Apoptose e maturação placentária bovina: um estudo imunohistoquímico e morfométrico / Apoptosis and maturation of the bovine placenta: an immunohistochemical and morphometric study

A liberação da placenta após o parto envolve a perda da adesão materno-fetal e ocorre somente após a maturação completa do placentoma, que está relacionada com a diminuição da celularidade dos tecidos fetal e materno. A apoptose é requerida tanto para a maturação quanto para a liberação normal da placenta após o parto. O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de apoptose em amostras de placenta de vacas em diferentes fases de gestação. Amostras de placentomas de 15 vacas saudáveis com 4 (n=5), 6 (n=5) e 9 (n=5) meses de gestação foram colhidas e processadas rotineiramente para a histologia, imunoistoquímica e histoquímica. As lâminas obtidas foram coradas em HE, Picrosirius Red e submetidas à análise imunoistoquímica das proteínas Caspase 3, Caspase 8, Bax e Bid. O aumento no número de vasos não necessariamente se associou ao aumento do calibre destes durante a evolução da gestação. Os resultados de histomorfometria revelaram aumento da marcação para Bax e Caspases 3 e 8 em células trofoblásticas binucleadas no final da gestação, enquanto o Bid se manteve sem alteração significativa. A histomorfometria das células trofoblásticas mononucleadas revelou expressão alta para Bax no início de gestação, com diminuição aos 6 meses de gestação e aumento das imunomarcações para Caspases 3 e 8, e Bid com o avanço gestacional. Os colágenos tipo I e III não aumentaram do terço médio ao final da gestação, o que é importante para a diminuição da adesão materno-fetal. Esses resultados confirmam que as Caspases 3 e 8, e o Bax estão envolvidos nos mecanismos de ativação da apoptose pela via intrínseca mitocondrial e/ou extrínseca ao longo da gestação em células trofoblásticas binucleadas, e que nas células trofoblásticas mononucleadas o Bax deixa de ser importante, enquanto o Bid e as Caspases 3 e 8 se tornam os mais significativos.(AU)

Placental release after birth involves loss of maternal-fetal adhesion and occurs only after complete maturation of the placentoma related to the decrease in cellularity of fetal and maternal tissues. Apoptosis is required for both the normal maturation and release of the placenta after birth. The aim of this study was to evaluate the occurrence of apoptosis in samples of the placenta of cows in different stages of gestation. Samples of 15 healthy cow placentomas at 4 (n=5), 6 (n=5) and 9 (n=5) months of gestation were harvested and processed for routine histology, immunohistochemistry and histochemistry. The slides were stained with HE, PicroSirius Red and subjected to immunohistochemical analysis of proteins Caspase 3, Caspase 8, Bax and Bid. Increase in number of vessels was not associated with increase in vascular area during progression of gestation. The results of histomorphometry revealed increased labeling for Bax and Caspases 3 and 8 in trophoblastic binucleated cells in late pregnancy, where the Bid remained without significant change. Histomorphometry analyzing the mononuclear trophoblast cells showed a high expression for Bax in early pregnancy, but decreased at 6 months of gestation. Immunolabeling revealed increased Caspases 3/8 and Bid with advancing of gestation. Further evaluation of type I and III collagen showed a decrease of both types of collagens at the end of gestation, what is very important for the reduction of maternal-fetal adhesion. These results confirm that Caspases 3 and 8 and Bax are involved in the mechanisms of activation of apoptosis through mitochondrial intrinsic and/or extrinsic pathway during pregnancy in trophoblastic binucleated cells. In mononuclear trophoblast cells Bax looses importance in the apoptosis process, awhile Bid and caspases 3 and 8 become the most significant.(AU)

ULTRASSONOGRAFIA MODO B E DOPPLER NA AVALIAÇÃO GESTACIONAL DE CABRAS

Este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia da ultrassonografia modo B e Doppler na avaliação gestacional em cabras, descrevendo as características de tecidos materno-fetais e determinando equações preditivas de idade gestacional, além de avaliar as características dopplerfluxometricas das artérias umbilical e uterina. De forma adicional, foram correlacionadas as alterações na impedância do muco vaginal, temperatura vulvar e medidas ecobiométricas com o momento do parto. Foram utilizadas 25 cabras das raças Saanen multíparas, com peso entre 30 e 60 kg e idades entre dois e cinco anos, hígidas e sem histórico de doenças reprodutivas. Os animais foram submetidos a protocolo de sincronização de estro e monta natural. As avaliações foram realizadas semanalmente do dia 21 de gestação até a parturição. O teste de Shapiro foi utilizado para determinar a normalidade dos dados e o teste de Spearman para determinar correlações de medidas reais ou transformadas à medida que a gestação avançou. Se houve uma diferença significativa detectada, ajustes variáveis e semanas gestacionais foram testados usando modelos de regressão. Também foram realizados teste de correlação entre o numero de fetos e as variáveis estudadas e de comparação pela análise de variância e pós-teste de Tukey. O nível de significância foi estabelecido em 5%. Os diâmetros abdominal, torácico, biparietal; os comprimentos cefalococcígeo, nuca ao focinho, úmero, rádio-ulna, metacarpo, fêmur, tíbia, metatarso, placentomas, órbita ocular, rins; e área do coração foram mensurados; além do índice de resistividade (IR) e pulsatilidade (IP) das artérias uterina e umbilical. A frequência cardíaca foi obtida utilizando o modo Doppler pulsado. Os maiores coeficientes de determinação (R²) foram obtidos para o comprimento do úmero (UMC; 96,2%), área do coração (ACOR; 95,6%) e distância da nuca ao focinho (DNF; 95,3%). Apenas placentomas e frequência cardíaca fetal apresentaram baixos coeficientes de determinação (R²=54,3 e R²=45,0). O fluxo da artéria uterina não variou ao longo das avaliações enquanto a umbilical apresentou baixa correlação com a idade gestacional (R² 33,7%). A frequência cardíaca se correlaciona negativamente com as horas antes do parto (p<0,001; r-Pearson= -0,451), assim como a temperatura vaginal (p= 0,001; rPearson= -0,275), enquanto a espessura da cérvix se correlacionou positivamente (p<0,001; r-Pearson= 0,490); a impedância do muco vaginal, não variou ao longo das avaliações e não se correlacionou com o momento do parto. As avaliações biométricas indicaram correlações significativas entre as medidas das estruturas materno-fetais e a idade gestacional, que podem ser usadas como valores de referência e detecção de anormalidades no desenvolvimento e o monitoramento da frequência cardíaca, temperatura vaginal e mensuração da espessura cervical na última semana gestacional fornecem informações adequadas acerca da proximidade do momento do parto.

This study aimed to evaluate the efficacy of B- mode and Doppler ultrasonography in gestational evaluation in goats, describing the characteristics of maternal-fetal tissues and determining predictive equations for gestational age, besides evaluating dopplerfluxometric characteristics of the umbilical and uterine arteries. In addition, changes in vaginal mucus impedance, vulvar temperature and ecobiometric measurements were correlated with the time of delivery. 25 multiparous Saanen goats were used, weighing between 30 and 60 kg and aged between two and five years, healthy and with no history of reproductive diseases. The animals were submitted to a protocol of estrus synchronization and natural breeding. The evaluations were carried out weekly from the 21st day of gestation until parturition. The Shapiro test was used to determine the normality of the data and the Spearman test to determine correlations of real or transformed measurements as the pregnancy progressed. If there was a significant difference detected, variable adjustments and gestational weeks were tested using regression models. Correlation tests were also carried out between the number of fetuses and the variables studied and for comparison by analysis of variance and Tukey's post-test. The level of significance was set at 5%. The abdominal, thoracic, biparietal diameters; cephalococcygeal lengths, neck to snout, humerus, radius-ulna, metacarpal, femur, tibia, metatarsus, placentomas, eye socket, kidneys; and heart area were measured; in addition to the resistivity (IR) and pulsatility (IP) index of the uterine and umbilical arteries. Heart rate was obtained using the pulsed Doppler mode. The highest coefficients of determination (R²) were obtained for the length of the humerus (UMC; 96.2%), heart area (ACOR; 95.6%) and distance from the neck to the muzzle (DNF; 95.3%). Only placentomas and fetal heart rate showed low determination coefficients (R² = 54.3 and R² = 45.0). The flow of the uterine artery did not vary during the evaluations while the umbilical presented a low correlation with gestational age (R² 33.7%). Heart rate is negatively correlated with the hours before parturition (p <0.001; r-Pearson = -0.451), as well as vaginal temperature (p = 0.001; r-Pearson = -0.275), while the thickness of the cervix was correlated positively (p <0.001; r-Pearson = 0.490); the impedance of the vaginal mucus, did not vary during the evaluations and did not correlate with the moment of delivery. Biometric evaluations indicated significant correlations between the measures of the maternal-fetal structures and the gestational age, which be used as reference values and detecting abnormalities in development and monitoring heart rate, vaginal temperature and measuring cervical thickness in the last gestational week provide adequate information about the moment of delivery.

