Resumo

Morcegos albergam centenas de espécies virais e podem atuar como reservatórios naturais de diversos vírus. O Brasil é o segundo país com o maior número de espécies de morcegos, no entanto, pouco se sabe quanto a diversidade viral presente em morcegos do país, especialmente quanto aos vírus de DNA. Esse estudo teve como objetivo investigar a presença do vírus das famílias Papillomaviridae e Adenoviridae em amostras de suabes orais e anais de morcegos coletados na Mata Atlântica, através da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento Sanger, contribuindo para o conhecimento da diversidade viral e a epidemiologia desses vírus. Vinte e quatro sequências parciais, 16 de adenovírus e oito de papilomavírus, foram obtidas. Pela primeira vez foi detectada a presença de papilomavírus em Carollia perspicillata, Sturnira lilium e Myotis nigricans e de adenovírus em Phyllostomus discolor, Eptesicus diminutus e Myotis riparius. As análises filogenéticas mostraram que os adenovírus de morcegos apresentavam alta diversidade genética e estão presentes em diferentes espécies de morcegos do Brasil. Quanto aos papilomavírus, as sequências obtidas se agruparam com os gêneros Dyotaupapilomavirus, Dyoupsilonpapilomavirus, Dyopsipapillomavirus e Betapapillomavirus. Adicionalmente, investigamos a presença de coronavírus em morcegos do Brasil, no qual 13 amostras foram positivas. As sequências obtidas agruparam-se com sequências pertencentes a quatro subgêneros do gênero Alphacoronavirus. Também foi detectado pela primeira vez coronavírus no morcego Phyllostomus hastatus. Esses resultados contribuem para o conhecimento da diversidade viral em morcegos e ressalta a importância da ampliação da vigilância epidemiológica para diferentes vírus. Vigilância de Vírus; Coronavírus; Diversidade Viral; Morcegos Neotropicais; Pernambuco; Santa Catarina;

Bats harbor hundreds of viral species and can act as natural reservoirs for several viruses. Brazil is the second country with the largest number of bat species, however little is known about the viral diversity present in bats in the country, especially DNA viruses. This study aimed to investigate the presence of the virus from the Papillomaviridae and Adenoviridae families in samples of oral and anal swabs of bats collected in the Atlantic Forest, through the polymerase chain reaction (PCR) and Sanger sequencing, contributing to the knowledge of the viral diversity and the epidemiology of these viruses. Twenty-four partial sequences, 16 from adenovirus and eight from papillomavirus, were obtained. For the first time, the presence of papillomavirus was detected in Carollia perspicillata, Sturnira lilium and Myotis nigricans and of adenovirus in Phyllostomus discolor, Eptesicus diminutus and Myotis riparius. Phylogenetic analyzes showed that adenoviruses from bats had high genetic diversity and are present in different species of bats in Brazil. As for the papillomaviruses, the sequences obtained were grouped with the genera Dyotaupapillomavirus, Dyoupsilonpapillomavirus, Dyopsipapillomavirus and Betapapillomavirus. Additionally, we investigated the presence of coronavirus in bats from Brazil, in which 13 samples were positive. The sequences obtained were grouped with sequences belonging to four subgenera of the Alphacoronavirus genus. Coronavirus was also first detected in Phyllostomus hastatus. These results contribute to the knowledge of viral diversity in bats and highlights the importance of expanding epidemiological surveillance for different viruses.

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Background: Several treatments for oral papillomatosis in dogs, with satisfactory results, have already been described in the literature. However, there is need for further studies regarding remission time, association and exposure to drugs, side effects, cost-effectiveness and reproducibility of results. Autohemotherapy (AHT) is a therapeutic technique increasingly used in veterinary medicine that has been providing satisfactory clinical results to treat several pathologies. The procedure consists of removing blood by intravenous puncture that is immediately re-administered via intramuscular, subcutaneous, intravenous or intradermal. Although the empirical isolated use via intramuscular reached excellent results in routine medical treatment of dogs and since few studies and protocols have been described for this species, many times the treatment is based on the experience with the bovine papillomatosis. To this end, this report describes a case of canine oral papillomatosis treated with autohemotherapy (AHT), emphasizing the dosage and clinical evolution of the case. Case: A one-year-old mongrel dog rescued from the street eight months earlier was treated. The animal was thin resulting from the small food amount ingested due to feeding difficulty, infested with ticks, had bad breath and few small warts on the lips, which, after five months, grew and multiplied, and were distributed throughout the oral cavity. The animal clinical history led to papillomatosis diagnosis, which was confirmed by cytological and histopathological exams. The AHT treatment consisted of taking 5 mL of whole blood without EDTA and immediately injecting this volume intramuscularly, every four days until the total remission of the clinical symptoms. Every four days, the papilloma fall off, and involution processes were recorded through a detailed macroscopic analysis of the warts […]

