Pathological and Immunohistochemical Examinations in Chukar Partridge (Alectoris chukar) of Wild and Captive Population

The aim of this study was to evaluate the health situation of chukar partridges through several diagnostic methods. We investigated a total of 224 birds in eighteen populations throughout Turkey, fourteen wild and four captive. The molecular sexing method was used for gender identification. Clinically, traumatic lesions and inflammatory reactions were the most commonly observed in the eyes and extremities of the Chukar Partridges in the breeding stations. At necropsy, the most common findings were enteritis and liver lesions. At the histopathological examination, pneumonia, anthracosis, and inflammatory changes in the digestive system were among the common findings. Interestingly, liver parasites were found in wild samples. At the immunohistochemical examinations, the tissues were evaluated for Marek's disease (MD), Adenovirus, Avian mycobacteriosis (AMB), and Aspergillosis. While MD and AMB were not found in breeding stations, we determined them from wild populations. Aspergillus was found in both wild and captive populations; Adenovirus antigens were found only in breeding stations. When the captive and wild populations were evaluated together, MD 1.3%, AMB 0.9%, Aspergillosis 1.3%, Adenovirus 1.8% were found. The relation between sex and diseases was also examined. As a result, the data of this study showed that chukar partridges from both breeding stations and wild populations are not an important source of diseases, but especially released partridges from breeding stations may carry some microorganisms. For that reason, captive populations should be regularly monitored for contagious diseases.(AU)

A citogenética da sexagem molecular de aves selvagens monomórficas e a influência negativa de anomalias pigmentares: revisão de literatura / The cytogenetics of the molecular sexage of wild birds monomorphics and the negative influence of anomalies pigmentary: literature review

O Brasil apresenta a segunda maior biodiversidade de aves do mundo, entretanto, lidera o ranking de aves ameaçadas de extinção, sobretudo, devido às ações antropológicas sobre as aves e seu habitat. Logo, a sexagem citogenética, através da técnica de PCR e estudo de cariótipos, possibilita a identificação e manutenção de espécies ameaçadas. Outrossim, existem anomalias pigmentares que modificam os fenótipos das aves e, consequentemente, prejudicam a identificação de espécies. Assim, esse trabalho objetivou, através de uma revisão de literatura, discorrer sobre a importância da citogenética na sexagem molecular de aves selvagens monomórficas e evidenciar a influência negativa de anomalias pigmentares.

Brazil has the second largest bird biodiversity in the world, however, it leads the ranking of endangered birds, mainly due to anthropological actions on birds and their habitat. Therefore, cytogenetic sexing, through the PCR technique and the study of karyotypes, enables the identification and maintenance of endangered species. Furthermore, there are pigmentary anomalies that modify the phenotypes of birds and, consequently, hinder the identification of species. Thus, this study aimed, through a literature review, to discuss the importance of cytogenetics in the molecular sexing of monomorphic wild birds and to highlight the negative influence of pigmentary anomalies.

Molecular sexing and intersexual differences in the morphometry of the Hangnest Tody-Tyrant Hemitriccus nidipendulus (Passeriformes: Rhynchocyclidae)

Variation in the morphometry of individuals in a population may result from natural or sexual selection. In the present study we investigated morphometric differences between males and females of a bird species endemic to the Brazilian Atlantic Forest, the Hangnest Tody-Tyrant, Hemitriccus nidipendulus (Wied, 1831), with no apparent sexual dimorphism. All individuals (n = 56) were sexed by PCR amplification of the intronic fragments of the CHDZ/CHDW alleles obtained from blood samples, and 12 morphometric measurements were recorded. The molecular configuration was similar to that described for other species of Passeriformes, with males presenting a single band of approximately 360 base pairs (bp), and females with two bands of 360 and 400 bp. Males had significantly larger tarsi and wings than the females, while the females had two larger beak measurements. This indicates that differential selection pressures may be modeling the morphometry of the Hangnest Tody-Tyrant. In the males, larger tarsi and wings may be beneficial for the exploration of the habitat or the acquisition of potential mates, while females with larger beaks may be able to exploit larger food items and forage more efficiently. However, these hypotheses need to be tested empirically in future studies.

Molecular sexing and intersexual differences in the morphometry of the Hangnest Tody-Tyrant Hemitriccus nidipendulus (Passeriformes: Rhynchocyclidae)

Variation in the morphometry of individuals in a population may result from natural or sexual selection. In the present study we investigated morphometric differences between males and females of a bird species endemic to the Brazilian Atlantic Forest, the Hangnest Tody-Tyrant, Hemitriccus nidipendulus (Wied, 1831), with no apparent sexual dimorphism. All individuals (n = 56) were sexed by PCR amplification of the intronic fragments of the CHDZ/CHDW alleles obtained from blood samples, and 12 morphometric measurements were recorded. The molecular configuration was similar to that described for other species of Passeriformes, with males presenting a single band of approximately 360 base pairs (bp), and females with two bands of 360 and 400 bp. Males had significantly larger tarsi and wings than the females, while the females had two larger beak measurements. This indicates that differential selection pressures may be modeling the morphometry of the Hangnest Tody-Tyrant. In the males, larger tarsi and wings may be beneficial for the exploration of the habitat or the acquisition of potential mates, while females with larger beaks may be able to exploit larger food items and forage more efficiently. However, these hypotheses need to be tested empirically in future studies.(AU)

Sex identification of domestic geese (Anser anser): comparison of cytogenetic analysis technique and post anesthetic inspection of the cloaca / Identificação do sexo de gansos domésticos (Anser anser): comparação da técnica de sexagem cromossômica e a inspeção pós-anestésica da cloaca

