Morphological and molecular characterization of Contracaecum australe (Nematoda: Anisakidae) parasitizing Phalacrocorax brasilianus (Aves: Phalacrocoracidae) on the north coast of Brazil / Caracterização morfológica e molecular de Contracaecum australe (Nematoda: Anisakidae) parasitando Phalacrocorax brasilianus (Aves: Phalacrocoracidae) no litoral norte do Brasil

Abstract For the first time in Brazil, Contracaecum australe is recorded parasitizing Phalacrocorax brasilianus (Aves, Suliformes, Phalacrocoracidae) from the Marine Extractive Reserve of Soure on Marajó Island, Brazilian Amazon. Its morphology revealed a body with a transversally striated cuticle, smooth or slightly cleft interlabia, lips with auricles, labial papillae, and conspicuous amphids. In males, the presence of the median papilla on the upper lip of the cloaca and spicules that reach almost half of the body of the parasite. These morphological characters, added to the number and distribution of the pre- and postcloacal papillae of the male specimens, and supported by the molecular phylogeny from the analysis of the ITS-1, 5.8S and ITS-2 genes, allowed the identification of these parasites.

Resumo Pela primeira vez no Brasil, Contracaecum australe é registrado parasitando Phalacrocorax brasilianus (Aves, Suliformes, Phalacrocoracidae) da Reserva Extrativista Marinha de Soure na Ilha de Marajó, Amazônia brasileira. Sua morfologia revelou corpo com cutícula estriada transversalmente, interlábios lisos ou levemente fendidos, lábios com aurículas, papilas labiais e anfídeos conspícuos. Nos machos, observa-se a presença da papila mediana no lábio superior da cloaca e espículos que atingem quase a metade do corpo do parasito. Esses caracteres morfológicos, somados ao número e distribuição das papilas pré e pós-cloacais dos espécimes machos, e apoiados pela filogenia molecular a partir da análise dos genes ITS-1, 5.8S e ITS-2, permitiram a identificação desses parasitos.

Canine ringworm caused by Trichophyton mentagrophytes - detection by SYBR-Green real-time PCR

Background: Dermatophytes, fungi of universal distribution, invade semi or fully keratinized structures, such as skin, fur/ hair and nails. The various species of dermatophytes are classified into three genera anamorphic: Microsporum, Trichophyton and Epidermophyton. The genus Epidermophyton includes only E. floccosum, that rarely affects animals. The main species responsible for the disease in dogs and cats are Microsporum canis, M. gypseum and Trichophyton mentagrophytes, which were characterized through conventional mycological methodology (microscopic examination with KOH and culture). Molecular methodologies, such as real-time PCR, can contribute to a rapid laboratory diagnosis, helping clinicians to initiate an early antifungal treatment. This case report describes a case of canine dermatophytosis due to Trichophyton mentagrophytes detected from a clinical sample by SYBR-Green real-time PCR. Case: A 8-year-old dog, rescued from the street, was referred to a private veterinary clinic in the city of Canoas, RS, Brazil, presenting generalized lymphadenomegaly, crusted lesions all over the body, generalized alopecia, signs of excoriation and epistaxis. Initially, were administered prednisone [1 mg/kg every 48 h, BID] and cephalexin [30 mg/kg, BID]. Weekly baths with benzoyl peroxide were also given. The therapy was not clinically successful. Wood's Lamp Test was negative. As a differential diagnosis, PCR for detection of Leishmania was negative. Complete blood count and serum biochemical assay were also performed. For mycological diagnosis, hair specimen was clarified and examined microscopically using 10% potassium hydroxide (KOH) for the visualization of chains of arthroconidia (ectothrix invasion of hair). The infected hair was plated onto MycoselTM Agar, incubated at 28°C for 15 days. Microscopy of hyphae/ conidia and macroscopic colony characteristics (colors and texture) were conducted for the differentiation of the species within the genus Microsporum and Trichophyton. In addition, real-time PCR was applied for direct analysis of the fungal DNA obtained from the hair sample. Microscopic examination was negative. The dermatophyte present in the hair sample was confirmed as Trichophyton mentagrophytes by culture and qPCR (melting-point analysis). The patient was treated with systemic itraconazole [10 mg/ kg SID - 90 days]. Twice-weekly application of 2.5 % miconazole and 2% chlorhexidine shampoo until complete cure. Discussion: Dermatophytosis is often listed as self-limiting infection; however, animal dermatophytosis can spread between pets, as well as a zoonotic transmission to humans. The literature on dermatophytosis indicates that Microsporum canis is the predominant etiological agent, followed by M. gypseum. Trichophyon mentagrophytes that appear in a lower percentage of isolation. The culture of hair, even with specific medium containing chloramphenicol and cyclohexamide, may present contaminating fungi, not related to dermatophytosis, which can inhibit or override the growth of dermatophytes. The use of real-time PCR provided a faster and specific diagnosis of dermatophytosis when compared to the conventional mycological methodology for detection and identification of T. mentagrophytes, which takes around 10 to 15 days for culture. It is possible to use this technique as an alternative diagnosis for dermatophytes associated to clinical hair samples of dogs.

Cross-genera amplification and identification of Colpodella sp. with Cryptosporidium primers in fecal samples of zoo felids from northeast China

Abstract The protozoans include many intracellular human pathogens. Accurate detection of these pathogens is necessary to treat the diseases. In clinical epidemiology, molecular identification of protozoan is considered a more reliable and rapid method for identification than microscopy. Among these protozoans, Cryptosporidium considered being one of the important water-borne zoonotic pathogens and a major cause of a diarrheal disease named cryptosporidiosis in humans, domestic animals, and wild animals. This study was aimed to identify Cryptosporidium in zoo felids (N= 56) belonging to different zoo of China, but accidentlly Colpodella was encountered in the zoo felids sample and phylogenetic data confirmed this unexpected amplification from fecal samples using two-step nested-PCR. Phylogenetic analysis revealed the fact about the specific primers used previously by many researchers and cross-genera amplification. We came to know that genetically sequenced amplicon gives more accurate identification of species. This study suggests more investigation on Colpodella which has been neglected previously but gains the attention of researchers after identified from humans and animals and has been known to correlate with neurological symptoms in patients.

