Essential oils isolated from popular medicinal plants and spices as alternative antimicrobial and antibiofilm compounds against the pig pathogen Actinobacilluspleuropneumoniae / Óleos essenciais isolados de plantas medicinais e temperos populares como compostos antimicrobianos e antibiofilme alternativos contra o patógeno de suínosActinobacillus pleuropneumoniae

ABSTRACT: Actinobacilluspleuropneumoniae is the causative agent of swine pleuropneumonia, a contagious respiratory disease associated with high morbidity and economic losses. While antibiotic therapy helps to control the spreading of the pathogen on the farm, resistance to several classes of antibiotics were reported, and treatment can be impaired by the bacterial ability to form biofilms. This increases the need for alternative therapy approaches, including the use of natural compounds with antimicrobial and/or antibiofilm activities. In this research we analyzed, by the broth microdilution method, the inhibitory and bactericidal activities of the essential oils obtained from eighteen Brazilian popular medicinal plants or spices against clinical isolates of Actinobacilluspleuropneumoniae. After that, sub-inhibitory concentrations of active oils were tested for their antibiofilm effects, analyzed by the crystal violet method. Among the eighteen oils tested, eight (extracted from cinnamon, coriander, peppermint, spearmint, thyme, marjoram, eucalyptus, and laurel) presented bacteriostatic and bactericidal activities against all isolates, and subinhibitory concentrations of five of them disrupted up to 80% preformed biofilms, and significantly inhibited biofilm formation. The chemical composition of such oils was assessed by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) and is presented, indicating that their bactericidal and antibiofilm properties were mostly associated with the presence of monoterpenes and phenylpropanoids. To our knowledge, this is the first report of essential oils with potential to control environmental contamination and animal infection with A. pleuropneumoniae, representing an alternative to increasing levels of antibiotic resistance.

RESUMO: Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente causador da pleuropneumonia suína, uma doença respiratória contagiosa associada à alta morbidade e perdas econômicas. Embora a antibioticoterapia ajude a controlar a disseminação do patógeno na fazenda, a resistência a várias classes de antibióticos tem sido relatada e o tratamento pode ser prejudicado pela capacidade bacteriana de formar biofilmes. Isso aumenta a necessidade de abordagens terapêuticas alternativas, que incluem o uso de compostos naturais com atividades antimicrobianas e/ou antibiofilme. Neste trabalho, analisamos, pelo método de microdiluição em caldo nutriente, os efeitos inibitórios e bactericidas dos óleos essenciais obtidos de dezoito plantas medicinais brasileiras populares e/ou temperos contra isolados clínicos de Actinobacillus pleuropneumoniae. Então, concentrações subinibitórias dos óleos ativos foram testados quanto a suas atividades antibiofilme, analisados pelo método do cristal violeta. Dentre os dezoito óleos testados, oito (extraídos da canela, coentro, hortelã-pimenta, hortelã, tomilho, manjerona, eucalipto e louro) apresentaram atividade bacteriostática e bactericida contra todos os isolados, e concentrações subinibitórias de cinco deles romperam biofilmes pré-formados em até 80%, além de inibirem fortemente a formação de biofilmes. A composição química desses óleos foi avaliada por cromatografia gasosa/espectrometria de massa (CG/MS) e é apresentada, indicando que suas propriedades bactericidas e antibiofilme estavam principalmente associadas à presença de monoterpenos e fenilpropanóides. Este é o primeiro relato de óleos essenciais com potencial para controlar a contaminação ambiental e infecção animal por A. pleuropneumoniae, representando uma alternativa contra o crescente aumento de resistência bacteriana aos antibióticos.

Essential oils isolated from popular medicinal plants and spices as alternative antimicrobial and antibiofilm compounds against the pig pathogen Actinobacilluspleuropneumoniae / Óleos essenciais isolados de plantas medicinais e temperos populares como compostos antimicrobianos e antibiofilme alternativos contra o patógeno de suínosActinobacillus pleuropneumoniae