Ultrasonographic evaluation of hG-CSF transgenic goat conceptus / Avaliação ultrassonográfica de conceptos transgênicos para o hG-CSF

The objective of this study was to evaluate the development of transgenic (T) goat embryos and fetuses for human Granulocyte Colony Stimulating Factor (hG-CSF) by ultrasonography. Four pregnancies in non-transgenic (NT) goats were obtained after fertilization (either fixed-time artificial insemination or natural mating) using the T male for hG-CSF. Ultrasound examinations were carried out at 30, 40 (transrectal via), 50, 60, 90 and 120 days of pregnancy (transabdominal via). Some parameters were observed such as morphology, organogenesis and formation of skeletal fetuses, viability with cardiac activity and fetuses movements. Measurements were taken of the crown-rump length, diameter of embryonic vesicle, thorax, abdomen, umbilical cord and placentomes. After parturition, DNA testing was conducted in all offspring and 4 T and 2 NT kids were identified. The conceptus started their differentiation at 40 days. The heart was detected in all examinations and the heart chambers were assessed at 50 days. Gastric compartments, liver and kidneys were observed at 60 days, the same period that all bony structures were visualized. Average values of all evaluated parameters had a gradual increase with the progression of pregnancy. T and NT goat embryos and fetuses had a similar growth and all remained viable throughout the experimental period.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar o desenvolvimento de embriões e fetos transgênicos (T) para o Fator Estimulante de Colôniasde Granulócitos humano (hG-CSF) por ultrassonografia. Quatro gestações em cabras não transgênicas (NT) foram obtidas pos fecundação (inseminação artificial em tempo fixo ou monta controlada) utilizando o bode T para o hG-CSF. Exames ultrassonográficos foram realizados aos 30, 40 (via transretal), 50, 60, 90 e 120 dias de gestação (via transabdominal). Alguns parâmetros foram observados como morfologia, organogênese e formação do esqueleto fetal, viabilidade por meio de atividade cardíaca e movimento fetal. As seguintes mensurações foram realizadas: comprimento crânio caudal, diâmetro da vesícula embrionária, do tórax, do abdomen, do cordão umbilical e dos placentomas. Após o parto, o exame por PCR foi conduzido em todas as crias e 4 T e 2NT foram identificadas. O concepto iniciou sua diferenciação aos 40 dias. O coração foi detectado em todos os exames e as câmeras cardíacas foram identificadas aos 50 dias. Compartimentos gástricos, fígado e rins foram observados aos 60 dias, o mesmo período que todas as estruturas ósseas foram visualizadas. Valores médios de todos os parâmetros avaliados tiveram um aumento gradual com o avanço da gestação. Embriões e fetos T e NT tiveram um crescimento similar e todos permaneceram viáveis durante o período experimental.(AU)

Ultrasonographic evaluation of hG-CSF transgenic goat conceptus / Avaliação ultrassonográfica de conceptos transgênicos para o hG-CSF

The objective of this study was to evaluate the development of transgenic (T) goat embryos and fetuses for human Granulocyte Colony Stimulating Factor (hG-CSF) by ultrasonography. Four pregnancies in non-transgenic (NT) goats were obtained after fertilization (either fixed-time artificial insemination or natural mating) using the T male for hG-CSF. Ultrasound examinations were carried out at 30, 40 (transrectal via), 50, 60, 90 and 120 days of pregnancy (transabdominal via). Some parameters were observed such as morphology, organogenesis and formation of skeletal fetuses, viability with cardiac activity and fetuses movements. Measurements were taken of the crown-rump length, diameter of embryonic vesicle, thorax, abdomen, umbilical cord and placentomes. After parturition, DNA testing was conducted in all offspring and 4 T and 2 NT kids were identified. The conceptus started their differentiation at 40 days. The heart was detected in all examinations and the heart chambers were assessed at 50 days. Gastric compartments, liver and kidneys were observed at 60 days, the same period that all bony structures were visualized. Average values of all evaluated parameters had a gradual increase with the progression of pregnancy. T and NT goat embryos and fetuses had a similar growth and all remained viable throughout the experimental period.

O objetivo deste estudo foi avaliar o desenvolvimento de embriões e fetos transgênicos (T) para o Fator Estimulante de Colôniasde Granulócitos humano (hG-CSF) por ultrassonografia. Quatro gestações em cabras não transgênicas (NT) foram obtidas pos fecundação (inseminação artificial em tempo fixo ou monta controlada) utilizando o bode T para o hG-CSF. Exames ultrassonográficos foram realizados aos 30, 40 (via transretal), 50, 60, 90 e 120 dias de gestação (via transabdominal). Alguns parâmetros foram observados como morfologia, organogênese e formação do esqueleto fetal, viabilidade por meio de atividade cardíaca e movimento fetal. As seguintes mensurações foram realizadas: comprimento crânio caudal, diâmetro da vesícula embrionária, do tórax, do abdomen, do cordão umbilical e dos placentomas. Após o parto, o exame por PCR foi conduzido em todas as crias e 4 T e 2NT foram identificadas. O concepto iniciou sua diferenciação aos 40 dias. O coração foi detectado em todos os exames e as câmeras cardíacas foram identificadas aos 50 dias. Compartimentos gástricos, fígado e rins foram observados aos 60 dias, o mesmo período que todas as estruturas ósseas foram visualizadas. Valores médios de todos os parâmetros avaliados tiveram um aumento gradual com o avanço da gestação. Embriões e fetos T e NT tiveram um crescimento similar e todos permaneceram viáveis durante o período experimental.

Alterações provocadas por Neospora caninum e imunodetecção de Toxoplasma gondii em placentas de cabras sem raça definida

O Toxoplasma gondii e o Neospora caninum são protozoários que causam diversas desordens reprodutivas em animais. Este estudo foi realizado com objetivo em cabras, os danos placentários causados por esses protozoários durante a gestação. No primeiro experimento foi realizada, análise ultraestrutural em placentas de animais infectados experimentalmente por N. caninum. Os animais foram divididos em 4 grupos, e inoculados em diferentes tempos gestacionais: G1, com inoculação aos 40 dias de gestação (n=4); G2, animais inoculados aos 90 dias de gestação (n=4); G3, inoculados aos 120 dias de gestação (n=4) e G4, grupo controle (n=3). Quando observado sofrimento fetal, as cabras foram eutanasiadas para coleta dos placentomas. Estes foram fixados em glutaraldeído com tampão fosfato a 2,5% refrigerado. As amostras foram pós-fixadas, desidratadas e incluídas em Époxy e, posteriormente realizados cortes em ultramicrótomo e analisadas. Foram identificadas lesões celulares graves como degenerações, vacuolização celular, retração nuclear/degeneração nuclear, restos celulares, em uma das amostras, o protozoário foi visualizado. Em conclusão, os achados ultraestruturais apresentados indicam modificações celulares degenerativas acentuadas em placentas de cabras induzidas por N. caninum. No segundo experimento, utilizou-se placentas provenientes de animais naturalmente infectados por T. gondii. Foram avaliadas 213 amostras de placenta de animais sorologicamente positivos em ELISA, submetidos a exames histopatológicos. Apenas 23 amostras apresentaram lesões características para protozoários e 4 foram provenientes de animais sorologicamente negativos, porém que também apresentaram as mesmas lesões. As amostras placentárias passaram por processo de desidratação, diafanização e inclusão em parafina. Os cortes de placentas foram submetidos a imunohistoquímica (IHQ) utilizando anticorpo anti-Toxoplasma gondii e o kit comercial DAKO LSAB2 System-HRP. Dessas amostras de placenta obtidas, 85,2% (23/27) foram positivas na IHQ e 81,5% (22/27) apresentaram lesões compatíveis com a infecção por T. gondii. A imunoexpressão ocorreu em células epiteliais das vilosidades placentárias. A técnica de IHQ demonstrou ser uma ferramenta valiosa no diagnóstico de T. gondii em tecido placentário de cabras naturalmente infectadas complementando de forma decisiva e agregando maior valor aos resultados obtidos na análise histopatológica e sorológica

Toxoplasma gondii and Neospora caninum are protozoa that cause various reproductive disorders in animals. With the objective of studying the reproductive disorders in goats, aiming at the placental damages caused by these protozoa, this study was carried out. The study consists of two stages, the first, ultrastructural analysis in placentas of 15 animals infected experimentally by N. caninum. The animals were divided into 4 groups, and inoculated at different gestational times: G1, with inoculation at 40 days of gestation (n = 4); G2, animals inoculated at 90 days of gestation (n = 4); G3, inoculated at 120 days of gestation (n = 4) and G4, control group (n = 3). When fetal distress was observed, the goats were euthanized to collect the placentomas. These were fixed in glutaraldehyde with 2.5% refrigerated phosphate buffer. The samples were sent to the Keizo Asami Immunopathology Laboratory for post-fixation, dehydration and inclusion in Epoxy and later to the Center of Strategic Technologies of the Northeast, where cuts were made in ultramicrotome and observation. Serious cell lesions such as degeneration, cell vacuolization, nuclear retraction / nuclear degeneration, cellular debris were identified in one of the samples, the protozoan was visualized and organelle degradation of placental cells. In conclusion, the ultrastructural findings presented indicate marked degenerative cell changes in N. caninum-induced goat placentas. In the second, immunohistochemistry was used in placentas from animals naturally infected with T. gondii. 213 placenta samples from serologically positive animals in ELISA, and also submitted to histopathological exams. Of these, 23 samples had characteristic lesions for protozoa and 4 were from serologically negative animals, but also had the same lesions. The placental samples underwent cleavage, dehydration, diaphanization and paraffin inclusion. Block cuts were performed by immunohistochemistry using anti-Toxoplasma gondii antibody and the commercial DAKO LSAB2 System-HRP kit. Of these placenta samples obtained, 85.2% (23/27) were positive in IHC and 81.5% (22/27) had lesions compatible with T. gondii infection. Immunoexpression occurred in epithelial cells of the placental villi. The IHQ technique proved to be a valuable tool in the diagnosis of T. gondii in placental tissue of naturally infected goats complementing in a decisive way and adding greater value to the results obtained in the histopathological and serological analysis