Resumo Os protozoários incluem muitos patógenos humanos intracelulares. A detecção acurada desses patógenos é necessária para tratar as doenças. Na epidemiologia clínica, a identificação molecular de protozoários é considerada o método de identificação mais confiável e rápido do que a microscopia. Entre esses protozoários, o Cryptosporidium é considerado um dos importantes patógenos zoonóticos transmitidos pela água e uma das principais causas de uma doença diarreica denominada criptosporidiose em humanos, animais domésticos e selvagens. Este estudo teve como objetivo identificar Cryptosporidium em zoofelídeos (N = 56) pertencentes a diferentes zoológicos da China, mas acidentalmente Colpodella foi encontrada na amostra de zoofelídeos e os dados filogenéticos confirmaram essa amplificação inesperada de amostras fecais usando nested-PCR em duas etapas. A análise filogenética revelou o fato sobre os primers específicos usados anteriormente por muitos pesquisadores e a amplificação entre gêneros. Ficamos sabendo que o amplicon sequenciado geneticamente fornece uma identificação mais acurada das espécies. Este estudo sugere mais investigação sobre Colpodella, que foi negligenciada anteriormente, mas ganha a atenção dos pesquisadores depois de identificada em humanos e animais e é conhecida por se correlacionar com sintomas neurológicos em pacientes.

Molecular identification of genus Pipistrellus (Mammalia: Chiroptera) from Fata region, Pakistan

Abstract A total of 10 specimens were captured from selected sites of Bajaur Agency FATA, Pakistan using mist nets. The captured specimens were morphologically identified and various morphometric measurements were taken. The head and Body length (HB) of Pipistrellus coromondra and Pipistrellus kuhlii lepidus (n=10) was 43±0.11 mm and 45±1.1 respectively. Morphologically identified Pipistrellus kuhlii confirmed as Pipistrellus kuhlii lepidus based on 16S rRNA sequences. The DNA sequences were submitted to GenBank and accession numbers were obtained (MN 719478 and MT430902). The available 16S rRNA gene sequences of Pipistrellus coromondra and Pipistrellus kuhlii lepidus were retrieved from NCBI and incorporated in N-J tree analysis. Overall, the interspecific genetic variations among Pipistrellus coromondra and Pipistrellus kuhlii lepidus were 8% and 1% respectively. In our recommendation, a comprehensive molecular identification of bats is need of hour to report more cryptic and new species from Pakistan.

Resumo Um total de 10 espécimes foi capturado em locais selecionados da Bajaur Agency FATA, Paquistão, usando redes de neblina. Os espécimes capturados foram identificados morfologicamente e várias medidas morfométricas foram realizadas. O comprimento da cabeça e do corpo (HB) de Pipistrellus coromondra e Pipistrellus kuhlii lepidus (n = 10) foi de 43 ± 0,11 mm e 45 ± 1,1, respectivamente. Pipistrellus kuhlii identificado morfologicamente e confirmado como Pipistrellus kuhlii lepidus com base em sequências de rRNA 16S. As sequências de DNA foram submetidas ao GenBank e os números de acesso foram obtidos (MN 719478 e MT430902). As sequências do gene 16S rRNA disponíveis de Pipistrellus coromondra e Pipistrellus kuhlii lepidus foram recuperadas do NCBI e incorporadas na análise da árvore N-J. No geral, as variações genéticas interespecíficas entre Pipistrellus coromondra e Pipistrellus kuhlii lepidus foram de 8% e 1%, respectivamente. Em nossa recomendação, uma identificação molecular abrangente de morcegos precisa de uma hora para relatar mais espécies crípticas e novas do Paquistão.

Molecular identification of pathogenic Escherichia coli virulence genes and histopathological analysis in chickens condemned for airsacculitis / Identificação molecular de genes de virulência de Escherichia coli e análise histopatológica em frangos condenados por aerossaculite

ABSTRACT: The present study identified virulence genes and pathological changes caused by Escherichia coli in chicken carcasses condemned for airsacculitis and assessed if the histopathological examination and polymerase chain reaction (PCR) were effective for studies like this. Trachea, liver, and lung were collected from 30 chickens with suspected airsacculitis that has been condemned in the inspection line. The samples were analyzed by PCR to simultaneously identify two virulence genes (iss and tsh genes) and for histopathological testing. PCR efficiently genotypically characterize the E. coli isolates, where the virulence genes iss and tsh were found in three birds simultaneously. The histopathological examination detected a predominance of heterophils and mononuclear cells in the trachea (100%), lung (90%), and liver (13.3%). The liver was the organ where practically no alteration was diagnosed. The results of multiplex PCR for the tsh and iss virulence genes indicate the great potential of the approach in the characterization of E. coli isolates. Unspecific identification did not occur, thus making it necessary to use technologies for the identification and prevention of this agent in aviaries and poultry abattoirs.

RESUMO: O objetivo do presente estudo foi identificar genes de virulência e alterações patológicas provocadas por Escherichia coli em carcaças de frango condenadas por aerossaculite e se o exame histopatológico e uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) são eficazes para os estudos dessa natureza. Para isso, foram coletados traqueia, fígado e pulmão de 30 frangos condenados na linha de inspeção, com suspeita de aerossaculite. As amostras foram submetidas a PCR para a identificação de dois genes de virulência de modo simultâneo (genes iss e tsh) e ao teste histopatológico. A PCR foi eficiente para caracterizar genotipicamente os isolados de E. coli, em que se constatou em três aves os genes de virulência iss e tsh simultaneamente. No exame histopatológico detectou-se a predominância de heterófilos e mononucleares na traqueia 100%, no pulmão 90% e no fígado 13,3%. O fígado foi o órgão onde praticamente não foi diagnosticada nenhuma alteração. Diante dos resultados obtidos, foi possível observar que a PCR multiplex para os genes de virulência tsh e iss apresenta um grande potencial na caracterização de isolados de E. coli, já que não gerou identificação inespecífica, com isso faz-se necessária a utilização de tecnologias para identificação e prevenção desse agente nos aviários e matadouros avícolas.