The domestic geese used in this experiment were free-living, from a lake located in an urban area and its population had increased dramatically. The need for a project proposing the sterilization of some males to restrain population growth, led to the need for sexing these animals. As domestic geese present minimal sexual dimorphism, two techniques were tested: cytogenetic analysis and post anesthetic inspection of the cloaca. There were used eight adults geese randomly chosen from a group of 80 animals. They were caught with nets or by hand, were individually transported and housed in appropriate place waiting for the cytogenetic analysis (three to four days). For the chromosomal sexing, was collected 2 mL of blood and the peripheral blood lymphocyte culture technique was used. The sample was treated with hypotonic KCl, fixed in three changes of methanol/acetic acid solution. The slides were prepared with the standard technique and examined under an optical microscope to observe the metaphase. To the technique of cloaca eversion, was performed injectable anesthesia with tiletamine-zolazepam 5%. Ten minutes after anesthesia, the cloaca has been everted to visualize the internal structures and sex determination. The techniques were performed in blinded trial to avoidinaccurate results. From the eight animals submitted to chromosomal sexing technique, five were identified as male and three as females, reaching 100% agreement when compared with the cloaca eversion technique. Sexing chromosomal technique appeared to cause the least discomfort in the animals evaluated, proving to be a reliable technique for sexualdetermination and favorable to animal welfare.

Os gansos domésticos utilizados neste experimento eram de vida livre, pertencentes a um lago localizado em uma área urbana e sua população havia aumentado dramaticamente. A necessidade de um projeto com foco na esterilização de alguns machos, para reduzir o crescimento populacional, levou à necessidade de sexagem desses animais. como os gansos domésticos apresentam mínimo dimorfismo sexual, duas técnicas foram testadas: análise citogenética e inspeção da cloaca pós-anestesia. Foram utilizados oito gansos adultos, escolhidos aleatoriamente de um grupo de 80 animais. Eles foram capturados com redes ou manualmente, transportados individualmente e alojados em local apropriado a espera da análise citogenética (três a quatro dias). Para a sexagem cromossomal, foram coletados 2 ml de sangue e a técnica de cultura de linfócitos periféricos foi empregada. As amostras resultantes foram tratadas com kcl hipotônico, fixadas em três trocas de solução de metanol e ácido acético. As lâminas foram preparadas com a técnica padrão e examinadas ao microscópio óptico para observação das metáfases. para a técnica de eversão da cloaca, foi realizada a anestesia injetável com tiletamina-zolazepam 5%. Dez minutos após a anestesia, a cloaca foi evertida para a visualização das estruturas internas e a determinação sexual. AAs técnicas foram conduzidas em duplo cego, para melhor acurácia dos resultados. Dos oito animais submetidos à técnica de sexagem cromossomal, cinco foram identificados como machos e três como fêmeas, alcançando 100% de concordância quando comparada com a técnica de eversão da cloaca. A técnica de sexagem cromossomal aparentou causar o menor desconforto nos animais avaliados, mostrando-se uma técnicaconfiável para determinação sexual e favorável ao bem-estar animal.

Sex identification of domestic geese (Anser anser): comparison of cytogenetic analysis technique and post anesthetic inspection of the cloaca / Identificação do sexo de gansos domésticos (Anser anser): comparação da técnica de sexagem cromossômica e a inspeção pós-anestésica da cloaca

The domestic geese used in this experiment were free-living, from a lake located in an urban area and its population had increased dramatically. The need for a project proposing the sterilization of some males to restrain population growth, led to the need for sexing these animals. As domestic geese present minimal sexual dimorphism, two techniques were tested: cytogenetic analysis and post anesthetic inspection of the cloaca. There were used eight adults geese randomly chosen from a group of 80 animals. They were caught with nets or by hand, were individually transported and housed in appropriate place waiting for the cytogenetic analysis (three to four days). For the chromosomal sexing, was collected 2 mL of blood and the peripheral blood lymphocyte culture technique was used. The sample was treated with hypotonic KCl, fixed in three changes of methanol/acetic acid solution. The slides were prepared with the standard technique and examined under an optical microscope to observe the metaphase. To the technique of cloaca eversion, was performed injectable anesthesia with tiletamine-zolazepam 5%. Ten minutes after anesthesia, the cloaca has been everted to visualize the internal structures and sex determination. The techniques were performed in blinded trial to avoidinaccurate results. From the eight animals submitted to chromosomal sexing technique, five were identified as male and three as females, reaching 100% agreement when compared with the cloaca eversion technique. Sexing chromosomal technique appeared to cause the least discomfort in the animals evaluated, proving to be a reliable technique for sexualdetermination and favorable to animal welfare. (AU)