XXX - ANÁLISE DE PADRÕES HOMEOSTÁTICOS EM CONCEPTOS BOVINOS CLONES NO DIA 225 DA GESTAÇÃO E ASSOCIAÇÃO COM ALTERAÇÕES FENOTÍPICAS FETAIS E PLACENTÁRIAS

Anormalidades de desenvolvimento após a produção de embriões bovinos por transferência nuclear de célula somática (SCNT) podem interferir no crescimento fetal e placentário em um conjunto de sintomas denominado de Síndrome do Bezerro Anormal (SBA). O objetivo deste estudo foi comparar as características fenotípicas com os perfis bioquímicos, metabólicos e os padrões de expressão gênica de conceptos bovinos no Dia 225 de gestação, estabelecidas in vivo (IVD) por superovulação e inseminação artificial, ou in vitro tanto por fecundação in vitro (IVF) quanto por Handmade Cloning (NT-HMC). Avaliações bioquímicas foram realizadas no plasma fetal e materno e nos fluidos fetais, e a expressão de genes chave para o desenvolvimento do concepto foi analisada por PCR quantitativo (RT-qPCR) em tecido hepático fetal e em diferentes tipos de placentônios (A, B, C), classificados de acordo com o aspecto morfológico. Os dados foram analisados pelo procedimento MIXED do sistema SAS. A maioria dos parâmetros fetais para funções hepáticas e renais, metabolismo da hemoglobina e osmolaridade no plasma fetal e nos líquidos amniótico e alantóico, concentrações de glicose, frutose, triglicerídeos e VLDL no plasma fetal, e a quantidade total de glicose e frutose no fluido alantóico foram maiores nos clones do que nos grupos IVD e IVF. No fígado fetal, houve diferença nos níveis de expressão gênica indicando menor atividade nas vias frutolítica, gliconeogênica, via das pentoses fosfato, síntese de colesterol e serina, e aumento de atividades frutogênica e lipogênica em clones do que em controles. Na placenta, não houve diferença entre os grupos para expressão gênica, porém houve padrão de expressão distinto entre os diferentes tipos de placentônios, em uma possível compartimentalização metabólica na placenta de bovinos. Quando comparado a placentônios com morfologia fisiológica (tipos A e B), houve um aumento na expressão de transportadores de glicose e diferença significativa nas vias metabólicas em placentônios tipo C, sugerindo o transporte ativo de glicose e síntese de frutose pelo placentônio tipo C. Como a proporção e massa de placentônios tipo C são significativamente maiores em conceptos clonados, tais funções metabólicas parecem ser intensificadas em clones, levando a alterações bioquímicas que promovem o crescimento fetal e até a processos patológicos, como uma possível lipidose hepática em fetos clonados. Tais mudanças homeorréticas podem estar associadas a mudanças na programação fetal metabólica e oferta excessiva de nutrientes ao fígado em gestações de clones, levando a alterações típicas da SBA em conceptos produzidos pela clonagem por TNCS.

Developmental abnormalities after production of embryos by somatic cell nuclear transfer (SCNT) may affect fetal and placental growth in a set of symptoms termed Abnormal Offspring Syndrome (AOS). The objective of this study was to compare phenotypic characteristics with biochemical, metabolic and gene expression patterns of bovine conceptus at Day 225 of gestation, established in vivo (IVD) by superovulation and artificial insemination, or in vitro both by in vitro fertilization (IVF) and Handmade Cloning (NT-HMC). Biochemical evaluations were performed in fetal and maternal plasma and in fetal fluids, and expression of key genes for the development of the concept was analyzed by quantitative PCR (RT-qPCR) in fetal liver and in different types of placentomes (A, B, C), classified according to the morphological aspect. The data were analyzed by the MIXED procedure of the SAS system. Most fetal parameters for liver and kidney functions, hemoglobin metabolism, and osmolarity in fetal plasma and in the amniotic and allantoic fluids were significantly higher in clones than in the in vivo control group, but no diferences. Glucose, fructose, triglycerides and VLDL concentrations in fetal plasma, and the total amount of glucose and fructose in the allantoic fluid were higher in the clones than in the IVD and IVF groups. In the fetal liver, there was a difference in the levels of gene expression indicating lower fructolysis, gluconeogenesis, phosphate pentoses pathway, cholesterol and serine synthesis, and an increase of fructogenic and lipogenic activities in clones than in controls. In the placenta, there was no difference between the groups for gene expression, but there was a distinct pattern of expression between the different types of placentones, in a possible metabolic compartmentalization of the bovine placenta. When compared to placentomes with physiological morphology (types A and B), there was an increase in the expression of glucose transporters and a significant difference in the metabolic pathways in Type C placentomes, suggesting an active transport of glucose and synthesis of fructose through placentone Type C. The proportion and mass of Type C placentomes are significantly higher in cloned conceptus; so metabolic functions seem to be intensified in clones, leading to biochemical changes that promote fetal growth and even pathological processes such as possible hepatic lipidosis in cloned fetuses. This way homeorrhetic changes may be associated with changes in metabolic fetal programming and excessive nutrients supply to the liver in gestations of clones, leading to typical alterations of AOS in conceptus produced by TNCS.

EXPRESSÃO DE mRNA E IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DAS VIAS DA ARGININA NO ENDOMÉTRIO, CONCEPTOS E PLACENTOMAS EM OVELHAS

A arginina é um aminoácido nutricionalmente essencial, importante na gestação de mamíferos, pois aumenta a sobrevivência, crescimento e desenvolvimento de embriões, fetos e neonatos. A arginina pode ser utilizada na síntese de poliaminas por uma via metabólica clássica, porém estudos recentes revelaram uma importante via alternativa. Todavia, ambas foram pouco investigadas. Nesse contexto, estudos são necessários a fim de identificar a ocorrência das vias metabólicas da arginina nos tecidos reprodutivos durante a gestação de ovelhas. Assim o presente estudo teve como objetivos: a) avaliar a expressão de genes das vias metabólicas da arginina em conceptos durante o período de peri-implantação em ovelhas; b) identificar a localização das proteínas das vias metabólicas da arginina em conceptos e no endométrio durante o período de peri-implantação em ovelhas; e c) identificar a localização das proteínas das vias metabólicas da arginina em placentomas em ovelhas. Para tanto, ovelhas da raça Rambouillet (n=72) foram sincronizadas e após detecção do estro por machos vasectomizados, foram cobertas por machos da raça Suffolk com fertilidade comprovada. No experimento 1, as ovelhas (n=20) foram histerectomizadas aos 13, 14, 15 ou 16 dias de gestação, e os fragmentos de conceptos coletados foram congelados em nitrogênio líquido a fim de se estudar a expressão gênica. No experimento 2, ovelhas (n=28) também foram histerectomizadas aos 13, 14, 15 ou 16 dias de gestação e, secções de conceptos e de endométrio, foram fixados a fim de avaliar a localização de proteínas por imunohistoquímica. No experimento 3, ovelhas (n=24) foram histerectomizadas aos 40, 60, 80, 100, 120 ou 140 dias de gestação e placentomas foram coletados e fixados para posterior análise imunohistoquímica. Os dados de expressão gênica foram analisados utilizando o procedimento GLM do SAS e as diferenças na intensidade da imunomarcação foram avaliadas com o software R, foi realizada a análise de variância (ANOVA). O nível de significância considerado foi <0,05. A expressão dos genes ADC e AGMAT (via alternativa), não foi alterada ao longos dos dias de gestação, e o mesmo ocorreu para o gene ARG1 (via clássica). O gene ODC1 (via clássica) apresentou maior expressão aos 13 dias de gestação (P=0,06). A análise imunohistoquímica identificou as proteínas ARG1, ODC1, ADC e AGMAT nos diferentes tecidos e dias de gestação, evidenciando a importância da ambas vias durante a gestação. A presença das proteínas no epitélio luminal do endométrio aumentou (p=0,038) após os 13 dias de gestação e foi significativamente maior aos 16 dias, sugerindo que essas proteínas são requeridas em maiores concentrações para o processo de alongamento do concepto e implantação. No epitélio glandular, a presença das proteínas não foi alterada (p=0,64) ao longo dos dias estudados. Não foi observada diferença (p=0,472) entre a identificação das proteínas no trofectoderma dos conceptos ao longo dos dias. Nos placentomas, a presença das proteínas foi menor (p<0,01) aos 40 dias de gestação, quando comparadas com os dias 60, 120 e 140. Os resultados do presente estudo evidenciam a importância de ambas vias metabólicas da arginina, para produção de poliaminas, durante o período gestacional de ovelhas