Cross-genera amplification and identification of Colpodella sp. with Cryptosporidium primers in fecal samples of zoo felids from northeast China / Amplificação cruzada de gêneros e identificação de Colpodella sp. com iniciadores de Cryptosporidium em amostras fecais de zoofilia do nordeste da China

Abstract The protozoans include many intracellular human pathogens. Accurate detection of these pathogens is necessary to treat the diseases. In clinical epidemiology, molecular identification of protozoan is considered a more reliable and rapid method for identification than microscopy. Among these protozoans, Cryptosporidium considered being one of the important water-borne zoonotic pathogens and a major cause of a diarrheal disease named cryptosporidiosis in humans, domestic animals, and wild animals. This study was aimed to identify Cryptosporidium in zoo felids (N= 56) belonging to different zoo of China, but accidentlly Colpodella was encountered in the zoo felids sample and phylogenetic data confirmed this unexpected amplification from fecal samples using two-step nested-PCR. Phylogenetic analysis revealed the fact about the specific primers used previously by many researchers and cross-genera amplification. We came to know that genetically sequenced amplicon gives more accurate identification of species. This study suggests more investigation on Colpodella which has been neglected previously but gains the attention of researchers after identified from humans and animals and has been known to correlate with neurological symptoms in patients.

Resumo Os protozoários incluem muitos patógenos humanos intracelulares. A detecção acurada desses patógenos é necessária para tratar as doenças. Na epidemiologia clínica, a identificação molecular de protozoários é considerada o método de identificação mais confiável e rápido do que a microscopia. Entre esses protozoários, o Cryptosporidium é considerado um dos importantes patógenos zoonóticos transmitidos pela água e uma das principais causas de uma doença diarreica denominada criptosporidiose em humanos, animais domésticos e selvagens. Este estudo teve como objetivo identificar Cryptosporidium em zoofelídeos (N = 56) pertencentes a diferentes zoológicos da China, mas acidentalmente Colpodella foi encontrada na amostra de zoofelídeos e os dados filogenéticos confirmaram essa amplificação inesperada de amostras fecais usando nested-PCR em duas etapas. A análise filogenética revelou o fato sobre os primers específicos usados ​​anteriormente por muitos pesquisadores e a amplificação entre gêneros. Ficamos sabendo que o amplicon sequenciado geneticamente fornece uma identificação mais acurada das espécies. Este estudo sugere mais investigação sobre Colpodella, que foi negligenciada anteriormente, mas ganha a atenção dos pesquisadores depois de identificada em humanos e animais e é conhecida por se correlacionar com sintomas neurológicos em pacientes.

Molecular identification of genus Pipistrellus (Mammalia: Chiroptera) from Fata region, Pakistan / Identificação molecular do gênero Pipistrellus (Mammalia: Chiroptera) da região de Fáta, Paquistão

Abstract A total of 10 specimens were captured from selected sites of Bajaur Agency FATA, Pakistan using mist nets. The captured specimens were morphologically identified and various morphometric measurements were taken. The head and Body length (HB) of Pipistrellus coromondra and Pipistrellus kuhlii lepidus (n=10) was 43±0.11 mm and 45±1.1 respectively. Morphologically identified Pipistrellus kuhlii confirmed as Pipistrellus kuhlii lepidus based on 16S rRNA sequences. The DNA sequences were submitted to GenBank and accession numbers were obtained (MN 719478 and MT430902). The available 16S rRNA gene sequences of Pipistrellus coromondra and Pipistrellus kuhlii lepidus were retrieved from NCBI and incorporated in N-J tree analysis. Overall, the interspecific genetic variations among Pipistrellus coromondra and Pipistrellus kuhlii lepidus were 8% and 1% respectively. In our recommendation, a comprehensive molecular identification of bats is need of hour to report more cryptic and new species from Pakistan.

Resumo Um total de 10 espécimes foi capturado em locais selecionados da Bajaur Agency FATA, Paquistão, usando redes de neblina. Os espécimes capturados foram identificados morfologicamente e várias medidas morfométricas foram realizadas. O comprimento da cabeça e do corpo (HB) de Pipistrellus coromondra e Pipistrellus kuhlii lepidus (n = 10) foi de 43 ± 0,11 mm e 45 ± 1,1, respectivamente. Pipistrellus kuhlii identificado morfologicamente e confirmado como Pipistrellus kuhlii lepidus com base em sequências de rRNA 16S. As sequências de DNA foram submetidas ao GenBank e os números de acesso foram obtidos (MN 719478 e MT430902). As sequências do gene 16S rRNA disponíveis de Pipistrellus coromondra e Pipistrellus kuhlii lepidus foram recuperadas do NCBI e incorporadas na análise da árvore N-J. No geral, as variações genéticas interespecíficas entre Pipistrellus coromondra e Pipistrellus kuhlii lepidus foram de 8% e 1%, respectivamente. Em nossa recomendação, uma identificação molecular abrangente de morcegos precisa de uma hora para relatar mais espécies crípticas e novas do Paquistão.

Phylogeography of cliff racer (Platyceps rhodorachis Jan, 1865) from Punjab, Pakistan

Abstract The present study reports the existence of cliff racer, Platyceps rhodorachis from the plains of Punjab, Pakistan. A total of 10 specimens were captured during the field surveys from June to September, 2018 from different sites of Punjab. Platyceps rhodorachis was identify on the basis of morphology and confirmed through COI gene sequences. The obtained DNA sequences have shown reliable and exact species identification. Newly produced DNA sequences of Platyceps rhodorachis were submitted to GenBank and accession numbers were obtained (MK936174.1, MK941839.1 and MT790210.1). N-J tree based on COI sequences of Platyceps rhodorachis clearly separated as out-group with other members of family Colubridae based on p-distance. The intra-specific genetic variation ranges from 12% to 18%. The DNA sequences of Platyceps rhodorachis kashmirensis, Platyceps rhodorachis ladacensis, Platyceps ventromaculatus, Platyceps ventromaculatus bengalensis and Platyceps ventromaculatus indusai are not available at NCBI to validate their taxonomic positions. In our recommendations, a large scale molecular based identification of Pakistans herpetofauna is required to report more new or subspecies from country.

Resumo O presente estudo relata a existência de um corredor de penhasco, Platyceps rhodorachis, das planícies de Punjab, Paquistão. Um total de 10 espécimes foi capturado durante os levantamentos de campo de junho a setembro de 2018 em diferentes locais de Punjab. Platyceps rhodorachis foi identificada com base na morfologia e confirmada por meio de sequências do gene COI. As sequências de DNA obtidas mostraram identificação de espécies confiável e exata. Sequências de DNA de Platyceps rhodorachis recém-produzidas foram submetidas ao GenBank e os números de acesso foram obtidos (MK936174.1, MK941839.1 e MT790210.1). Árvore N-J baseada em sequências COI de Platyceps rhodorachis claramente separadas como out-group com outros membros da família Colubridae com base na distância-p. A variação genética intraespecífica varia de 12% a 18%. As sequências de DNA de Platyceps rhodorachis kashmirensis, Platyceps rhodorachis ladacensis, Platyceps ventromaculatus, Platyceps ventromaculatus bengalensis e Platyceps ventromaculatus indusai não estão disponíveis no NCBI para validar suas posições taxonômicas. Em nossas recomendações, uma identificação de base molecular em grande escala da herpetofauna do Paquistão é necessária para relatar mais novas ou subespécies do país.

