (p>0,05), mas ambos diferiram (p<0,05) em relação ao grupo folículo pequeno (41,0 ± 4,5%). Entre os oócitos BCB+ e BCB–, não houve diferença (p>0,05) na taxa de MII nos grupos mistos (respectivamente 86,7 ± 3,4 e 75,8 ± 2,2), grande (respectivamente 89,4 ± 2,6 e 79,7 ± 2,3) e pequeno (respectivamente 76,7 ± 2,9 e 67,2 ± 2,5). Comparando os oócitos BCB (+ e -), não observamos alteração (p>0,05) na porcentagem de embriões no grupo grande (respectivamente 67,3 ± 3,3 e 53,5 ± 5,8) e no grupo pequeno (respectivamente 43,8 ± 5,3 e 33,9 ± 2,2), mas há houve diferença (p<0,05) no grupo misto (respectivamente 57,8 ± 3,9 e 39,6 ± 7,5). Além disso, quando comparamos os grupos foliculares, o grupo BCB+/grande (61,1 ± 3,9%) apresentou uma porcentagem significativamente maior de embriões (p<0,05) do que o grupo BCB+/pequeno (43,8 ± 5,3). Para concluir, os procedimentos de seleção que usam tamanho do folículo e/ou coloração com BCB podem ser usados como uma ferramenta adicional para melhorar a produção in vitro de embriões.(AU)

Fatores que influenciam a taxa de concepção e perda gestacional de embriões produzidos in vitro na raça Girolando / Factors influencing the conception rate and pregnancy loss in Girolando embryos produced in vitro

A produção in vitro de embriões é de fundamental importância para a pecuária, entretanto ainda é uma biotecnologia com resultados variados sendo, portanto, necessário estudar formas de melhorar. Objetivou-se com este trabalho avaliar se a categoria das receptoras, estação do ano e estágio de desenvolvimento embrionário afetam as taxas de concepção e as perdas gestacionais em receptoras de embriões da raça Girolando produzidos in vitro e transferidos em tempo fixo (TETF). O experimento foi realizado em uma fazenda leiteira comercial, localizada na região de Uberlândia – MG. Foram avaliadas 1.017 TETF. As receptoras foram divididas em vacas em lactação (n=618), vacas secas (n=44) e novilhas (n=355). As estações do ano foram agrupadas em verão (primavera e verão) e inverno (outono e inverno). Os embriões, todos com qualidade morfológica grau 1, foram agrupados de acordo com seu estágio de desenvolvimento em: Grupo 1 (n=216) - blastocisto inicial (BI) e blastocisto (BL) e Grupo 2 (n=801) - blastocisto expandido (BX), blastocisto em eclosão (BN) e blastocisto eclodido (BE). Foi detectado efeito da categoria da receptora na taxa de concepção (p<0,001) e na perda de gestação (p<0,003). O verão afetou negativamente (p<0,044) a taxa de concepção. O Grupo 2 teve mais sucesso na manutenção da gestação (p<0,025). Conclui-se que os três fatores avaliados interferem nas taxas de concepção e/ou perda gestacional e devem ser considerados nos programas de transferência de embriões da raça Girolando.

The in vitro production of embryos is fundamental importance for livestock, although it is still a biotechnology with varieds results than expected, being therefore necessary study ways to improve its rates. The objective of this study was to evaluate if the recipient category, season and stage of embryo development affect conception rates and gestational losses in recipients of girolando’s embryos produced in vitro and transferred at fixed time (ETFT). The experiment was carried out in a commercial dairy farm, located in the Uberlândia - MG region. A total of 1,017 TETF were evaluated. The recipients were divided into lactating cows (n=618), dry cows (n=44) and heifers (n=355). The seasons were grouped in summer (spring and summer) and winter (autumn and winter). The embryos were grouped in Group 1 (n=216) - initial blastocyst (BI) and blastocyst (BL) and Group 2 (n=801) - expanded blastocyst (BX), hatching blastocyst (BH) and hatched (BE). Receptor category effect was detected at conception rate (p<0.001) and loss of gestation (p<0.003). The summer affected negatively (p<0.044) the conception rate. Group 2 was more successful in maintaining gestation (p<0.025). It is concluded that the three evaluated factors interfere in conception rates and / or gestational loss and should be considered in the genetic improvement programs embryo transfer of the Girolando breed.

Fatores que influenciam a taxa de concepção e perda gestacional de embriões produzidos in vitro na raça Girolando / Factors influencing the conception rate and pregnancy loss in Girolando embryos produced in vitro

A produção in vitro de embriões é de fundamental importância para a pecuária, entretanto ainda é uma biotecnologia com resultados variados sendo, portanto, necessário estudar formas de melhorar. Objetivou-se com este trabalho avaliar se a categoria das receptoras, estação do ano e estágio de desenvolvimento embrionário afetam as taxas de concepção e as perdas gestacionais em receptoras de embriões da raça Girolando produzidos in vitro e transferidos em tempo fixo (TETF). O experimento foi realizado em uma fazenda leiteira comercial, localizada na região de Uberlândia MG. Foram avaliadas 1.017 TETF. As receptoras foram divididas em vacas em lactação (n=618), vacas secas (n=44) e novilhas (n=355). As estações do ano foram agrupadas em verão (primavera e verão) e inverno (outono e inverno). Os embriões, todos com qualidade morfológica grau 1, foram agrupados de acordo com seu estágio de desenvolvimento em: Grupo 1 (n=216) - blastocisto inicial (BI) e blastocisto (BL) e Grupo 2 (n=801) - blastocisto expandido (BX), blastocisto em eclosão (BN) e blastocisto eclodido (BE). Foi detectado efeito da categoria da receptora na taxa de concepção (p<0,001) e na perda de gestação (p<0,003). O verão afetou negativamente (p<0,044) a taxa de concepção. O Grupo 2 teve mais sucesso na manutenção da gestação (p<0,025). Conclui-se que os três fatores avaliados interferem nas taxas de concepção e/ou perda gestacional e devem ser considerados nos programas de transferência de embriões da raça Girolando.(AU)

The in vitro production of embryos is fundamental importance for livestock, although it is still a biotechnology with varieds results than expected, being therefore necessary study ways to improve its rates. The objective of this study was to evaluate if the recipient category, season and stage of embryo development affect conception rates and gestational losses in recipients of girolandos embryos produced in vitro and transferred at fixed time (ETFT). The experiment was carried out in a commercial dairy farm, located in the Uberlândia - MG region. A total of 1,017 TETF were evaluated. The recipients were divided into lactating cows (n=618), dry cows (n=44) and heifers (n=355). The seasons were grouped in summer (spring and summer) and winter (autumn and winter). The embryos were grouped in Group 1 (n=216) - initial blastocyst (BI) and blastocyst (BL) and Group 2 (n=801) - expanded blastocyst (BX), hatching blastocyst (BH) and hatched (BE). Receptor category effect was detected at conception rate (p<0.001) and loss of gestation (p<0.003). The summer affected negatively (p<0.044) the conception rate. Group 2 was more successful in maintaining gestation (p<0.025). It is concluded that the three evaluated factors interfere in conception rates and / or gestational loss and should be considered in the genetic improvement programs embryo transfer of the Girolando breed.(AU)