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O carcinoma de células escamosas (CCE) é uma neoplasia maligna oriunda dos queratinócitos altamente prevalente em equinos, afetando frequentemente o pênis e prepúcio. Sua contrapartida benigna, o papiloma, também é comum na região genital, e pode ser induzida pela infecção por papilomavírus (PVs). Embora se saiba que os papilomas genitais de equinos podem ter uma origem viral, a etiologia dos CCEs genitais não está completamente elucidada. Recentemente foi detectada a presença de um novo PV, o papilomavírus Equus caballus tipo 2 (EcPV-2), em meio a CCEs genitais de equinos machos. Acredita-se, a partir disso, que possa existir uma associação entre a infecção por EcPV-2 e a gênese de alguns papilomas e CCEs genitais em equinos. Desde a sua descoberta em 2010, o EcPV-2 já foi descrito em diferentes países da América do Norte e Europa, no entanto, sem relatos no Brasil. Com base nisso, o objetivo desse trabalho é investigar a presença de EcPV-2 em meio a CCEs e papilomas genitais de equinos machos brasileiros. Foram investigados 40 CCEs e papilomas acometendo pênis e/ou prepúcio recebidos na rotina de biópsias e necropsias do Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) e na rotina de biópsias do setor de Patologia Veterinária (SPV) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) (2000-2021). Dados relacionados à raça e à idade foram retirados dos laudos histopatológicos. Os blocos de parafina foram recuperados para confecção de lâminas de Hematoxilina e Eosina, imuno-histoquímica (IHQ) para PV (40/40) e reação de polimerase em cadeia (PCR) utilizando um par de primers específico para PV (40/40) e um par de primers específico para EcPV-2 (40/40). Casos positivos foram sequenciados. Dos casos incluídos, 34 eram CCEs invasivos, três eram carcinomas in situ (CIS) e três eram papilomas. A mediana de idade foi de 13,2 anos, e dos equinos com status reprodutivo informado, três eram garanhões e dois eram castrados. A raça Crioula foi a mais representada (16/40). Todos os tumores apresentaram graus variáveis de inflamação linfoplasmocítica, sendo que dois CCEs apresentaram invasão vascular linfática e dois apresentaram invasão sanguínea. Em meio aos carcinomas, ou na mucosa adjacente, também se observaram ceratinócitos tumefeitos, degenerados, com citoplasma fracamente basofílico, ocasionalmente contendo um vacúolo claro, e um núcleo grande. Inclusões estavam ausentes em todos os casos. Na IHQ utilizando anticorpo anti-BPV-1, quatro casos (dois CCEs, um CIS e um papiloma) tiveram imunomarcação positiva, observada no núcleo de ceratinócitos neoplásicos (CIS e papiloma) ou no epitélio adjacente ao tumor (CCEs). A análise molecular revelou sete casos positivos para PV e cinco desses positivos para EcPV-2. Três casos positivos para EcPV-2 e dois casos negativos para EcPV-2 e positivos para PV foram sequenciados, sendo todos compatíveis com EcPV-2. A partir desses resultados, podemos confirmar a presença de EcPV-2 em equinos brasileiros. Espera-se que esse estudo venha a estimular novas pesquisas relacionadas a esse novo vírus, contribuindo, por fim, para o melhor conhecimento das formas de transmissão do vírus, e para o desenvolvimento de medidas preventivas eficazes.

Squamous cell carcinoma (SCC) is a malignant neoplasm arising from keratinocytes. It is highly prevalent in horses, often affecting the penis and prepuce. Its benign counterpart, the papilloma, is also common in the genital region, and can be induced by infection with papillomaviruses (PVs). Although it is known that equine genital papillomas may have a viral origin, the etiology of genital SCCs is not fully understood. The presence of a new PV, Equus caballus papillomavirus type 2 (EcPV-2), was recently detected among genital SCCs in male horses. Based on this, it is believed that there may be an association between EcPV-2 infection and the genesis of some equine genital papillomas and SCCs. Since its discovery in 2010, EcPV-2 has been described in different countries in North America and Europe, however, with no reports in Brazil. The objective of this research is to investigate the presence of EcPV-2 within genital papillomas and SCCs of male Brazilian horses. We investigated 40 SCCs and papillomas involving the penis and/or prepuce, diagnosed in the biopsy or necropsy routine of the Laboratório de Patologia Veterinária (LPV), Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), and in the biopsy routine of the Setor de Patologia Veterinária (SPV), Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) (2000-2021). Data related to breed and age were taken from the histopathological reports. The paraffin blocks were recovered for the preparation of Hematoxylin and Eosin slides, immunohistochemistry (IHC) for PV (40/40) and polymerase chain reaction (PCR) using a pair of primers specific for PV (23/40) and another pair specific for EcPV-2 (40/40). Positive cases were sequenced. Of the included cases, 34 were invasive SCCs, three were carcinomas in situ (CIS), and three were papillomas. The median age was 13.2 years, and of the horses with informed reproductive status, three were stallions and two were geldings. The breed Crioula was the most represented (16/40). All tumors showed varying degrees of lymphoplasmacytic inflammation, with two SCC's showing lymphatic vascular invasion and two showing blood invasion. Within the carcinomas, or in the tumor-adjacent mucosa, swollen, degenerated keratinocytes with a weakly basophilic cytoplasm, occasionally containing a clear vacuole and a large nucleus, were ocasionally observed. Viral inclusions were absent in all cases. In the IHC using anti-BPV-1 antibody, four cases (two SCCs, one CIS and one papilloma) had positive immunostaining, observed in the nucleus of neoplastic keratinocytes (CIS and papilloma) or in the epithelium adjacent to the tumor (SCCs). PCR revealed seven positive cases for PV and five of these positive for EcPV-2. Three EcPV2-positive cases and two PVpositive and EcPV2-negative were sequenced, and compatible with EcPV-2. With this study, we can confirm the presence of EcPV-2 in Brazilian horses. We hope this study stimulates further research related to this new virus, ultimately contributing to a better understanding of transmission routes, and to the development of effective preventive measures

