Nanoparticles from culture media are internalized by in vitro-produced bovine embryos and its depletion affect expression of pluripotency genes

Abstract Extracellular vesicles are nanoparticles secreted by cell and have been proposed as suitable markers to identify competent embryos produced in vitro. Characterizing EVs secreted by individual embryos is challenging because culture medium itself contributes to the pool of nanoparticles that are co-isolated. To avoid this, culture medium must be depleted of nanoparticles that are present in natural protein source. The aim of this study was to evaluate if the culture medium subjected to nanoparticle depletion can support the proper in vitro development of bovine embryos. Zygotes were cultured in groups on depleted or control medium for 8 days. Nanoparticles from the medium were characterized by their morphology, size and expression of EVs surface markers. Isolated nanoparticles were labelled and added to depleted medium containing embryos at different developmental stages and evaluated after 24 hours at 2, 8-16 cells, morula and blastocyst stages. There were no statistical differences on blastocyst rate at day 7 and 8, total cell count neither blastocyst diameter between groups. However, morphological quality was better in blastocysts cultured in non-depleted medium and the expression of SOX2 was significantly lower whereas NANOG expression was significantly higher. Few nanoparticles from medium had a typical morphology of EVs but were positive to specific surface markers. Punctuated green fluorescence near the nuclei of embryonic cells was observed in embryos from all developmental stages. In summary, nanoparticles from culture medium are internalized by in vitro cultured bovine embryos and their depletion affects the capacity of medium to support the proper embryo development.

Nanoparticles from culture media are internalized by in vitro-produced bovine embryos and its depletion affect expression of pluripotency genes

Extracellular vesicles are nanoparticles secreted by cell and have been proposed as suitable markers to identify competent embryos produced in vitro. Characterizing EVs secreted by individual embryos is challenging because culture medium itself contributes to the pool of nanoparticles that are co-isolated. To avoid this, culture medium must be depleted of nanoparticles that are present in natural protein source. The aim of this study was to evaluate if the culture medium subjected to nanoparticle depletion can support the proper in vitro development of bovine embryos. Zygotes were cultured in groups on depleted or control medium for 8 days. Nanoparticles from the medium were characterized by their morphology, size and expression of EVs surface markers. Isolated nanoparticles were labelled and added to depleted medium containing embryos at different developmental stages and evaluated after 24 hours at 2, 8-16 cells, morula and blastocyst stages. There were no statistical differences on blastocyst rate at day 7 and 8, total cell count neither blastocyst diameter between groups. However, morphological quality was better in blastocysts cultured in non-depleted medium and the expression of SOX2 was significantly lower whereas NANOG expression was significantly higher. Few nanoparticles from medium had a typical morphology of EVs but were positive to specific surface markers. Punctuated green fluorescence near the nuclei of embryonic cells was observed in embryos from all developmental stages. In summary, nanoparticles from culture medium are internalized by in vitro cultured bovine embryos and their depletion affects the capacity of medium to support the proper embryo development.(AU)

Mountain high and valley deep: epigenetic controls of pluripotency and cell fate

All the somatic cells composing a mammalian organism are genetically identical and contain the same DNA sequence. Nevertheless, they are able to adopt a distinct commitment, differentiate in a tissue specific way and respond to developmental cues, acquiring a terminal phenotype. At the end of the differentiation process, each cell is highly specialized and committed to a distinct determined fate. This is possible thanks to tissue-specific gene expression, timely regulated by epigenetic modifications, that gradually limit cell potency to a more restricted phenotype-related expression pattern. Complex chemical modifications of DNA, RNA and associated proteins, that determine activation or silencing of certain genes are responsible for the ‘epigenetic control’ that triggers the restriction of cell pluripotency, with the acquisition of the phenotypic definition and the preservation of its stability during subsequent cell divisions. The process is however reversible and may be modified by biochemical and biological manipulation, leading to the reactivation of hypermethylated pluripotency genes and inducing cells to transit from a terminally committed state to a higher plasticity one.These epigenetic regulatory mechanisms play a key role in embryonic development since they drive phenotype definition and tissue differentiation. At the same time, they are crucial for a better understanding of pluripotency regulation and restriction, stem cell biology and tissue repair process.

Mountain high and valley deep: epigenetic controls of pluripotency and cell fate

All the somatic cells composing a mammalian organism are genetically identical and contain the same DNA sequence. Nevertheless, they are able to adopt a distinct commitment, differentiate in a tissue specific way and respond to developmental cues, acquiring a terminal phenotype. At the end of the differentiation process, each cell is highly specialized and committed to a distinct determined fate. This is possible thanks to tissue-specific gene expression, timely regulated by epigenetic modifications, that gradually limit cell potency to a more restricted phenotype-related expression pattern. Complex chemical modifications of DNA, RNA and associated proteins, that determine activation or silencing of certain genes are responsible for the ‘epigenetic control that triggers the restriction of cell pluripotency, with the acquisition of the phenotypic definition and the preservation of its stability during subsequent cell divisions. The process is however reversible and may be modified by biochemical and biological manipulation, leading to the reactivation of hypermethylated pluripotency genes and inducing cells to transit from a terminally committed state to a higher plasticity one.These epigenetic regulatory mechanisms play a key role in embryonic development since they drive phenotype definition and tissue differentiation. At the same time, they are crucial for a better understanding of pluripotency regulation and restriction, stem cell biology and tissue repair process.(AU)

EFEITOS DE DIFERENTES TENSÕES DE OXIGÊNIO NA EFICIÊNCIA DA REPROGRAMAÇÃO E MANUTENÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES INDUZIDAS DE EQUINO

Células tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são uma ferramenta promissora para o tratamento de doenças, seja através de seu uso na medicina regenerativa, com estudos clínicos in vitro, ou ainda em estudos na área básica para desvendar mecanismos fisiológicos e patológicos. No entanto, algumas limitações, como a idade avançada do doador, o estado de senescência celular ou até mesmo as condições da atmosfera gasosa utilizadas no cultivo in vitro podem diminuir a eficiência da reprogramação à pluripotência. Dessa forma, a presente tese teve como objetivo estudar os efeitos do oxigênio no cultivo de células iPSC de equino (eiPSC), sendo na reprogramação à pluripotência ou nas iPSC originadas. No capítulo 1 uma revisão de literatura foi realizada a fim de sustentar a hipótese e justificar o estudo. No capítulo 2, o efeito das diferentes tensões de oxigênio (tensão de oxigênio atmosférica aproximadamente 20% O2; tensão de oxigênio reduzida - 5% O2; ou a mudanças da atmosfera gasosa de aproximadamente 20% O2 para 5% O2) foi estudado durante o processo de reprogramação celular à pluripotência. Para tanto, a eficiência de reprogramação em cada grupo foi considerada, e uma avaliação seriada, a cada 3 dias, da expressão de genes chave de pluripotência (OCT4, SOX2, REX-1 e NANOG), genes relacionados ao metabolismo da glicose (GAPDH, e PFKM), genes relacionados aos processos de fusão e fissão mitocondriais (MFN1 e DNM1L), e genes relacionados a resposta da célula à baixa tensão de oxigênio (HIF1, HIF2, e VEGFA), foram realizadas, através de uma análise descritiva. A eficiência de reprogramação encontrada foi maior para o grupo cultivado em baixo oxigênio (grupo B). A alta eficiência de reprogramação do grupo B teve aparente correlação com uma maior expressão de OCT4 e NANOG e menor expressão de MFN1. Por outro lado, os resultados encontrados para o GAPDH sugeriram uma correlação negativa com a eficiência de reprogramação, e os genes HIF1 e HIF2 apresentaram expressão com menores valores no grupo B do que nos demais. Os resultados encontrados comprovam a hipótese de que a tensão de oxigênio influenciou na reprogramação das células eiPSC, já que observamos mudanças na expressão gênica entre os grupos ao longo da reprogramação. Além disso, a eficiência de formação de colônias eiPSC em baixo oxigênio foi maior que em alto oxigênio. No capítulo 3, eiPSC de um animal de mais de 20 anos de idade foram obtidas e o efeito das mesmas diferentes tensões de oxigênio propostas no capítulo 2 foi estudado nessas células. A reprogramação das células do animal idoso foi possível, como demonstrado pela coloração positiva para fosfatase alcalina; expressão endógena de mRNA de genes relacionados à pluripotência (OCT4, SOX2, REX-1 e NANOG) em todas as colônias avaliadas; coloração positiva no ensaio de imunofluorescência para OCT4 e NANOG (todos os grupos), SOX2 (grupo 5% O2 e 20% para 5% O2) e TRA-1-60, TRA-1-81 e SSEA-1 (somente em 20% O2), demonstrando diferenças entre os grupos; a formação de corpos embrióides; e diferenciação celular espontânea nas três camadas germinativas embrionárias mesoderme, endoderme e ectoderme. Diferenças na morfologia das colônias de eiPSC geradas foram observadas, sendo que as células do grupo cultivado em 20% O2 apresentaram maior similaridade com células naïve e as células dos grupos cultivados em 5% O2 e 20% para 5% O2 maior similaridade com a morfologia de células primed. Diferenças significativas foram também observadas na expressão dos genes GAPDH, GLUT3, MFN1, HIF1 e HIF2, relacionados ao metabolismo da glicose, fissão mitocondrial, e hipóxia, respectivamente, após a reprogramação. Nossos resultados demonstram que a derivação de eiPSC não foi prejudicada pela idade avançada do animal. Além disso, esse estudo é o primeiro a comparar o cultivo de iPSC de equino em alto e baixo oxigênio e a demonstrar que o oxigênio influencia no processo de reprogramação nesses animais, como indicado pela geração de células pluripotentes com diferentes perfis; nas condições testadas, a tensão de oxigênio mais baixa foi responsável por uma maior eficiência de reprogramação, em acordo com o demonstrado no capítulo 2, mas não favoreceu a pluripotência das eiPSC.