Os gansos domésticos utilizados neste experimento eram de vida livre, pertencentes a um lago localizado em uma área urbana e sua população havia aumentado dramaticamente. A necessidade de um projeto com foco na esterilização de alguns machos, para reduzir o crescimento populacional, levou à necessidade de sexagem desses animais. como os gansos domésticos apresentam mínimo dimorfismo sexual, duas técnicas foram testadas: análise citogenética e inspeção da cloaca pós-anestesia. Foram utilizados oito gansos adultos, escolhidos aleatoriamente de um grupo de 80 animais. Eles foram capturados com redes ou manualmente, transportados individualmente e alojados em local apropriado a espera da análise citogenética (três a quatro dias). Para a sexagem cromossomal, foram coletados 2 ml de sangue e a técnica de cultura de linfócitos periféricos foi empregada. As amostras resultantes foram tratadas com kcl hipotônico, fixadas em três trocas de solução de metanol e ácido acético. As lâminas foram preparadas com a técnica padrão e examinadas ao microscópio óptico para observação das metáfases. para a técnica de eversão da cloaca, foi realizada a anestesia injetável com tiletamina-zolazepam 5%. Dez minutos após a anestesia, a cloaca foi evertida para a visualização das estruturas internas e a determinação sexual. AAs técnicas foram conduzidas em duplo cego, para melhor acurácia dos resultados. Dos oito animais submetidos à técnica de sexagem cromossomal, cinco foram identificados como machos e três como fêmeas, alcançando 100% de concordância quando comparada com a técnica de eversão da cloaca. A técnica de sexagem cromossomal aparentou causar o menor desconforto nos animais avaliados, mostrando-se uma técnicaconfiável para determinação sexual e favorável ao bem-estar animal. (AU)

Utilização da LAMP (amplificação isotermal mediada por Loop) como ferramenta para determinação do sexo na espécie eqüina

A sexagem fetal em equinos representa uma abordagem de grande importância para a equideocultura. Através da determinação do sexo do feto, tomadas de decisões por parte do produtor podem ser realizadas quanto ao concepto, como, a manutenção do potro no plantel, venda e determinação do valor da venda, utilização para determinada atividade, entre outros. Algumas técnicas já são utilizadas com essa finalidade, como ultrassonografia, aplicações moleculares, bioquímicas e citogenéticas, porém, o longo tempo empregado nas técnicas, a necessidade de mão-de-obra treinada, e a utilização de equipamentos laboratoriais caros, oneram e restringem a sua realização. O objetivo deste trabalho é desenvolver um protocolo baseado na técnica de LAMP (Amplificação Isoretmal Mediada por Loop) para sexagem de equinos que possa ser aplicada para a sexagem fetal utilizando o DNA circulante no sangue materno. Para isso, foram realizados estudos para a identificação de genes macho específicos, que foram determinantes para o desenvolvimento do trabalho in silico, com desenhos e análise de primers e na otimização das técnicas da Reação em cadeia da Polimerase (PCR) e LAMP. Foi coletado sangue de 10 cavalos e 10 éguas e realizada ainda a quantificação e diluição do DNA obtido para a determinação da quantidade mínima de DNA necessário para obtenção de resultados esperados. Através dessa quantificação a menor concentração adotada para a otimização da etapa colorimétrica na técnica de LAMP foi de 0,004 ng/L de DNA. Após a otimização, foi coletado sangue venoso de 13 éguas prenhas, nos tempos de 30, 60, 90 dias de gestação, e, através da extração de DNA do plasma sanguíneo, foi realizado o teste de diagnóstico do sexo dos fetos por LAMP. Como resultados das otimizações da PCR e LAMP foi verificado que é possível diagnosticar o sexo dos equinos através dos genes escolhidos. No entanto, não se obteve resultado quanto a sexagem fetal utilizando o sangue materno até os 90 dias de gestação. Assim, considera-se a necessidade de realização de testes de diagnóstico fetal com a ampliação do período de coleta do sangue materno, quanto a idade gestacional das éguas, no terço médio e final da gestação.

The equine fetal sexing represents a great important subject for an equine culture. Through the fetal gender determination, producer decisions may be taken regarding the conceptus, as a foal maintenance in a squad, sale and sale price determination, assignment for a given task, and others. Some techniques have already been used for this goal, as ultrasound, molecular, biochemical and cytogenetics applications, however, the long time period required for each technique of those, specialized labor skills needs and expensive laboratory equipment burden this realization. The aim of this study is to develop an equine sexing protocol based on LAMP technique allowed to be applied to fetal sexing using the DNA that flows into maternal blood. Therefore, studies were performed to identify specific male genes that were determinants to in silico work development, with drawings and primers analysis and optimization of Polymerase Chain Reaction (PCR) and LAMP technique. Blood of 10 male and 10 female horses were collected and the quantification and dilution of DNA obtained were done to determinate the minimum amount DNA required to expected results. Through this quantification, the least adopted concentration to the optimization of colorimetric step in a LAMP technique was 0,004 ng/L of DNA. After optimization, venous blood of 13 male inseminated horses were collected, at times of 30, 60, 90 days after and, through the DNA plasma blood extraction, the fetal gender diagnostic test were made by LAMP. As an optimization of PCR and LAMP results were verified that is possible the equine sex diagnosis by the choose genes. However, results about fetal sexing were no obtained using maternal blood until 90 days of pregnancy. So that, the necessity carrying out fetal diagnostic tests with the extension of the maternal blood collection period regarding the gestational age of the mares, for the middle and final third of gestation.

Different ways to evaluate bovine sexed sperm in vitro

Over the years, many techniques for in vitro evaluation of sperm have been developed. Those assessments allow to perform structural, functional and molecular evaluations of the sperm cell. A combination of laboratory tests used simultaneously can provide more accurate information on sperm function and quality because sperm have multiple compartments with different functions. Many of those analyses have been used to assess the effect of sexing by flow cytometry on sperm cellular and molecular levels such as DNA methylation pattern, sperm shape, sperm morphology and capacity to remain viable after thawing. Considering that sexed sperm are submitted to a variety of adverse conditions during sorting, evaluation and identification of the possible damages caused by the sexing process are needed. It is expected that those information will help to develop procedures to improve results when sexed sperm is used. This review is focused on the recent results using structural, functional and molecular tests to evaluate sperm viability after sexing by flow cytometry.