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A placa aural é uma dermatopatia associada à quatro Equus caballus papillomavirus (EcPVs). Até o momento, o DNA de EcPVs não foi identificado em amostras de placa aural fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE). O objetivo deste estudo foi otimizar um método para a detecção dos quatro tipos de EcPVs em 21 amostras FFPE usando a PCR. O DNA dos EcPVs foram detectados em 11 amostras (52.4%). O DNA do EcPV4 foi detectado em 38.1% (8/21) e do EcPV3 em 4.8% (1/21) das amostras. Coinfecção foi identificada em duas amostras (9.5%); EcPV4 e 5 foram detectados simultaneamente em uma amostra, enquanto o DNA dos EcPV4 e 6 foi detectado em outra. A especificidade do DNA dos papilomavírus equinos foi avaliada por sequenciamento gênico direto, que confirmou a especificidade dos produtos. A metodologia de PCR proposta possibilita o diagnóstico dos EcPV3, 4, 5 e 6 em amostras FFPE de placa aural equina.(AU)

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High-risk human papillomaviruses (HR-HPV) are considered necessary for the development of cervical cancer. Furthermore, there is no doubt that some types of oral squamous cell carcinoma are associated with HR-HPV. The epidemiology of oral HPV infections in healthy subjects remains unclear due to a lack of knowledge. The objective of this study was to investigate the epidemiology of human papillomavirus infections of the oral mucosa without pathology. A cross-sectional study was performed; samples from 390 women seeking prenatal care, Pap smears, family planning or gynecological diseases were studied. Oral cells were collected by direct swab sampling. Information regarding sociodemographic status, sexual behavior, infectious diseases, contraceptive history and tobacco and alcohol consumption were obtained through direct interviews. HPV and genotypes were detected by type-specific polymerase chain reaction. Our results revealed that 14% of the women studied had an oral HPV infection. Women ≤ 20 years of age had the highest HPV prevalence (24.5%). In total, seven genotypes were identified, including the high-risk genotypes 16, 18, 58 and 59 and the low-risk genotypes 6, 81 and 13, the latter of which is a type exclusive to oral mucosa. Sexual behavior was not associated with the presence of genital HPV types in the oral mucosa. Genital HPV types were present in the oral mucosa of women without associated clinical manifestations; however, sexual behavior was not associated with infection, and therefore others routes of transmission should be explored.

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A papilomatose canina é uma doença viral espécie-específica que pode ser causada por diversos tipos de vírus. Sua transmissão é feita por contato direto e também indireto devido à resistência dos vírus ao meio ambiente. A manifestação clínica mais frequente é a papilomatose oral que acomete principalmente cães jovens ou cães adultos imunossuprimidos. Após um período de incubação de quatro semanas, os animais acometidos pela papilomatose viral podem ou não apresentar sintomatologia dependendo de seu estado imunológico. As lesões podem acometer toda a mucosa oral, lábio, língua e orofaringe e normalmente regridem após um período de um a dois meses. Alguns animais podem apresentar quadros de maior duração ou recidivas. Pela sua característica autolimitante, o tratamento cirúrgico com remoção das lesões é indicado apenas nos animais que apresentam dificuldade de apreensão e ingestão de alimentos. Outros tratamentos medicamentosos vêm sendo apresentados para a resolução mais rápida do quadro, porém os estudos ainda não são comprobatórios de sua eficácia.

Canine papillomatosis is a species-specific viral disease that can be caused by several types of virus. Its transmission is made by direct and also indirect contact due to virus resistance in environment. The most common clinical manifestation is oral papillomatosis, which affects mainly young dogs or immunosuppressed adult dogs. After an incubation period of 4 weeks, the animais affected by viral papillomatosis may or may not present symptomatology depending on their immunological status. Lesions may involve the entire oral mucosa, lip, tongue and oropharynx and usually regress after a period of one to two months. Some animais may present persistent and of repeatedlyrecurrent oral papillomas. Because of its self-limiting characteristics, surgical treatment with removal of lesions is indicated only in animais that present difficulties in seizure and ingestion of food. Other drug treatments have been presented for the quicker resolution of the condition, but the studies have not yet prove their efficacy.