Sporothrix brasiliensis infecting cats in northeastern Brazil: New emerging areas in Paraíba state / Sporothrix brasiliensis infectando felinos no nordeste do Brasil: novas áreas emergentes no estado da Paraíba

ABSTRACT: Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by fungus of the Sporothrix complex, and in Brazil the main species reported is Sporothrix brasiliensis, of which the diseased cat is the transmitter. Although, its occurrence has increased in the state of Paraíba, Brazil, since 2016, data on the disease in this state are limited. Therefore, this research aimed to identify molecularly isolates of Sporothrix spp. from domestic cats from cities in Paraíba, and in this way to expand the understanding of the disease in the state. Thirty-nine samples were analyzed, obtained from skin lesions of domestic felines, from the following cities in Paraíba: João Pessoa, Pilões, Patos, Areia, Bananeiras and Guarabira. Cytological analysis was performed to screen the samples, followed by fungal culture, and the molecular characterization of the isolates was performed, using the species-specific Polymerase Chain Reaction (PCR) or partial sequencing of the calmodulin gene. All isolates were identified as S. brasiliensis. The sequencing showed 100% similarity to the S. brasiliensis CBS 120339 strain. In view of this, it is concluded that in the study areas the species involved in cases of feline sporotrichosis is S. brasiliensis, its presence in Paraíba demonstrated the spread of the agent in regions distant from the epicenters in Brazil, alerting to the possible occurrence of zoonotic outbreaks similar to those found in the South and Southeast regions of the country. In addition, it highlights the emerging role of felines in the transmission of sporotrichosis in new endemic areas of Brazil.

RESUMO: A esporotricose é uma micose subcutânea causada por fungos do complexo Sporothrix, e no Brasil a principal espécie relatada é Sporothrix brasiliensis da qual o transmissor é o gato doente. Embora sua ocorrência tenha aumentado no estado da Paraíba, Brasil, desde 2016, os dados sobre a doença neste estado são limitados. Diante disso, esta pesquisa teve por objetivo identificar, molecularmente, isolados de Sporothrix spp. procedentes de felinos domésticos de cidades da Paraíba, e dessa maneira expandir a compreensão da enfermidade no estado. Foram analisadas 39 amostras, obtidas de lesões cutâneas de felinos domésticos, oriundos das seguintes cidades paraibanas: João Pessoa, Pilões, Patos, Areia, Bananeiras e Guarabira. Realizou-se análise citológica, para triagem das amostras, a seguir cultura fúngica, e posteriormente a caracterização molecular dos isolados, utilizando a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), espécie-específica ou sequenciamento parcial do gene calmodulina. Todos os isolados foram identificados molecularmente como S. brasiliensis. O sequenciamento demonstrou 100% de similaridade com a cepa S. brasiliensis CBS 120339. Contudo, conclui-se que nas áreas do estudo a espécie envolvida em casos de esporotricose felina é S. brasiliensis, sua presença na Paraíba demonstra a disseminação do agente em regiões distantes dos epicentros no Brasil, alertando para a possível ocorrência de surtos zoonóticos, semelhantes aos encontrados nas regiões Sul e Sudeste do país. Além disso, destaca o papel emergente dos felinos na transmissão da esporotricose em novas áreas endêmicas do Brasil.

Cross-genera amplification and identification of Colpodella sp. with Cryptosporidium primers in fecal samples of zoo felids from northeast China / Amplificação cruzada de gêneros e identificação de Colpodella sp. com iniciadores de Cryptosporidium em amostras fecais de zoofilia do nordeste da China

The protozoans include many intracellular human pathogens. Accurate detection of these pathogens is necessary to treat the diseases. In clinical epidemiology, molecular identification of protozoan is considered a more reliable and rapid method for identification than microscopy. Among these protozoans, Cryptosporidium considered being one of the important water-borne zoonotic pathogens and a major cause of a diarrheal disease named cryptosporidiosis in humans, domestic animals, and wild animals. This study was aimed to identify Cryptosporidium in zoo felids (N= 56) belonging to different zoo of China, but accidentlly Colpodella was encountered in the zoo felids sample and phylogenetic data confirmed this unexpected amplification from fecal samples using two-step nested-PCR. Phylogenetic analysis revealed the fact about the specific primers used previously by many researchers and cross-genera amplification. We came to know that genetically sequenced amplicon gives more accurate identification of species. This study suggests more investigation on Colpodella which has been neglected previously but gains the attention of researchers after identified from humans and animals and has been known to correlate with neurological symptoms in patients.

Os protozoários incluem muitos patógenos humanos intracelulares. A detecção acurada desses patógenos é necessária para tratar as doenças. Na epidemiologia clínica, a identificação molecular de protozoários é considerada o método de identificação mais confiável e rápido do que a microscopia. Entre esses protozoários, o Cryptosporidium é considerado um dos importantes patógenos zoonóticos transmitidos pela água e uma das principais causas de uma doença diarreica denominada criptosporidiose em humanos, animais domésticos e selvagens. Este estudo teve como objetivo identificar Cryptosporidium em zoofelídeos (N = 56) pertencentes a diferentes zoológicos da China, mas acidentalmente Colpodella foi encontrada na amostra de zoofelídeos e os dados filogenéticos confirmaram essa amplificação inesperada de amostras fecais usando nested-PCR em duas etapas. A análise filogenética revelou o fato sobre os primers específicos usados anteriormente por muitos pesquisadores e a amplificação entre gêneros. Ficamos sabendo que o amplicon sequenciado geneticamente fornece uma identificação mais acurada das espécies. Este estudo sugere mais investigação sobre Colpodella, que foi negligenciada anteriormente, mas ganha a atenção dos pesquisadores depois de identificada em humanos e animais e é conhecida por se correlacionar com sintomas neurológicos em pacientes.