Arginine is a nutritionally essential amino acid, important for pregnancy in mammalian, to increase the survival, growth and development of embryos, fetuses and neonates. Arginine can be used in the synthesis of polyamines by a classical metabolic pathway, though recent studies revealed an important alternative pathway, however, both have been poorly investigated. In this context, studies are necessary in order to identify an occurrence of arginine metabolic pathways in the reproductive tissues during a pregnancy in ewes. Thus, the present study had as objectives: a) evaluate the gene expression in the metabolic pathways of arginine, in concepts during the pre-implantation period of pregnancy in ewes; b) to identify the localization of proteins, from the metabolic pathways of arginine, in concepts and uterine endometrium during the pre-implantation period of pregnancy in ewes; and c) to identify the localization of proteins, from the metabolic pathway of arginine, in placentomes during the pre-implantation period of pregnancy in ewes. Rambouillet ewes (n=72) were synchronized and after estrus detection by vasectomized males, ewes were mated by Suffolk males with proven fertility. In experiment 1, ewes (n=20) were hysterectomized at days 13, 14, 15 or 16 of pregnancy, and the sections of concepts collected were frozen in liquid nitrogen in order to study gene expression. In the experiment 2, ewes (n=28) were also hysterectomized at days 13, 14, 15 or 16 of pregnancy, sections of conceptuses and uterine endometrium were fixed in order to identify the protein localization by immunohistochemical analysis. In experiment 3, ewes (n=24) were hysterectomized on days 40, 60, 80, 100, 120 or 140 days of pregnancy, placentomes were collected and fixed for immunohistochemical analysis. Data analysis of gene expression was analyzed using GLM procedure of SAS and differences in the intensity of the immunostaining were evaluated using software R, analysis of variance (ANOVA) was performed. Significance level was declared < 0.05. The expression of ADC and AGMAT genes (alternative pathway) did not alter across days of pregnancy, and the same happened with ARG1 gene (classic pathway). The ODC1 gene (classic pathway) showed greater expression at 13 days of pregnancy (P=0.06). The immunohistochemical analysis identified ARG1, ODC1, ADC and AGMAT proteins in all tissues and days of pregnancy studied, evidencing the relevance of both pathways during pregnancy. The identification of proteins on lumen epithelia from endometrium improved (p=0.038) after Day 13 of pregnancy and it was significantly greater on Day 16, suggesting that these proteins are required in higher concentrations for conceptuses elongation and implantation. On glandular epithelia, the proteins identification did not change (p=0.64) across days of pregnancy. No difference was observed (p=0.472) between the proteins identification on trofectoderm across days. On placentomes, the proteins identification was lower (p<0.01) on Day 40 of pregnancy compared with Days 60, 120 and 140. The results of the experiment indicate that relevance of both metabolic pathways of arginine to polyamines production during the pregnancy period in ewes

Comparação da imunolocalização de receptores de progesterona em placentas de bovinos normais e clonados / Comparison of the imunolocalization of progesterone receptors in placentas of bovine normal and cloned

A progesterona é um hormônio fundamental na manutenção da gestação nos mamíferos. Em bovinos clonados, perdas gestacionais significativas ocorrem devido à deficiência placentária. Tendo em vista esse problema, o objetivo do trabalho foi analisar em diferentes idades gestacionais a imunolocalização para receptores de progesterona em placentas de animais não clonados e clonados. Tecidos placentomais de bovinos não clonados foram obtidos da linha de abate no Matadouro Mantiqueira, enquanto os tecidos placentomais dos animais clonados com idades gestacionais de 68, 135, 225 e 270 dias de gestação foram obtidos em empresas especializadas em clonagem animal. Os tecidos foram processados e embebidos em paraplast para localização de receptores de progesterona, utilizando-se a técnica de imuno-histoquímica pelo anticorpo monoclonal (Progesterone receptor SER 294). Pela imuno-histoquímica, comparando-se a concentração de receptores de progesterona na placenta de animais clonados com as de animais não clonados, em diferentes idades gestacionais, observou-se que as células dos placentomas dos animais clonados apresentaram uma marcação mais intensa de receptor de progesterona nas idades de 135 e 270 dias de gestação em relação aos não clonados. Tal fato sugere que a presença de progesterona no final da gestação pode ser mais uma das possíveis causas de gestações prolongadas.(AU)

To progesterone is a fundamental hormone in the maintenance of the gestation in the mammals. In bovine they cloned, losses gestational significant, occur due to the placental deficiency. Having in mind that problem, the objective of the work was analyze in different gestational ages to immune stained for receivers of progesterone in placentas of normal animals and cloned. Placentomal tissues of bovine normal were obtained of the line of counts on in the Slaughterhouse Mantiqueira, while the placentomal tissues of the animals cloned with gestational ages of 68, 135, 225 and 270 days of gestation were obtained in companies specialized in animal cloning. The fabrics were prosecuted and absorbed in paraplast for progesterone receivers location, utilizing itself to technical of immunohistochemistry by the antibody monoclonal (Progesterone receiver BE 294). By the immunohistochemistry comparing the progesterone receivers concentration in the placenta of animals cloned, with the of animals done not manipulate, in different gestational ages we observe that the cells of the placentomal tissues of the animals manipulated (cloned) presented a more intense marking of receiver of progesterone in the ages of 135 and 270 days of gestation regarding the done not manipulate. Suggesting that the presence of progesterone in the end of the gestation can be more one of the possible cause of gestations prolonged.(AU)

Comparação da imunolocalização de receptores de progesterona em placentas de bovinos normais e clonados / Comparison of the imunolocalization of progesterone receptors in placentas of bovine normal and cloned

A progesterona é um hormônio fundamental na manutenção da gestação nos mamíferos. Em bovinos clonados, perdas gestacionais significativas ocorrem devido à deficiência placentária. Tendo em vista esse problema, o objetivo do trabalho foi analisar em diferentes idades gestacionais a imunolocalização para receptores de progesterona em placentas de animais não clonados e clonados. Tecidos placentomais de bovinos não clonados foram obtidos da linha de abate no Matadouro Mantiqueira, enquanto os tecidos placentomais dos animais clonados com idades gestacionais de 68, 135, 225 e 270 dias de gestação foram obtidos em empresas especializadas em clonagem animal. Os tecidos foram processados e embebidos em paraplast para localização de receptores de progesterona, utilizando-se a técnica de imuno-histoquímica pelo anticorpo monoclonal (Progesterone receptor SER 294). Pela imuno-histoquímica, comparando-se a concentração de receptores de progesterona na placenta de animais clonados com as de animais não clonados, em diferentes idades gestacionais, observou-se que as células dos placentomas dos animais clonados apresentaram uma marcação mais intensa de receptor de progesterona nas idades de 135 e 270 dias de gestação em relação aos não clonados. Tal fato sugere que a presença de progesterona no final da gestação pode ser mais uma das possíveis causas de gestações prolongadas.

To progesterone is a fundamental hormone in the maintenance of the gestation in the mammals. In bovine they cloned, losses gestational significant, occur due to the placental deficiency. Having in mind that problem, the objective of the work was analyze in different gestational ages to immune stained for receivers of progesterone in placentas of normal animals and cloned. Placentomal tissues of bovine normal were obtained of the line of counts on in the Slaughterhouse Mantiqueira, while the placentomal tissues of the animals cloned with gestational ages of 68, 135, 225 and 270 days of gestation were obtained in companies specialized in animal cloning. The fabrics were prosecuted and absorbed in paraplast for progesterone receivers location, utilizing itself to technical of immunohistochemistry by the antibody monoclonal (Progesterone receiver BE 294). By the immunohistochemistry comparing the progesterone receivers concentration in the placenta of animals cloned, with the of animals done not manipulate, in different gestational ages we observe that the cells of the placentomal tissues of the animals manipulated (cloned) presented a more intense marking of receiver of progesterone in the ages of 135 and 270 days of gestation regarding the done not manipulate. Suggesting that the presence of progesterone in the end of the gestation can be more one of the possible cause of gestations prolonged.

COMPARISON OF PURINE BASES AND 15N TO QUANTIFY MICROBIAL NITROGEN YIELD IN BEEF CATTLE AND THE EFFECTS OF DAY OF GESTATION AND FEEDING REGIMEN IN HOLSTEIN × GYR COWS