La papilomatosis canina es una enfermedad viral de tipo especie específico que puede ser causada por diversos tipos de virus. Su transmisión es hecha por contacto directo y también indirecto debido a la resistencia de los virus ai medio ambiente. La manifestación clínica más frecuente es la papilomatosis oral que afecta principalmente los perros jóvenes o perros adultos inmunosuprimidos. Después de un período de incubación de 4 semanas, los animales acometidos por la papilomatosis viral pueden o no presentar sintomatología dependiendo de su estado inmunológico. Las lesiones pueden acometer toda Ia mucosa oral, ellabio, la lengua y la orofaringe y normalmente se remontan después de un período de uno a dos meses. Algunos animales pueden presentar cuadros de mayor duración o recidivas. Por su característica autolimitante, el tratamiento quirúrgico con remoción de las lesiones es indicado sólo en los animales que presentan dificultad de aprehensión e ingestión de alimentos. Se han presentado otros tratamientos medicamentosos para la resolución más rápida dei cuadro, pero los estudios aún no son comprobantes de su eficacia.

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Os papilomavírus constituem uma extensa família de vírus associados a lesões epiteliotrópicas, assim como acometem o tecido mucoso onde podem causar tumores benignos que podem evoluir para a malignização. A papilomatose bovina é uma doença economicamente relevante, já que há a desvalorização dos animais a serem comercializados devido à aparência e depreciação do couro. Em humanos, a identificação dos tipos de papilomavírus (HPV) envolvidos bem como o relato de co-infecções são bem estabelecidos. Já foram descritos na literatura mais de 200 tipos de HPVs, o que ainda é pouco explorado na área da Medicina Veterinária, em que somente 21 tipos de papilomavírus bovino (BPV) foram caracterizados até o momento. A presente dissertação visou investigar a diversidade de BPV presentes em um papiloma de um bovino oriundo do Estado de Rondônia. A partir do DNA extraído da lesão, foi realizada a rooling circle amplification (RCA) seguida do sequenciamento de última geração (Ilumina MiSeq). O emprego dessas metodologias culminou na identificação do BPV13, que atualmente é bem caracterizado, e de três prováveis novos tipos de BPVs que haviam sido descritos em um único estudo recente. Estes resultados confirmam a presença de co-infecção em lesões de papilomatose bovina e demonstram que estas técnicas possibilitaram a detecção de espécies que não são identificadas pelos métodos convencionais. Este conhecimento sobre a diversidade de BPV servirá de base para o melhor entendimento da biologia do vírus e para a geração de vacinas profiláticas ou terapêuticas eficazes.

Papillomaviruses are an extensive family of viruses associated with epitheliotropic lesions, as well as affecting mucosal tissue where they can cause benign tumors that may progress to malignancy. Bovine papillomatosis is an economically relevant disease, since there is a devaluation of the animals to be marketed due to the appearance and depreciation of the leather. In humans, the identification of the types of papillomavirus (HPV) involved as well as the reporting of co-infections is well established. More than 200 types of HPV have been described in the literature, which is still little explored in the area of Veterinary Medicine, in which only 21 types of bovine papillomavirus (BPV) have been characterized. This study aimed to investigate the diversity of BPV present in a papilloma of a bovine animal from the State of Rondônia. From the DNA extracted from the lesion, the rooling circle amplification (RCA) was performed followed by the last generation sequencing (Ilumina MiSeq). The use of these methodologies culminated in the identification of BPV13, which is currently well characterized, and of three putative new BPVs types that had been described in a single recent study. These results confirm the presence of co-infection in bovine papillomatosis lesions and demonstrate that these techniques enabled the detection of species that are not identified by conventional methods. This knowledge on BPV diversity will serve as a basis for a better understanding of the biology of the virus and for the generation of effective prophylactic or therapeutic vaccines.

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Resumo Os papilomavírus (PV) são vírus epiteliotrópicos que infectam um grande número de vertebrados, incluindo os mamíferos, aves, répteis e peixes. Eles são vírus não envelopados, compostos de um capsídeo estruturado pelas proteínas L1 e L2, que abriga uma molécula de DNA dupla fita e circular. Os PV são vírus oncogênicos que causam lesões benignas e malignas na epiderme e mucosas de seus hospedeiros. Em bovinos, o papilomavírus bovino (BPV) causa papilomas extensivos em animais suscetíveis. Apesar das infecções por BPV apresentarem alta morbidade e baixa mortalidade, elas causam prejuízos econômicos aos produtores, que frequentemente descartam animais precocemente devido à extensão e o local das lesões. Atualmente, 23 tipos de BPV foram classificados e caracterizados, contrastando com o alto número de papilomavírus humanos (HPV) sequenciados e caracterizados (204). Desta forma, acredita-se que a diversidade genética dos BPV seja provavelmente similar à diversidade genética dos HPV existentes. Este trabalho objetivou investigar a diversidade genética dos BPV existentes na região norte e sul do Brasil, assim como realizar o sequenciamento completo de novos tipos virais e tipos já descritos e, desta forma, contribuir para futuros estudos epidemiológicos, filogenéticos e de caracterização genética de BPV. Ainda, esta tese objetivou prover uma atualização da atual epidemiologia, classificação e características genéticas dos PV de ruminantes, com o foco principal nos BPV. Metodologias convencionais (baseadas em amplificação de ácidos nucléicos virais por PCR utilizando oligonucletotídeos específicos para PV) e de última geração (amplificação randômica de genomas circulares e sequenciamento de alta eficiência) foram empregadas, proporcionando a identificação dos vírus circulantes em rebanhos da região Norte e da região Sul do país. Nove novos tipos de BPV foram sequenciados e caracterizados neste estudo (BPV16, 17, 18, 19, 20, 21 e os prováveis BPV24, 25 e 26), evidenciando a grande diversidade genética de BPV presente na região amazônica quando comparada com amostras do sul do país. Além disso, o sequenciamento de genomas completos de outros tipos virais já descritos também foi realizado. Esses resultados proporcionaram uma visão geral dos tipos virais presentes em rebanhos de dois extremos do Brasil, assim como possibilitou a identificação de prováveis novos tipos e a caracterização de novos tipos de BPV. Esses resultados são importantes para entender a evolução e a distribuição dos papilomavírus, bem como para o desenvolvimento de estudos vacinais, que envolvem papilomavírus humano e bovino. Adicionalmente, podemos verificar que pesquisas envolvendo ruminantes selvagens são esporádicas, no entanto seriam importantes para o melhor entendimento da biologia e das relações intra e interespecíficas dos PV.