Induced pluripotent stem cells (iPSC) are a promising tool for treating diseases, through their use in regenerative medicine, clinical trials, and studies in the basic area for unveiling physiological and pathological mechanisms. However, there still are some barriers for the obtention of these cells by reprogramming them to pluripotency. Limiting factors for the reprogramming process may come from the cells itself, as the advanced cellular donor age, high passage number in culture and the cellular senescence state; or they can be due to the culture conditions in vitro, as the gas atmosphere in which the cells are being cultured. Thus, the present thesis has the objective of studying the oxygen effects in the iPSC culture, in reprogramming to pluripotency and in the maintenance of the equine iPSC (eiPSC) obtained. In chapter 1 a literature review was made to give support to the hypothesis and justify this work. In chapter 2, the effect of different oxygen tensions (atmospheric oxygen tension 20% O2 approximately; reduced oxygen tension 5% O2; or the change of gas atmosphere from 20% O2 to 5% O2) was studied during reprogramming to pluripotency process. Therefore, the reprogramming efficiency was determined, and a serial evaluation, each 3 days, of the expression of key pluripotency genes (OCT4, SOX2, REX-1 and NANOG), genes related to cellular metabolism (GAPDH and PFKM), genes related to mitochondrial fusion and fission processes (MFN1 and DNM1L), and genes related to cellular response to low oxygen tension (HIF1, HIF2, and VEGFA), were performed. The reprogramming efficiency was higher in group cultured in low oxygen tension (group B). The high reprogramming efficiency in group B correlates with higher expression of OCT4 and NANOG in this group and lower expression of MFN1. On the other hand, GAPDH showed a negative correlation with the reprogramming efficiency and HIF1 and HIF2 genes presented a lower expression in group B compared to the other groups. Based on these results it is possible to confirm the hypothesis that the oxygen tension influenced reprogramming of eiPSC, and the efficiency of reprogramming in low oxygen is higher than in high oxygen. In chapter 3 we aimed to generate and maintain eiPSC derived from fibroblasts of a horse older than 20 years and to evaluate the effect of the same oxygen conditions, already proposed in chapter 2, on these cells. Reprogramming of the aged animal cells was possible, as shown by positive alkaline phosphatase staining; endogenous expression of mRNA of pluripotency-related genes (OCT4, SOX2, REX-1 and NANOG) in all evaluated colonies; immunofluorescence positive staining for OCT4 and NANOG (all groups), SOX2 (groups 5% O2 and 20%-to-5% O2) and TRA-1-60, TRA-1-81 and SSEA-1 (only in 20% O2), showing differences between the groups; the formation of embryoid bodies; and spontaneous cell differentiation in mesoderm, endoderm and ectoderm embryonic germ layers. The eiPSC colonies generated at 20% O2 presented with a more naïve-like morphology, while groups cultured in 5% O2 or 20% to 5% O2 presented a more primed morphology. Significant differences were also observed in the expression of GAPDH, GLUT3, MFN1, HIF1 and HIF2, genes related to glucose metabolism, mitochondrial fission, and hypoxia, respectively, after reprogramming. Moreover, fibroblasts of the old animal proliferated slowly, as detected by the population doubling time assay, and TERT expression was only increased after reprogramming, suggesting the fibroblasts were senescent before reprogramming and a reversion of this state occurred. Our results show that the derivation of iPSC from an adult equine was not impaired by aging. Additionally, this study is the first to compare high- and low-oxygen cultures of equine iPSC and to demonstrate that oxygen influences the reprogramming process, as indicated by the generation of pluripotent cells with different profiles; under the tested conditions, the lower oxygen tension was responsible for a higher reprogramming efficiency rate, according to the results described in chapter 2, but did not favor the pluripotency of eiPSC.

PERFIL DE EXPRESSÃO DE GENES ASSOCIADOS À QUALIDADE E IMPLANTAÇÃO DE EMBRIÕES OVINOS CRIOPRESERVADOS POR DIFERENTES TÉCNICAS

A transferência de embriões frescos resulta em maior taxa de gestação comparada à transferência de embriões criopreservados, sugerindo comprometimento do estabelecimento da gestação após criopreservação. Este estudo objetivou avaliar o efeito da técnica de criopreservação (vitrificação ou congelação lenta) de embriões ovinos produzidos in vivo, na taxa de sobrevivência e perfil de expressão de genes relacionados à apoptose (BAX, BCL2), proliferação e diferenciação celular (TGFB1), respiração celular (NFR1), manutenção da pluripotência (NANOG) e implantação (CDX2). Trinta e duas ovelhas foram submetidas à superovulação e posterior coleta de embriões. Os embriões obtidos foram classificados quanto ao estágio de desenvolvimento e qualidade. Os embriões GI e GII foram uniformemente distribuídos dentro dos grupos experimentais: CONT) blastocistos frescos (n=15); CONG) congelação lenta (n=42); ou VIT) vitrificação (n=43). Os embriões CONT foram congelados a seco em três pools de cinco embriões, para posterior RT-qPCR. Os embriões CONG e VIT após descongelamento/aquecimento, respectivamente, foram alocados para análise de expressão gênica ou cultivo in vitro (24 e 48 h) em meio SOF com aminoácidos suplementado com 2,5% soro fetal bovino, a 38,5 °C e 5% CO2 (CONG: n=27; VIT: n=28). As taxas de sobrevivência de CONG e VIT foram, respectivamente, 29,6% (8/27) e 14,2% (4/28) em 24 h; e 48,1% (13/27) e 32,1% (9/28) em 48 h (P > 0,05). Independentemente da técnica de criopreservação, o gene CDX2 foi super expresso (P < 0,05) quando comparado ao CONT. A expressão dos genes BAX, BCL2, TGFB1 e CDX2 foi aumentada no grupo VIT (P < 0,05) quando comparados ao CONT. Contudo, quando as duas técnicas de criopreservação foram comparadas, apenas o gene BAX foi super expresso (P < 0,05) no VIT, em comparação com o CONG. Esses dados sugerem que o decréscimo de 16% (não-significativo) na taxa de sobrevivência, observado no grupo VIT, pode estar associado ao aumento na expressão do gene pró-apoptótico (BAX). Em conclusão, a técnica de vitrificação levou a um decréscimo de 16% (não significativo) na taxa de sobrevivência do embrião e aumento do gene pró-apoptótico.

Transfer of fresh sheep embryos have a higher pregnancy rate compared to cryopreserved embryos, suggesting that cryopreservation compromises embryonic signaling during implantation and establishment of pregnancy. This mechanism needs to be more clarified. Thus, this study aimed to evaluate the effect of the cryopreservation technique (vitrification or slow freezing) of sheep embryos produced in vivo on embryo survival rate and expression of genes related to apoptosis (BAX and BCL2), cellular differentiation and proliferation (TGFB1), cellular respiration (NFR1), maintenance of pluripotency (NANOG) and implantation (CDX2). Superovulation (n=32 ewes) was performed and embryos were transcervically collected. A total of 100 GI/II embryos was randomly allocated into three groups: 1) fresh blastocysts (CONT; n=15); 2) slow freezing (SF; n=42); or 3) vitrification (VT; n=43). After thawing/warming, three pools of five embryos per group were used for RT-qPCR; and other embryos were cultured in vitro (24 and 48 h) in SOF with aminoacids and 2.5% of fetal bovine serum medium at 38.5 °C and 5% CO2 (SF: n=27; VT: n=28). Embryonic survival rate of SF and VT were, respectively, 29.6% (8/27) and 14.2% (4/28) at 24 h; and 48.1% (13/27) and 32.1% (9/28) at 48 h (P > 0.05). Only the CDX2 gene was affected (up-regulated, P < 0.05) in both groups compared to CONT. The BAX gene was up-regulated in VT, compared to SF group. The VT increased (P < 0.05) the expression of all genes associated with embryonic quality and implantation, except for NANOG and NRF1, when compared to the CONT. In conclusion, the VT technique led to a decrease of 16% (non-significant) in embryo survival rate and increased pro-apoptotic gene expression.

Current status of in vitro differentiation of stem cells into gametes

From an evolutionary point of view, the gametes are the cells in the body that matter the most as they are the ones who transmit their genes to the next generation ensuring continuation of the species. Being able to generate mature oocytes in vitro is of great interest. Oocytes are the key to totipotency and are able to reprogram somatic cells in approximately one day. In addition, in contrast to a clump of pluripotent stem cells, once the developmental program has started, fertilized oocytes develop into a clump of cells with positional in formation and the possibility to differentiate into both the embryonic and the extraembryonic lineages that form a complete developing and viable organism. How to instruct pluripotent stem cells to become oocytes in vitrois still unclear and even though the first steps to obtain mouse oocytes have recently been successfully demonstrated, inducing meiosis progression and folliculogenesis in vitro are still far from being understood and have not yet been accomplished. In humans, the specific molecular niche that leads to correct oogenesis is less understood. Here, we discuss the current status of in vitro differentiation of human pluripotent stem cells into gametes, in particular to oocytes.