RESUMO ROTTA, Polyana Pizzi, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, fevereiro de 2015. Comparação entre bases purinas e 15N para quantificar a produção de proteína microbiana em bovinos de corte e os efeitos do dia de gestação e do sistema de alimentação em vacas Holandês × Gir. Orientador: Sebastião de Campos Valadares Filho. Coorientadores: Marcos Inácio Marcondes e Fernanda Samarini Machado. A produção de proteína microbiana (PM) é de grande importância para o metabolismo proteico em animais ruminantes. Assim, um experimento foi conduzido para avaliar o uso de marcadores microbianos (MM), locais de coleta (LC) e sistemas de marcadores (SM) para estimar a PM em bovinos não castrados e desenvolver equações para corrigir as estimativas de PM. Os MM utilizados foram 1) bases purinas (BP) e 2) 15N. Os LC avaliados foram: 1) retículo, 2) omaso e 3) abomaso e os SM estudados foram: 1) simples, 2) duplo e 3) triplo. Oito bovinos cruzados (Holandês × Zebu) não castrados (353 ± 36.9 kg de PC; 24 ± 1 meses) com fístulas ruminal e abomasal foram uilizados. Quando as BP foram utilizadas, os maiores (P < 0,01) valores de PM foram observados para a digesta coletada no retículo e no abomaso. Por outro lado, utiliando o 15N, os maiores (P < 0,01) valores foram observados para a digesta coletada no omaso e abomaso. A PM foi apenas diferente (P < 0,05) quando utilizou-se a digesta coletada no retículo e o 15N em relação à digesta coletada no abomaso e o 15N. Assim, a equação desenvolvida para corrigir a PM foi: PM (g/d) = 27,93 ± 2,46 + 0,99 ± 0,09 × retículo 15N. O SM triplo apresentou maior (P < 0,01) valor para a PM comparado aos SM simples e duplo. Não houve interação (P > 0,05) entre os SM e MM ou LC; assim, a equação recomendada para corrigir os valores de PM utiliza apenas a variável SM. Em suma, nós concluimos que não há diferença ao utilizar 15N para estimar a PM desde que o local de coleta seja o omaso ou o abomaso. Dessa forma, o omaso pode ser utilizado como um acurado LC para estimar a PM. O SM triplo apresentou os maiores valores em relação aos sistemas simples e duplo. Assim, caso os sistemas simples ou duplo x sejam utilizados, o valor da PM deverá ser corrigida pela equação obtida utilizando os valores do SM triplo. Um outro estudo foi conduzido objetivando investigar como o sistema de alimentação (SA) e os dias de gestação (DG) alteram a digestibilidade aparente, o desempenho, o balanço de nitrogênio, a excreção de derivados de purina, a deposição de gordura, a massa de órgaos maternos e fetais e a expressão de genes responsáveis pelo desenvolvimento, transferência de nutrientes e fatores angiogênicos na placenta em vacas leiteiras Holandes × Gir. Quarenta e quarto vacas múltiparas Holandês × Gir com um PC inicial de 480 ± 10.1 kg e com idade inicial de 5 ± 0.5 anos foram distribuídas em 1 dos 2 SA: ad libitum (AL; n = 20) e nível de mantenca (NM; n = 24). O nível de mantença foi considerado sendo 1,15% do PC (% MS) e supriu 100% da exigência de energia, enquanto que a dieta AL forneceu 190% da exigência de energia. As vacas foram individualmente alimentas com uma dieta a base de silagem de milho e concentrado na relação 93:7 (% MS). As vacas gestantes foram abatidas em 4 diferentes DG: 139 (n = 11), 199 (n = 11), 241 (n = 11) e 268 d (n = 11). De maneira geral, o consumo de MS diminuiu conforme os DG aumentaram. A diminuição que foi observada para o consumo de MS pode estar associada com a diminuição do volume ruminal causado pelo rápido aumento no tamanho do feto durante o final da gestação. Nós observamos uma interação entre a digestibilidade da MS e da matéria orgânica entre SA e DG; aos 150, 178 e 206 DG, as vacas alimentadas a nível de mantença apresentaram um maior valor para a digestibilidade aparente da MS e da matéria orgânica em relação às vacas que foram alimentadas AL. A espessura de gordura de cobertura, o mesenterio e a gordura interna foram maiores para as vacas alimentadas AL em relação às vacas alimentadas a NM, sendo a única exceção, a espessura de gordura de coberta aos 139 dias, que foi similar para os dois SA. As vacas alimentadas AL apresentaram maior excreção de N nas fezes em relação às vacas alimentadas a NM. A glândula mamária foi mais pesada em vacas xi alimentadas AL em relação às vacas alimentadas a NM, e o maior valor foi observado aos 268 dias de gestação. O SA não influenciou o peso fetal. A maior parte dos órgãos fetais tiveram pesos similares para as vacas alimentadas AL e a NM. Estes dados indicam que a restrição alimentar não afeta o desenvolvimento da maior parte dos órgãos fetais e o próprio desenvolimento fetal. Entretanto, o peso de alguns órgãos maternos foram afetados de acordo com o SA oferecido. Além disso, o efeito negativo sobre a glândula mamária causado pelo SA a NM provavelmente não afetará as subsequentes lactações, porque a concentração de proteína bruta na glândula mamária aumentou com o fornecimento da dieta a NM. Nós sugerimos que a dieta AL para vacas leiteiras deve ser fornecida com cuidado devido ao aumento de gordura observado nessa vacas a 268 dias de gestação. A placenta foi mais pesada em vacas alimentadas a NM em relação às vacas alimentadas AL aos 268 dias de gestação. Ainda, a placenta foi mais leve aos 139 dias e mais pesada aos 268 dias de gestação em vacas alimentadas a NM. Entretanto, para as vacas alimentadas AL, a placenta foi mais pesada a partir de 199 dias de gestação. Os placentomas foram mais pesados em vacas alimentadas a NM durante a gestação e o número de placentomas foi maior em vacas alimentadas a NM aos 268 dias de gestação. Nós observamos que os genes IGFR1 e IGFR2 foram responsáveis por adaptações placentárias quando a dieta a NM foi fornecida, pois as suas expressões em células de placentomas foram maiores em vacas alimentadas a NM aos 268 dias de gestação. Os genes reponsáveis pela angiogênese também tiveram maior expressão em vacas alimentadas a NM. A expressão dos genes VEGFA, GUCYB3, HIFA, FGF2 e NOS3 foi alterada pela interação entre SA e DG sendo maior em vacas alimentadas a NM aos 268 dias de gestação. Ainda, VEGFB e ANGPT2 não apresentaram interação entre SA e DG, mas tiveram maior expressão em vacas alimentadas a NM. Assim, nós recomendamos o NM (1,15 % do PC - dieta composta por 93% de volumoso) xii como o SA para vacas gestantes secas. No entanto, durante o último mês de gestação, o SA AL parece ser o mais apropriado para evitar a perda de peso. No entanto, caso a dieta AL seja fornecida a vacas secas gestantes, isso deverá ser feito com cautela porque há um aumento na gordura da glândula mamária aos 268 dias de gestação. Ainda, nós sugerimos que a placenta de vacas alimentadas a NM desenvolve adaptações ao reduzido suprimento de nutrientes alterando sua estrutura e a expressão genética; desenvolvendo assim, mecanismos para um potencial aumento na transferência de nutrientes ao feto.

ABSTRACT ROTTA, Polyana Pizzi, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, February of 2015. Comparison of purine bases and 15N to quantify microbial nitrogen yield in beef cattle and the effects of day of gestation and feeding regimen in Holstein × Gyr cows. Adviser: Sebastião de Campos Valadares Filho. Co-Advisers: Marcos Inácio Marcondes and Fernanda Samarini Machado. Microbial nitrogen yield (MN) is of great importance to protein metabolism in ruminants. The quantification of its flow to the small intestine is therefore important in calculating the amount of digestible MN available to the animal. Thus, an experiment was designed to evaluate the use of microbial markers (MM), sampling sites (SS), and marker systems (MS) to estimate MN in bulls and to develop equations to correct MN estimates. The MM systems that were evaluated were 1) purine bases (PB) and 2) 15N labeling. The SS that were evaluated were 1) reticulum, 2) omasum, and 3) abomasum, and the studied MS were 1) single, 2) double, and 3) triple. Eight crossbred (Holstein × Zebu) bulls (353 ± 36.9 kg of BW; 24 ± 1 mo) with ruminal and abomasal cannulas were utilized in this experiment. For PB, the greatest (P < 0.01) values of MN were observed for the digesta that were sampled from the reticulum and abomasum. In contrast, for 15N, the greatest (P < 0.01) values were observed for digesta that were sampled in the omasum and abomasum. Microbial nitrogen yield was only different (P < 0.05) from those estimated using abomasum and 15N when using reticulum and 15N. Thus, the equation that was developed to correct the MN value was as follows: MN (g/d) = 27.93 ± 2.46 + 0.99 ± 0.09 × reticulum 15N. The triple MS exhibited the greatest (P < 0.01) value of MN when compared to the single and double MS. No interactions (P > 0.05) were observed between MS and MM or SS; thus, the equation that was established to correct the MN value used only the MS. In conclusion, we have demonstrated that there is no difference when using 15N to estimate MN yield if the omasum or abomasum are used. Therefore, the omasum can be used as an accurate SS to predict MN. The vi triple MS presented with greater values than the single and double MS. Thus, if single or double MS is used, the value must be corrected by the equation that was obtained by using the triple MS. Another study was conducted with the aim of investigating how the feeding regimen (FR) alters apparent total tract digestibility, performance, N balance, excretion of purine derivatives, fat deposition, maternal and fetal visceral organ mass, and the expression of genes that are responsible for placental development, nutrient transfer, and angiogenic factors in Holstein × Gyr cows at different days of gestation (DG). Forty-four pregnant multiparous Holstein × Gyr cows with an average initial body weight of 480 ± 10.1 kg and an initial age of 5 ± 0.5 years were allocated to 1 of 2 FR: ad libitum (AL; n = 20) and maintenance level (ML; n = 24). Maintenance level was considered to be 1.15% of body weight on a dry matter (DM) basis and met 100% of the energy requirements, while AL provided 190% of the total net energy requirements. Cows were individually fed a corn silage-concentrate based diet composed of 93% roughage and 7% concentrate (DM basis) as a total mixed ration. Pregnant cows were slaughtered at 4 DG: 139 (n = 11), 199 (n = 11), 241 (n = 11), and 268 d (n = 11). Overall, DM intake decreased as DG increased. The decrease that was observed in DM intake may be associated with the reduction in ruminal volume caused by the rapid increase in fetal size during late gestation. We observed an interaction for DM and organic matter apparent total tract digestibility between FR and DG; at 150, 178, and 206 d of gestation, ML-fed cows had greater DM and organic matter apparent total tract digestibility values than AL-fed cows. Rib fat thickness, mesentery, and kidney, pelvic, and heart fat were greater in AL- than in ML-fed cows at all DG, with the exception of rib fat thickness on d-139. Ad libitum-fed cows excreted more N in their feces and urine compared to ML-fed cows. Pregnant cows that were fed at maintenance had greater digestibility during some DG, excreted less N in feces and less N and urea in urine, vii and deposited less fat in the body. Mass of the heart, liver, and gastrointestinal tract were heavier in AL- than in ML-fed cows. Feeding regimen did not influence fetal body weight in this study. The majority of the visceral organ masses were similar in fetuses from cows that were fed AL and ML. This data indicates that maternal feed-restriction does not affect the development of most fetal organs and fetal development; however, some maternal organs are affected according to the FR that is provided. Mammary gland mass was heavier in AL- than in ML-fed cows, and the heaviest mass was observed at 268 d of gestation. The negative impact on mammary gland mass caused by the ML probably will not affect the subsequent lactation because the crude protein concentration in the mammary gland increased with this FR. However, we suggest that the AL diet should be provided in pregnant dry cows with caution since the amount of fat in the mammary gland increased at 268 d of gestation. Placenta was heavier in ML- than in AL-fed cows at 268 d of gestation; the lightest mass was observed at 139 d of gestation, and the heaviest mass was observed at 268 d in ML-fed cows. However, in AL-fed cows, the heaviest placenta was observed from 199 d of gestation. Placentomes were heavier in ML-fed cows during gestation, and the number of placentomes was greater in ML-fed cows at 268 d of gestation. We observed that IGFR1 and IGFR2 genes were involved in placental adaptations when ML was provided, as their expression in placentome cells were greater in ML-fed cows at 268 d of gestation. The genes that are responsible for angiogenesis were also greater in ML-fed cows. VEGFA, GUCYB3, HIFA, FGF2, and NOS3 were altered by FR and DG interaction and they were greater in ML-fed cows at 268 d of gestation. Also, VEGFB and ANGPT2 did not present an interaction between FR and DG, but they were greater in ML-fed cows. We recommend ML (1.15% of body weight with 93% of roughage) as a FR for pregnant dry cows; however, during the last month of gestation, AL seems to be the most appropriate FR to avoid loss of body viii weight; however if AL diets in pregnant dry cows were to be provided, it had to be with caution since the amount of fat in the mammary gland increased at 268 d of gestation. Moreover, we suggest that the placenta from ML-fed cows develop adaptations to the reduced nutrient supply by altering its structure and gene expression, thereby developing mechanisms for a potential increase in the nutrient transfer efficiency to the fetus.