Papillomaviruses (PV) are epitheliotropic viruses that infect a large number of vertebrates, including mammals, birds, reptiles and fish. They are non-enveloped viruses composed of a capsid that is structured by the L1 and L2 proteins, which harbous a circular double-stranded DNA molecule. PVs are oncogenic viruses that cause benign and malignant lesions in the epidermis and mucosa of their hosts. In cattle, bovine papillomavirus (BPV) causes extensive papillomas in susceptible animals. Although BPV infections present high morbidity and low mortality, they cause economic losses to producers, who often discard animals prematurely because of the extent and location of the lesions. Currently, 23 types of BPVs have been classified and characterized, contrasting with the high number of human papillomaviruses (HPVs) sequenced and characterized (204). Therefore, it is believed that the genetic diversity of BPV is probably similar to the genetic diversity of existing HPV. This work aimed to investigate the genetic diversity of BPV in the Northern and Southern regions of Brazil, as well as complete sequencing of new viral types and types already described, and thus contribute to future epidemiological, phylogenetic and genetic characterization studies of BPV. Furthermore, this thesis aimed to provide an update of the current epidemiology, classification and genetic characteristics of ruminant PV, with the main focus on BPV. Conventional methodologies (based on amplification of viral nucleic acids by PCR using specific oligonucleotides for PV) and last generation methodologies (random amplification of circular genomes and high efficiency sequencing) were employed, providing the identification of circular viruses in herds of the North and South regions of the country. Nine new types of BPV were sequenced and characterized in this study (BPV16, 17, 18, 19, 20, 21 and the putatives BPV24, 25 and 26), evidencing the great genetic diversity of BPV present in the Amazon region when compared with samples from the South region. In addition, sequencing of complete genomes from other viral types already described has also been performed. These results provided an overview of the viral types present in Brazilian herds from two distant regions, as well as the identification of potential new types and the characterization of new types of BPV. These results are important to understand the papillomavirus evolution and distribution as well as to development of vaccinal studies, which involve human and bovine papillomaviruses. Additionally, we could verify that researches involving wild ruminants are sporadic, but it would be important for the better understanding of the biology as well as the intra and interspecific of PV relationship.

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A retrospective study of 24 cases of papillomas in dogs was performed from January 2001 to March 2011. Additionally, immunohistochemistry (IHC) was used to characterize and evaluate the samples. We found that disease was observed more in mixed breed dogs, ages ranging from 6 months to 10 years (mean 3.1 years), and there was no gender predilection. The main lesion sites were the skin (75%), lips (16.7%), and eyelids (8.3%). Upon histological evaluation, we observed papillary exophytic proliferation of squamous epithelium and papillary endophytic proliferation (inverted) in 87.5% and 12.5% of cases, respectively. The tumors were characterized by spinous layer hyperplasia (87.5%) with koilocytes (70.8%) and intranuclear pale basophilic inclusions bodies (8.3%), prominent granular layer with large amounts of keratohyalin granules (95.8%), and hyperkeratosis in the stratum corneum (100%). Positive immunostaining for Papillomavirus was found in 83.3% of cases, which were distributed between the granular layer and the stratum corneum. These findings indicate the following: that papillomas in dogs are caused by Papillomavirus, the viral cytopathic effect induces epithelial lesions, viral particles are found inside the cell nuclei, and inclusions bodies are rare.

