Produção in vitro de embriões ovinos: avanços e desafios / In vitro production of sheep embryos: advances and challenges

A produção in vitro (PIV) de embriões é uma ferramenta interessante, que pode ser aplicada na tentativade transpor as limitações inerentes à espécie ovina, como a estacionalidade reprodutiva, a inseminação artificialtranscervical, a variabilidade na resposta aos protocolos de superovulação, as falhas na fertilização, bem como anecessidade de cirurgia para coleta e transferência de gametas e embriões. Os embriões produzidos podem sertransferidos para receptoras ou criopreservados para uso futuro. As taxas de desenvolvimento embrionário invitro ainda são significativamente inferiores, quando comparadas à situação in vivo, o que pode ser atribuído adeficiências tanto na maturação nuclear quanto na citoplasmática, além do bloqueio do desenvolvimentoembrionário. A composição dos meios de cultivo e as condições de incubação estabelecidas interferem demaneira contundente no sucesso dessa biotécnica. Nesse contexto, a suplementação com antioxidantes e fatoresde crescimento durante as diferentes etapas da PIV tem sido amplamente utilizada visando ao aprimoramento datécnica e da qualidade dos embriões obtidos. Nesta revisão, serão discutidos os avanços e os desafios dessabiotécnica, aplicada a ovinos, nas diferentes etapas compreendidas.(AU)

In vitro production (IVP) of embryos is an interesting tool that can be applied in an attempt toovercome the main limitations of a wider application in ovine reproduction, we can cite the naturally occurringanoestrus period, the variability of response to superovulatory treatments, the fertilization failure and the needfor surgery for the collection and transfer of gametes and embryos. The embryos can be transferred to recipientsor cryopreserved for future use. The in vitro production of embryos is still significantly lower when compared toin vivo, which can be attributed to compromised nuclear and cytoplasmic maturation and embryonicdevelopment failure. The composition of the culture media and the incubation conditions established mayinterfere with the success of this biotechnology. In this context, supplementation with antioxidants and growthfactors during the different stages of IVP production has been widely used in order to improve the technique andquality of embryos. This paper reviews the advances and challenges of this biotechnology in sheep, analyzing thedifferent stages included.(AU)

Produção in vitro de embriões ovinos: avanços e desafios / In vitro production of sheep embryos: advances and challenges

A produção in vitro (PIV) de embriões é uma ferramenta interessante, que pode ser aplicada na tentativade transpor as limitações inerentes à espécie ovina, como a estacionalidade reprodutiva, a inseminação artificialtranscervical, a variabilidade na resposta aos protocolos de superovulação, as falhas na fertilização, bem como anecessidade de cirurgia para coleta e transferência de gametas e embriões. Os embriões produzidos podem sertransferidos para receptoras ou criopreservados para uso futuro. As taxas de desenvolvimento embrionário invitro ainda são significativamente inferiores, quando comparadas à situação in vivo, o que pode ser atribuído adeficiências tanto na maturação nuclear quanto na citoplasmática, além do bloqueio do desenvolvimentoembrionário. A composição dos meios de cultivo e as condições de incubação estabelecidas interferem demaneira contundente no sucesso dessa biotécnica. Nesse contexto, a suplementação com antioxidantes e fatoresde crescimento durante as diferentes etapas da PIV tem sido amplamente utilizada visando ao aprimoramento datécnica e da qualidade dos embriões obtidos. Nesta revisão, serão discutidos os avanços e os desafios dessabiotécnica, aplicada a ovinos, nas diferentes etapas compreendidas.

In vitro production (IVP) of embryos is an interesting tool that can be applied in an attempt toovercome the main limitations of a wider application in ovine reproduction, we can cite the naturally occurringanoestrus period, the variability of response to superovulatory treatments, the fertilization failure and the needfor surgery for the collection and transfer of gametes and embryos. The embryos can be transferred to recipientsor cryopreserved for future use. The in vitro production of embryos is still significantly lower when compared toin vivo, which can be attributed to compromised nuclear and cytoplasmic maturation and embryonicdevelopment failure. The composition of the culture media and the incubation conditions established mayinterfere with the success of this biotechnology. In this context, supplementation with antioxidants and growthfactors during the different stages of IVP production has been widely used in order to improve the technique andquality of embryos. This paper reviews the advances and challenges of this biotechnology in sheep, analyzing thedifferent stages included.

CINÉTICA DE MATURAÇÃO NUCLEAR E FECUNDAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS IMATUROS INJETADOS EM FOLÍCULO PRÉ OVULATÓRIO

produção de embriões bovinos pode ser realizada por biotécnicas in vivo e in vitro. Na produção in vivo utiliza-se a superestimulação ovariana para promover múltiplas ovulações. Com esse intuito, protocolos de superestimulação ovariana foram desenvolvidos. Porém, as vacas doadoras de embriõess são submetidas a vários manejos e ao estresse hormonal durante os procedimentos de superovulação e colheita de embriões. Além disso, algumas vacas não respondem aos protocolos de superovulação. Tais dificuldades na produção in vivo de embriões não são observadas na produção in vitro que consiste em realizar in vitro a maturação e fecundação dos oócitos e cultivo inicial do desenvolvimento embrionário. No entanto, embriões produzidos in vivo possuem qualidade superior aos produzidos in vitro, o que acarreta maior criotolerância e melhores resultados de prenhez. Sendo assim, uma alternativa para melhorar a qualidade embrionária e evitar as dificuldades da produção in vivo é a utilização da técnica de injeção intrafolicular de oócitos (IIFO). Porém, a produção de embriões por essa técnica ainda é baixa e variável entre as vacas. Dessa maneira, o objetivo do estudo foi verificar se o processo de maturação in vivo de vários oócitos em folículo pre ovulatório está relacionado com a baixa produção de embriões pela técnica de IIFO. Para isso, dois experimentos foram realizados para avaliar a cinética de maturação (Experimento 1) e a fecundação in vitro (Experimento 2) de oócitos maturados em folículo pré ovulatório após IIFO. Verificou-se que a maturação de oócitos em folículo pré ovulatório por 20 horas não altera a cinética de maturação e aumenta a capacidade de fecundação in vitro em relação aos oócitos que foram maturados in vitro. Portanto, a maturação de vários oócitos no folículo pré ovulatório não é o fator determinante para a baixa produção de embriões pela técnica de IIFO.