Different ways to evaluate bovine sexed sperm in vitro

Over the years, many techniques for in vitro evaluation of sperm have been developed. Those assessments allow to perform structural, functional and molecular evaluations of the sperm cell. A combination of laboratory tests used simultaneously can provide more accurate information on sperm function and quality because sperm have multiple compartments with different functions. Many of those analyses have been used to assess the effect of sexing by flow cytometry on sperm cellular and molecular levels such as DNA methylation pattern, sperm shape, sperm morphology and capacity to remain viable after thawing. Considering that sexed sperm are submitted to a variety of adverse conditions during sorting, evaluation and identification of the possible damages caused by the sexing process are needed. It is expected that those information will help to develop procedures to improve results when sexed sperm is used. This review is focused on the recent results using structural, functional and molecular tests to evaluate sperm viability after sexing by flow cytometry. (AU)

PCR como técnica para sexagem molecular em aves / PCR as technique for molecular sexing in birds

O presente estudo avaliou a PCR como técnica para sexagem molecular em aves, a qual empregou os primers P2/P8, relacionados com os cromossomos sexuais (Z/W) das aves. Os produtos da PCR foram submetidos à corrida eletroforética, e esta revelou que o tamanho dos pares de base (pb) variou entre as espécies: de 246 a 396 pb para o alelo Z e de 254 a 412 pb para o W. Os resultados mostraram 76 machos (49,31%) e 78 fêmeas (50,69%), totalizando 154 aves. Esta situação propõe desvios meramente casuais ao teste χ² (P > 0,05), pois sendo a variável estudada dicotômica, a relação 1:1 está dentro de um universo amostral. Tais dados mostram que esta técnica, utilizando DNA extraído tanto de penas quanto de sangue, é segura e eficaz para a determinação sexual das aves.(AU)

This study evaluated PCR as a technique for molecular sexing in birds using the primers P2/P8, related to the sex chromosomes (Z/W) of birds. The PCR products under electrophoresis showing the size of the base pairs (bp) varying between species: 246 to 396 bp for the allele Z and 254 to 412 for W. The results identified 76 males (49,31%) and 78 females (50,69%), totalizing 154 birds. This situation proposes casual deviations, Test χ² (p>0.05), as being the dicotomic variable studied the 1:1 ratio is within a sampling universe. The data show that the technique is accurate and effective for sex determination of birds, both using DNA extracted from feathers and blood. (AU)

PCR como técnica para sexagem molecular em aves / PCR as technique for molecular sexing in birds

O presente estudo avaliou a PCR como técnica para sexagem molecular em aves, a qual empregou os primers P2/P8, relacionados com os cromossomos sexuais (Z/W) das aves. Os produtos da PCR foram submetidos à corrida eletroforética, e esta revelou que o tamanho dos pares de base (pb) variou entre as espécies: de 246 a 396 pb para o alelo Z e de 254 a 412 pb para o W. Os resultados mostraram 76 machos (49,31%) e 78 fêmeas (50,69%), totalizando 154 aves. Esta situação propõe desvios meramente casuais ao teste χ² (P > 0,05), pois sendo a variável estudada dicotômica, a relação 1:1 está dentro de um universo amostral. Tais dados mostram que esta técnica, utilizando DNA extraído tanto de penas quanto de sangue, é segura e eficaz para a determinação sexual das aves.

This study evaluated PCR as a technique for molecular sexing in birds using the primers P2/P8, related to the sex chromosomes (Z/W) of birds. The PCR products under electrophoresis showing the size of the base pairs (bp) varying between species: 246 to 396 bp for the allele Z and 254 to 412 for W. The results identified 76 males (49,31%) and 78 females (50,69%), totalizing 154 birds. This situation proposes casual deviations, Test χ² (p>0.05), as being the dicotomic variable studied the 1:1 ratio is within a sampling universe. The data show that the technique is accurate and effective for sex determination of birds, both using DNA extracted from feathers and blood.