Current status of in vitro differentiation of stem cells into gametes

From an evolutionary point of view, the gametes are the cells in the body that matter the most as they are the ones who transmit their genes to the next generation ensuring continuation of the species. Being able to generate mature oocytes in vitro is of great interest. Oocytes are the key to totipotency and are able to reprogram somatic cells in approximately one day. In addition, in contrast to a clump of pluripotent stem cells, once the developmental program has started, fertilized oocytes develop into a clump of cells with positional in formation and the possibility to differentiate into both the embryonic and the extraembryonic lineages that form a complete developing and viable organism. How to instruct pluripotent stem cells to become oocytes in vitrois still unclear and even though the first steps to obtain mouse oocytes have recently been successfully demonstrated, inducing meiosis progression and folliculogenesis in vitro are still far from being understood and have not yet been accomplished. In humans, the specific molecular niche that leads to correct oogenesis is less understood. Here, we discuss the current status of in vitro differentiation of human pluripotent stem cells into gametes, in particular to oocytes.(AU)

REGULAÇÃO EPIGENÉTICA NO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO INICIAL E REPROGRAMAÇÃO CELULAR NA CLONAGEM POR TRANSFERÊNCIA

Estudos recentes têm destacado o papel das modificações epigenéticas durante os processos reprodutivos, desde a formação dos gametas até a fecundação e desenvolvimento embrionário inicial. Nesse período, uma ativa regulação de inúmeros fatores epigenéticos são determinantes para o desenvolvimento embrionário subsequente. Nos últimos anos, foram descritas diversas moléculas e genes capazes de alterar e/ou sofrer modificações epigenéticas de maneira ativa. Desta forma, nesta tese, em um primeiro estudo, foi realizada uma caracterização de genes que codificam demetilases de histonas durante o desenvolvimento embrionário inicial nas espécies bovina e suína. Foram utilizados embriões produzidos por fecundação in vitro e clonagem por transferência nuclear de células somáticas. Um aumento significativo na expressão de diversas demetilases no período correspondente a ativação do genoma embrionário em ambas espécies foi observada. Além disso, embriões produzidos por transferência nuclear apresentaram uma expressão atípica desses mesmos genes em comparação a embriões fecundados. Os resultados obtidos nesse primeiro trabalho nos permitiram identificar a importância das enzimas demetilases de histonas para o desenvolvimento embrionário inicial. Por outro lado, a expressão errônea de tais genes evidencia uma incompleta reprogramação celular em embriões clonados. Em um segundo estudo, foi avaliado o efeito da associação entre um inibidor de deacetilases, molécula que promove a acetilação das histonas, e um inibidor de atividade transcricional sobre o desenvolvimento embrionário em embriões clonados. A associação foi capaz de melhorar o desenvolvimento e a qualidade dos embriões produzidos. Além disso, foi avaliada a expressão das principais demetilases de histonas previamente caracterizadas no primeiro estudo. Os tratamentos foram capazes de modular a expressão de algumas demetilases de histonas, refletindo um padrão de expressão, aproximando-se aos padrões observados em embriões fecundados. No terceiro trabalho, foi realizado um estudo funcional de uma demetilase que demonstrou um pico de expressão durante a ativação do genoma em bovinos e suínos. Foi realizado o knockdown da expressão através da injeção de RNA de interferência e avaliado o seu efeito sobre o desenvolvimento embrionário. O knockdown reduziu as taxas de desenvolvimento embrionário, alterou o padrão de metilação de histonas, reduziu a qualidade, bem como a expressão de genes de pluripotência nos embriões. Em conjunto, os dados apresentados evidenciam a importância de moduladores epigenéticos tanto para o desenvolvimento embrionário inicial quanto para a reprogramação celular em embriões clonados.

Recent studies highlight the role of epigenetic changes during reproductive events, from the formation of gametes to fertilization and early embryo development. In these processes, a dynamic epigenetic regulation is observed and is thought to be determinant for the subsequent development. Recent studies have identified several molecules and genes that catalyze the addition and removal of epigenetic modifications in an active way. Therefore, in the first study, several genes coding for histone demethylases were characterized during initial embryo development in bovine and porcine species. Embryos produced by in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer were used. A significant increase in the expression of several demethylases during embryo genome activation period was observed in both species. In addition, the expression of such genes was altered in embryos produced by nuclear transfer. The obtained results have identified that histone demethylase enzymes may have an important role during early embryo development. Moreover, the aberrant expression of such genes may be related to an incomplete cellular reprogramming in cloned embryos. In a second study, the effect of the association between a deacetylase inhibitor, a molecule that promotes histone acetylation, and an inhibitor of transcriptional activity on embryonic development in cloned embryos was evaluated. The treatment was able to improve embryo development. In addition, the expression of several histone demethylases previously characterized in the first study was assessed. The treatments were able to modulate the expression of some histone demethylases, showing a pattern of expression similar to fertilized embryos. In the final study, a functional assessment was performed with a lysine demethylase that was previously showed to have a peak of expression during genome activation in bovine and porcine species. Knockdown of KDM7A gene expression was performed by interference RNA microinjection. The knockdown effect resulted in impaired embryo development, altered levels of histone methylation and affected the expression of key pluripotency genes. Altogether, data presented in these studies provided evidence that epigenetic modulators, such as, lysine demethylases play important roles on embryo development and cell reprogramming in cloned embryos.

Inseminação artificial em tempo fixo e produção in vitro de embriões : avanços na reprodução de bovinos

O objetivo deste trabalho foi estudar estratégias para incrementar a eficiência das biotecnologias de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) e produção in vitro de embriões (PIVE), através da: I) Utilização da diluição de sêmen pós-descongelamento na IATF e PIVE; II) Suplementação do meio de maturação e cultivo in vitro com diferentes concentrações de Peptídeo Natriurético C (NPPC); e III) Avaliação do perfil lipídico de embriões Bos indicus produzidos in vitro com diferentes quantidades de folículos antrais. No experimento I foram utilizadas palhetas de sêmen de um único touro com fertilidade previamente conhecida foram utilizadas no grupo controle e grupo diluição (diluição de uma palheta em duas utilizando o produto comercial Prosemen®). A taxa de concepção foi semelhante (P = 0,517) entre o diluidor (52,11%) e controle (55,48%), mas o grupo com diluente apresentou uma redução no número de doses utilizadas por concepção (0,95 diluidor vs. 1,80 controle; P <0,001). Não foi observado diferença na PIVE, taxa de fertilização oocitária, motilidade total e progressiva na análise espermática. No experimento II foi avaliado a suplementação com NPPC na maturação in vitro (MIV; 50 nM, 100 nM ou 150 nM) ou no cultivo in vitro (CIV; 50 nM, 100 nM ou 150 nM) em comparação a um grupo controle (sem suplementação). As taxas de blastocistos não diferiram entre os grupos (P?0,05). Para os genes analisados observamos diferença somente na expressão de REST, gene relacionado a pluripotência e desenvolvimento embrionário, com maior expressão no grupo 150 nM MIV. Para os genes relacionados ao metabolismo (AKR1B1, SCD e SREBF1), maturação oocitária e desenvolvimento folicular (BMP15 e GDF9), sinalização Celular, estresse oxidativo e térmico (FOXO3, HSF1 e HSPA1A), pluripotência (POU5F1 e NANOG), desenvolvimento embrionário (HAND1, GPX1, STAT3 e VEGFA), interação materno-fetal (IFNT2 e PTGS2/COX-2), regulação epigenética (Dnmt3? e Dnmt3?) e receptor do NPPC (NPR2) não foi demonstrado diferença entre os grupos. Adicionalmente, foi demonstrado pela primeira vez a expressão do receptor de NPPC (NPR2) em embriões. No experimento III foi investigar se a quantidade de folículos antrais (FAs) influencia o perfil lipídico (análise do perfil lipídico pela técnica DESI-MS) de embriões produzidos in vitro de fêmeas Bos taurus indicus. Para o cultivo in vitro foram utilizados ovários (n = 498) de 249 fêmeas Nelore, coletados de abatedouro local e transportados em solução salina a 30-35º C até o laboratório. Os animais foram classificados em grupo de baixa (?31; média menos DP) e alta quantidade de FAs (?92; média mais DP). As taxas de clivagem e blastocisto, não apresentaram diferenças entre os grupos (78,9% e 41,7% no grupo de alta; n= 419 oócitos; 79,5% e 40,3% no grupo de baixa; n= 357 oócitos; P?0,05). O perfil lipídico de embriões derivados de vacas com maior quantidade de FAs apresentaram uma maior concentração de lipídios triacilgliceróis e menor de derivados de colesterol e diacilgliceróis, quando comparados aos embriões de vacas com menor quantidade de FAs. Em conclusão, I) o uso do diluidor pós-descongelamento reduziu o número de doses por concepção, reduzindo o custo por prenhez na IATF; II) Embora as taxas de blastocisto não tenham diferido entre os grupos, o gene REST relacionado a pluripotência e desenvolvimento embrionário teve maior expressão em 150MIV, fornecendo referências para a melhoria dos resultados de MIV; III) Nossos resultados demonstraram diferenças no perfil lipídico nos embriões PIV quando analisamos diferentes quantidades de FAs, porém não foi possível avaliar sua interferência significativa nas taxas de clivagem e blastocistos.