The production of bovine embryos can be performed by in vivo and in vitro biotechniques. In in vivo embryo production, ovarian superstimulation is used to promote multiple ovulations. For this purpose, ovarian superstimulation protocols were developed. However, embryo donor cows are subjected to several manipulations and hormonal stress during superovulation and embryo collection procedures. In addition, some cows do not respond to superovulation protocols. Such difficulties in the in vivo embryo production are not observed in the in vitro technique, that consists in performing, via in vitro, the maturation and fecundation of the oocytes and initial culture of the embryonic development. However, embryos produced in vivo have superior quality when compared to those produced in vitro, which leads to greater cryotolerance and better pregnancy results. Thus, an alternative to improve embryo quality and to avoid the difficulties of in vivo production is the use of intrafollicular oocyte injection technique (IFOI). However, the production of embryos by this technique is still low and variable among cows. Thus, the objective of the study was to verify if the process of in vivo maturation of several oocytes in pre ovulatory follicle is related to a low production of embryos by the IFOI technique. For this purpose, two experiments were performed to evaluate maturation kinetics (Experiment 1) and in vitro fecundation (Experiment 2) of oocytes matured in pre ovulatory follicle after IFOI. It was found that the maturation of oocytes in the pre ovulatory follicle for 20 hours does not alter maturation kinetics and increases in vitro fertilization capacity in relation to oocytes that were matured in vitro. Therefore, the maturation of several oocytes in the preovulatory follicle is not the determining factor for low embryo production by the IFOI technique.

EFEITO DA UTILIZAÇÃO, DURANTE A MATURAÇÃO OOCITÁRIA IN VITRO, DE MODULADORES DE AMPc SOBRE O DESENVOLVIMENTO E QUALIDADE DE EMBRIÕES BOVINOS

No cenário internacional, o Brasil se encontra na posição de maior produtor de embriões pela técnica de produção in vitro. Apesar das vantagens apresentadas por esta biotecnologia, também existem algumas limitações. A qualidade oocitária é considerada um fator fundamental, tornando a maturação in vitro uma das etapas cruciais da técnica, já que tem por função proporcionar o desenvolvimento adequado dos oócitos para a fecundação e como consequência disto, o futuro desenvolvimento embrionário. A retirada de oócitos imaturos do ambiente folicular pode interromper a capacitação oocitária e prejudicar a maturação citoplasmática, comprometendo a viabilidade dos oócitos. Já foi demonstrado que além da qualidade oocitária determinar a proporção de oócitos que se desenvolverão até o estádio de blastocisto, as condições de maturação também influenciam a qualidade dos embriões produzidos in vitro. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do uso de moduladores de cAMP, através da utilização do sistema de maturação in vitro SPOM (Albuz et al., 2010) sobre parâmetros de desenvolvimento(taxas de clivagem e desenvolvimento) e qualidade de embriões bovinos(número total de células, acúmulo lipídico e relação entre os dois parâmetros).Para tal, foram realizados três Experimentos: o Experimento I ( OPU de mestiças Gir x Holandês) avaliou o efeito do sistema sobre a maturação oocitária nuclear e os Experimentos II(ovários de matadouro) e III (OPU de vacas Gir ) sobre a taxa de clivagem e de blastocistos, sobre o número total de células e o conteúdo lipídico, bem como a relação entre esses dois parâmetros em embriões bovinos.Foram utilizados 2 grupos experimentais (SPOM e CONTROLE I) nos Experimentos I e III e 3 grupos no Experimento II(SPOM, CONTROLE I e CONTROLE II).O sistema SPOM demonstrou ser eficaz em bloquear a meiose na avaliação de 20h de maturação(P<0,005) no Experimento I. Nos experimentos II e III as taxas de clivagem e produção de blastocistos no grupo SPOM foram significativamente inferiores (P<0,05) quando comparado aos outros grupos, porém ele não interferiu no número total de células dos embriões produzidos (P<0,05); reduziu o acúmulo lipídico nos blastocistos obtidos por aspiração das vacas Gir; e não apresentou efeito significativo sobre o escore lipídico (relação entre número total de células e acúmulo lipídico). Concluiu-se então, que a utilização do sistema reduziu os índices de desenvolvimento embrionário, mas apresentou efeito benéfico sobre a redução do acúmulo lipídico .

In the international scene, Brazil occupies the higher position in the embryo production by the in vitro technique. Despite the advantages provided by this biotechnology, there are also a few limitations. The oocyte quality is considered a key factor, making the maturation in vitro one of the crucial steps of the technique. That due to fact that its function is to provide the proper development of oocytes for fecundation and as a result, the future embryonic development. The removal of immature oocytes from follicular environment can interrupt the oocyte capacity and damage the cytoplasmic maturation, committing the oocytes viability. It has been demonstrated that besides the oocyte quality, that determines the proportion of oocytes that develop to the blastocyst stage, the maturation conditions also influence embryos produced in vitro quality. The aim of this study was to evaluate the effect of using cAMP modulators, by using the SPOM in vitro maturation system (Albuz et al., 2010) about the development parameters (cleavage and development rates) and bovine embryos quality (total number of cells, lipid content and relationship between the two parameters). For this, three experiments were performed: the Experiment I (Gir x Holstein crossbred heifers OPU) evaluated the effect of the system on a nuclear oocyte maturation. The Experiment II (slaughterhouses ovaries) and III (Gir cows OPU) evaluated the effect of the system on the cleavage and blastocyst rate, on the total number of cells and the lipid content, as the relationship between this two parameters in bovine embryos. Two experimental groups (SPOM and CONTROLE) were used in the Experiment I and III, and three experimental groups (SPOM, CONTROLE and COMERCIAL) were used in the Experiment II. The SPOM system proved itself effective in blocking the meiosis in the twenty hours evaluation (P<0,05) in the Experiment I. In the Experiments II and III the cleavage and production rates of blastocyst in SPOM group were significantly lower (P<0,05) when compared to the other groups, but it did not affect the total number of cells of the produced embryos (P<0,05); reduced the lipid content in the blastocysts obtained by the aspiration of Gir cows; and no significant effect on lipid score (relationship between the total number of cells and the lipid content). Therefore, it was concluded that the use of the system reduced the embryonic development indices, but presented beneficial effect on lipid content reduction

Embriões F1 (Hol X Gir) produzidos in vitro utilizados a fresco em rebanhos leiteiros comerciais e controlado / F1 Holstein (Friesan x Gir) embryos produced in vitro used fresh in commercial dairy herds and controlled herds

A importância do (F1) para o Brasil é notória, associando rusticidade e produtividade, porém é grande a dificuldade do produtor em manter seu rebanho nesse grau de sangue. No laboratório da Embrapa Gado de Leite em Juiz de Fora, MG foram produzidos in vitro 266 embriões (F1), a partir de complexos cumulus-oócitos (CCO's) de vacas Gir puncionadas e fecundadas com sêmen de touro Holandês. Destes, 53 embriões foram transferidos a fresco para receptoras de rebanhos comerciais de uma Cooperativa da Zona da Mata, MG, enquanto 72 embriões foram inovulados em rebanho controlado da Embrapa Campo Experimental de Coronel Pacheco. A produção de embriões F1 por fecundação in vitro apresentou taxa de produção de blastocisto de 15,58%. A taxa de gestação obtida foi de 26,4% no rebanho comercial e 40,2% no rebanho da Embrapa. Considerando-se o nascimento de 50% de machos e fêmeas, conclui-se que em rebanhos de 100 vacas seriam obtidas 13 fêmeas (13% de reposição) nos rebanhos comerciais e 20 fêmeas (20% de reposição) no rebanho da Embrapa. Foram muitas as dificuldades de operacionalização para o uso de dessa biotecnologia que requer um mínimo de escrituração zootécnica, controle sanitário, observação de cios e manejo reprodutivo.(AU)