AVALIAÇÃO MOLECULAR E FUNCIONAL DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO VITRIFICADOS POR CRYOTOP

O sucesso da criopreservação de embriões bovinos é essencial para melhor aproveitamento de embriões produzidos em excesso, para o estabelecimento de bancos de germoplasma e para comercialização de genética. Neste estudo, foi analisada a alteração na expressão de genes induzida pelo procedimento de vitrificação por Cryotop em blastocistos bovinos usando lâminas de microarranjo EmbryoGENE. Embriões bovinos produzidos in vitro em estágio de blastocisto (144 a 156 horas pós-inseminação) foram vitrificados com Cryotop e não vitrificados (controle). Após 4 horas de cultivo, embriões que re-expandiram ou evoluíram para o estágio de blastocisto expandido foram usados para análises do microarranjo e para quantificação em reação de cadeia de polimerase em tempo real (qPCR). As análises da expressão global revelaram 43 genes diferencialmente expressos em embriões vitrificados comparados aos do grupo controle (p<0,05). Um total de 9 genes foram validados por qPCR, dos quais o FOSL1, envolvido no processo de apoptose, mostrou expressão diferencial (p<0,05) para ambos os métodos, estando super-expresso em embriões vitrificados. Os resultados sugerem que a apoptose tem um papel fundamental na resposta de embriões ao processo de vitrificação. Considerando que a resposta à vitrificação está muito relacionada à qualidade do embrião, levantou-se a hipótese de que a seleção dos embriões para a vitrificação poderia influenciar também a diferença na proporção macho:fêmea, devido a velocidade de desenvolvimento e tolerância ao estresse. Por isso, na segunda etapa deste estudo, foi avaliado o efeito de touros na cinética do desenvolvimento embrionário e na resposta dos embriões à criopreservação. Para isso foram utilizados 5 touros e comparou-se além da produção de embriões, a resposta à criopreservação pelo método Cryotop dos embriões produzidos. Inicialmente, embriões em estágio de blastocisto foram vitrificados (144 a 156 horas pós-inseminação), para avaliação da criotolerância relativa aos touros; enquanto que embriões em estágio de blastocisto expandido foram removidos do cultivo no D6, D7 e D8, e sexados, para avaliação da cinética de desenvolvimento. Na segunda etapa, embriões em estágio de blastocisto expandido foram vitrificados (168 horas pós-inseminação). Todos os embriões (re-expandidos, evoluídos para o estágio de blastocisto eclodido e degenerados), de ambos tratamentos, com 24 horas de cultivo pós-vitrificação foram usados para sexagem. Os resultados sugerem que a escolha do touro, apesar de não interferir na cinética de desenvolvimento embrionário (p>0,05), afeta a produção de blastocistos e também a resposta à criopreservação (p<0,05). E ainda, que os touros que produzem embriões mais crioresistentes nem sempre são os que produzem maior taxa de embriões PIV. Além disso, embriões macho e fêmea têm a mesma capacidade de resposta à vitrificação por Cryotop.

The cryopreservation success of bovine embryos is essential for the better use of excess produced embryos, for the establishment of germplasm banks and genetics commercialization. In this study, gene expression alteration induced by the Cryotop vitrification procedure in bovine blastocysts using EmbryoGENE microarray slides was analyzed. Bovine in vitro produced embryos at blastocyst stage (144 to 156 hours postinsemination) were vitrified with Cryotop and non-vitrified (control). After 4 hours of culture, re-expanded or expanded blastocyst stage embryos were submitted to microarray analyzes and real time polymerase chain reaction (qPCR) quantification. Global gene expression analysis revealed 43 differentially expressed genes in vitrified embryos compared to control group (p <0.05). Nine genes in total were evaluated by qPCR, of which FOSL1, involved in apoptosis process, showed differential expression (p <0.05) for both methods, being overexpressed in vitrified embryos. The results suggest that apoptosis plays a key role in embryos response of vitrification process. Considering that vitrification response is closely related to embryo quality, it was hypothesized that embryos selection for vitrification could also influence the difference in male:female ratio due to developmental speed and stress tolerance. Therefore, in the second stage of this study, the bull´s influence on embryo developmental kinetics and embryo response to cryopreservation was evaluated. For this, five bulls were taken and embryos cryopreservation by Cryotop method was compared in addition to embryo production. Initially, blastocyst stage embryos were vitrified (144 to 156 hours post-insemination), to evaluate the cryotolerance relative to the bulls; while expanded blastocyst stage embryos were removed from culture at D6, D7 and D8, then sexed for developmental kinetics. As a second experiment, expanded blastocyst stage embryos were vitrified (168 hours post-insemination). All embryos (re-expanded, hatched blastocyst stage e, and degenerated) of both treatments, with 24 hours post-vitrification culture were used for sexing. The results suggest that sire´s choice, although not interfering in embryonic development kinetics, affects the blastocysts rates and the cryopreservation response. Besides, bulls producing more cryoresistent embryos are not always the ones that produce the highest IVP embryo rate. In addition, male and female embryos have the same Cryotop vitrification response.

Aplicações da técnica de PCR na reprodução animal / Polymerase Chain Reaction application in animal reproduction

As doenças da reprodução possuem peso importante nos índices de natalidade e de natimortos, na taxa de prenhez e no retorno ao cio, causando inúmeros prejuízos. Com o desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase na medicina veterinária, é possível reduzir essas perdas por meio do diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas, além de esta ser uma tecnologia capaz de viabilizar procedimentos como identificação do sexo embrionário e investigação de paternidade. Este trabalho traz uma revisão de literatura sobre a aplicação desta ferramenta molecular na reprodução animal, abordando sua utilização como suporte a novas biotecnologias, na detecção de diversas doenças e no aumento da eficiência reprodutiva animal.

The reproductive diseases have significant importance in the birth rate, rate of pregnant, return to estrus and stillbirths, causing numerous losses. With the development of polymerase chain reaction in veterinary medicine, it is possible to reduce these losses by the diagnosis of genetic diseases and infectious diseases, in addition to being a technology capable of viabilize procedures for identification of embryonic sex and paternity. This study brings a revision above the application of this molecular tool on Animal Reproduction, approach its utilization like a support the new biotechnologies, to detection of patologies and to improve the efficiency of animal reproduction.