Foi realizado um estudo retrospectivo de 24 casos de papilomas em cães diagnosticados no período de janeiro 2001 a março de 2011, bem como a sua caracterização imuno-histoquímica (IHQ). Cães sem raça definida foram os mais afetados, a idade média foi de 3,1 anos, com variação de 6 meses a 10 anos e não houve predileção sexual. Quanto à localização das lesões, 75,0% estavam na pele, 16,7% no lábio e 8,3% em pálpebra. Na avaliação histológica havia proliferação papilar exofítica do epitélio escamoso em 87,5% e papilar endofítica (invertido) em 12,5%. O tumor era caracterizado por hiperplasia do estrato espinhoso (87,5%) com coilócitos (70,8%) e inclusões intranucleares basofílicas pálidas (8,3%); o estrato granular estava proeminente com grande quantidade de grânulos de querato-hialina (95,8%); e havia hiperqueratose do estrato córneo (100%). Na avaliação IHQ para Papillomavirus houve marcação nos estratos granuloso e córneo em 83,3%. Estes achados indicam que os papilomas em cães são causados por Papillomavirus, as lesões epiteliais são decorrentes do efeito citopático viral, as partículas virais estão no núcleo das células e corpúsculos de inclusão são raros.

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Papilomavírus (PV) são vírus oncogênicos que acometem diversas espécies de mamíferos, incluindo o homem. São capazes de induzir tumores benignos (papilomas ou verrugas) e malignos (condilomas) em epitélio cutâneo e mucoso. O genoma viral é constituído por até 10 fases abertas de leitura (ORFs), sendo que a ORF L1, sequência de nucleotídeos mais conservada entre os PVs, é utilizada para a identificação de novos tipos virais. Este estudo teve como objetivo identificar os tipos de papilomavírus bovino (BPV) presentes em cinco amostras de papilomas provenientes de um rebanho bovino leiteiro da região do norte pioneiro do estado do Paraná e determinar a sua classificação taxonômica por meio de comparação dessas sequências com as sequências de nucleotídeos de outros PVs previamente identificados e depositados em base pública de dados (GenBank). O par de primers degenerados FAP54/59 foi utilizado em reação de PCR para a triagem das amostras de papilomas. Os fragmentos de 480 pb obtidos das cinco amostras analisadas, permitiram a identificação de cinco diferentes tipos de BPV no mesmo rebanho, sendo estes BPV10, BPV6 e dois subtipos mais similares a BPV11 e BPV3. A quinta amostra, denominada BPV/BRUEL8, foi identificada no terceiro animal analisado, a partir de uma amostra de papiloma cutâneo. A análise da sequência gerada com o emprego do primeiro par de primers indicou que a cepa BPV/BR-UEL8 apresentava apenas 77% de identidade com o isolado 7Z (KT315748). Adicionalmente, foram empregados primers específicos do gene L1 de BPV6 para a obtenção da sequência completa do gene L1 do provável novo tipo. O produto da PCR foi submetido à clonagem e sequenciamento. A análise filogenética envolvendo a sequência completa da ORF L1 com 1.521 pb possibilitou identificar que a cepa BPV/BR-UEL8 pertence ao gênero Xipapillomavirus com maior identidade (apenas 75,1% identidade de nt) com BPV15. Este resultado possibilitou caracterizar a cepa BPV/BR-UEL8 como um provável novo tipo viral. Nos últimos anos, estudos que avaliaram características moleculares de BPV revelaram grande diversidade de tipos virais envolvidos em infecções singulares e, principalmente, em infecções mistas. A identificação de novos tipos virais pode auxiliar na compreensão da patogenia da doença e na avaliação de novos tratamentos, assim como no desenvolvimento de vacinas eficazes contra a papilomatose bovina

Papillomaviruses (PV) are oncogenic viruses that affect various mammalian species, including man. They can induce benign tumors (papillomas or warts) and malignant tumors (condylomas) in cutaneous and mucosal epithelium. The viral genome consists of up to 10 open reading frames (ORFs), and the L1 ORF, the most conserved nucleotide sequence among the PVs, is used to identify new viral types. The aim of this study was to identify the bovine papillomavirus (BPV) types present in five samples of papillomas from a dairy cattle herd at pioneer northern region of the state of Paraná and to determine their taxonomic classification by comparing these sequences with the sequences of nucleotides from other PVs previously identified and deposited in a public database (GenBank). The degenerate primer pair FAP54/59 was used in PCR reaction for the screening of papillomavirus samples. The 480 bp fragments obtained from the five analyzed samples allowed the identification of five different types of BPV in the same herd, being these BPV10, BPV6 and two subtypes more similar to BPV11 and BPV3. The fifth sample, named BPV/BR-UEL8, was identified in the third animal analyzed from a cutaneous papilloma sample. Analysis of the sequence generated using the first pair of primers indicated that the BPV/BR-UEL8 strain showed only 77% identity with the 7Z isolate (KT315748). In addition, specific primers of BPV6 L1 gene were used to obtain the complete L1 gene sequence of the putative new type. The PCR product was subjected to cloning and sequencing. The phylogenetic analysis involving the complete sequence of the L1 ORF with 1.521 bp allowed to identify that the BPV / BR-UEL8 strain belongs to the genus Xipapillomavirus with identity (only 75.1% identity of nt) with BPV15. This result made it possible to characterize the BPV/BR-UEL8 strain as a putative new viral type. In recent years, studies that have evaluated molecular characteristics of BPV revealed a wide variety of viral types involved in unique infections and, especially, mixed infections. The identification of new viral types can help to understand the pathogenesis of the disease and the evaluation of new treatments, as well as in the development of effective vaccines against bovine papillomatosis.