The importance of (F1) to Brazil is notable, associating productivity and rusticity, it is difficult to the producer maintaining the herd in this blood degree. In Embrapa's Gado de Leite, laboratory in the city of Juiz de Fora, M.G., 266 embryos (F1) were produced in vitro from the oocytes of Gir cows, punched and fecundated with Holstein Friesan bull semen. Out of these, 53 embryos were transferred at natural into recipient cows in the commercial herds indicated by the technicians of a great cooperative of Zona da Mata's area, 72 embryos were transferred into recipients of Embrapa's herds under nutritional and sanitary controls. The remainder 139 embryos were frozen due to the lack of adequate recipient cows. The production of F1 embryos through in vitro fecundation of oocytes from Gir cows with semen from Holstein Friesan bull blastocist production rate of 15,58 %. The pregnance rate obtained was 26.4% in the cows from the commercial herds and 40.2% in the herds of Embrapa Gado de Leite. Considering the birth of 50% female cows, we can estimate a replacement annual rate of 13% (26.2% for gestation) for commercial herds and 20% (40% for pregnancy) for the controlled herd. There were many difficulties encountered in the operation, such as (i) the low level of adoption of technology; (ii) little investment in feeding, handling and sanity conditions of the herds; (iii) conditions capable to compromising the utilization of embryos, which requires a minimum of structure in terms of zoo-technical documentation, observation of rutting and reproduction management.(AU)

Embriões F1 (Hol X Gir) produzidos in vitro utilizados a fresco em rebanhos leiteiros comerciais e controlado / F1 Holstein (Friesan x Gir) embryos produced in vitro used fresh in commercial dairy herds and controlled herds

A importância do (F1) para o Brasil é notória, associando rusticidade e produtividade, porém é grande a dificuldade do produtor em manter seu rebanho nesse grau de sangue. No laboratório da Embrapa Gado de Leite em Juiz de Fora, MG foram produzidos in vitro 266 embriões (F1), a partir de complexos cumulus-oócitos (CCO's) de vacas Gir puncionadas e fecundadas com sêmen de touro Holandês. Destes, 53 embriões foram transferidos a fresco para receptoras de rebanhos comerciais de uma Cooperativa da Zona da Mata, MG, enquanto 72 embriões foram inovulados em rebanho controlado da Embrapa Campo Experimental de Coronel Pacheco. A produção de embriões F1 por fecundação in vitro apresentou taxa de produção de blastocisto de 15,58%. A taxa de gestação obtida foi de 26,4% no rebanho comercial e 40,2% no rebanho da Embrapa. Considerando-se o nascimento de 50% de machos e fêmeas, conclui-se que em rebanhos de 100 vacas seriam obtidas 13 fêmeas (13% de reposição) nos rebanhos comerciais e 20 fêmeas (20% de reposição) no rebanho da Embrapa. Foram muitas as dificuldades de operacionalização para o uso de dessa biotecnologia que requer um mínimo de escrituração zootécnica, controle sanitário, observação de cios e manejo reprodutivo.

The importance of (F1) to Brazil is notable, associating productivity and rusticity, it is difficult to the producer maintaining the herd in this blood degree. In Embrapa's Gado de Leite, laboratory in the city of Juiz de Fora, M.G., 266 embryos (F1) were produced in vitro from the oocytes of Gir cows, punched and fecundated with Holstein Friesan bull semen. Out of these, 53 embryos were transferred at natural into recipient cows in the commercial herds indicated by the technicians of a great cooperative of Zona da Mata's area, 72 embryos were transferred into recipients of Embrapa's herds under nutritional and sanitary controls. The remainder 139 embryos were frozen due to the lack of adequate recipient cows. The production of F1 embryos through in vitro fecundation of oocytes from Gir cows with semen from Holstein Friesan bull blastocist production rate of 15,58 %. The pregnance rate obtained was 26.4% in the cows from the commercial herds and 40.2% in the herds of Embrapa Gado de Leite. Considering the birth of 50% female cows, we can estimate a replacement annual rate of 13% (26.2% for gestation) for commercial herds and 20% (40% for pregnancy) for the controlled herd. There were many difficulties encountered in the operation, such as (i) the low level of adoption of technology; (ii) little investment in feeding, handling and sanity conditions of the herds; (iii) conditions capable to compromising the utilization of embryos, which requires a minimum of structure in terms of zoo-technical documentation, observation of rutting and reproduction management.

Avaliação espermática do sêmen criopreservado de touros Curraleiro/Pé Duro em banco de germoplasma / Spermatic evaluation of cryopreserved semen from curraleiro/ pé duro bulls in germplasm bank

Esta pesquisa objetivou avaliar a qualidade do sêmen criopreservado de 21 touros Curraleiro/Pé Duro em banco de germoplasma, categorizando as doses dos reprodutores segundo parâmetros espermáticos que buscam a fertilização oocitária, e verificando in vitro o potencial fecundante da dose seminal. Todas as amostras foram descongeladas e analisadas pelos exames espermáticos de morfologia, cinética, integridade da membrana plasmática e integridade do acrossoma; no entanto, só quatro delas também foram avaliadas através das taxas de fecundação, devido ao maior número de palhetas estocadas, as quais permitiram testar mais de um ensaio in vitro. Contaram-se aproximadamente 200 espermatozóides para cada exame, os resultados foram expressos em porcentagens e submetidos a estatística descritiva simples (média e desvio padrão), utilizando como referência comparativa, os padrões sugeridos pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal para sêmen descongelado bovino, assim como valores obtidos em outras pesquisas. Os resultados dos quatro exames espermáticos foram verificados, e buscaram-se os parâmetros mais importantes que visam a fertilidade, sendo na morfologia a taxa de espermatozóides normais (NRM) e defeitos maiores (DMA); na cinética, a motilidade progressiva (MP) e células rápidas (RPD); na integridade da membrana plasmática, a membrana plasmática íntegra (MPI) e na integridade do acrossoma, o espermatozóide vivo com acrossoma íntegro (EVAI). Das 21 doses analisadas, dez apresentaram valores adversos nos parâmetros espermáticos mencionados, e dessas amostras, sete mostraram divergências, porque tinham resultados negativos para a fecundação em alguns exames e resultados favoráveis em outros, revelando a complexa natureza do espermatozóide. Tomaram-se em conta para as correlações de Pearson, análise de Cluster e elaboração de um dendrograma, os parâmetros NRM, DMA, MP, RPD, MPI e EVAI. O Cluster criou por similaridade espermática três grupos (G1, G2 e G3), para morfologia, cinética, integridade da membrana plasmática e integridade do acrossoma. Os resultados foram avaliados mediante estatística descritiva simples, e a diferença das médias pelos testes de Duncan e Kruskal Wallis, ao nível de significância de 5%. Vale salientar que no dendrograma a DT10 e DT19 foram discriminadas dos grupos por ter valores muito distantes do resto das doses seminais. Na avaliação das taxas de fecundação, foram feitas três réplicas com as palhetas dos quatro touros escolhidos, passando previamente através do gradiente Percoll (45:90%), para eliminar as células defeituosas e melhorar a capacidade fecundante. Esta seleção permitiu resultados favoráveis, com taxas de oócitos fertilizados superiores a 60%. Na avaliação da cromatina masculina 18 horas pós inseminação in vitro foram observadas altas taxas para Pronúcleo. A diferença estatística destes valores foi estimada pelo teste Chi-quadrado. Os resultados revelaram a qualidade espermática e capacidade fecundante in vitro do sêmen Curraleiro/Pé Duro analisado, possibilitando delinear adequadas estratégias, para a conservação deste recurso genético local em extinção, possuidor de características únicas de adaptação e rusticidade, que poderiam ser inseridas futuramente nos rebanhos bovinos brasileiros