Cross-genera amplification and identification of Colpodella sp. with Cryptosporidium primers in fecal samples of zoo felids from northeast China / Amplificação cruzada de gêneros e identificação de Colpodella sp. com iniciadores de Cryptosporidium em amostras fecais de zoofilia do nordeste da China

The protozoans include many intracellular human pathogens. Accurate detection of these pathogens is necessary to treat the diseases. In clinical epidemiology, molecular identification of protozoan is considered a more reliable and rapid method for identification than microscopy. Among these protozoans, Cryptosporidium considered being one of the important water-borne zoonotic pathogens and a major cause of a diarrheal disease named cryptosporidiosis in humans, domestic animals, and wild animals. This study was aimed to identify Cryptosporidium in zoo felids (N= 56) belonging to different zoo of China, but accidentlly Colpodella was encountered in the zoo felids sample and phylogenetic data confirmed this unexpected amplification from fecal samples using two-step nested-PCR. Phylogenetic analysis revealed the fact about the specific primers used previously by many researchers and cross-genera amplification. We came to know that genetically sequenced amplicon gives more accurate identification of species. This study suggests more investigation on Colpodella which has been neglected previously but gains the attention of researchers after identified from humans and animals and has been known to correlate with neurological symptoms in patients.(AU)

Os protozoários incluem muitos patógenos humanos intracelulares. A detecção acurada desses patógenos é necessária para tratar as doenças. Na epidemiologia clínica, a identificação molecular de protozoários é considerada o método de identificação mais confiável e rápido do que a microscopia. Entre esses protozoários, o Cryptosporidium é considerado um dos importantes patógenos zoonóticos transmitidos pela água e uma das principais causas de uma doença diarreica denominada criptosporidiose em humanos, animais domésticos e selvagens. Este estudo teve como objetivo identificar Cryptosporidium em zoofelídeos (N = 56) pertencentes a diferentes zoológicos da China, mas acidentalmente Colpodella foi encontrada na amostra de zoofelídeos e os dados filogenéticos confirmaram essa amplificação inesperada de amostras fecais usando nested-PCR em duas etapas. A análise filogenética revelou o fato sobre os primers específicos usados anteriormente por muitos pesquisadores e a amplificação entre gêneros. Ficamos sabendo que o amplicon sequenciado geneticamente fornece uma identificação mais acurada das espécies. Este estudo sugere mais investigação sobre Colpodella, que foi negligenciada anteriormente, mas ganha a atenção dos pesquisadores depois de identificada em humanos e animais e é conhecida por se correlacionar com sintomas neurológicos em pacientes.(AU)

Rhinitis in goat by Exserohilum rostratum (Setosphaeria rostrata) / Rinite em caprino por Exserohilum rostratum (Setosphaeria rostrata)

ABSTRACT: We described a case of rhinitis case caused by Exserohilum rostratum in a 3-year-old, mixed breed, afemale goat, presenting with decreased appetite, dyspnea, and face deformity, with evolution of approximately 2 months. Necropsy revealed an extensive brownish yellow, irregular, ulcerated, and friable focal lesion in the nasal cavity. Purulent secretion drained from the lesion, affecting the nasal vestibule and extending the caudal portion of the dorsal concha, associated with nasal meatus obstruction, destruction of the nasal septum, and nasal bone palatine and vomer. Histologically, the lesion was characterized as rhinitis and pyogranulomatous and necrotizing osteomyelitis (multifocal to coalescent, sharp, and chronic) and associated with a myriad of fungal structures. Morphologically, the hyphae were characterized by thin, slightly tortuous, and rarely septate walls (2-6 μm diameter), multiple chains of individual conidia or in groups (8-10 μm diameter), and pigmented chlamydoconidia (7.5-15 μm diameter). They showed positive results for the special histochemical techniques such as Fontana Masson, methenamine silver nitrate by Grocott, and periodic acid by Schiff. E. rostratum was identified as the causative agent using microbiological isolation associated with molecular identification. Pyrogranulomatous rhinitis caused by E. rostratum in goats is unprecedented, being the first isolation of the agent in animals in Brazil and the first case of nasal phaeohyphomycosis in the goats.

RESUMO: Descreve-se um caso de rinite por Exserohilum rostratum em um caprino, sem raça definida, fêmea, três anos, com diminuição do apetite, dispneia e deformidade facial, com evolução de aproximadamente dois meses. Durante a necropsia, observou-se que na cavidade nasal havia área focal extensa, amarelo acastanhada, irregular, ulcerada e friável, que drenava secreção purulenta acometendo o vestíbulo nasal e estendendo-se da porção caudal da concha dorsal, associada a obstrução do meato nasal, destruição do septo nasal e osso nasal palatino e vômer. Histologicamente, a lesão foi caracterizada como rinite e osteomielite piogranulomatosa e necrosante, multifocal a coalescente, aguda, crônica, associada a uma miríade de estruturas fúngicas. Morfologicamente, as hifas foram caracterizadas por paredes finas, discretamente tortuosas e septadas medindo 2 a 6 μm de diâmetro. Observamos algumas cadeias de conídios ou grupos com 8 a 10 μm de diâmetro e clamidoconídios pigmentados medindo de 7,5 a 15 μm de diâmetro. Foram positivos na histoquímica especial de Fontana Masson, Nitrato de Metenamina de Prata de Grocott e Ácido Periódico de Schiff. O agente foi determinado por meio de isolamento microbiológico associado à identificação molecular. A rinite piogranulomatosa causada por E. rostratum em caprinos é inédita, sendo o primeiro isolamento do agente em animais no Brasil e o primeiro caso de feo-hifomicose nasal na espécie caprina.

Aeromonas from farmed tambaqui from North Brazil: molecular identification and pathogenic potential / Aeromonas de tambaqui de cultivo do norte do Brasil: identificação molecular e potencial patogênico

ABSTRACT: The aim of this study was to molecularly identify different species of Aeromonas isolated from farmed tambaqui (Colossoma macropomum) from North Brazil, and evaluate their pathogenic potential by the presence of virulence genes. From the extraction of bacterial DNA, PCR (polymerase chain reaction) of the primers 16S rDNA, aerA (cytolytic enterotoxin), ast (cytotoxic enterotoxin) and act (cytotoxic enterotoxin) were performed. Of 24 isolates evaluated, eight amplified the ast gene, one amplified the act gene, but the areA gene was not amplified in any isolate. Sequencing of the 16S rRNA primer revealed a predominance of Aeromonas jandaei specie (92%). Aeromonas taiwanensis (4%), for the first time isolated from fish in Brazil, and Aeromonas hydrophila (4%) each appeared as just one isolate. Results showed that 32% of Aeromonas isolated from farmed tambaqui have considerable pathogenic potential for systemic damage, since the selected PCR primers are encoding the most common virulence genes in Aeromonas with high pathogenic intensity.