Aplicações da técnica de PCR na reprodução animal / Polymerase Chain Reaction application in animal reproduction

As doenças da reprodução possuem peso importante nos índices de natalidade e de natimortos, na taxa de prenhez e no retorno ao cio, causando inúmeros prejuízos. Com o desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase na medicina veterinária, é possível reduzir essas perdas por meio do diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas, além de esta ser uma tecnologia capaz de viabilizar procedimentos como identificação do sexo embrionário e investigação de paternidade. Este trabalho traz uma revisão de literatura sobre a aplicação desta ferramenta molecular na reprodução animal, abordando sua utilização como suporte a novas biotecnologias, na detecção de diversas doenças e no aumento da eficiência reprodutiva animal.(AU)

The reproductive diseases have significant importance in the birth rate, rate of pregnant, return to estrus and stillbirths, causing numerous losses. With the development of polymerase chain reaction in veterinary medicine, it is possible to reduce these losses by the diagnosis of genetic diseases and infectious diseases, in addition to being a technology capable of viabilize procedures for identification of embryonic sex and paternity. This study brings a revision above the application of this molecular tool on Animal Reproduction, approach its utilization like a support the new biotechnologies, to detection of patologies and to improve the efficiency of animal reproduction.(AU)

Diferenciação sexual e variabilidade genética de Astronotus ocellatus (Oscar)

Estudos que investiguem métodos alternativos para sexagem de espécies de peixe com dimorfismo sexual reduzido, como Astronotus ocellatus, são de extrema importância para facilitar técnicas de manejo da reprodução. Para isso, objetivou-se com esse estudo a determinação da viabilidade da sexagem manual, muito utilizada por piscicultores e aquariofilistas, e a identificação de marcadores moleculares específicos de determinado sexo utilizando marcadores ISSR. Esta última técnica também gerou dados de diversidade e similaridade genética importantes para estudos de conservação. A sexagem manual foi feita por análise macroscópica da papila urogenital. Amostras de nadadeira e gônada de 30 exemplares (±83,32g e ±15,96 cm) de A. ocellatus foram coletadas para extração de DNA e histologia, respectivamente. Para extração foi empregado o protocolo do NaCl. Amostras de qualidade foram utilizadas na amplificação utilizando primer universais ISSR com posterior separação dos fragmentos gerados por eletroforese. O perfil de bandas gerado por cada primer foi genotipado indicando presença e ausência dos fragmentos. A sexagem manual não se apresentou como uma técnica viável para distinção dos sexos nessa espécie, pois se observou 37% de erros durante a seleção. Da mesma forma o perfil de bandas gerado pela amplificação de primers ISSR não permitiu a distinção de um padrão específico para um dos sexos. A porcentagem de polimorfismo encontrada (64,4%) e os índices He e I (0,225 ± 0,030 e 0,375 ± 0,044, respectivamente) sugerem moderada diversidade, indicando que nem sempre populações em cativeiro marcam decréscimo na diversidade genética.

Studies that investigate alternative methods for sexing fish species with reduced sexual dimorphism, as Astronotus ocellatus, are extremely important to facilitate reproduction management techniques. For this, the aim of this study is to determine the feasibility of manual sexing, widely used by fish farmers and hobbyists, and the identification of specific molecular markers for a particular sex using ISSR markers. The latter technique also generates data of genetic diversity and similarity important to conservation studies. Manual sexing was performed by macroscopic analysis of urogenital papilla. Fin and gonad samples of 30 A. ocellatus (±83,32g e ±15, 96 cm) were collected for DNA extraction and histology, respectively. For the DNA extraction was adopted the NaCl protocol. Quality samples were used for amplification using universal ISSR primers with subsequent separation of the generated fragments by electrophoresis. The bands profile generated by each primer was genotyped indicating the presence and absence of the fragments. The manual sexing did not appear as a viable technique to distinguish the sexes in this species, as it was observed 37% of errors during selection. Likewise, the bands profile generated by the amplification with ISSR primers could not distinguish a specific pattern for one sex. The found percentage of polymorphism (64,4%), He and I indices (0.225 ± 0.030 and 0.375 ± 0.044, respectively) suggest moderate diversity, indicating that not always captive populations marked decrease in genetic diversity.

Produção in vivo e identificação do sexo de embriões híbridos Equus caballus x Equus asinus

SILVA, Paula Cardoso de Almeida Silva. Produção in vivo e identificação do sexo de embriões híbridos Equus caballus x Equus asinus. 2015. 84p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária). Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2015. A transferência de embriões e outras biotecnologias reprodutivas são cada vez mais utilizadas para a produção de equinos e de outros animais, entretanto, mesmo com a expansão do mercado de muares e com crescimento do número de animais, as pesquisas relacionadas com a produção desses animais ainda são raras. O presente estudo avaliou as características relacionadas à transferência de embriões, a morfologia e a identificação do sexo de embriões híbridos (muares), verificando sua semelhança ou divergência com as características já conhecidas em equinos. Foram realizadas colheitas de embriões provenientes do cruzamento de éguas com um jumento Pêga, nos dias 6, 7, 8 e 9 após a ovulação, a taxa de recuperação embrionária, e as características relacionadas com a idade, morfologia e diâmetro embrionário foram avaliadas para os diferentes dias. Após essas avaliações, uma parte dos embriões coletados foi seccionada, com uma técnica adaptada onde o corte foi realizado com o auxílio de uma lâmina de bisturi oftalmológico. A maior porção resultante do corte foi destinada para transferência de embriões e a menor parte, juntamente com os embriões inteiros, foram utilizados para verificar a eficiência dos primers SRY e ZFX/ZFY, na análise molecular para a determinação do sexo dos embriões. Os dados foram analisados pelo teste Exato de Fisher, com 5% de significância, exceto o crescimento diário dos embriões que foi analisado através da regressão linear. A taxa de recuperação embrionária total foi de 55,9% (71/127), e para os diferentes dias de colheita D6, D7, D8 e D9, foi 57,1% (28/49), 51% (25/49), 63% (15/24), 60% (3/5), respectivamente. Os embriões coletados apresentavam-se nos seguintes estágios de desenvolvimento, mórulas: 18,3% (13/71); blastocistos iniciais: 26,8% (19/71); blastocistos: 29,6% (21/71); e blastocistos expandidos: 25,3% (18/71). O diâmetro mensurado revelou que o tamanho dos embriões variou entre 147 - 1688µm, a média do diâmetro de todos os embriões recolhidos foi de 438,04µm, e de acordo com os diferentes dias de colheita, o tamanho médio (maior e menor diâmetro) dos embriões foi de: D6 (n = 29) 183,4µm (147 - 253µm), D7 (n = 24) 463,2µm (168 - 886µm), D8 (n = 15) 727,2µm (422 - 1224µm) e D9 (n = 3) 1350,6µm (844 1688µm), e a taxa de crescimento diária foi de 312,7µm. Após a secção e transferência de 23 embriões, apenas uma receptora foi diagnosticada como gestante aos 15 dias, mas aos 30 dias, o embrião tinha sido absorvido. A identificação do sexo através da técnica de PCR, utilizando os primers SRY e ZFx/ZFy foi de 85,9% (61/71), sendo determinado fêmeas: 55,7% (34/61) e machos: 39,3% (27/61). A transferência de embriões é favorável para auxiliar na produção de muares, a taxa de recuperação e as características dos embriões são semelhantes aos embriões equinos. A metodologia de secção dos embriões, inviabilizou o desenvolvimento gestacional, entretanto a biopsia oriunda do corte permitiu a sexagem da maioria dos embriões coletados.