This investigation aimed to evaluate the quality of cryopreserved semen from 21 Curraleiro/Pé Duro bulls in germplasm bank, categorizing the doses of the sires according to spermatic parameters that search the oocitary fertilization, and verifying in vitro the fecundant potential of the seminal dose. All the samples were thawed and analyzed by the spermatic exams of morphology, kinetics, integrity of plasmatic membrane and integrity of acrosome; however, only four of them also were evaluated through the fertilization rates, due to the major number of stocked straws, which allowed to test more than one in vitro essay. Approximately 200 spermatozoids were counted for each exam, the results were expressed in percentages and submitted to simple descriptive statistics (mean and standard deviation), using as comparative reference, the patterns suggested by the Brazilian Animal Reproduction College for bovine thawed semen, as well as values obtained in other investigations. The results of the four spermatic exams were verified, and were searched the most important parameters that aim the fertility, being in the morphology the rate of normal spermatozoids (NRM) and major defects (DMA); in the kinetics, the progressive motility (MP) and rapid cells (RPD); in the integrity of plasmatic membrane, the whole plasmatic membrane (MPI); and in the integrity of acrosome, the live spermatozoid with whole acrosome (EVAI). From the 21 analyzed doses, ten presented adverse values in the mentioned spermatic parameters, and of these samples, seven showed divergences, because they had negative results for fertilization in some exams and favorable results in others, revealing the complex nature of the spermatozoid. Were taken into account for Pearson correlations, Cluster analysis and a dendrogram elaboration, the parameters NRM, DMA, MP, RPD, MPI and EVAI. The Cluster created by spermatic similarity three groups (G1, G2 e G3), for morphology, kinetics, integrity of plasmatic membrane and integrity of acrosome. The results were evaluated through simple descriptive statistics, and the difference of means by Duncan and Kruskal Wallis tests, at 5% significance level. It is worth mentioning that in the dendrogram the DT10 and DT19 were discriminated from the groups for having very distant values from the rest of seminal doses. In fecundation rates evaluation, three replicates were made with the straws of the four chosen bulls, passing previously through Percoll gradient (45:90%), for eliminating the defective cells and improving the fertilizing capacity. This selection allowed favorable results, with rates of fertilized oocytes superior to 60%. In the evaluation of masculine chromatin 18 hours post in vitro insemination high Pronucleus rates were observed. The statistical difference of these values was estimated by Chi-square test. The results revealed the spermatic quality and in vitro fecundant capacity of Curraleiro/Pé Duro analyzed semen, enabling to delineate appropriate strategies, for the conservation of this local genetic resource in extinction, owner of unique characteristics of adaptation and rusticity, that could be included hereafter in the brazilian cattle herds

Ação da Proteína Kinase C na maturação de oócitos bovinos / Role of Protein Kinase C on bovine oocyte maturation

A qualidade do oócito é um fator limitante na fertilidade das fêmeas e reflete seu intrínseco potencial ao desenvolvimento embrionário subsequente. As alterações moleculares e bioquímicas no processo de maturação dos oócitos são necessárias para permitir a fecundação destes. Sob influência das gonadotrofinas, uma cascata de eventos é desencadeada, alterando a expressão gênica e a estrutura dos folículos. A maturação ocorre pelo intercâmbio entre o oócito e as células do cumulus que irão fornecer fatores para o desenvolvimento do oócito e criar o microambiente necessário para garantir o sucesso na maturação. A ação do FSH sobre a retomada da meiose ocorre, possivelmente, por ativação da proteína quinase C (PKC). A via de sinalização desta proteína parece estar envolvida na ativação da quinase ativada por mitógeno (MAPK) em oócitos e células do cumulus, na maturação induzida por FSH e LH, além de regular a síntese do Fator de Crescimento Epidermal (EGF). Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a ação da PKC na maturação de oócitos bovinos e se esta ativação envolve o EGF. Para tal foram realizados dois experimentos. Em ambos, a progressão do ciclo celular foi avaliada utilizando a sonda fluorescente Hoechst 33342. A expansão das células do cumulus foi avaliada utilizando-se o software Image Pro Plus 5.1 para análise das imagens dos oócitos geradas em microscópio Olympus IX81. O maior diâmetro de cada complexo cumulus oócito foi adotado como parâmetro de mensuração da expansão. A dosagem de progesterona do meio de cultivo foi realizada pela técnica de RIA. A ativação da PKC e da MAPK foi avaliada pela técnica de Western blot. Os dados foram avaliados pelo software SigmaPlot versão 12.2 e submetidos ao teste de normalidade (Shapiro-Wilk). Quando necessário, os dados foram transformados. Para comparação entre dois tratamentos, utilizou-se o teste t-student. Para mais de dois tratamentos foi realizada análise de variância e teste de comparação de médias (TUKEY), considerando-se 0,05 para rejeitar a hipótese de nulidade. No experimento 1 foi avaliado se a ativação da PKC foi estimulada por gonadotrofinas. Os oócitos foram maturados in vitro tratados com gonadotrofinas, na presença ou ausência do inibidor de PKC. A presença do inibidor de PKC diminuiu as taxas de quebra de vesícula germinativa e a expansão das células do cumulus, sem alterar a esteroidogênese. Estes resultados demonstram que a PKC participa da via de sinalização da retomada da meiose. No experimento 2 foi avaliado se o EGF está envolvido na via regulada pela PKC. Os oócitos foram maturados in vitro, na presença ou ausência de LH e FSH, do inibidor de PKC e do EGF. O EGF foi capaz de reverter os efeitos do inibidor de PKC, aumentando as taxas de quebra de vesícula germinativa e a expansão de células do cumulus. Não foi possível detectar, nas condições deste experimento, a ativação das proteínas PKC e MAPK através do Western Blot. Este trabalho permite concluir que a via de sinalização da maturação de oócitos bovinos envolve a PKC e sugere a participação do EGF nesta via