RESUMO: O objetivo deste estudo foi identificar molecularmente diferentes espécies de Aeromonas isoladas de tambaqui (Colossoma macropomum) de cultivo do norte do Brasil e avaliar seu potencial patogênico pela presença de genes de virulência. A partir da extração do DNA bacteriano, foi realizada a PCR (reação em cadeia da polimerase) dos primers 16S rDNA, aerA (enterotoxina citolítica), ast (enterotoxina citotóxica) e act (enterotoxina citotóxica). Dos 24 isolados avaliados, oito amplificaram o gene ast, um amplificou o gene act, mas o gene areA não foi amplificado em nenhum isolado. O sequenciamento do primer 16S rRNA revelou uma predominância da espécie Aeromonas jandaei (92%). Aeromonas taiwanensis (4%), pela primeira vez isolada em peixes no Brasil, e Aeromonas hydrophila (4%) apareceram cada uma como apenas um isolado. Os resultados mostram que 32% das Aeromonas isoladas de tambaqui de cultivo apresentam considerável potencial patogênico para danos sistêmicos, uma vez que os primers de PCR selecionados estão codificando os genes de virulência mais comuns em Aeromonas com alta intensidade patogênica.

Identification by molecular techniques of halophilic bacteria producing important enzymes from pristine area in Campeche, Mexico / Identificação por técnicas moleculares de bactérias halofílicas que produzem enzimas importantes em área intocada de Campeche, México

Abstract Isla Arena is located in the coordinate 20° 70´ N - 90° 45´ W, from Campeche, Mexico. In these estuaries, the ocean mixes with fresh water, and ecosystems are concentrated where petenes and pink flamingos proliferate. Crustaceans and mollusks abound in the sea. Despite its enormous marine wealth, there are no studies carried out on which halophilic microorganisms are present in these waters. In this work, the diversity and structure of the microbial community was investigated through a metagenomics approach and corroborated for sequencing of 16S rRNA genes. It was found that the phylum Fimicutes predominates with more than 50%, in almost the same proportion of the class Bacilli and with almost 41% of relative abundance of the order Bacillales. The sequencing results showed that one of the samples presented a high percentage of similarity (99.75%) using the Nucleotide BLAST program with a peculiar microorganism: Bacillus subtilis. This microorganism is one of the best characterized bacteria among the gram-positive ones. Our results demonstrate that B. subtilis can be an efficient source of proteases, lipases and cellulases, from halophilic microbial communities located in poorly explored areas.

Resumo Isla Arena está localizada na coordenada 20°70'N - 90°45'W, de Campeche, México. Nesses estuários, o oceano se mistura com a água doce e os ecossistemas se concentram onde proliferam petenos e flamingos rosa. Crustáceos e moluscos abundam no mar. Apesar de sua enorme riqueza marinha, não há estudos realizados sobre a presença de microrganismos halofílicos nessas águas. Neste trabalho, a diversidade e estrutura da comunidade microbiana foram investigadas através de uma abordagem metagenômica e corroboradas para o sequenciamento de genes 16S rRNA. Verificou-se que o filo Fimicutes predomina com mais de 50%, quase na mesma proporção da classe Bacilli e com quase 41% de abundância relativa da ordem Bacillales. Os resultados do sequenciamento mostraram que uma das amostras apresentou alto percentual de similaridade (99,75%) pelo programa Nucleotide BLAST com um microrganismo peculiar: Bacillus subtilis. Nossos resultados demonstram que B. subtilis pode ser uma fonte eficiente de proteases, lipases e celulases, provenientes de comunidades microbianas halofílicas localizadas em áreas pouco exploradas.

Morphological and molecular characterization of Contracaecum australe (Nematoda: Anisakidae) parasitizing Phalacrocorax brasilianus (Aves: Phalacrocoracidae) on the north coast of Brazil / Caracterização morfológica e molecular de Contracaecum australe (Nematoda: Anisakidae) parasitando Phalacrocorax brasilianus (Aves: Phalacrocoracidae) no litoral norte do Brasil

For the first time in Brazil, Contracaecum australe is recorded parasitizing Phalacrocorax brasilianus (Aves, Suliformes, Phalacrocoracidae) from the Marine Extractive Reserve of Soure on Marajó Island, Brazilian Amazon. Its morphology revealed a body with a transversally striated cuticle, smooth or slightly cleft interlabia, lips with auricles, labial papillae, and conspicuous amphids. In males, the presence of the median papilla on the upper lip of the cloaca and spicules that reach almost half of the body of the parasite. These morphological characters, added to the number and distribution of the pre- and postcloacal papillae of the male specimens, and supported by the molecular phylogeny from the analysis of the ITS-1, 5.8S and ITS-2 genes, allowed the identification of these parasites.(AU)

Pela primeira vez no Brasil, Contracaecum australe é registrado parasitando Phalacrocorax brasilianus (Aves, Suliformes, Phalacrocoracidae) da Reserva Extrativista Marinha de Soure na Ilha de Marajó, Amazônia brasileira. Sua morfologia revelou corpo com cutícula estriada transversalmente, interlábios lisos ou levemente fendidos, lábios com aurículas, papilas labiais e anfídeos conspícuos. Nos machos, observa-se a presença da papila mediana no lábio superior da cloaca e espículos que atingem quase a metade do corpo do parasito. Esses caracteres morfológicos, somados ao número e distribuição das papilas pré e pós-cloacais dos espécimes machos, e apoiados pela filogenia molecular a partir da análise dos genes ITS-1, 5.8S e ITS-2, permitiram a identificação desses parasitos.(AU)

Molecular diversity of Sarcocystis spp. in opossums (Didelphis spp.) from Southeastern and Midwestern Brazil / Diversidade molecular de Sarcocystis spp. em gambás (Didelphis spp.) do Sudeste e Centro-oeste do Brasil