The objective of this study was to evaluate strategies to increase the efficiency of biotechnology Timed Artificial Insemination (TAI) and in vitro embryo production (IVP) through: I) Use of post-thaw dilution of semen in IATF and IVP; II) Supplementation of the in vitro culture and maturation medium with different concentrations of Natriuretic Peptide C (NPPC); and III) Influence of the amount of antral follicles on the lipid profile of embryos Bos indicus produced in vitro. In the experiment I were used semen straws of a single bull with previously known fertility were used in the control group and dilution group (dilution of one straw in two using commercial product Prosemen®). The conception rate was similar (P = 0.517) between the diluent (52.11%) and control group (55.48%), but the diluent group showed a reduction in the number of doses used per conception (0.95 diluent vs 1.80 control, P <0.001). No difference was observed in IVP, oocyte fertilization rate, total and progressive motility in sperm analysis. In Experiment II, NPPC supplementation in vitro maturation (IVM; 50 nM, 100 nM or 150 nM) or in vitro culture (IVC; 50 nM, 100 nM or 150 nM) was evaluated in comparison to a control group (without supplementation). Blastocyst rates did not differ between groups (P?0.09). For the genes analyzed, we observed a significant difference only in the expression of REST, a gene related to pluripotency and embryonic development, with higher expression in the 150 nM IVM group. For the genes related to metabolism (AKR1B1, SCD and SREBF1), oocyte maturation and follicular development (BMP15 and GDF9), cell signaling, oxidative and thermal stress (FOXO3, HSF1 and HSPA1A), pluripotency (POU5F1 and NANOG), embryonic development HAND1, GPX1, STAT3 and VEGFA), maternal-fetal interaction (IFNT2 and PTGS2 / COX-2), epigenetic regulation (Dnmt3? and Dnmt3?) and NPPC receptor (NPR2) showed no difference between groups. Additionally, the expression of the NPPC receptor (NPR2) in embryos has been demonstrated for the first time. In experiment III it was investigated if the number of antral follicles (AFs) influences the lipid profile (DESI-MS lipid profile analysis) of embryos produced in vitro of Bos taurus indicus females. For in vitro culture, ovaries (n = 498) of 249 Nelore females were collected from a local slaughterhouse and transported in saline at 30-35º C until laboratory. The animals were classified as low (?31, mean less SD) and high number of AFs (?92, mean plus SD). The cleavage and blastocyst rates did not differ between the groups (78.9% and 41.7% in the high group, n = 419 oocytes, 79.5% and 40.3% in the low group, n = 357 oocytes; P?0,05). The lipid profile of embryos derived from cows with higher AFs presented a higher lipid concentration triacylglycerols and lower cholesterol derivatives and diacylglycerols when compared to the embryos of cows with a lower amount of AF. In conclusion, I) the use of the post-thaw diluent reduced the number of doses per conception, reducing the pregnancy cost in TAI; II) Although blastocyst rates did not differ between groups, the REST gene related to pluripotency and embryonic development had greater expression in 150MIV, provide references for the improvement of IVM results; III) Our results demonstrate differences in the lipid profile in the PIV embryos when we analyzed different amounts of AFs, but it was not possible to evaluate their significant interference in the rates of cleavage and blastocysts.

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA EM OÓCITOS E EMBRIÕES OVINOS PRODUZIDOS IN VITRO

A análise da expressão gênica é cada vez mais importante na pesquisa biológica. A PCR em tempo real de transcrição reversa (RT-PCR) tem se tornando o método de escolha para o perfil de expressão de alta produtividade e precisão de genes selecionados, dado o aumento da sensibilidade, reprodutibilidade e grande alcance dinâmico desta metodologia, os requisitos para um gene de controle interno adequado para normalização tornaram-se cada vez mais rigoros. No primeiro experimento, o objetivo foi identificar os genes de referência (GRs), expressos de forma mais estável em tipos celulares específicos investigados em ovinos, além de determinar o número mínimo de GRs necessários para normalização da expressão gênica. Dos onze RGs candidatos (ACT, ATP1A1, GAPDH, H3F3A, HPRT1, PPIA, RPL19, SDHA, TBP, UBB e YWHAZ) testados para normalização RT-qPCR durante o estádio de pré-implantação (ovócitos, embriões em estádio de clivagem e mórulas compactas). Sete primers foram eficientes (97,20 % - 105,96 %). O software GeNorm indicou GAPDH e TBP como o melhor par de RG, e H3F3A e YWHAZ foram o terceiro e quarto RGs mais estáveis, respectivamente. O software NormFinder descreveu o H3F3A como o RG mais estável, enquanto o YWHAZ e o H3F3A foram o par de RG mais apropriado. O fator de transcrição (FT) ZFX foi regulado negativamente em embriões em estádios de clivagem ao comparar estes dois estádios de desenvolvimento usando dois GRs (GAPDH e TBP). A abundância de transcritos do gene associada à pluripotência de desenvolvimento 3 (DPPA3) foi similar entre todos os estádios independentemente do uso de dois ou três GRs. No segundo experimento, o objetivo foi compreender a expressão temporal e padrões dinâmicos dos FT associados à pluripotência (FTAP) durante o desenvolvimento totipotente de embriões ovinos, sendo particularmente relevante por se tratar de um espécie pouco explorada. Foi possível observar eficiência de todos os oito primers de FTAP candidatos (91,98% - 104,46%). Quatro padrões de expressão dos FTAP foram encontrados em embriões totipotentes de ovinos. Primeiramente, os transcritos dos genes RXRB e TCF3 foram detectados apenas em oócitos. Em segundo lugar, a abundância de transcritos de genes não variou entre os estádios de desenvolvimento (isto é, RONIN e SP1). Em terceiro lugar, a abundância de transcritos de genes foi maior no estágio de clivagem, como encontrado para NR5A2 e SF1. Finalmente, a abundância de transcritos gênicos foi maior no estádio mórula (SF1, UTF1 e ZFP281). Assim, as FTAP mantêm padrões dinâmicos de expressão durante o desenvolvimento totipotente de ovelhas e contribuem para a elucidação da embriogênese nesta espécie.

Gene expression analysis is increasingly important in biological research, with real-time reverse transcription (RT-PCR) PCR becoming the method of choice for the high productivity and precision expression profile of selected genes, given the increased sensitivity, reproducibility and wide dynamic range of this methodology, the requirements for an internal control gene suitable for normalization have become increasingly rigorous. In the first experiment, the objective was to identify the reference genes (RGs), expressed more stable in specific cell types investigated in sheep, in addition to determining the minimum number of RGs required for normalization of gene expression. Of the eleven candidate RGs (ACT, ATP1A1, GAPDH, H3T3A, HPRT1, PPIA, RPL19, SDHA, TBP, UBB and YWHAZ) tested for RT-qPCR normalization during the preimplantation stage (oocytes, cleavage stage embryos and morulae compact). Seven primers were efficient (97.20% - 105.96%). GeNorm software found GAPDH and TBP as the best pair of RGs, and H3F3A and YWHAZ were the third and fourth most stable RGs, respectively. NormFinder software described H3F3A as the most stable RG, while YWHAZ and H3F3A were the most appropriate RG pair. The transcription factor (FT) ZFX was downregulated in embryos at cleavage stages when comparing these two developmental stages using two GRs (GAPDH and TBP). The abundance of gene transcripts associated with developmental pluripotency 3 (DPPA3) was similar across all stages regardless of the use of two or three GRs. In the second experiment, the objective was to understand the temporal expression and dynamic patterns of FTAP associated to pluripotency during the totipotent development of ovine embryos, being particularly relevant because it is an unexplored species. It was possible to observe efficiency of all eight candidate FTAP primers (91.98% - 104.46%). Four patterns of FTAP expression were found in totipotent ovum embryos. First, transcripts of the RXRB and TCF3 genes were detected only in oocytes. Second, the abundance of gene transcripts did not vary between the developmental stages (i.e., RONIN and SP1). Third, the abundance of gene transcripts was higher at the cleavage stage, as found for NR5A2 and SF1. Finally, the abundance of gene transcripts was higher at the morula stage (SF1, UTF1 and ZFP281). Thus, FTAP maintain dynamic patterns of expression during the totipotent development of sheep and contribute to the elucidation of embryogenesis in this species.

TRANSCRIÇÃO EM EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO

O processo transcricional em embriões extremamente complexo, nosso trabalho estimou o impacto de perturbações nos processos de transcricionais, durante as fases de ativação do genoma embrionário sobre o desenvolvimento embrionário in vitro de embriões; analisamos dados de sequenciamento de rna (RNA-seq) depositados nos bancos públicos (GEO) desde o estágio de oóocito até o dia 19 do desenvolvimento embrionário; Isolamos e caracterizamos a massa celular interna (ICM) e a trofectoderma (TE) do sexo masculino e feminino, oriundos de um mesmo blastocisto produzido in vitro com espermatozoides sexados (X e Y) e com sêmen convencional e caracterizamos e exploramos o transcriptoma desses isolados celulares. Concluímos então que a EGA menor é essencial para o desenvolvimento embrionário bovino, blastocistos possuem a maior atividade transcricional de um total de 6457 genes diferentemente expressos entre os contrastes avaliado encontramos; 2065 genes diferencialmente expressos entre a ICM e a TE, enquanto a ICM está voltada para a manutenção da pluripotência, a TE está voltada ao metabolismo energético. Os nossos dados sugerem que os embriões fêmeas são mais sensíveis ao cultivo in vitro.