Oocyte quality is a limiting factor in female fertility and reflects its potential to the subsequent embryonic development. Molecular and biochemical alterations during the oocyte maturation process are needed to allow fecundation. Under gonadotropin influence, cascade of events occurs changing gene expression and follicle structure. Maturation depends on the interaction between oocyte and cumulus cells interaction, which provides factors for oocyte development and create the ideal microenvironment for the success of the maturation process. The FSH stimulation of meiosis resumption probably occurs through PKC activation. The signaling pathway of PKC might be involved by the mitogen activated protein kinase (MAPK) in oocytes and cumulus cells during FSH-LH induced maturation. Furthermore, MAPK regulates the epidermal growth factor (EGF) synthesis. The aim of the present study was to evaluate PKC function during bovine oocyte maturation and if its activity involves EGF. Two experiments were performed. In both experiments, the cell cycle progression was analyzed by Hoechst 33342 fluorescent dye. The cumulus cells expansion was performed using software Image Pro Plus 5.1 by the analysis of oocyte images taken in Olympus IX81 microscope. The highest diameter of each cumulus oocyte complex was recorded as the expansion value. The RIA and Western Blot techniques were used to measure progesterone concentration in the culture media and the PKC and MAPK activity, respectively. Data was analyzed by SigmaPlot software, version 12.2. The Shapiro-Wilk test was used to assess for normality and, when needed, the data was transformed. Student t tests were carried out to compare two treatments. Differences between more than two means were assessed by analysis of variance followed by Tukey test, considering P-value lower than 0.05 as statistically significant. Experiment 1 studied whether PKC function was stimulated by gonadotropins. FSH and LH were used for oocyte maturation in vitro, with or without PKC inhibitor. The presence of PKC inhibitor decreased germinal vesicle breakdown and the cumulus cells expansion, but did not alter the steroidogenesis. These results show that PKC participates in the signaling pathway of meiosis resumption. The Experiment 2 evaluated whether EGF influences PKC signaling pathway. The oocytes were matured in vitro, in the presence or absence of LH and FSH, PKC inhibitor and EGF. Epidermal Growth Factor was able to reverse PKC inhibitor effects, increasing germinal vesicle breakdown rates and cumulus cells expansion. The Western Blot technique was not able to detect PKC and MAPK activity, considering the conditions of this study. In conclusion, PKC is involved in the signaling pathway of bovine oocytes maturation and its pathway is mediated by EGF

Ação da Proteína Kinase C na maturação de oócitos bovinos / Role of Protein Kinase C on bovine oocyte maturation

A qualidade do oócito é um fator limitante na fertilidade das fêmeas e reflete seu intrínseco potencial ao desenvolvimento embrionário subsequente. As alterações moleculares e bioquímicas no processo de maturação dos oócitos são necessárias para permitir a fecundação destes. Sob influência das gonadotrofinas, uma cascata de eventos é desencadeada, alterando a expressão gênica e a estrutura dos folículos. A maturação ocorre pelo intercâmbio entre o oócito e as células do cumulus que irão fornecer fatores para o desenvolvimento do oócito e criar o microambiente necessário para garantir o sucesso na maturação. A ação do FSH sobre a retomada da meiose ocorre, possivelmente, por ativação da proteína quinase C (PKC). A via de sinalização desta proteína parece estar envolvida na ativação da quinase ativada por mitógeno (MAPK) em oócitos e células do cumulus, na maturação induzida por FSH e LH, além de regular a síntese do Fator de Crescimento Epidermal (EGF). Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a ação da PKC na maturação de oócitos bovinos e se esta ativação envolve o EGF. Para tal foram realizados dois experimentos. Em ambos, a progressão do ciclo celular foi avaliada utilizando a sonda fluorescente Hoechst 33342. A expansão das células do cumulus foi avaliada utilizando-se o software Image Pro Plus 5.1 para análise das imagens dos oócitos geradas em microscópio Olympus IX81. O maior diâmetro de cada complexo cumulus oócito foi adotado como parâmetro de mensuração da expansão. A dosagem de progesterona do meio de cultivo foi realizada pela técnica de RIA. A ativação da PKC e da MAPK foi avaliada pela técnica de Western blot. Os dados foram avaliados pelo software SigmaPlot versão 12.2 e submetidos ao teste de normalidade (Shapiro-Wilk). Quando necessário, os dados foram transformados. Para comparação entre dois tratamentos, utilizou-se o teste t-student. Para mais de dois tratamentos foi realizada análise de variância e teste de comparação de médias (TUKEY), considerando-se 0,05 para rejeitar a hipótese de nulidade. No experimento 1 foi avaliado se a ativação da PKC foi estimulada por gonadotrofinas. Os oócitos foram maturados in vitro tratados com gonadotrofinas, na presença ou ausência do inibidor de PKC. A presença do inibidor de PKC diminuiu as taxas de quebra de vesícula germinativa e a expansão das células do cumulus, sem alterar a esteroidogênese. Estes resultados demonstram que a PKC participa da via de sinalização da retomada da meiose. No experimento 2 foi avaliado se o EGF está envolvido na via regulada pela PKC. Os oócitos foram maturados in vitro, na presença ou ausência de LH e FSH, do inibidor de PKC e do EGF. O EGF foi capaz de reverter os efeitos do inibidor de PKC, aumentando as taxas de quebra de vesícula germinativa e a expansão de células do cumulus. Não foi possível detectar, nas condições deste experimento, a ativação das proteínas PKC e MAPK através do Western Blot. Este trabalho permite concluir que a via de sinalização da maturação de oócitos bovinos envolve a PKC e sugere a participação do EGF nesta via (AU)

Oocyte quality is a limiting factor in female fertility and reflects its potential to the subsequent embryonic development. Molecular and biochemical alterations during the oocyte maturation process are needed to allow fecundation. Under gonadotropin influence, cascade of events occurs changing gene expression and follicle structure. Maturation depends on the interaction between oocyte and cumulus cells interaction, which provides factors for oocyte development and create the ideal microenvironment for the success of the maturation process. The FSH stimulation of meiosis resumption probably occurs through PKC activation. The signaling pathway of PKC might be involved by the mitogen activated protein kinase (MAPK) in oocytes and cumulus cells during FSH-LH induced maturation. Furthermore, MAPK regulates the epidermal growth factor (EGF) synthesis. The aim of the present study was to evaluate PKC function during bovine oocyte maturation and if its activity involves EGF. Two experiments were performed. In both experiments, the cell cycle progression was analyzed by Hoechst 33342 fluorescent dye. The cumulus cells expansion was performed using software Image Pro Plus 5.1 by the analysis of oocyte images taken in Olympus IX81 microscope. The highest diameter of each cumulus oocyte complex was recorded as the expansion value. The RIA and Western Blot techniques were used to measure progesterone concentration in the culture media and the PKC and MAPK activity, respectively. Data was analyzed by SigmaPlot software, version 12.2. The Shapiro-Wilk test was used to assess for normality and, when needed, the data was transformed. Student t tests were carried out to compare two treatments. Differences between more than two means were assessed by analysis of variance followed by Tukey test, considering P-value lower than 0.05 as statistically significant. Experiment 1 studied whether PKC function was stimulated by gonadotropins. FSH and LH were used for oocyte maturation in vitro, with or without PKC inhibitor. The presence of PKC inhibitor decreased germinal vesicle breakdown and the cumulus cells expansion, but did not alter the steroidogenesis. These results show that PKC participates in the signaling pathway of meiosis resumption. The Experiment 2 evaluated whether EGF influences PKC signaling pathway. The oocytes were matured in vitro, in the presence or absence of LH and FSH, PKC inhibitor and EGF. Epidermal Growth Factor was able to reverse PKC inhibitor effects, increasing germinal vesicle breakdown rates and cumulus cells expansion. The Western Blot technique was not able to detect PKC and MAPK activity, considering the conditions of this study. In conclusion, PKC is involved in the signaling pathway of bovine oocytes maturation and its pathway is mediated by EGF (AU)