Ultrasonographic evaluation of embryo-fetal development of saint ines breed of ewes / Avaliação ultrasonográfica do desenvolvimento embrionário-fetal de ovinos da raça santa inês

This study was evaluated, by transretal ultrasound, the embryonic-fetal development from days 15th to 45th of gestation visualizing the first signs of gestation in 60 Sant Inês ewes. The identification of the earliest and the latest parameters of evaluation were performed between days 15th to 19th (16.7 ± 1,3) of pregnancy for intra-uterine fluid, . embryonic vesicle between days 16th to 22th (18.6 ± 1.4), embryo between 18th to 26th (22.8 ± 1.9), placentoms between 20th to 29th (25.1 ± 2.0), heartbeat between days 24th to 29th (25.9 ± 1.4), amniotic membrane between 24th to 32th (27.4 ± 1.8), head and upper body differentiation between 30th to 37th (33.4 ± 2.2), fetus movement between 30th to 38th (34.2 ± 2.0), umbilical cord between 32th to 39th (35.1 ± 1.5), button of the anterior and posterior members between 34th to 39th (36.7 ± 1.5) and ocular globe between days 39th to 43th (40.9 ± 1.2). It was concluded that the first signs of gestation can be identified as soon as day 15th days of gestation. However, it is wise diagnosing pregnancy after day 24th, when it is possible to visualize the fetus and the heart beat.

Avaliou-se, por ultra-sonografia transretal, o desenvolvimento embrionário-fetal de ovinos Santa Inês, identificando o dia da primeira visualização dos principais parâmetros da gestação de 60 ovelhas entre o 15 e o 45 dia de gestação. A identificação mais precoce e mais tardia dos parâmetros avaliados ocorreu entre os dias 15 e 19 (16,7 ± 1,3) da gestação para líquido intra-uterino, 16 e 22 (18,6 ± 1,4) para vesícula embrionária, 18 e 26 (22,8 ± 1,9) para embrião, 20 e 29 (25,1 ± 2,0) para placentomas, 24 e 29 (25,9 ± 1,4) para batimento cardíaco, 24 e 32 (27,4 ± 1,8) para membrana amniótica, 30 e 37 (33,4 ± 2,2) para diferenciação entre cabeça e tronco, 30 e 38 (34,2 ± 2,0) para movimento do feto, 32 e 39 (35,1 ± 1,5) para cordão umbilical, 34 e 39 (36,7 ± 1,5) para botão dos membros anteriores e posteriores e entre os dias 39 e 43 (40,9 ± 1,2) para globo ocular. Conclui-se que é possível identificar os primeiros sinais de gestação já no 15º dia, todavia, é prudente que o diagnóstico de gestação somente seja emitido a partir do 24º dia, quando é possível visualizar o embrião e seus batimentos cardíacos.

Desenvolvimento e composição química do útero gravídeo, da glândula mamária e as mudanças corporais em cabras durante a gestação

O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da restrição alimentar, tipo e a fase de gestação de cabras nas alterações que ocorrem no corpo materno e na dinâmica do desenvolvimento do útero gravídeo e da glândula mamária. Foram realizados dois experimentos, em que o primeiro, foi conduzido em delineamento interiamente casualizado com esquema fatorial (3x2x2), sendo três idades gestacionais (80; 110 e 140), duas raças (Saanen e Alpina) e dois tipos de gestação (simples e dupla); e o segundo experimento foi em blocos casualizados, em esquema fatorial 3x3x2 sendo três níveis de restrição alimentar (0, 20 e 40 %), três dias de gestação (80; 110 e 140) e duas raças (Saanen e Alpina). Aos 80; 110 e 140 dias de gestação, as cabras foram abatidas. Após o abate, foi removida a glândula mamária e o útero gravídeo. Os componentes do útero grávido (útero vazio, placenta, placentomas, liquído placentário e fetos) foram separados e pesados. Nos fetos foram realizadas medidas biométricas e identificação do sexo. O corpo das fêmeas gestantes foi pesado separado em carcaça, orgãos, trato digestório, gordura intracavitária e sangue. Individualmente os fetos das cabras da raça Alpina foram mais pesados (P<0,05). Os pesos individuais dos fetos de gestação simples foram superiores aos de gestação gemelar, no entanto os pesos e as deposições de nutrientes nos componentes do útero gravídeo foram maiores para as cabras de gestação gemelar (P<0,05). A restrição alimentar não interferiu no desenvolvimento do útero gravídeo e da glândula mamária (P>0,05). Os pesos e as deposições de nutrientes nos fetos e no útero gravídeo aumentaram exponencialmente ao longo da gestação, porém na glândula este aumentou foi de forma linear (P<0,05). O peso dos depósitos de gorduras, da carcaça...

The aim of this study was to evaluate the effects of nutritional management, type and stage of gestation of goats on changes that occur in the maternal body and in the dynamics of the development of gravid uterus and mammary gland. Two experiments were conducted, being the first a factorial design, with three days of gestation (80, 110 and 140), two breeds (Saanen and Alpine) and two types of pregnancy (single and double), and second experiment was in randomized blocks with factorial 3x3x2, being three nutritional levels (0, 20 and 40% restriction), three days of gestation (80, 110 and 140) and two breeds (Saanen and Alpine). At 80, 110 and 140 days of gestation, the goats were slaughtered. After slaughter, both mammary gland and pregnant uterus were removed. The components of the pregnant uterus were separated and weighed. Biometric measures and the identification of the sex were made in the fetuses. The body of the pregnant females were separated weighed into carcass, external components, digestive tract, fat intracavitary and blood. The individual weights of fetuses of Alpine goats were heavier (P<0.05). The individual weights of fetuses of simple gestation were superior to twin gestation, however, the weights and the deposition of nutrients in the pregnant uteru?s components were higher for the goats of twin pregnancy (P<0.05). Nutritional restriction did not affect the growth of the gravid uterus and mammary gland (P>0.05). Weights and nutrients deposition in fetus and pregnant uteru?s exponentially increased throught the gestation, but in this gland was increased linearly (P<0.05).The weight of the carcass, fat and stomach of the goats were reduced in late pregnancy (P<0.05). Goats of twin gestation should receive a higher nutrient intake than goats of single pregnancy

Desenvolvimento do útero grávido e da glândula mamária e mudanças corporais em cabras leiteiras durante a gestação