Resumo

Os papilomavírus (PV) são vírus epiteliotrópicos e constituem um grande grupo geneticamente diverso da família Papillomaviridae que infecta diferentes espécies de mamíferos, répteis e aves. Estes vírus caracterizam-se por sua propriedade oncogênica, sendo responsáveis pela indução de tumores benignos e malignos nos epitélios cutâneo e mucoso de suas espécies hospedeiras. Nos bovinos, a papilomatose causa importantes prejuízos econômicos à pecuária de corte e leiteira, dentre as quais destacam-se as infecções secundárias, a dificuldade de amamentação do bezerro, a depreciação do couro e o descarte precoce de animais e, ainda, no caso de rebanhos de aptidão leiteira, a papilomatose mamária ocasiona dificuldade de ordenha, retenção de leite e predispõe à mastite. Independente do nível de tecnificação da exploração na pecuária, estes agentes podem ser encontrados em quase todos os países. No entanto, poucos tipos de papilomavírus bovinos (BPV) foram caracterizados até o presente momento. Desta forma, este trabalho teve como objetivo realizar um estudo de caracterização genética e patológica das infecções causadas pelo BPV na região norte do Brasil. No Capítulo 1, buscou-se avaliar a diversidade dos BPVs em lesões cutâneas de bovinos na região Amazônica brasileira utilizando o par de primers degenerados FAP (FAP59 e FAP64). Foram encontrados os BPVs tipo 1, 2, 11, e 13 além de quatro prováveis novos tipos virais que apresentaram baixa identidade com os BPVs 7, 8, 11 e 12. No Capítulo 2, o genoma de um novo tipo de papilomavírus bovino pertencente ao gênero Xipapillomavirus, espécie Xipapillomavirus 1, foi caracterizado aplicando a técnica de amplificação por círculo rolante seguida de sequenciamento de alta eficiência utilizando a plataforma Illumina. Este novo tipo apresentou maior similaridade com o BPV3 (79% de identidade a nível genômico) e preenche os requisitos para ser considerado um novo tipo de BPV. Histopatologicamente, a lesão causada por esse novo BPV foi caracterizada como papiloma exofítico, apresentando células bem diferenciadas, marcada acantose e paraqueratose. No Capítulo 3, foi realizado o sequenciamento de um genoma completo de BPV5 utilizando o mesmo protocolo do Capítulo 2. Este foi o primeiro genoma de BPV5 da América do Sul completamente sequenciado e caracterizado. Assim, os resultados obtidos nesta tese contribuem para o melhor conhecimento da variabilidade genética do BPV e mostra a importância da utilização de ferramentas moleculares na sua caracterização, principalmente em regiões carentes de estudos e que podem abrigar tipos desconhecidos.

Papillomaviruses (PV) are epitheliotropic viruses that constitute a large genetically diverse group of the Papillomaviridae family which can infect different species of mammals, reptiles and birds. These viruses are characterized by their oncogenic properties and are responsible for the induction of benign and malignant tumors in cutaneous and mucosal epithelia. In cattle, papillomatosis causes significant economic losses to beef and dairy cattle characterized by secondary infections, calf breastfeeding difficulties, leather depreciation, early animal discarding, mammary papillomatosis, retention of milk and predisposes to mastitis. Regardless of the level of technification of livestock farming, these agents can be found in almost all countries. However, few types of bovine papillomavirus (BPV) have been characterized to date. Thereby, this work had as objective to carry out a study of genetic and pathological characterization of the infections caused by the BPV from Northern Brazil. In Chapter 1, we evaluated the genetic diversity of BPVs in bovine cutaneous lesions from Brazilian Amazon using the degenerate FAP pairs of primers (FAP59 and FAP64). BPV1, 2, 11, and 13 were found in addition to four probable new viral types that had low identity with BPVs 7, 8, 11 and 12. In Chapter 2, the whole genome of a new BPV type belonging to genus Xipapillomavirus, species Xipapillomavirus 1, was characterized applying the technique of rolling circle amplification followed by high-throughput sequencing using the Illumina platform. This new type showed greater similarity with BPV3 (79% identity at the genomic level) and fulfills the requirements to be considered a new BPV type. Histopathology was characterized by exophytic papilloma, presenting well differentiated cells, marked acanthosis and parakeratosis. In Chapter 3, a complete BPV5 genome was sequenced using the same protocol used in Chapter 2. This was the first fully sequenced and characterized BPV5 genome from South America. Thus, the results obtained in this thesis contribute to a better knowledge of the genetic variability of BPV and shows the importance of the use of molecular tools in their characterization, especially in regions that are lacking in studies and which may harbor unknown types.