Transcription process in embryos is a complex process, our work estimated the impact of perturbations in the transcriptional processes during genome activation of vitro produced bovine embryos on their development; we analyzed public data (GEO) from rna sequencing data (RNA-seq) of oocyte up to the 19th day of embryonic development; Wed performed isolation and characterization of male and female inner cell mass (ICM) and trofectoderma (TE) from the same blastocyst produced in vitro with sorted semen (X and Y) and with conventional semen. We did the characterization and exploratory analysis of the transcriptome of these cells. We conclude that minor EGA is essential for bovine embryonic development. Blastocysts possess the highest transcriptional activity of 6457 differentially expressed genes among analyzed contrasts. We found 2065 genes differentially expressed between ICM and TE, while ICM is maintaining pluripotency, TE is focused on energy metabolism. Our data suggest that female embryos are more sensitive to in vitro culture.

INFLUÊNCIA DO FSH SOBRE OS ASPECTOS CELULARES E MOLECULARES NA MATURAÇÃO IN VITRO DE COMPLEXOS CUMULUS-OVÓCITOS DE BOVINOS

As biotécnicas aplicadas à reprodução de bovinos ainda possuem limitações e muitas estão ligadas a falta de conhecimento sobre a atuação de macromoléculas adicionadas ao meio de maturação ovocitária in vitro (MIV), ao processo de desenvolvimento embrionário e diferenciação celular, bem como as alterações de genes relacionados à pluripotência na produção in vitro nesta espécie. O hormônio folículo estimulante (FSH) está presente na maioria dos protocolos de MIV, devido a sua importância na expansão das células do cumulus, síntese de estradiol e maturação citoplasmática e nuclear do ovócito. Porém, poucos estudos relatam a influência do FSH na atividade gênica durante a maturação. Visto que a identificação e elucidação das modificações bioquímicas do meio e dos mecanismos de ação desses genes contribuiriam para melhorias nas diversas biotécnicas aplicadas à reprodução e para o aumento da produção de animais de alto valor genético, este trabalho teve como objetivo avaliar a influencia do FSH em células do cumulus durante a maturação de ovócitos bovinos. Foram feitas análises hormonal e bioquímicas do meio de maturação in vitro antes e após a MIV, com e sem FSH (G-FSH, G-FSHIN, G-CTL, G-CTLIN) bem como a análise da expressão de genes relacionados à pluripotência em células do cumulus de bovinos maturados com e sem FSH (G-FSH e G-CTL) coletados em abatedouros da região da Zona da Mata e Agreste de Pernambuco. Foi observada a concentração de estradiol por imunoensaio e concentração de proteína, glicogênio, açúcar e lipídeo (análise bioquímica) através de espectofotômetro na análise de expressão relativa por PCR em tempo real (RT-qPCR). Para análise estatística avaliou-se a normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk para serem então submetidos à análise de variância (ANOVA), Teste F e, posteriormente o teste de Tukey HSD, nível de significância de 5,0%. Foi observada maior expansão das células do cumulus durante a maturação em meio contendo FSH, quando comparado ao meio sem FSH. Além disso, o FSH influenciou o consumo de glicogênio pelas células, diminuindo sua concentração no meio, sugerindo grande demanda de energia para o processo. Observou-se influência do FSH sobre a expressão de RONIN e CMYC, nos quais o hormônio estimula a atividade de RONIN e reprime CMYC. Dessa forma, o FSH influencia a maturação de ovócitos bovinos, além de atuar também na atividade energética do complexo cumulus-ovócito de nos níveis celulares e moleculares.

Biotechniques applied to bovine reproduction still have limitations and many are linked to a lack of knowledge about an update of macromolecules added to the medium of in vitro oocyte maturation (IVM), embryonic development process and cell difference, as well as genes of inhibitors related to pluripotency in in vitro production in this species. Follicle stimulating hormone (FSH) is present in most IVM protocols because of its importance in large cumulus cells, estradiol synthesis and cytoplasmic and nuclear maturation of the oocyte. However, few studies report an influence of FSH on gene activity during maturation. Considering the identification and modification of the biochemistry of the medium and mechanisms of action of the genes contributed to improvements in the various biotechniques applied to the reproduction to increase the production of animals of high genetic value, this work had the objective of evaluating an influence of FSH in cumulus during maturation of bovine oocytes. Hormonal and biochemical analyzes of the in vitro maturation medium before and MAB, with and FSH (G-FSH, G-FSHIN, G-CTL, G-CTLIN), as well as an analysis of the expression of pluripotency related genes in cumulus of cattle matured with and without FSH (G-FSH and G-CTL) collected in slaughterhouses of the Zona da Mata and Agreste of Pernambuco. A concentration of estradiol was observed by immunoassay and concentration of protein, glycogen, sugar and lipid (biochemical analysis) through a spectrophotometer in the analysis of real-time PCR (RT-qPCR). For statistical analysis, normality was assessed by Shapiro-Wilk test to be submitted to analysis of variance (Test F) and, or Tukey HSD test, level of significance of 5.0%. Increased cumulus cell amplitudes were observed during maturation in the FSH medium when compared to the non-FSH medium. In addition, FSH influences glycogen consumption by cells, decreasing their concentration not medium, due to the need for high energy demand for the process. Influence was observed in the expression of RONIN and CMYC, in which the hormone stimulates RONIN activity and represses CMYC. Thus, FSH influences a maturation of oocytes, besides also acting in the energetic activity of the cumulus-oocyte complex of bovine without cellular and molecular physics.

Isolamento e identificação de populações de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical e da medula óssea de bubalinos post-mortem

As células-tronco mesenquimais (CTM) são células indiferenciadas com alta capacidade de proliferação e potencial de se diferenciar em células especializadas. Elas são encontradas em tecidos como medula óssea, cordão umbilical, polpa dentária, ligamento periodontal e tecido adiposo. As CTM representam uma ferramenta ideal para o estudo da embriogênese in vitro, favorecendo o desenvolvimento de métodos eficazes para clonagem de células somáticas, transgênese e regulação de genes, o que resultaria em espécies mais resistentes e com um potencial reprodutivo mais aprimorado. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão gênica de pluripotência e marcadores fenotípicos de células-tronco em células isoladas do cordão umbilical e medula óssea de búfalos (Bubalus bubalis). Após 24 horas foram observadas as primeiras adesões celulares nas placas de cultivo. Ambas as células apresentaram alta capacidade de expansão in vitro, confirmado pela curva de crescimento, apresentando uma confluência média de 85% no décimo quinto dia de cultura. A imunofenotipagem revelou populações de células da medula óssea positivas para o marcador de citoesqueleto Vimentina (72,7%), enquanto que não houve expressão para os marcadores de células mesenquimais e para os marcadores de pluripotência. Na análise da expressão genica por qRT-PCR em células da medula não houve expressão de nenhum dos genes analisados, enquanto que nas células do cordão umbilical foi expresso transcritos de mRNA dos genes CD29, CD44, SOX-2 e NANOG. Podemos concluir que as células mesenquimais podem ser isoladas post-mortem do cordão umbilical e da medula óssea de bubalinos (Bubalus bubalis), e que as características apresentadas pelas células do cordão umbilical, sugerem que estas são células-tronco mesenquimais, embora haja necessidade da realização de mais testes de caracterização.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are undifferentiated cells with a high capacity of proliferation and transformation into several specialized cells. They are found in tissues such as bone marrow, umbilical cord, dental pulp, periodontal ligament and adipose tissue. Although MSCs isolation has been already well established, in buffaloes it is still a challenge. In buffaloes, stem cells represent an ideal tool for embryogenesis study in vitro, favoring the development of effective methods for somatic cells cloning, transgenesis and gene regulation. The aim of this study was to evaluate the gene expression of pluripotency and stem cells markers in cells isolated from the bone marrow of buffaloes (Bubalus bubalis) post mortem. After isolation and cultivation, samples were frozen until the assays. Morphological analyses were made through optical and electronic microscopy. The growth curve and immunophenotyping were made by flow cytometry. After 24 hours was observed cell adhesion into culture plates. The cells showed high expansion capacity in vitro, presenting an average of 85% confluence on the fifth day of culture. Flow cytometry showed a small cell population with little granularity. The populations of bone marrow cells were positive for the marker of mesenchymal cells Vimentina (72.7%). In the analysis of the genetic expression by qRT-PCR in cells of the marrow there was no expression of any of the genes analyzed, whereas in umbilical cord cells mRNA transcripts of the genes CD29, CD44, SOX-2 and NANOG were expressed. We can conclude that as mesenchymal stem cells can be isolated post-mortem of adipose tissue and bone marrow of buffaloes (Bubalus bubalis), and that as characteristics presented by umbilical cord cells, confirm that these are mesenchymal stem cells.