O objetivo do experimento foi estudar o crescimento do útero grávido e da glândula mamária e as mudanças corporais em cabras leiteiras durante a gestação. A técnica usada foi a do abate comparativo. O experimento foi em esquema fatorial, sendo quatro dias de gestação (0; 80; 110 e 140), duas raças (Saanen e Alpina) e dois tipos de gestação (simples e dupla), sendo que para os componentes do útero grávido o dia zero não foi considerado. O modelo utilizado foi Ln(Y)= (b0 + b1T + b2T2) + ?, sendo T o tempo de gestação e b os parâmetros da equação. Dez cabras não gestantes e não lactantes foram abatidas e 39 foram cobertas. As cabras cobertas, após 30 dias foram distribuídas em dois lotes conforme o número de fetos e subdivididas em seis sub-lotes, três para cada raça. Aos 80; 110 e 140 dias de gestação, um lote de cada raça foi abatido. Antes do abate foram feitas as medidas biométricas. Após o abate, foi removida a glândula mamária e o útero grávido. Os componentes do útero grávido (útero vazio, fetos, membrana placentária, placentomas e fluídos uterinos) foram separados e pesados. Nos fetos foram realizadas medidas morfométricas e identificação do sexo. A glândula mamária foi pesada após a retirada da pele e tetos. O corpo dos animais livre do peso do útero e da glândula mamária foi separado em carcaça, componentes externos (coração, fígado, baço, pulmões e pâncreas), trato digestório, gordura intracavitária, sangue e outros componentes (traquéia, esôfago, diafragma e língua). A dinâmica do crescimento do útero grávido, da glândula mamária e da mudança no corpo materno pode ser estimada por modelos matemáticos biologicamente explicáveis. As medidas morfométricas foram utilizadas com precisão na estimativa da idade e peso fetal. O peso do útero grávido pode ser estimado pelo perímetro abdominal

The aim of this experiment was to study the growth of the pregnant uterus and mammary gland and the body changes in dairy goats during pregnancy. It was used the technique of the comparative slaughter. The experimental was a 3x2x2 factorial. The model used was log (Y) = (b0 + b1T + b2T2) + ?, where T was the time of pregnancy and b the parameters of the equation. Ten empty goats and not lactating were slaughtered and 39 were covered. After 30 days this goats (the covered ones) were divided into two lots as the number of fetuses and subdivided into six sub-plots, three for each breed. At 80, 110 and 140 days of gestation, a lot of each breed was slaughtered. Biometric measurements were made before the slaughter, and after this the mammary gland and pregnant uterus were removed. The components of the pregnant uterus ( empty womb, fetuses, placental membranes, placentomes and uterine fluid) were separated and weighted. Morphometric measures and the identification of the sex were made in the fetuses. The mammary gland was weighted after the removal of the skin and ceilings. The animals' body weight without the uterus and the mammary gland was separated in carcass, external components (heart, liver, spleen, lungs and pancreas), digestive tract, intracavitary fat, blood and other components (trachea, esophagus, diaphragm and tongue). The growth dynamics of the pregnant uterus, mammary gland and the change in the maternal body can be estimated by mathematical models that are biologically explainable. The morphometric measurements were used with accuracy to estimate the age and fetal weight. The pregnant uteru?s weight can be estimated by abdominal circumference

Interação celular na placenta de gestações de bovinos clonados com especial ênfase às integrinas / Cell-cell interactions in the bovine placenta from pregnancies with cloned fetuses with special respect to integrins and their receptors

Integrinas são glicoproteínas transmembrânicas envolvidas na adesão célula-célula e célula-proteina da matriz extracellular (ECM) que participam da migração e fusão de células trofoblásticas gigantes (TGC) com células do epitélio materno no placentoma bovino e interagem com inibidores teciduais de metalloproteinases (TIMPs), considerados importantes reguladores das metaloproteinases de matriz (MMPs), que são reconhecidas como passo limitande para ação de enzimas que atuam no remodelamento da ECM na implantação e na gestação. Uma vez que as integrinas são consideradas responsáveis pela manutenção da arquitetura tecidual e que as MMPs podem regular a degradação e a reconstituição da ECM necessária para a invasão do trofoblasto, temos como objetivo verificar uma possível relação das integrinas com alterações placentárias comumente observadas em gestações de animais clonados (SCNT). Para avaliar a funcionalidade placentária, a expressão do lactogênio placentário (PL) e do antígeno Ki-67 foram também verificadas. Placentomas bovinos foram coletados e divididos em 3 grupos: 1) início (n = 6) e 2) final (n = 3) da gestação de animais derivados de monta natural (n=9) e final da gestação de animais clonados (n=8), clones machos (n=4) e clones fêmeas (n=4). As proteínas foram localizadas por imuno-histoquímica indireta, exceto as subunidades de integrina α6, β1, αV e β3 que foram localizadas por imunofluorescência. A especificidade dos anticorpos e expressão protéica foi confirmada por Western blot e a expressão do RNAm foi avaliada por meio de RT-PCR e PCR em tempo real quantitativo. As células positivas para a laminina, TIMP-2, Ki-67 e lactogênio placentário (PL) foram quantificadas e para comparação entre os grupos. A proteína das subunidades α6 do receptor de integrina e β1 foi observada nos animais clonados e não clonados nos estromas materno e fetal e porção basal dos epitélios materno e fetal e foi co-localizada com a laminina. A proteína das subunidades αV e β3 do receptor de integrina foi observado nos estromas materno e fetal e foi co-localizado com a fibronectina. O TIMP-2 foi exclusivamente e especificamente localizado nas TGCs no início e final da gestação de animais clonados e não clonados, mas não houve diferença significativa em sua expressão. O PL apresentou a mesma localização do TIMP-2 em todos os grupos analisados. Houve diferença significativa (p<0,05) entre 270d e clones ao se comprar a expressão relativa do RNAm da subunidade de integrina β1 e do lactogênio placentário e ao se comparar a expressão protéica por western blot da laminina e do TIMP-2. Foi possível observar diferença significativa (p<0,05) entre o grupo controle e o grupo de animais clonados ao se quantificar o número de TGCs positivas para a laminina e para o lactogênio placentário. Apesar de algumas diferenças terem sido observadas na expressão de integrinas e de proteínas da ECM, sugere-se que a interação das integrinas com seus ligantes da ECM a termo não é um determinante da sobrevivência neonatal de bovinos clonados. Contudo, outros estudos são necessários para esclarecer se estas proteínas representam elementos chave na placentação de bovinos clonados em início de gestação. As diferenças observadas na expressão de integrinas e principalmente do PL entre clones fêmeas e machos sugerem possível influência de genes associados ao cromossomo sexual ou imprinting

Integrins are transmembrane glycoproteins involved in cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) adhesion and signal transduction. They participate in the migration and fusion of trophoblast giant cells (TGC) with uterine epithelial cells in bovine placentomes, and interact with tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), considered important regulators of matrix metalloproteinases (MMPs). MMPs are rate-limiting enzymes degrading ECM proteins during tissue remodeling around embryo implantation, pregnancy and parturition. Since integrins are considered to be responsible for the maintenance of the architecture within tissues and MMPs may also regulate degradation and reconstitution of ECM required for trophoblast invasion, we aimed to verify a potential relation of integrins with common placental alterations observed in cloned animals (SCNT). To verify the placental functionality, expression of placental lactogen (PL) and Ki-67 antigen was also assessed. Bovine placentomes were collected and divided into 3 groups: 1) early and 2) late gestation derived from natural mating (n=9) and 3) late gestational bovine clones (n=8), also divided into male clones (n=4) and female clones (n=4). All proteins were localized by indirect immunohistochemistry except for integrin subunits α6, β1, αV and β3 that were shown by immunofluorescence. The antibody specificity and protein expression were confirmed by Western blot. Expression of mRNA was evaluated using RT-PCR and quantitative Real Time PCR. Positive cells for laminin, TIMP-2, Ki-67 and placental lactogen were quantified for comparisons among groups. The protein of integrin receptor subunits α6 and β1 was observed in both cloned and non-cloned animals in the fetal and maternal stroma and at the basal membrane of maternal and fetal epithelial cells, co-localized with laminin and with collagen IV. The integrin receptor subunits αV and β3 were observed in the fetal and maternal stroma, co-localized with fibronectin. TIMP-2 was specifically and exclusively localized in TGC in the early and term gestation in both cloned and non-cloned animals. PL has shown the same localization of TIMP-2 in all analyzed samples. Statistically significant differences (p<0,05) between term gestation of non-cloned and cloned animals were observed comparing the mRNA expression of integrin β1 subunit and placental lactogen and the protein expression of laminin and TIMP-2. There were also statistically significant differences (p<0,05) between non-cloned and cloned animals in the number of laminin and placental lactogen positive cells. Despite some differences in integrin and ECM proteins expression, our results suggest that the interaction between integrins and their ECM ligands in term gestation is not a determinant for the survival rate of newborn cloned calves. However further studies are necessary to elucidate if integrins represent key elements in the early placentation of SCNT bovines. The differences found in the integrin and principally in the placental lactogen expression between female and male cloned calves suggests the influence of sex-chromosome associated genes or imprinting

Bovine placentome preservation for light microscopy evaluation

This work evaluates the preservation of bovine placentomes using paraformaldehyde and glutaraldehyde at 4% and solutions of Karnovsky, Bouin and Carnoy for 4, 12 and 24 hours fixation, at room temperature or at 4ºC, before inclusion in plastic resin and paraffin. The best preservation of the specimens was obtained after 12 hours of fixation with those solutions containing aldehydes. With Bouin solution the best time of fixation was 4 hours, while for Carnoy solution the best time of fixation was 24 hours. Inclusion in plastic resin gave better results than in paraffin, and the temperature did not influence the quality of preservation of the specimens of bovine placentomes for evaluation with light microscopy.