South American opossums (Didelphis spp.) are definitive hosts of Sarcocystis neurona, Sarcocystis speeri, Sarcocystis lindsayi and Sarcocystis falcatula. In Brazil, diverse studies have demonstrated a high frequency of Sarcocystis falcatula-like in sporocysts derived from opossums, and high genetic diversity has been observed in surface antigen-encoding genes (SAGs). In this study, genetic diversity of Sarcocystis spp. derived from Didelphis albiventris and Didelphis aurita from the cities of Campo Grande and São Paulo, was accessed by sequencing SAG2, SAG3, SAG4, the first internal transcribed spacer (ITS-1) and cytochrome c oxidase subunit I (cox1). Molecular identification was performed for 16 DNA samples obtained from sporocyst or culture-derived merozoites. The ITS-1, cox1, and SAG3 fragments were cloned, whereas SAG2 and SAG4 were sequenced directly from PCR products. Four alleles variants were found for SAG2, 13 for SAG3 and seven for SAG4, from which four, 13 and four, respectively, were novel. Twenty-seven allele variants were found for ITS-1, all phylogenetically related to S. falcatula-like previously described in Brazil. Sarcocystis sp. phylogenetically related to Sarcocystis rileyi was evidenced by cox1 in three opossums. Further studies are needed to clarify the role of Didelphis spp. as definitive hosts of Sarcocystis spp. other than that previous described.(AU)

Gambás sul-americanos (Didelphis spp.) são hospedeiros definitivos de Sarcocystis neurona, Sarcocystis speeri, Sarcocystis lindsayi e Sarcocystis falcatula. No Brasil, diversos estudos têm demonstrado alta frequência de Sarcocystis falcatula-like em esporocistos derivados de gambás, com grande diversidade nos genes que codificam antígenos de superfície (SAGs). Neste estudo, a diversidade genética de Sarcocystis spp., oriundos de Didelphis albiventris e Didelphis aurita, dos municípios de Campo Grande e São Paulo, foi acessada por meio do sequenciamento de SAG2, SAG3 e SAG4, da primeira região espaçadora interna transcrita (ITS-1) e citocromo c oxidase subunidade I (cox1). Identificação molecular foi realizada em 16 amostras de DNA, obtidas de esporocistos ou merozoítos derivados de cultivo. Os fragmentos de ITS-1, cox1 e SAG3 foram clonados, enquanto SAG2 e SAG4 foram sequenciados diretamente dos produtos de PCR. Quatro alelos foram observados em SAG2, 13 em SAG3 e sete em SAG4, sendo novos quatro, 13 e quatro, respectivamente. Em ITS-1, 27 alelos foram observados, todos filogeneticamente relacionados à S. falcatula-like, previamente detectados no Brasil. Sarcocystis sp. filogeneticamente relacionado à Sarcocystis rileyi foi evidenciado por cox1 em três gambás. Mais estudos são necessários para entender o papel de Didelphis spp. como hospedeiro definitivo de Sarcocystis spp. diferentes daqueles previamente descritos.(AU)

Molecular identification of genus Pipistrellus (Mammalia: Chiroptera) from Fata region, Pakistan / Identificação molecular do gênero Pipistrellus (Mammalia: Chiroptera) da região de Fáta, Paquistão

A total of 10 specimens were captured from selected sites of Bajaur Agency FATA, Pakistan using mist nets. The captured specimens were morphologically identified and various morphometric measurements were taken. The head and Body length (HB) of Pipistrellus coromondra and Pipistrellus kuhlii lepidus (n=10) was 43±0.11 mm and 45±1.1 respectively. Morphologically identified Pipistrellus kuhlii confirmed as Pipistrellus kuhlii lepidus based on 16S rRNA sequences. The DNA sequences were submitted to GenBank and accession numbers were obtained (MN719478 and MT430902). The available 16S rRNA gene sequences of Pipistrellus coromondra and Pipistrellus kuhlii lepidus were retrieved from NCBI and incorporated in N-J tree analysis. Overall, the interspecific genetic variations among Pipistrellus coromondra and Pipistrellus kuhlii lepidus were 8% and 1% respectively. In our recommendation, a comprehensive molecular identification of bats is need of hour to report more cryptic and new species from Pakistan.

Um total de 10 espécimes foi capturado em locais selecionados da Bajaur Agency FATA, Paquistão, usando redes de neblina. Os espécimes capturados foram identificados morfologicamente e várias medidas morfométricas foram realizadas. O comprimento da cabeça e do corpo (HB) de Pipistrellus coromondra e Pipistrellus kuhlii lepidus (n = 10) foi de 43 ± 0,11 mm e 45 ± 1,1, respectivamente. Pipistrellus kuhlii identificado morfologicamente e confirmado como Pipistrellus kuhlii lepidus com base em sequências de rRNA 16S. As sequências de DNA foram submetidas ao GenBank e os números de acesso foram obtidos (MN 719478 e MT430902). As sequências do gene 16S rRNA disponíveis de Pipistrellus coromondra e Pipistrellus kuhlii lepidus foram recuperadas do NCBI e incorporadas na análise da árvore N-J. No geral, as variações genéticas interespecíficas entre Pipistrellus coromondra e Pipistrellus kuhlii lepidus foram de 8% e 1%, respectivamente. Em nossa recomendação, uma identificação molecular abrangente de morcegos precisa de uma hora para relatar mais espécies crípticas e novas do Paquistão.

Molecular identification of genus Pipistrellus (Mammalia: Chiroptera) from Fata region, Pakistan / Identificação molecular do gênero Pipistrellus (Mammalia: Chiroptera) da região de Fáta, Paquistão

A total of 10 specimens were captured from selected sites of Bajaur Agency FATA, Pakistan using mist nets. The captured specimens were morphologically identified and various morphometric measurements were taken. The head and Body length (HB) of Pipistrellus coromondra and Pipistrellus kuhlii lepidus (n=10) was 43±0.11 mm and 45±1.1 respectively. Morphologically identified Pipistrellus kuhlii confirmed as Pipistrellus kuhlii lepidus based on 16S rRNA sequences. The DNA sequences were submitted to GenBank and accession numbers were obtained (MN719478 and MT430902). The available 16S rRNA gene sequences of Pipistrellus coromondra and Pipistrellus kuhlii lepidus were retrieved from NCBI and incorporated in N-J tree analysis. Overall, the interspecific genetic variations among Pipistrellus coromondra and Pipistrellus kuhlii lepidus were 8% and 1% respectively. In our recommendation, a comprehensive molecular identification of bats is need of hour to report more cryptic and new species from Pakistan.(AU)