Indução da pluripotência celular e diferenciação in vitro no modelo suíno como modelo translacional

Em 2006, Takahashi e colaboradores demonstraram ser possível a obtenção de células-tronco pluripotentes por indução gênica (induced pluripotent stem cells ou iPSCs). Desde o surgimento desta tecnologia diversos modelos animais foram gerados, ampliando as possibilidades de seu uso na pesquisa, como por exemplo, na criação de modelos para doenças genéticas humanas como esclerose lateral amiotrófica, autismo, esquizofrenia, doença de Parkinson e Alzheimer, além do aprimoramento de características relevantes para produção animal. O modelo suíno é considerado vantajoso sobre os outros modelos animais principalmente pela criação já bem estudada e similaridades fisiológicas com os humanos. O intuito deste projeto foi reprogramar fibroblastos embrionários suínos através do sistema integrativo à iPSCs, para então diferenciá-las em células progenitoras neurais (neural progenitor cells, NPCs). Para isso, os fibroblastos foram transduzidos com vetores contendo sequencias humanas ou murinas dos genes OCT4, SOX2, c-Myc e KLF4 (hOSKM ou mOSKM) para formação das iPSCs. Estas foram caracterizadas quanto a morfologia, presença de fosfatase alcalina, a expressão dos genes exógenos e endógenos (OSKM, HS OCT4, OCT4, NANOG) através de imunofluorescência e RT-qPCR e formação de corpos embrióides. Então foram submetidas durante 14 dias ao meio de indução neural sob matriz extracelular comercial, gerando células potencialmente similares às NPCs. Estas foram caracterizadas morfologicamente, por imunofluorescência das proteínas NESTIN, BETA TUBULINA III e VIMENTINA, além da expressão de NESTIN e GFAP por RT-qPCR. Foram produzidas com sucesso 3 linhagens de iPSC em diferentes estágios de reprogramação e células positivas para todos os marcadores neurais testados. Os resultados apresentados deverão contribuir para a utilização do modelo suíno em futuros estudos voltados à medicina regenerativa e translacional.

In 2006, Takahashi and collaborators reported the induction into pluripotency of somatic cells (induced pluripotent stem cells, iPSCs). Since then, this technique has much been developed; many animal models have been created opening a new series of opportunities in research. They enable the creation of models for human genetic diseases, for example, amyotrophic lateral sclerosis, autism, schizophrenia, Parkinson´s disease, Alzheimer´s disease and the enhancement of relevant characteristics in agriculture. The swine model is considered to present many advantages over others, including the well-known production and maintenance and physiological similarities to humans. The aim of this project was to reprogram porcine embryonic fibroblasts (pEF) into iPSCs using the lentiviral integrative system, followed by its differentiation into neural progenitor cells (NPCs). The cells were reprogrammed using vector containing either the human sequences (hOSKM) or the mouse sequences (mOSKM) for the OCT4, SOX2, c-Myc and KLF4 genes to form the iPSCs. They were characterized regarding the presence of the Alkaline Phosphatase enzyme, expression of exogenous and endogenous genes (OSKM, HS OCT4, OCT4, NANOG) through immunofluorescence and RT-qPCR, and embryoid body formation. Then, the cells were cultured with neural induction media for 14 days in commercial extracellular matrix, generating cells potentially similar to NPCs. Those were characterized regarding their morphology, immunofluorescence for NESTIN, BETA TUBULIN III and VIMENTIN and gene expression of NESTIN and GFAP. iPSCs were successfully reprogramed, generating 3 cell lines at different stages of reprograming and cells positive for all the neural markers tested were produced. The results shown will contribute to the use of the porcine model in future regenerative and translational medicine research.

ANÁLISE INTERESPECÍFICA DA EXPRESSÃO DE GENES RELACIONADOS À PLURIPOTÊNCIA DURANTE O DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO

A embriogênese inicia com a junção dos gametas. O embrião é formado por células semelhantes em morfologia e que possuem a condição de totipotência, ou seja, a capacidade de formar todos os tecidos do feto e a placenta. A diferenciação morfológica do embrião no estádio de blastocisto resulta na formação do embrioblasto e trofoblasto. O embrioblasto é formado por células pluripotentes, que tem potencial de formação de tecidos do feto, enquanto que o trofoblasto é multipotente e formará a placenta. Os genes relacionados à pluripotência (GRP) atuam como importantes fatores de manutenção da totipotência e pluripotência de embriões de diferentes espécies. No entanto, o entendimento sobre a atividade de GRP em ruminantes permanece limitado a poucos genes e estádios do desenvolvimento. A comparação da expressão dos GRP pode determinar o perfil de expressão temporal destes genes, identificando possíveis diferenças entre as espécies. Dessa forma, o objetivo foi comparar a expressão de oito GRP durante o desenvolvimento embrionário de ovinos e bovinos. Para tanto, embriões ovinos e bovinos foram produzidos in vitro e avaliados em quatro estádios de desenvolvimento (ovócitos, embriões clivados - duas a oito células, mórula e blastocisto) quanto à sua detecção por PCR em tempo real (RT-qPCR). Com o intuito de estimar possíveis diferenças no perfil de expressão e atividades dos GRP em ruminantes, análises através da bioinformática foram realizadas quanto à conservação das sequências de proteína. Os genes OCT4, RONIN, ZFP281, ZFX e KLF5 foram detectados em todos os estádios nas duas espécies. CMYC foi detectado em todas as amostras de bovinos, embora em ovinos seja expresso a partir da fase de clivagem. Em contrapartida, DAX1 foi detectado em todas as amostras de ovinos, e em bovinos, não foi verificada detecção apenas em mórula. GLIS1 apresentou a maior variação entre as espécies, sendo detectado apenas em ovócitos de bovinos e em embriões clivados e blastocistos de ovinos. O grau de conservação dos GRP em nível de proteína mostrou-se alto, embora com diferenças entre os genes. Portanto, as análises in silico sugerem que a função dos GRP é conservada em ruminantes. Em conclusão, a expressão temporal dos GRP difere entre bovinos e ovinos, sugerindo possíveis diferenças na utilização destes genes como marcadores moleculares de embriões entre espécies.

Embryogenesis begins with gamete fusion. The embryo is formed by morphologically similar cells that hold the condition of totipotency, that is, the capacity to give rise to all tissues that make up the fetus and the placenta. The morphological differentiation in the embryo results in formation of embryoblast and trophoblast. The embryoblast is formed by pluripotent cells, that have potential to give rise to all tissues that make up the fetus, while the trophoblast is multipotent and forms the placenta. Pluripotency-associated genes (PAG) play key roles in maintenance of embryo totipotency and pluripotency in different species. However, the understanding of PAG activity in ruminants remains restricted to few genes and embryonic developmental stages. The comparison of PAG gene expression among species would allow to determine the temporal expression profile of these genes, further allowing to define putative differences in gene expression patterns within species. The work was aimed to compare the expression of eight PAG during embryonic development in sheep and cattle. Embryos from sheep and cattle were produced in vitro and gene expression analysis was carried out in four developmental stages (oocytes, cleavages-stage - 2 to 8 cells, morula and blastocyst) for their detection by Real Time PCR (RT-qPCR). In order to estimate possible diferences in expression profile and activity of PAG between ruminants, in silico analysis was performed addressing structural conservation at the and protein level. OCT4, RONIN, ZFP281, ZFX and KLF5 were detected in all developmental stages of both species. CMYC was detected in all cattle samples, although it was expressed in sheep from cleavage stage onwards. However, DAX1 was detected in all sheep samples, while in cattle, it was not found at the morula stage. GLIS1 showed the greatest variation between species, since it was only detected in cattle oocytes and in sheep cleavage-stage embryos and blastocysts. The PAG conservation at the protein level was high, despite differences among genes. Moreover, in silico analysis suggested that PAG function is conserved between ruminants. In conclusion, temporal expression of PAG differs between sheep and cattle, suggesting possible differences in their usage as molecular markers for embryos across species.

Epigenética da reprogramação em células germinativas embrionárias caninas

As células germinativas primordiais (CGPs) são capazes de gerar um novo indivíduo, são originárias de gametas, os quais transmitirão os materiais genéticos para as futuras gerações. Normalmente, a linha germinal de mamífero é determinada por fatores genéticos e epigenéticos que possuem funções essenciais para guiar na direção e desenvolvimento das CGPs, bem como das células germinativas embrionárias (CGEs). A reprogramação epigenética é fundamental para a regulação do genoma durante o desenvolvimento das células germinativas responsáveis por originar a linhagem gametogênica nos mamíferos. A metilação e desmetilação em CGPs são um evento único, essencial para apagar a memória epigenética e também prevenir transmissões de epimutações para a próxima geração. Assim, o completo entendimento das vias e mecanismos para a migração inicial e diferenciação destas células em CGEs podem ser importantes para identificar e corrigir falhas possíveis nesses processos, o que será importante, no futuro, para o desenvolvimento e desempenho reprodutivo. A maioria dos estudos com CGPs e CGEs é realizado em camundongos, porém nem sempre esta espécie torna-se o melhor modelo de estudo quando se quer transpor esses conhecimentos a humanos. O cão doméstico (Canis lúpus familiaris) apresenta-se como um modelo ideal para o estudo do desenvolvimento em mamíferos, pois possui inúmeras similaridades com a bioquímica, fisiologia e genética. Deste modo, torna-se interessante expandir os estudos sobre as CGPs e CGEs na espécie canina, a fim de mostrar a importância de diferentes modelos que se assemelham a seres humanos. Portanto, objetiva-se, nesta proposta, identificar qual é a dinâmica de marcadores pluripotentes, germinativos e epigenéticos que são importantes para o desenvolvimento das CGPs e CGEs caninas. Para tal procedimento, essa pesquisa foi dividida em duas fases: a primeira, consiste no processo in vivo, desde o desenvolvimento inicial do embrião até a completa formação da crista gônadal. Análises de Q-PCR e imunofluorescência para marcadores pluripotentes, germinativos e epigenéticos foram realizados para criar um perfil de genes que são importantes para o desenvolvimento das CGPs caninas. Prosseguiu-se para a segunda fase in vitro, que incide na derivação e caracterização das CGEs caninas. Ensaios de alcalina fosfatase, imunofluorescência, Q-PCR e formação de teratoma foram efetivados para comprovar a linhagem de células CGEs. Como resultado in vivo, percebe-se que diferentes padrões de marcações e genes foram expressos nas CGPs, comprovando que a espécie canina se assemelha mais com os humanos do que com os camundongos. Os resultados in vitro mostraram que foi possível derivar as células CGEs e que estas conseguem reter sua pluripotencialidade e que diminuem a expressão dos genes germinativos. Porém, essas células tendem a se diferenciar em outros tecidos somáticos, mesmo com a adição de suplementos, fato também notado em CGEs humanas.