SILVA, Paula Cardoso de Almeida Silva. In vivo production and sex determination of hybrid embryos Equus caballus x Equus asinus. 2015. 84p. Thesis (Doctored in Medicina Veterinária). Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2015. Embryo transfer and other biotechnologies are intensivelyused for equine reproduction and other species as well. Even though there is an expansion of the mule market and an increase in the number of animals, researches working with reproduction of these animals are still scarce. The aim of this study was to evaluate aspects of embryo transfer, embryo morphology and gender identification of hybrid (horses x donkeys) embryos, checking either their similarity or divergence with the characteristics already known of equine embryos. Attempts of embryo collection on Day 6 -9 after OV were performed in mares previously bred with a Pêga donkey. The embryo recovery rates, the characteristics related to age, morphology and embryonic diameter were evaluated. After these assessments, a group of embryos was cut using an adapted technique, where, the cutting process was carried out with the aid of an ophthalmic scalpel blade. The resulting biggest cut portion was used for embryo transfer, and the smallest parts and the others whole embryos to determination of the embryo gender. Data were analyzed using Fisher's exact test, with 5% significance, except the daily growth of embryos, which was analyzed by linear regression. The overall embryo recovery rate was 55,9% (71/127), and for each group D6, D7, D8 and D9, was 57,1% (28/49), 51% (25/49), 63% (15/24) 60% (3/5), respectively. The developmental stage of the collected embryos were, morula: 18.3% (13/71); early blastocysts: 26,8% (19/71); blastocyst: 29,6% (21/71); and expanded blastocysts: 25,3% (18/71). The measured diameter revealed that the size of the embryos ranged from 147 to 1688m, the mean diameter of all collected embryos was 438,04m, and according to different groups, the average size (smallest and largest diameter) of embryos were D6 (n = 29) - 183,4m (147 - 253m), D7 (n = 24) - 463,2m (168 - 886m), D8 (n = 15) - 727,2m (422 - 1224m ) and D9 (n = 3) - 1350,6m (844 - 1688m), and daily growth rate was 312,7m. After the section, the 23 embryos were transfered, only one recipient mare was diagnosed as pregnant at 15 days after ovulation, however after 30 days the embryo was lost. The efficiency of the sex identification by PCR using the primers SRY and ZFX / ZFY was 85,9% (61/71), being 55,7% (34/61) determined as female: and 39,3% (27/61) as male. Embryo transfer has shown to be favorable to aid mule reproduction, whereas the recovery rate and the characteristics of the embryos are similar to equine embryos. Altough, the methodology used to section of embryos had unable the gestational development, the most part of the biopsy derived cutting allowed sexing of the embryos.

Comparação de três técnicas de extração de dna para sexagem molecular em aves / Comparison of three techniques for dna extraction for molecular sexing birds / Comparación De Tres Técnicas De Extracción De Dna Para Determinación Del Sexo De Las Aves Por El Método De Análisis Molecular

Este estudo avaliou o método de análise molecular para a identificação do sexo das aves utilizando três diferentes técnicas de extração de DNA de penas e de sangue. Foi empregado o par de primers alelo-específico, P2/P8, para o gene CHD, localizado nos cromossomos sexuais (Z e W) das aves, pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). As três técnicas de extração de DNA foram eficazes a todas as 16 espécies analisadas, entretanto, não houve diferença na amplificação dos alelos quando comparados no gel. Porém, a extração de DNA pelo método PFE, mostrou maior tempo de conservação do DNA em relação às outras técnicas e melhor custo benefício.(AU)

This study evaluated the method of molecular analysis to the identification of the sex of birds using three different techniques of DNA extraction, from feathers and blood. A pair of allele-specific pair of primers, P2/P8, for gene CHD, located on the sexual chromosomes (Z and W) of birds was used, for polymerase chain reaction (PCR). The three DNA extraction techniques were efficient to all the 16 species analyzed. No difference in the amplification of the alleles when compared to gel was found. However, the DNA extraction by PEF showed a longer time of conservation of DNA in relation to the other techniques, having the better cost- benefit-ratio.(AU)