Resumo

Infection with high risk Human papillomavirus (HR-HPV) is necessary but not sufficient to cause cervical carcinoma. This study explored whether multiple HR-HPV or coinfection with Epstein-Barr virus (EBV) influence the integration status of HPV16 genome. The presence and typing of HPV in a series of 125 cervical specimens were assessed by polymerase chain reaction (PCR) using the specific primers for the HPV L1 region. As for EBV infection, the viral EBNA1 gene was used for its detection through PCR amplification. Disruption of the HPV E2 gene was assessed by amplification of the entire E2 gene with single set of primers, while E2 transcripts were evaluated by a reverse transcription PCR method (RT-PCR). The overall prevalence of HPVDNA was of 81.8% in cervical cancers versus 26.9% in benign lesions. In HPV positive cases, HPV16 and HPV18 were the most prevalent types, followed by HPV types 33, 31. EBV EBNA1 prevalence was statistically more frequent in cervical carcinomas than in benign lesions (29.5%, vs 9.6%; P=0.01). No viral infection was detected in healthy control women. The uninterrupted E2 gene was correlated with the presence of E2 transcripts originating from the HPV episomal forms. It was observed that integration was more common in HPV18 and EBV coinfection. The presence of EBV caused a five-fold [OR= 5; CI= 1.15-21.8; P = 0.04] increase in the risk of HPV16 genome integration in the host genome. This study indicates that EBV infection is acting as a cofactor for induction of cervical cancer by favoring HPVDNA integration.

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Eleven juvenile green turtles (Chelonia mydas) from Atlantic Ocean, Brazil, with multiple cutaneous papillomatosis were examined. Histologically, the papillomas exhibit stromal hyperplasia proliferation and epithelial proliferation. The epithelial cells had nuclear changes suggestive of viral infection and severe nuclear pleomorphism. A large nuclear halo was present in the cases of epithelial proliferation; in these cells, nuclear features were frequently dyscariotic, without inclusion. All fibropapillomas examined were negative for papillomavirus group-specific antigens (BPV) and herpesvirus group-specific antigens (HSV1 / HSV2) by the peroxidase-antiperoxidase technique. Electronic microscopy investigation was negative for papillomaviruses and herpes-viruses particles

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Papillomaviruses are described selectively infecting epithelial tissues and are associated with many forms of cancer in different species. Considering the widespread dissemination of papillomatosis in livestock, interest is being centred on possible forms of viral transmission and respective mechanisms. In the present study, we report the detection of bovine papillomavirus (BPV) DNA sequences in female reproductive tract tissues, fluids and oocytes from slaughtered bovines not afflicted by cutaneous papillomatosis. BPV-2 DNA sequences were found in ovarian and uterine tissues as well as in oocytes, cumulus cells and uterine flushings. The presence of papillomavirus sequences in reproductive organ tissues and fluids shows that viral infection in organisms can be verified in others tissues, not only in epithelial ones. The present findings alert to the possibility of BPV transmission in embryo transfer programs and assisted fertilization procedures.

Os vírus do papiloma bovino, descritos como agentes infectantes específicos do epitélio, têm sido associados a diversas formas de câncer em diferentes espécies animais. Dada a intensa disseminação da papilomatose nos rebanhos, a investigação de diferentes formas de transmissão e seus respectivos mecanismos tem exigido especial atenção. No presente estudo, é relatada a detecção de seqüências genômicas do papilomavirus bovino (BPV) em ovócitos e tecidos do trato reprodutivo oriundos de fêmeas abatidas comercialmente, não apresentando papilomatose cutânea. A presença de DNA de BPV-2 em tecidos do trato reprodutivo, lavado uterino, ovócitos e células do cumulus traz evidências de que a infecção viral pode se desenvolver fora do tecido epitelial. Esses achados alertam para a possibilidade de transmissão do BPV através dos procedimentos de transferência de embriões e de fertilização in vitro.

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Papillomaviruses are described selectively infecting epithelial tissues and are associated with many forms of cancer in different species. Considering the widespread dissemination of papillomatosis in livestock, interest is being centred on possible forms of viral transmission and respective mechanisms. In the present study, we report the detection of bovine papillomavirus (BPV) DNA sequences in female reproductive tract tissues, fluids and oocytes from slaughtered bovines not afflicted by cutaneous papillomatosis. BPV-2 DNA sequences were found in ovarian and uterine tissues as well as in oocytes, cumulus cells and uterine flushings. The presence of papillomavirus sequences in reproductive organ tissues and fluids shows that viral infection in organisms can be verified in others tissues, not only in epithelial ones. The present findings alert to the possibility of BPV transmission in embryo transfer programs and assisted fertilization procedures.

Os vírus do papiloma bovino, descritos como agentes infectantes específicos do epitélio, têm sido associados a diversas formas de câncer em diferentes espécies animais. Dada a intensa disseminação da papilomatose nos rebanhos, a investigação de diferentes formas de transmissão e seus respectivos mecanismos tem exigido especial atenção. No presente estudo, é relatada a detecção de seqüências genômicas do papilomavirus bovino (BPV) em ovócitos e tecidos do trato reprodutivo oriundos de fêmeas abatidas comercialmente, não apresentando papilomatose cutânea. A presença de DNA de BPV-2 em tecidos do trato reprodutivo, lavado uterino, ovócitos e células do cumulus traz evidências de que a infecção viral pode se desenvolver fora do tecido epitelial. Esses achados alertam para a possibilidade de transmissão do BPV através dos procedimentos de transferência de embriões e de fertilização in vitro.