In particular, primordial germ cells (PGCs) are known as the only cells capable of generating a new individual, for they originate the gametes which then will transmit genetic material to future generations. Normally, the mammalian germ line is determined by genetic and epigenetic factors that have essential functions to guide the direction and development of CGPs as well as embryonic germ cells (EGCs). Epigenetic reprogramming is fundamental for the regulation of the genome during the development of the germ cells responsible for originating the gametogenic lineage in mammals. Methylation and demethylation in CGPs is a unique event, essential for erasing epigenetic memory and also preventing transmissions of epimutations to the next generation. Thus, the understanding of the patterns of differentiation of PGCs in EGCs can be important in identifying and correcting possible failures in these processes, which will be important in the future for development and reproductive performance. Most of the studies with PGCs in EGCs are carried out in mice, but this species is not always the best model of study when transposing this knowledge to humans. In canines, no study has ever been reported on canine PGCs and maybe the Canine species has become interesting as a new animal model for studies. It is known that the study material of human embryos are scarce samples and difficult to obtain, so it is necessary to use other animal models, such as the Canids, which also resemble humans. Dogs were the first fundamental models for the development of bone marrow transplantation in humans, but also made valuable contributions to the development of therapies for cardiovascular and orthopedic diseases. Then, it has become interesting to expand the studies on PGCs in the canine species in order to show the importance of different models that might resemble humans. Therefore, we had how proposal identify which were pluripotent, germinative and epigenetic markers that are important for the development of PGCs and canine EGCs. We analyzed through the techniques of immunofluorescence, immunohistochemistry, real-time PCR and alkaline phosphatase. It was found in canine PGCs different patterns of markers and genes that it was expressed in the gonadal ridge between the embryo and fetal periods. The in vitro results showed established the canine EGCs cells lines from embryos at 30 days of gestation characterized and tested for pluripotency using a variety of methods.

Efeito da reprogramação por indução à pluripotência (iPS) na manutenção do imprinting genômico celular

Biotecnologias reprodutivas como a produção in vitro de embriões e a transferência de núcleo apresentam grande potencial de aplicação na medicina veterinária seja para a correção de infertilidades, para o aumento na eficiência da produção animal ou mesmo para um melhor entendimento sobre os mecanismos envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial. Porém, manipulações in vitro de gametas ou embriões levam a alterações na regulação epigenética, podendo causar altas taxas de anormalidades no desenvolvimento e no nascimento de indivíduos derivados. A geração de um modelo de indução da pluripotência in vitro, ou seja, a geração de células iPS (do inglês induced pluripotent stem cells) possibilitou estudar o processo de reprogramação in vitro de maneira robusta e precisa. Os genes OCT4 e SOX2 são fundamentais no processo de aquisição e manutenção da pluripotência celular, e recentemente foi reportado que a ação destes dois fatores exerce grande influência sobre a regulação de alguns genes imprinted, em especial, no locus H19/IGF2, sabidamente importantes para o desenvolvimento normal do embrião e de sua placenta. Este estudo propõe a geração de um modelo experimental in vitro onde os fatores em questão sejam estudados, juntos ou em combinação, quanto à sua influência na regulação do imprinting genômico. Para tal, três linhagens de fibroblastos fetais bovinos (bFF1, bFF2 e bFF3) foram transduzidas com vetores lentivirais contendo cDNAs de OCT4 ou SOX2 humanos. Os fibroblastos foram analisados através de citometria e as células positivas foram separadas e recuperadas (sorted). Os fibroblastos expressando OCT4, SOX2, ambos (OCT4 + SOX2), nenhum (controle) juntamente com um controle recuperado (não sorted) não transgênico (total de cinco tratamentos) foram investigados quanto à expressão de genes relacionados à pluripotência e expressão de genes imprinted, bem como a manutenção dos padrões de metilação do DNA no locus H19/IGF2. Além disso, estas células foram submetidas à reprogramação in vitro e produção de células iPS. A indução à pluripotência foi realizada através da transdução dos fibroblastos com o vetor policistrônico contendo o cDNAs murino ou humano dos fatores de transcrição OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4 (OSMK, vetor STEMCCA). Os resultados da análise de fluorescência por citometria de fluxo foram, em média, de 40,4% para OCT4, 6,1% para SOX2 e 0,63% para OCT4 + SOX2. A bFF1 foi a única linhagem a apresentar uma recuperação pós-sorting, o que possibilitou sua utilização para a indução da pluripotência. De maneira interessante, as células que não passaram pela citometria geraram colónias de células iPS, enquanto que os demais grupos não. A quantificação de transcritos por qRT-PCR mostrou que a expressão de OCT4 e de SOX2 estava aumentada nos respectivos grupos, a expressão do gene H19 mostrou-se aumentada no grupo controle que passou pelo procedimento de sorting e a expressão do gene imprinted IGF2R não variou entre os grupos. Já a análise preliminar da manutenção do padrão de metilação de DNA na DMR do locus H19/IGF2 mostrou que o grupo controle sorted apresentou uma leve diferença no padrão de metilação quando comparada aos outros grupos. Neste estudo, portanto, o procedimento de separação e recuperação celular por citometria de fluxo celular, aliado ao elevado número de repiques celulares durante o cultivo prolongado pode ter levado a um efeito prejudicial sobre a eficiência de reprogramação in vitro.

Reproductive biotechniques such as in vitro embryo production and somatic cell nuclear transfer may greatly contribute for fertility improvements, to enhance animal production or else to contribute to a better understanding of the underlying mechanism involved during initial embryonic development. However, in vitro manipulation of gametes or embryos may lead to possible disruptions on epigenetic regulation, causing high developmental abnormalities and decreased healthy calves born at term. The generation of induced pluripotency models (induced pluripotent stem cells, or iPS) made it possible to study the process of in vitro reprogramming in a more solid and precise manner. OCT4 and SOX2 are fundamental genes for the acquisition and maintenance process of cellular pluripotency. Recently, it has been reported that both factors may have a huge influence on the regulation of some imprinted genes, specially at locus H19/IGF2, known to be important for the normal development of embryo and placenta. Therefore, this study aimed to generate an in vitro experimental model where the above transcription factors will be studied together or separately regarding their influence on genomic imprinting regulation. For that, three bovine fetal fibroblasts cell lines (bFF1, bFF2 and bFF3) were transduced with lentiviral vectors containing human OCT4 or SOX2 cDNAs. The fibroblasts were analyzed trough cell cytometry and positive cells were sorted. Fibroblasts expressing OCT4, SOX2, both (OCT4+SOX2), none (control) together with a non-sorted and non-transgenic control (five treatments) were investigated regarding pluripotency and imprinted gene expression, as well maintenance of DNA methylation patterns at H19/IGF2 locus. Further, these cells were also submitted to in vitro induced reprogramming and production of iPS cell colonies. Induction into pluripotency was realized by transducing fibroblasts with polycistronic excisable vector containing the murine or human cDNA of OCT4, SOX2, c-MYC and KLF4 transcription factors (OSMK, STEMCCA vector). The results of fluorescence analysis by flow cytometry were, on average, 40.4% for OCT4, 6.1% for SOX2 and 0,63% for OCT4+SOX2 groups. bFF1 was the only lineage presenting a post-sorting recovery that enabled its use for pluripotency induction. Interestingly, non-sorted cells generated biPS colonies whereas sorted cells (control non transgenic, OCT4, SOX2 and OCT4+SOX2 expressing cells) did not generate biPS cells. The transcript quantification by qRT-PCR showed that OCT4 and SOX2 expression were increased in the respective groups, the expression of H19 gene was increased in the control sorted group and IGF2R expression was not different between groups. Preliminary results of imprinting pattern methylation at H19/IGF2 locus showed that sorted group was slightly different from others. In this study, therefore, analysis and sorting procedure by flow citometry, together with an extended period in culture may have lead to a detrimental effect on in vitro reprogramming efficiency.