Este estudio evaluó el método de análisis molecular para identificar el sexo de las aves con tres distintas técnicas de extracción de DNA, de las plumas y sangre. Se utilizó un par de iniciadores alelo-específicos, P2/P8, para el gene CHD, que se encuentra en los cromosomas sexuales (Z y W) de las aves, para la técnica de reacción en cadena de la polimerase (PCR). Las tres técnicas de extracción de DNA fueron efectivas para las 16 especies analizadas, pero no hubo diferencia en la amplificación de los alelos en comparación en el gel. Sin embargo, el método de extracción de DNA por PFE mostró mayor tiempo de conservación de DNA con mejor relación costo-beneficio. (AU)

Sex ratio and morphological characteristics of rufous gnateaters, Conopophaga lineata (Aves, Passeriformes) in Atlantic forest fragments

Unequal sex ratios lead to the loss of genetic variability, decreasing the viability of populations in the long term. Anthropogenic activities often disturb the natural habitats and can cause alterations in sex ratio and morphological characteristics of several species. Forest fragmentation is a major conservation concern, so that understanding its effects in natural populations is essential. In this study, we evaluated the sex ratio and the morphological characteristics of Rufous Gnateaters (Conopophaga lineata (Wied, 1831)) in small and large forest fragments in Minas Gerais, Brazil. Birds (n = 89) were sexed by plumage characteristics and molecular markers. The molecular analysis showed that plumage is not a totally reliable method for sexing Rufous Gnateaters. We observed that sex ratio did not differ between large and small forest fragments, but birds in small fragments had larger wings and tarsus. Wing and tarsus changes may affect the movement ability of individuals within and among forest fragments. In conclusion, Rufous Gnateaters have been able to survive in both small and large Atlantic rain forest fragments without altering their sex ratio, but morphological changes can be prejudicial to their long term survival.

A razão sexual desigual pode levar à perda de variabilidade genética, diminuindo a viabilidade das populações em longo prazo. Atividades antrópicas causam alterações nos hábitats e podem causar mudanças na razão sexual e na morfologia de muitas espécies. A fragmentação florestal é uma grande preocupação em conservação e entender os seus efeitos em populações naturais é fundamental. Assim, neste estudo buscamos investigar a razão sexual e algumas características morfológicas do chupa-dente (Conopophaga lineata (Wied, 1831)) em fragmentos pequenos e grandes no Estado de Minas Gerais, Brasil. As aves (n = 89) foram sexadas através de características da plumagem e através de marcadores moleculares. Marcadores moleculares indicaram que a identificação por plumagem não é um método totalmente confiável para essa espécie. Observamos que a razão sexual não difere entre os fragmentos grandes e pequenos, mas os indivíduos dos fragmentos pequenos apresentaram asas e tarsos maiores. Modificações nas asas e tarsos podem causar alterações no deslocamento dos indivíduos dentro e entre os fragmentos. Portanto, os chupa-dentes têm sido capazes de sobreviver mesmo nos pequenos fragmentos de Mata Atlântica sem sofrer alterações na razão sexual. Porém, as diferenças morfológicas apresentadas podem ser prejudiciais para a sobrevivência da espécie a longo prazo.

Sex ratio and morphological characteristics of rufous gnateaters, Conopophaga lineata (Aves, Passeriformes) in Atlantic forest fragments

Unequal sex ratios lead to the loss of genetic variability, decreasing the viability of populations in the long term. Anthropogenic activities often disturb the natural habitats and can cause alterations in sex ratio and morphological characteristics of several species. Forest fragmentation is a major conservation concern, so that understanding its effects in natural populations is essential. In this study, we evaluated the sex ratio and the morphological characteristics of Rufous Gnateaters (Conopophaga lineata (Wied, 1831)) in small and large forest fragments in Minas Gerais, Brazil. Birds (n = 89) were sexed by plumage characteristics and molecular markers. The molecular analysis showed that plumage is not a totally reliable method for sexing Rufous Gnateaters. We observed that sex ratio did not differ between large and small forest fragments, but birds in small fragments had larger wings and tarsus. Wing and tarsus changes may affect the movement ability of individuals within and among forest fragments. In conclusion, Rufous Gnateaters have been able to survive in both small and large Atlantic rain forest fragments without altering their sex ratio, but morphological changes can be prejudicial to their long term survival.

A razão sexual desigual pode levar à perda de variabilidade genética, diminuindo a viabilidade das populações em longo prazo. Atividades antrópicas causam alterações nos hábitats e podem causar mudanças na razão sexual e na morfologia de muitas espécies. A fragmentação florestal é uma grande preocupação em conservação e entender os seus efeitos em populações naturais é fundamental. Assim, neste estudo buscamos investigar a razão sexual e algumas características morfológicas do chupa-dente (Conopophaga lineata (Wied, 1831)) em fragmentos pequenos e grandes no Estado de Minas Gerais, Brasil. As aves (n = 89) foram sexadas através de características da plumagem e através de marcadores moleculares. Marcadores moleculares indicaram que a identificação por plumagem não é um método totalmente confiável para essa espécie. Observamos que a razão sexual não difere entre os fragmentos grandes e pequenos, mas os indivíduos dos fragmentos pequenos apresentaram asas e tarsos maiores. Modificações nas asas e tarsos podem causar alterações no deslocamento dos indivíduos dentro e entre os fragmentos. Portanto, os chupa-dentes têm sido capazes de sobreviver mesmo nos pequenos fragmentos de Mata Atlântica sem sofrer alterações na razão sexual. Porém, as diferenças morfológicas apresentadas podem ser prejudiciais para a sobrevivência da espécie a longo prazo.