Avaliou-se a preservação de placentomas bovinos com as soluções fixadoras paraformaldeído e glutaraldeído a 4% e soluções de Karnovsky, Bouin e Carnoy nos tempos de 4, 12 e 24 horas de fixação, à temperatura ambiente ou a 4ºC, incluídos em resina plástica e parafina. A melhor preservação dos placentomas foi obtida com os fixadores à base de aldeídos, a partir de 12 horas de fixação. Em Bouin, os espécimes foram melhor preservados quando fixados por 4 horas, enquanto que em Carnoy a preservação foi melhor com 24 horas. A inclusão em resina plástica apresentou resultados superiores do que em parafina. A temperatura de fixação, 4ºC ou ambiente, não influenciou na preservação dos espécimes de placentoma para estudos em microscopia óptica.

Hidropsia uterina em bovinos / Hidropsia uterina em bovinos

One case of hydrops uterine was observed in a female bovine, holstein cross, 5 years old, 8 mounts of pregnancy, with enlarged abdomen and sudden death. In the necropsy were observed hydrallantois, adventitious placentae, small placentomes and reduced numbers of placentomes, and one dead normal fetus slightly edematousus.

Relato de um caso de hidropsia uterina observada em uma fêmea bovina, mestiça holandesa, de 5 anos de idade, gestante de 8 meses, que apresentou um aumento exagerado do volunte abdominal e morte súbita. A necropsia confirmou-se o diagnóstico de hidroalantóide, com pontos de fixação adventícia da placenta, placentomas pequenos e com redução de número, e um feto morto de características normais e levemente edematoso.

Hidropsia uterina em bovinos / Hidropsia uterina em bovinos

One case of hydrops uterine was observed in a female bovine, holstein cross, 5 years old, 8 mounts of pregnancy, with enlarged abdomen and sudden death. In the necropsy were observed hydrallantois, adventitious placentae, small placentomes and reduced numbers of placentomes, and one dead normal fetus slightly edematousus.  

Relato de um caso de hidropsia uterina observada em uma fêmea bovina, mestiça holandesa, de 5 anos de idade, gestante de 8 meses, que apresentou um aumento exagerado do volunte abdominal e morte súbita. A necropsia confirmou-se o diagnóstico de hidroalantóide, com pontos de fixação adventícia da placenta, placentomas pequenos e com redução de número, e um feto morto de características normais e levemente edematoso.    

Volumetric proportions of the goat placenta structural components throughout gestation / Proporção volumétrica dos componentes estruturais da placenta caprina ao longo da gestação

The goal of this research was to determine the volumetric proportions of the structural components of the goat placenta throughout gestation. We used nine goats of nondefined breed, separated into groups A, B and C, with 90, 120 and 150 days of gestation, respectively. From each animal fragments of three placentomes were obtained, one removed from the base, another from the middle part and the other from the end of the gestational uterine horn. The fragments were fixed in Bouin solution and histologically processed according to the standard techniques and stained with hematoxilin-eosin. Microscopically, a 25-point circular grid (Zeiss KPL ocular 6.3x with 25 points) was randomly used across the placentome to determine the volumetric proportion of the maternal and fetal connective tissue, syncytium, trophoblastic epithelium and binucleate cells. An increase of volumetric proportion of the syncytium was found at the end of gestation and also a decrease of volumetric proportion of fetal connective tissue in the same period.

O objetivo deste estudo foi determinar as proporções volumétricas dos componentes estruturais da placenta caprina ao longo da gestação. Foram utilizadas nove cabras adultas sem raça definida, separadas em grupos A, B e C, com 90, 120 e 150 dias de gestação, respectivamente. De cada animal foram colhidos fragmentos de três placentomas, sendo um localizado na base do corno uterino, outro no terço médio e o último da extremidade. Os fragmentos foram fixados em solução de Bouin, processados segundo as técnicas rotineiras de inclusão em parafina e corados pela hematoxilina e eosina. Microscopicamente, uma ocular integradora (Ocular Zeiss KPL 6,3x com 25 pontos) foi aleatoriamente sobreposta sobre a secção do placentoma para a determinação da proporção volumétrica do tecido conjuntivo materno e fetal, do sincício, do epitélio trofoblástico e das células binucleadas. Foi observado aumento na proporção volumétrica do sincício ao final da gestação e diminuição do tecido conjuntivo fetal no mesmo período.

ULTRASONOGRAPHIC EVALUATION OF EMBRYO-FETAL DEVELOPMENT OF SAINT INES BREED OF EWES / AVALIAÇÃO ULTRASONOGRÁFICA DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO-FETAL DE OVINOS DA RAÇA SANTA INÊS

This study was evaluated, by transretal ultrasound, the embryonic-fetal development from days 15th to 45th of gestation visualizing the first signs of gestation in 60 Sant Inês ewes. The identification of the earliest and the latest parameters of evaluation were performed between days 15th to 19th (16.7 ± 1,3) of pregnancy for intra-uterine fluid, . embryonic vesicle between days 16th to 22th (18.6 ± 1.4), embryo between 18th to 26th (22.8 ± 1.9), placentoms between 20th to 29th (25.1 ± 2.0), heartbeat between days 24th to 29th (25.9 ± 1.4), amniotic membrane between 24th to 32th (27.4 ± 1.8), head and upper body differentiation between 30th to 37th (33.4 ± 2.2), fetus movement between 30th to 38th (34.2 ± 2.0), umbilical cord between 32th to 39th (35.1 ± 1.5), button of the anterior and posterior members between 34th to 39th (36.7 ± 1.5) and ocular globe between days 39th to 43th (40.9 ± 1.2). It was concluded that the first signs of gestation can be identified as soon as day 15th days of gestation. However, it is wise diagnosing pregnancy after day 24th, when it is possible to visualize the fetus and the heart beat.

Avaliou-se, por ultra-sonografia transretal, o desenvolvimento embrionário-fetal de ovinos Santa Inês, identificando o dia da primeira visualização dos principais parâmetros da gestação de 60 ovelhas entre o 15 e o 45 dia de gestação. A identificação mais precoce e mais tardia dos parâmetros avaliados ocorreu entre os dias 15 e 19 (16,7 ± 1,3) da gestação para líquido intra-uterino, 16 e 22 (18,6 ± 1,4) para vesícula embrionária, 18 e 26 (22,8 ± 1,9) para embrião, 20 e 29 (25,1 ± 2,0) para placentomas, 24 e 29 (25,9 ± 1,4) para batimento cardíaco, 24 e 32 (27,4 ± 1,8) para membrana amniótica, 30 e 37 (33,4 ± 2,2) para diferenciação entre cabeça e tronco, 30 e 38 (34,2 ± 2,0) para movimento do feto, 32 e 39 (35,1 ± 1,5) para cordão umbilical, 34 e 39 (36,7 ± 1,5) para botão dos membros anteriores e posteriores e entre os dias 39 e 43 (40,9 ± 1,2) para globo ocular. Conclui-se que é possível identificar os primeiros sinais de gestação já no 15º dia, todavia, é prudente que o diagnóstico de gestação somente seja emitido a partir do 24º dia, quando é possível visualizar o embrião e seus batimentos cardíacos.

Avaliação de dois métodos de diagnóstico precoce de gestação em ovelhas: ultra-sonografia transretal e detector de prenhez para pequenos ruminantes (DPPR-80®) / Evaluation of two methods for early pregnancy diagnosis in ewes: transrectal ultrasonography and pregnancy detector for small ruminant (DPPR-80®)

No período de março a maio de 2001, foram realizados os exames ultra-sonográficos em 88 ovelhas do Núcleo de Pesquisas Zootécnicas Sudoeste - Instituto de Zootecnia. Os animais foram examinados entre o 19º e 33º dia de gestação pela ultra-sonografia transretal com exames executados em dias alternados, e do 25º ao 45º dia pelo detector de prenhez para pequenos ruminantes (DPPR-80O). O diagnóstico foi considerado positivo pela ultra-sonografia transretal por meio da visualização do saco gestacional e embrião. Após o 25º dia de gestação foi observado também o batimento cardíaco embrionário, cuja freqüência é de 160 a 200 batimentos por minuto. Esta observação foi dada como diagnóstico de gestação. Os nascimentos confirmaram os resultados dos exames. Dentre 88 fêmeas acasaladas, 3 abortaram durante o experimento e foram retiradas do grupo. Das 85 fêmeas restantes, 64 pariram. O diagnóstico de prenhez por meio da ultra-sonografia transretal apresentou 35,29 por cento de acurácia no 19º dia de gestação, culminando em 82,35.00 por cento no 31º dia de gestação. Pelo detector de prenhez, a acurácia foi de 24,71 por cento no 25º dia de gestação e 34,12.00 por cento no 45º dia. Foi possível visualizar os batimentos cardíacos do embrião pela ultra-sonografia transretal à partir do 21º dia de gestação e os primeiros placentomas foram observados ao redor do 25º dia de gestação. A ultra-sonografia transretal mostrou-se um método superior ao detector de prenhez para pequenos ruminantes, para diagnóstico precoce de gestação em ovelhas.(AU)