Modificações epigenéticas da cromatina e sua relação com a reprogramação nuclear de bovinos

A reprogramação nuclear de uma célula somática a um estado embrionário tem diversas aplicações, como pesquisas básicas na biologia do desenvolvimento, terapia celular, melhoramento genético em animais de produção e conservação de espécies. As principais técnicas utilizadas para a reprogramação nuclear são a transferência nuclear de células somáticas (TNCS) e a geração de células tronco pluripotente induzidas (iPS). Muitos trabalhos têm mostrado uma baixa eficiência no processo de reprogramação nuclear nas duas técnicas, além disso, modificações epigenéticas tem sido apontada como a principal barreira para uma reprogramação nuclear eficiente. Por esse motivo, medidas como a utilização de células menos diferenciadas e/ou alteração do perfil epigenético das células somáticas podem aumentar a eficiência destas técnicas. Por isso, o objetivo deste trabalho foi investigar a influência de marcas epigenéticas em células bovinas utilizadas na reprogramação nuclear mediada por TNCS ou superexpressão de genes relacionados a pluripotêcia (iPS). Para isso, utilizamos 3 abordagens. Primeiro, analisamos marcações epigenéticas relacionadas ao desenvolvimento embrionário e pluripotência (H3K9me2, H3K9me3, H3K9ac, 5mC e 5hmC) em diferentes tipos celulares, analisamos a expressão gênica de genes responsáveis por essas marcações em células de diferentes tecidos (ex. células tronco mesenquimais (MSC) e fibroblastos) e as utilizamos como doadoras de núcleo na TNCS. Na segunda e a terceira abordagem, utilizamos células com menores níveis de H3K9me2 para a geração de iPS e na TNCS, respectivamente. Além disso, por se mostrar eficiente na TNCS, analisamos o efeito da sincronização do ciclo celular por privação de soro fetal bovino (SFB) na geração de células iPS. Com o intuito de diminuir os níveis de H3K9me2, as células foram tratadas com UNC0638, um inibidor especifico das metiltransferases de histona G9a/GLP. Nossos resultados do primeiro experimento mostraram que as MSC podem ser utilizadas como doadoras de núcleo na TNCS, no entanto, mesmo com algumas diferenças na expressão gênica em relação aos fibroblastos, a produção de blastocistos não foi diferente entre as duas células. No segundo experimento, as células privadas de SFB geraram mais colônias que as células controle, enquanto que as células tratadas não apresentaram diferença. Por último, as células tratadas com o UNC0638 apresentaram um menor nível de metilação no DNA em zigotos em relação às células controle. Os resultados encontrados neste trabalho podem contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos epigenéticos envolvidos na reprogramação nuclear de bovinos.

Nuclear reprogramming of somatic cells to embryonic state has several aplications, such as basic research on developmental biology, cell therapy, genetic improvement in livestock animals and preservation of endangered species. The principal techniques utilized to achieve nuclear reprogramming are Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) and induced pluripotency. Several works has reported low efficiency rates of nuclear reprogramming when these techniques are used to reprogram somatic cells. Moreover, epigenetic modifications acquired during development act as epigenetic barrier to the complete reprogramming process. For this reason, strategies such as use of less differentiated cells and/or modification of epigenetic profile of somatic cells might increase the efficiency these techniques. The objective of this work was investigate the influence of epigenetic marks in bovine cells utilized on nuclear reprogramming experiments mediated by SCNT or induced pluripotency. To investigate it, we used three approaches. First, we analyzed the epigenetic marks related to the embryonic development and pluripotency (e.g H3K9me2, H3K9me3, H3K9ac, 5mC and 5hmC), gene expression of genes involved in these epigenetic marks in different tissues (i.e. mesenchymal stem cells (MSC) and fibroblasts) and their use as nuclear donor cells on SCNT procedure. Regarding the second and the third approach, we utilized cells with reduced levels of H3K9me2 to generate iPS cells and cloned embryos, respectively. Furthermore, since serum starvation has been demonstrated increase SCNT developmental rates, we assessed the effect of cell cycle synchronization mediated by serum starvation on nuclear reprogramming using iPS cells. Aiming decrease the levels of H3K9me2, cells were treated with UNC0638, a chemical probe that works as a specific inhibitor of the histone methyltransferases G9a and its counterpartner GLP. Our results showed that MSC are suitable to be used as nuclear donors on SCNT procedures, however, in spite of differences on gene expression comparing with fibroblasts, the embryonic developmental rates were not improved. On the second experiment, cells privated of fetal calf serum produced more iPS cells colonies than control cells, whereas cells treated with UNC did not show differences when compared with untreated cells. Lastly, UNC treated donor cells treated produced cloned zygotes with lower levels of DNA methylation compared to zygotes derivated from untreated cells. The results presented here will contribute to the better understanding of the epigenetic mechanisms involved on bovine nuclear reprogramming.

Comparação molecular entre células-tronco mesenquimais de membrana amniótica de cão e de gato

As membranas amnióticas humana, felina e canina representam uma boa fonte de célulastronco mesenquimais multipotentes. Sua obtenção não causa conflitos éticos, pois o âmnio é comumente descartado após o nascimento do indivíduo. Devido à característica inovadora da utilização de células-tronco na medicina regenerativa, diversos testes estão sendo realizados a fim de sanar dúvidas sobre possíveis complicações de seu emprego, tais como: infecções no ato da aplicação, deterioração da função tecidual e principalmente sobre o potencial tumorigênico das linhagens celulares. O teste tumoral foi negativo nas espécies felina e humana, viabilizando a utilização deste tipo de célula nestas espécies, porém, o mesmo teste foi realizado em cães anteriormente com resultado positivo para formação tumoral. A proposta deste estudo é traçar um perfil comparativo sobre as características de cultivo, marcadores moleculares e ensaio tumoral na membrana amniótica canina e felina. Para a obtenção das células, foram utilizadas placentas oriundas de 9 gestações caninas nas idades entre 35 a 45 dias, 1 gestação canina de 25 dias e 3 gestações felinas nas idades de 35 a 45 dias por procedimento de cesariana seguida de castração em clínicas da região dePirassununga. O âmnio foi separado manualmente das outras membranas fetais e acondicionado em placas de Petri, submetido à maceração manual, para posterior cultivo em meio adequado para cultura de células mesenquimais. Após o estabelecimento do cultivo, foram realizadas análises de imunocitoquímica para marcadores mesenquimais (CD73, CD90 e CD105) e tumoral (CD30) sendo que as células de origem canina mostraram-se positivas para os marcadores mesenquimais CD73, CD90 e para o marcador tumoral CD30 e as de origem felina mostraram-se positivas para os marcadores mesenquimais CD73, CD90 e CD105. O ensaio in vivo realizado com a inoculação das CTs canina e felina em camundongos imunossuprimidos (Balb/c NUDE) pelas vias subcutânea, intramuscular e intraperitoneal não demonstrando formação tumoral após 60 dias da inoculação. Foram realizadas análises de citometria de fluxo onde as maiores quantificações nas células caninas foram os marcadores de pluripotência (OCT-4 e SOX2, com 59,4% e 34,35% respectivamente), e felinas foram os marcadores mesenquimais (CD73 e CD90, com 32,58%e 23,48%). A análise de qPCR das células felinas demonstrou baixa, expressão de todos os genes testados (mesenquimais, pluripotência, hematopoiético e teratogênico). Já as células de origem canina, demonstraram expressão maior do gene mesenquimal (CD90) e do gene de pluripotência (SOX2 e OCT4). Os achados deste estudo demonstraram por ambas as técnicas (citometria e qPCR) que as células da membrana amniótica felina tem um potencial mesenquimal mais evidente do que as caninas e ambas não apresentaram potencial tumorigênico quando submetidas ao ensaio in vivo.

Human, feline and canine amniotic membranes are a good source of multipotent mesenchymal stem cells. The obtaining does not cause ethical conflict because the amnion is usually discarded after the birth. Due to the innovative feature of the use of stem cells in regenerative medicine, several tests are being conducted to answer some questions about possible complications of its use, such as infections during application, deterioration of tissue function and particularly on the carcinogenic potential of amniotic stem cells. Teratoma formation assays were proved negative in feline and human species, enabling the use of this type of cell in these species, however, the same test was performed in dogs previously and was positive for teratomas, condemning its application. The purpose of this study is to trace a molecular profile and detailed teratogenic test, comparing the canine and feline amniotic membrane model, since the experiments were favorable to the feline model, in order to find out where they differ to justify the new data to counteract the results of previous studies using canine amnion. To obtain cells, it were used placentas from 9 pregnant canines between 35 to 45 days of gestation, one placenta at 25 days from canine and 3 placentas from feline at 35 to 45 days. It was realized caesarean and followed ovarian salpingo hysterectomy at veterinarian clinics on Pirassununga region. The amnion was manually separated from the other fetalmembranes and placed on Petri dishes. Then was made a manual maceration, later to be cultivated. After culture establishment were performed immunocytochemical analyzes for mesenchymal (CD73, CD90 and CD105) and teratogenic (CD30) markers. The canine cells were positive to the following markers: CD73, CD90 and CD30 and the feline cells were positive for CD73, CD90 and CD105. Teratogenic test was conducted by subcutaneous, intramuscular and intraperitoneal inoculation of the canine and feline stem cells, in immunosuppressed mice (Balb/c NUDE)and was not observed tumor formation after 60 days of inoculation. Flow cytometry analyzes were performed where the largest quantifications in canine cells were the genes of pluripotency (Oct-4 and Sox2, 59.4% and 34.35% respectively), and the feline were performed at the mesenchymal genes (CD73 and CD90, with 32.58% and 23.48%). PCR analysis of feline cells demonstrated low expression of allmarkers tested (mesenchymal, pluripotency, hematopoietic and teratogenic). The cells of canine origin, showed higher expression of mesenchymal gene (CD90) and pluripotencys genes (SOX2 and OCT4). The findings of this study demonstrated for both techniques (flow cytometry and qPCR) that feline amniotic membrane cells has a more potential than the canine amniotic membrane cells. Both showed no tumorigenic potential when submitted to in vivo test.