Concentração espermática e tempo de incubação na fecundação in vitro usando-se sêmen de touros da raça Guzerá / Sperm concentration and incubation period on in vitro fecundation using sperm of Guzera bulls

Estudou-se o efeito da concentração espermática e período de incubação e da interação dessas características sobre a fecundação in vitro (FIV) usando-se sêmen de touros Guzerá. Oócitos (n=1146) maturados in vitro foram divididos em tratamentos objetivando a FIV, em esquema fatorial 3×2×2 (três touros - A, B e C, duas concentrações espermáticas - 2 e 4×106 espermatozóides/ml e dois tempos de incubação 12 e 18 horas). Utilizaram-se espermatozóides viáveis obtidos por swin-up. A FIV foi realizada em meio fert-talp com heparina, em incubadora com 5% de CO2 e 95% de umidade, a 38,5°C. Após incubação, 50% dos oócitos foram fixados e corados para determinação das taxas de penetração, fecundação monoespermática e poliespermia. O restante foi co-cultivado com células da granulosa em meio CR2aa por oito dias, avaliando-se a taxa de clivagem e a produção de blastocisto. Houve maior taxa de penetração (P<0,05) na concentração de 4×106 espermatozóides/ml por 18 horas (64%), e não se observou diferença (P>0,05) entre os demais tratamentos. A taxa de poliespermia foi maior (P<0,05) na concentração espermática de 4×106, independente do tempo de incubação. Na concentração espermática mais alta, a taxa de poliespermia foi maior no tempo de incubação de 18 horas (P<0,05). O touro A apresentou menor (P<0,05) taxa de poliespermia em relação aos demais. Ainda, no touro A a taxa de clivagem foi maior (P<0,05) que no touro B, enquanto o C mostrou-se semelhante tanto ao A quanto ao B. O tempo de incubação, a concentração espermática e a interação das variáveis influenciaram as taxas de penetração e poliespermia, sem interferir na taxa de fecundação monoespermática e na produção de blastocistos.(AU)

The effects of sperm concentration, incubation period and their interaction on in vitro fertilization (IVF) using sperm of Guzera bulls were evaluated. In vitro matured oocytes (n=1146) were allotted to IVF treatments in a factorial scheme 3×2×2 - three bulls (A, B and C), two sperm concentrations (2 and 4×106 spermatozoa/ml) and two incubation periods (12 and 18h). Viable spermatozoa were obtained by swim-up. The IVF was performed using in Fert-Talp medium with heparin, on incubator with 5% CO2 and 95% humidity, at 38.5ºC. After the incubation, 50% of oocytes were fixed and stained to determine penetration, monospermic fecundation and polyspermy rates. The remainder was co-cultured with granulosa cells in CR2 medium for eight days to evaluate cleavage and embryo production rates. The penetration rate was higher (P<0.05) for sperm concentration of 4×106 spermatozoa/ml incubated for 18 hours (64%), and no differences (P>0.05) among remainder treatments were observed. The polyspermic rate (P<0.05) was higher for higher sperm concentration and incubation period. Bull A showed the lowest (P<0.05) polyspermy rate. Bulls A and C showed higher (P<0.05) cleavage than bull B. Incubation period, sperm concentration, and interaction of these two factors influenced penetration and polyspermy rates, without any effect on monospermic fecundation rates and embryos production.(AU)

Fecundação in vitro com sêmen de bovinos da raça Gir

The aim of this study was to evaluate the effects of differents sperm concentration and incubation time during in vitro fecundation on sperm penetration, monospermic fecundation and cleavage rates, using sperm of Gyr bulls. In vitro matured oocytes (n=817) were distributed into treatments to in vitro fertilization (IVF) in a factorial design, with two sperm concentration (2 and 4×10(6) spermatozoa/ml), two incubation time (12 and 18h) and two bulls (A and B). Viable spermatozoa were obtained by swin-up. The IVF was realized in Fert-Talp medium with heparin, on incubator with 5% CO2 and 95% humidity in air, at 39ºC. After insemination, 359 oocytes were fixed and stained to determine penetration and polyspermy rates. The remainder were co-cultivated in bovine oviduct epithelial cells and TCM-199, for 72h, to evaluate cleavage rate. The penetration, monospermic fecundation, and cleavage rates were not affected (P>0.05) by sperm concentration and incubation time. Higher (P 0.05) penetration and cleavage rates were observed for bull B (83.3 and 81.8%, respectively) than for bull A (66.3 and 64%, respectively). Bull B showed a tendency to present higher (P 0.07) polyspermy than bull A (16.4 and 6.25, respectively). No interactions among treatments were observed.

Estudaram-se os efeitos da concentração espermática e do tempo de incubação do sêmen com ovócitos, durante a fecundação in vitro, sobre as taxas de penetração espermática, de fecundação monoespermática e de clivagem, utilizando-se sêmen de touros da raça Gir. Ovócitos (n=817) maturados in vitro foram distribuídos em tratamentos visando à fecundação in vitro (FIV), em um delineamento fatorial 2×2×2, com duas concentrações espermáticas (2 e 4×10(6) espermatozóides/ml), dois períodos de incubação (12 e 18h) e dois touros (A e B). Espermatozóides viáveis foram obtidos pela técnica de swin-up. A FIV foi realizada em meio fert-talp com heparina, em incubadora com 5% de CO2 em ar atmosférico e 95% de umidade, a 39ºC. Após inseminação, 359 ovócitos foram fixados e corados para determinação das taxa de penetração e poliespermia. O restante foi co-cultivado com células da tuba uterina e TCM-199 por 72h, avaliando-se a clivagem. As taxas de penetração, fecundação monoespermática e clivagem não foram influenciadas (P>0,05) pela concentração espermática e pelo período de incubação. O touro B produziu maiores taxas (P 0,05) de penetração e de clivagem (83,3 e 81,0%, respectivamente) do que o touro A (66,5 e 64,0%). Houve tendência do touro B apresentar maior taxa de polispermia (P=0,067) do que o touro A (16,4 e 6,2 %, respectivamente). As interações entre tratamentos não foram significativas (P>0,05). O efeito touro sobre a capacidade de fecundação dos espermatozóides deve ser considerado quando da fecundação in vitro.