Um total de 10 espécimes foi capturado em locais selecionados da Bajaur Agency FATA, Paquistão, usando redes de neblina. Os espécimes capturados foram identificados morfologicamente e várias medidas morfométricas foram realizadas. O comprimento da cabeça e do corpo (HB) de Pipistrellus coromondra e Pipistrellus kuhlii lepidus (n = 10) foi de 43 ± 0,11 mm e 45 ± 1,1, respectivamente. Pipistrellus kuhlii identificado morfologicamente e confirmado como Pipistrellus kuhlii lepidus com base em sequências de rRNA 16S. As sequências de DNA foram submetidas ao GenBank e os números de acesso foram obtidos (MN 719478 e MT430902). As sequências do gene 16S rRNA disponíveis de Pipistrellus coromondra e Pipistrellus kuhlii lepidus foram recuperadas do NCBI e incorporadas na análise da árvore N-J. No geral, as variações genéticas interespecíficas entre Pipistrellus coromondra e Pipistrellus kuhlii lepidus foram de 8% e 1%, respectivamente. Em nossa recomendação, uma identificação molecular abrangente de morcegos precisa de uma hora para relatar mais espécies crípticas e novas do Paquistão.(AU)

Morphometric and molecular differentiation of Pimelodus grosskopfii and Pimelodus yuma (Siluriformes: Pimelodidae)

Pimelodus grosskopfii and Pimelodus yuma, two species endemic to the Magdalena-Cauca basin in Colombia, overlap in the ranges of some of their diagnostic characters, which hampers their correct morphological identification. Aiming to help discriminate these species, this study conducted an integrative analysis using traditional and geometric morphometrics, phylogenetic analysis based on partial sequences of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 gene (COI, cox1) and the identification of diagnostic Single Nucleotide Polymorphism markers (SNP). The species differ significantly in body geometry, allowing 100% discrimination, which was reinforced by a phylogenetic analysis that recovered well-supported monophyly of each species (posterior probability > 0.95). Additionally, the traditional morphometric results corroborated some previously reported diagnostic traits for both species and let us describe one non-overlapping ratio related to the adipose fin length. Three of five SNP markers had reciprocally exclusive alleles suitable for identifying each species. The morphometric and molecular methods conducted in this study constitute alternative tools for the correct discrimination of P. grosskopfii and P. yuma in the wild and in captive populations used for aquaculture.(AU)

Pimelodus grosskopfii y Pimelodus yuma, dos especies endémicas de la Cuenca Magdalena-Cauca en Colombia, se superponen en los rangos de variación de algunos de sus caracteres diagnósticos, lo que dificulta su correcta diferenciación morfológica. Con el objetivo de contribuir a la discriminación de estas especies, se realizó un análisis integrativo utilizando la morfometría geométrica y tradicional, análisis filogenético basado en secuencias parciales del gen mitocondrial citocromo c oxidasa subunidad I (COI, cox1) y la identificación de marcadores diagnósticos de polimorfismo de nucleótido único (SNP). Las especies difieren significativamente en la geometría del cuerpo, permitiendo una discriminación del 100%, lo que fue reforzado por un análisis filogenético que recuperó una monofilia bien soportada para cada especie (probabilidad posterior > 0,95). Además, los resultados de la morfometría tradicional corroboraron algunos rasgos diagnósticos previamente reportados para ambas especies y nos permitieron describir una proporción que no se sobrepone, relacionada con la longitud de la aleta adiposa. Tres de los cinco marcadores SNP poseían alelos recíprocamente exclusivos, adecuados para identificar cada especie. Los métodos morfométricos y moleculares implementados en este estudio constituyen herramientas alternativas para la correcta discriminación de P. grosskopfii y P. yuma tanto en la naturaleza como en poblaciones cautivas utilizadas para la acuicultura.(AU)

Phylogeography of cliff racer (Platyceps rhodorachis Jan, 1865) from Punjab, Pakistan / Filografia de penhasco (Platyceps rhodorachis Jan, 1865) de Punjab, Paquistão

The present study reports the existence of cliff racer, Platyceps rhodorachis from the plains of Punjab, Pakistan. A total of 10 specimens were captured during the field surveys from June to September, 2018 from different sites of Punjab. Platyceps rhodorachis was identify on the basis of morphology and confirmed through COI gene sequences. The obtained DNA sequences have shown reliable and exact species identification. Newly produced DNA sequences of Platyceps rhodorachis were submitted to GenBank and accession numbers were obtained (MK936174.1, MK941839.1 and MT790210.1). N-J tree based on COI sequences of Platyceps rhodorachis clearly separated as out-group with other members of family Colubridae based on p-distance. The intra-specific genetic variation ranges from 12% to 18%. The DNA sequences of Platyceps rhodorachis kashmirensis, Platyceps rhodorachis ladacensis, Platyceps ventromaculatus, Platyceps ventromaculatus bengalensis and Platyceps ventromaculatus indusai are not available at NCBI to validate their taxonomic positions. In our recommendations, a large scale molecular based identification of Pakistan’s herpetofauna is required to report more new or subspecies from country.

O presente estudo relata a existência de um corredor de penhasco, Platyceps rhodorachis, das planícies de Punjab, Paquistão. Um total de 10 espécimes foi capturado durante os levantamentos de campo de junho a setembro de 2018 em diferentes locais de Punjab. Platyceps rhodorachis foi identificada com base na morfologia e confirmada por meio de sequências do gene COI. As sequências de DNA obtidas mostraram identificação de espécies confiável e exata. Sequências de DNA de Platyceps rhodorachis recém-produzidas foram submetidas ao GenBank e os números de acesso foram obtidos (MK936174.1, MK941839.1 e MT790210.1). Árvore N-J baseada em sequências COI de Platyceps rhodorachis claramente separadas como out-group com outros membros da família Colubridae com base na distância-p. A variação genética intraespecífica varia de 12% a 18%. As sequências de DNA de Platyceps rhodorachis kashmirensis, Platyceps rhodorachis ladacensis, Platyceps ventromaculatus, Platyceps ventromaculatus bengalensis e Platyceps ventromaculatus indusai não estão disponíveis no NCBI para validar suas posições taxonômicas. Em nossas recomendações, uma identificação de base molecular em grande escala da herpetofauna do Paquistão é necessária para relatar mais novas ou subespécies do país.