Composição bioquímica e hormonal do líquido ammniotico de fetos bovinos oriundos de inseminação artificial(IA), transferência de embriões(TE) e produção in vitro(PIV)

O presente trabalho teve por objetivo comparar a composição bioquímica e as concentrações de testosterona e progesterona no líquido amniótico de fetos bovino da raça Nelore produzidos por fecundação in vivo, fecundação in vivo com transferência de embrião (TE) e produção in vitro (PIV). Os problemas fetais observados ao momento do parto e pós-parto imediato em animais oriundos de PIV e a escassez de pesquisas que determinem a composição do líquido amniótico associada aos três sistemas de produção embrionária permitiram o desenvolvimento deste trabalho. Utilizaram-se 60 animais divididos em: grupo 01 - vacas Nelore gestando bezerros oriundos de inseminação artificial (IA) (n=20); grupo 02 - receptoras gestando bezerros Nelore provenientes de inovulações de embriões oriundos de doadoras superovuladas pelo método convencional (n=20); grupo 03 - receptoras de embriões gestando bezerros Nelore originados de inovulações de embriões oriundos de doadoras pelo método de aspiração folicular (n=20). No momento do parto, após a visualização das bolsas, colheram-se 15mL de líquido amniótico por punção da bolsa com agulha e seringa adequadas. As amostras foram processadas e analisadas no serviço de laboratório clínico do Departamento de Clínica Veterinária da FMVZ/UNESP de Botucatu-SP e no Laboratório de Endocrinologia do departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária. Para análise bioquímica foram utilizados Kits comerciais seguindo a técnica recomendada pelo fabricante. A dosagem hormonal de progesterona (P4) e testosterona (T) foi determinada por meio de radioimunoensaio em fase sólida com a leitura realizada em contador Gama Count Cobra II. Os dados obtidos na avaliação bioquímica e no perfil hormonal foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e, uma vez demonstrada diferença estatística por 22 esse teste aplicou-se o Método de Tukey, com 5% de nível de significância

The present work had for objective to compare the biochemical composition and the concentrations of testosterone and progesterone in the amniotic fluid of fetuses of the Nelore cows produced by in vivo fecundation, in vivo fecundation at embryo transfer (ET) and in vitro production (IVP). The fetal problems observed at the delivery moment and at the immediate post-partum in animals originating from IVP and the shortage of researches that determine the composition of the amniotic fluid associated to the three systems of embryonic production allowed the development of this work, adding results to the studies that are being done by other researchers with the placenta of IVP animals. Sixty animals were used divided into 3 groups: Group 1 - Nelore cows pregnant with calves conceived by artificial insemination (AI) (n=20); Group 2 ? receptor cows pregnant with Nelore calves provement from superovulation of embryo donors (n=20); Group 3 ? receptor cows pregnant with Nelore calves obtained by in vitro production after follicular aspiration (n=20). At the delivery moment, after the visualization of the sacs, 15mL of amniotic liquid were collected by puncture. The samples were processed and analyzed in the service of clinical laboratory of the Department of Veterinary Clinic of FMVZ/UNESP of Botucatu-SP and in the Laboratory of Endocrinology of the department of Animal Reproduction and Veterinary Radiology. For biochemical analysis commercial kits were used following the technique recommended by the manufacturer. The hormonal determinaton of progesterone (P4) and testosterone (T) was performed through radioimmunossay (RIA) in solid phase with the reading accomplished in accountant Gama Count Collects II. The data obtained in the biochemical evaluation and in the hormonal profile were submitted to the variance analysis (ANOVA) and, once demonstrated a statistic difference by that method the Tukey test was applied, with a 24 5% of level significancy

Vitrificação de ovócitos imaturos de bovinos utilizando etilenoglicol associado à trehalose e polivinilpirrolidona / Vitrification of immature bovine oocytes, by the ethylene glycol associated with trehalose and polivinylpyrrolidone

Avaliaram-se os efeitos da vitrificação de ovócitos imaturos de bovinos utilizando o etilenoglicol (EG) associado à trehalose e à polivinilpirrolidona (PVP). Utilizaram-se ovócitos provenientes de ovários de vacas abatidas em matadouro, distribuídos aleatoriamente em três tratamentos (T). TI - ovócitos não desnudados e não congelados, TII - ovócitos vitrificados com cumulus oophorus e TIII - ovócitos desnudados vitrificados. A percentagem de ovócitos recuperados e ovócitos com morfologia normal após a vitrificação foi diferente entre TII e TIII (92,2 e 72,6 por cento; 79,0 e 63,6 por cento, respectivamente). Os ovócitos normais foram cultivados à 38,5ºC em atmosfera de 5 por cento de CO2 por 24 horas. Após o cultivo, os ovócitos foram fecundados e os embriões cultivados in vitro por sete dias. Foram encontradas diferenças entre tratamentos quanto às taxas de maturação nuclear, fecundação e clivagem (83,9, 70,0 e 44,0 por cento; 17,5, 23,7 e 5,1 por cento; 0,0, 0,0 e 0,0 por cento para os tratamentos I, II e III, respectivamente). Apenas no TI foram obtidas mórulas e blastocistos (21,4 por cento). Os procedimentos de vitrificação, segundo os protocolos utilizados, não são indicados para a criopreservação de ovócitos imaturos de bovinos.(AU)

This study aimed to evaluate the effects of vitrification procedure of immature bovine oocytes using ethylene glycol (EG) associated with trehalose and polivinylpyrrolidone on the percentage of recovered oocytes with normal morphology and nuclear maturation, fecundation and cleavage rates for in vitro cultivated embryos. Ovary oocytes of slaughtered cows were randomly allotted to three treatments (T): TI - oocytes neither undenuded nor vitrified, TII - vitrified oocytes with cumulus oophorus, TIII - undenuded vitrified oocytes. The percentage of recovered oocytes and oocytes with normal morphology after vitrification was different for TII and TIII (92.2 and 72.6%, 79.0 and 63.3% for TII and TIII, respectively). All normal oocytes were cultivated at 38.5ºC in atmosphere with 5% CO2 for 24 hours. After culture, the oocytes were fecundated and the embryos were cultivated in vitro for seven days. The nuclear maturation, fecundation and cleavage rates for TI, TII and TIII were different (83.9, 70.0 and 44.0%, 17.5, 23.7 and 5.1%, 0.0, 0.0 and 0.0% for TI, TII and TIII, respectively). Morulas and blastocysts were obtained only for TI (21.4%). These results indicate that the protocol used for vitrification procedure is not recommended for cryopreservation of immature bovine oocytes.(AU)

Quantificação dos níveis de endotelina-1 em placentas e mebranas fetais humanas / Quantification of endothelin-1 level in placentae and human fetal membranes

A endotelina é um peptídeo vasoconstrictor potente que possui funções angiogênicas, mitogênicas e neurotróficas. Neste estudo procurou-se quantificar os níveis de Endotelina -1 (ET-1) em vilos coriônicos placentários e no âmnio de placentas de fetos gemelares, cujas mães submeteram-se à reprodução assistida e fecundação espontânea. Foram colhidas oito amostras de placentas, que após o delivramento placentário, foram colocadas em nitrogênio líquido e, posteriormente, congeladas e mantidas à -80ºC até o processamento por ensaio imunoenzimático (ELISA). Os níveis de concentração de ET-1 em amostras de vilos coriônicos de placentas de fetos gemelares variaram de 0,52 a 0,70fmol/ml, enquanto que de fetos únicos variou de 0,47 a 0,86fmol/ml. A mesma determinação em amostras de âmnio de placentas de gemelares variou de 0,61 a 1,16 fmol/ml, enquanto que de fetos únicos variou de 0,65 a 1,04fmol/ml. Estes achados indicam que em vilos coriônicos, os níveis de concentração de ET-1 não variaram entre gemelares e fetos únicos. No âmnio, os níveis de ET-1 são mais elevados em gemelares que em fetos únicos, dados que sugerem que o âmnio é a principal fonte de ET-1 presente no líquido amniótico.(AU)

The endothelin is a potent vasoconstricor that possess angiogenic, mitogenic and neurotrophical functions. In this study we aimed to quantify the Endothelin-1 (ET-1) levels in chorionic placental villi and amnion of placentae of twins childbirths whose women were submitted to an assisted pregnancy and spontaneal fecundation. Were collected 08 placental samples. After the placental delivery the samples had been placed in liquid nitrogen and later in a -80ºC until the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) technique. The concentration levels of ET-1 in samples of chorionic villi in twins placentae varied from 0,52 to 0,70 fmol/ml, while in chorionic villi single gestation varied from 0,47 to 0,86 fmol/ml. The same determination in samples of amnion of twins placentae varied from 0,65 to 1,16 fmol/ml, while in single gestation varied from 0,65 to 1,04 fmol/ml. These findings suggests that in the chorionic villi the levels of ET-1 didn't vary between twins and single gestation. In the amnion the levels of ET-1 are higher in twins than in single gestation, suggesting that the amnion is the source of ET-1 in the amniotic fluid.(AU)

Influência do estágio reprodutivo e suplementação do meio de cultivo com progesterona eou soro de cadela em estro, nas taxas de maturação in vitro de oócitos de fêmeas caninas

O principal objetivo das pesquisas com MIV canina tem sido o desenvolvimento e implementação adequados da fecundação in vitro (FIV) e do cultivo embrionário in vitro (CIV) para a obtenção de embriões das espécies de canídeos em extinção. Concomitantemente à publicação de dados sobre índices de MIV em cadelas, surgiram alguns relatos sobre taxas de maturação completa e indícios de retomada da meiose em oócitos provenientes de folículos pré-ovulatórios. Assim, o presente estudo objetivou investigar a incidência de maturação oocitária intraovariana de cadelas em anestro, estro natural e estro induzido. Os oócitos foram colhidos após fatiamento ovariano e imediatamente corados com bisbenzimida para avaliação dos diferentes graus de configuração cromossômica. Em conclusão podemos afirmar que há retomada e progressão da meiose em oócitos, no ambiente intrafolicular; não há diferença estatística (P<0,05) nas porcentagens das diferentes configurações cromossômicas de acordo com os estádios reprodutivos avaliados neste estudo (anestro/estro e estro induzido)

The main canine MIV research goal has been adequate in vitro fecundation develop and implementation (FIV) and the in vitro embryo cultivation (CIV) to obtain in extinction canid species embryos. Concomitantly to data publication about bitch MIV indexes appeared some relates about complete maturation rates and indications of meiosis retaken in oocytes from pre-ovulatory follicles. This way, the present study aimed investigate the anestrus bitches interovarian oocytary maturation incidence, natural estrus and estrus-induced The oocytes were collected after the ovary slicing and immediately colored with bisbenzimide to evaluate the different chromosomic configuration degrees. As a conclusion, can be affirmed there is meiosis progression and resumption in oocytes, in the intra follicular environment. There were no statistical difference (P<0.05) between the different chromosomic configurations percentages according to the reproductive stages evaluated in this study (anestrus/estrus and estrus- induced)

Influência das técnicas reprodutivas e tipo de acasalamento em programas de seleção de gado de corte e seu impacto no custo e na produção de tourinhos / Influence of the reproductive techniques and the kind of mating in programmes of beef cattle selection, and its impact on the cost and on the young bulls production

A seleção e produção de touros para o mercado pecuário tornam-se foco de muitos estudos, e um grande desafio para o segmento em se tratando da constante busca de melhorias nos desempenhos produtivos dessa categoria animal. A tese teve por objetivo simular o que poderá acontecer com a produção de reprodutores, em termos de quantidades produzidas e custos operacionais efetivos, sob a influência dos métodos de acasalamentos e das biotécnicas reprodutivas disponíveis no mercado nacional. A hipótese em questão é a de testar se acasalar matrizes, classificadas por genótipo, suas produções serão melhores do que quando comparada à produção de matrizes classificadas por fenótipo. Foram simulados 42 cenários produtivos, divididos em 21 cenários com acasalamento genotípico e 21 com acasalamento fenotípico. Em cada divisão constam simulações com uso de Monta Natural, Inseminação Artificial padrão e com sêmen sexado para machos, Transferência de Embriões padrão e com sêmen sexado para machos, Fecundação in vitro padrão e com sêmen sexado para machos, sendo que em todos os casos três níveis diferentes de taxas de concepção foram testados. Os resultados apontaram que o sistema de acasalamento teve influência direta na produção de tourinhos, sendo que o acasalamento por genótipo foi mais eficiente do que o acasalamento por fenótipo. As taxas de concepção influenciaram negativamente mais os resultados dos sistemas de acasalamento fenotípico. Há um grande aumento no custo operacional efetivo dos sistemas que utilizaram as biotécnicas reprodutivas de Transferência de Embriões e Fecundação in vitro, e consequentemente uma redução na lucratividade destes sistemas. As simulações com Monta Natural apresentaram as maiores Margens Brutas e as simulações com Inseminação Artificial com uso de sêmen sexado para machos apresentaram os maiores Lucros Brutos

The selection and production of bulls for the cattle market have both become the goal of many studies, as well as a great challenge for the segment, providing the constant search for performance improvement of that sort of animal. The target of this thesis is to simulate what may happen to the production of stud, in terms of quantity and effective operational costs, under the influence of the mating methods and the available reproduction biotechniques in the national market. The hypothesis under analysis consists of testing if mating matrices, classed by their genotype, their produce will be better than when compared to the produce of phenotype-classed matrices. 42 productive-scenes, divided into 21 genotype mating and 21 phenotype mating were simulated. In each of the scene divisions there were the following simulations: Natural Breeding, standard Artificial Insemination, Artificial Insemination with male-gendered semen, standard Embryo Transference, Embryo Transference with male-gendered semen, standard In-vitro Fecundation and In-vitro Fecundation with male-gendered semen, so that in all the cases, three different conception rates were tested. The results displayed that the mating system directly influenced the young bull production, once the genotype mating was more efficient than the phenotype mating. The conception rates negatively influenced the results of the phenotype mating mainly. There was a dramatic increase in the effective operational cost of the systems that used the reproductive biotechniques of Embryo Transference and In-vitro Fecundation, and, consequently, profitability reduction of those systems. The Natural Breeding simulations presented the highest Gross Margin, and the simulations of Artificial Insemination with male-gendered semen showed the highest Gross Profit