Actinobacilluspleuropneumoniae is the causative agent of swine pleuropneumonia, a contagious respiratory disease associated with high morbidity and economic losses. While antibiotic therapy helps to control the spreading of the pathogen on the farm, resistance to several classes of antibiotics were reported, and treatment can be impaired by the bacterial ability to form biofilms. This increases the need for alternative therapy approaches, including the use of natural compounds with antimicrobial and/or antibiofilm activities. In this research we analyzed, by the broth microdilution method, the inhibitory and bactericidal activities of the essential oils obtained from eighteen Brazilian popular medicinal plants or spices against clinical isolates of Actinobacilluspleuropneumoniae. After that, sub-inhibitory concentrations of active oils were tested for their antibiofilm effects, analyzed by the crystal violet method. Among the eighteen oils tested, eight (extracted from cinnamon, coriander, peppermint, spearmint, thyme, marjoram, eucalyptus, and laurel) presented bacteriostatic and bactericidal activities against all isolates, and subinhibitory concentrations of five of them disrupted up to 80% preformed biofilms, and significantly inhibited biofilm formation. The chemical composition of such oils was assessed by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) and is presented, indicating that their bactericidal and antibiofilm properties were mostly associated with the presence of monoterpenes and phenylpropanoids. To our knowledge, this is the first report of essential oils with potential to control environmental contamination and animal infection with A. pleuropneumoniae, representing an alternative to increasing levels of antibiotic resistance.

Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente causador da pleuropneumonia suína, uma doença respiratória contagiosa associada à alta morbidade e perdas econômicas. Embora a antibioticoterapia ajude a controlar a disseminação do patógeno na fazenda, a resistência a várias classes de antibióticos tem sido relatada e o tratamento pode ser prejudicado pela capacidade bacteriana de formar biofilmes. Isso aumenta a necessidade de abordagens terapêuticas alternativas, que incluem o uso de compostos naturais com atividades antimicrobianas e/ou antibiofilme. Neste trabalho, analisamos, pelo método de microdiluição em caldo nutriente, os efeitos inibitórios e bactericidas dos óleos essenciais obtidos de dezoito plantas medicinais brasileiras populares e/ou temperos contra isolados clínicos de Actinobacillus pleuropneumoniae. Então, concentrações subinibitórias dos óleos ativos foram testados quanto a suas atividades antibiofilme, analisados pelo método do cristal violeta. Dentre os dezoito óleos testados, oito (extraídos da canela, coentro, hortelã-pimenta, hortelã, tomilho, manjerona, eucalipto e louro) apresentaram atividade bacteriostática e bactericida contra todos os isolados, e concentrações subinibitórias de cinco deles romperam biofilmes pré-formados em até 80%, além de inibirem fortemente a formação de biofilmes. A composição química desses óleos foi avaliada por cromatografia gasosa/espectrometria de massa (CG/MS) e é apresentada, indicando que suas propriedades bactericidas e antibiofilme estavam principalmente associadas à presença de monoterpenos e fenilpropanóides. Este é o primeiro relato de óleos essenciais com potencial para controlar a contaminação ambiental e infecção animal por A. pleuropneumoniae, representando uma alternativa contra o crescente aumento de resistência bacteriana aos antibióticos.

Molecular prevalence of Mycoplasma parvum in production cycle of technified swine herds / Prevalência molecular do Mycoplasma parvum em granjas de suínos tecnificados de ciclo completo

Porcine hemoplasmosis is characterized as a geographically cosmopolitan disease caused by Mycoplasma suis and Mycoplasma parvum. Asymptomatic pigs are considered the focus of hemoplasmosis because they are carriers and reservoirs to new infections. This study aimed to determine the molecular occurrence of porcine hemoplasmas (PH) in the production cycle of technified farrow-to-finished swine herds. For this purpose, 20 swine herds were evaluated, where 501 whole blood samples were collected for qPCR and phylogenetic analyses for hemoplasmas. The epidemiological analysis was performed for the entire population and per the growth stage. The total prevalence for PH was 31.93% (161/501); 95% (19/20) of sampled herds were positive. The occurrence of PH by swine growth stages was nursery (30.47%), growing (31.29%), finishing (26.18%), and slaughter (40.25%). The quantification cycles (Cq) ranged from 3.18-39.56 and the number of PH 16S rRNA copies per µL of DNA ranged from 5,57 x10 to 2.23 x1010 . Sequencing and phylogenetic analysis of five selected samples showed 100% identity with M. parvum strain Indiana and two M. parvum sequences from Brazil/Goiás. This is the first report on PH in technified herds in Southeastern Brazil by growth stages.

A hemoplasmose suína é uma doença geograficamente cosmopolita, causada por Mycoplasma suis e Mycoplasma parvum. Suínos assintomáticos são considerados foco de hemoplasmose por serem portadores e reservatórios de novas infecções. Este estudo teve como objetivo determinar a ocorrência molecular de hemoplasmas suínos (HP) no ciclo de produção de rebanhos suínos tecnificados. Foram avaliados 20 rebanhos suínos e coletadas 501 amostras de sangue total para qPCR e análises filogenéticas para hemoplasmas. A análise epidemiológica foi realizada pela população e por estágio de crescimento. A prevalência total de HP foi de 31,93% (161/501); 95% (19/20) dos rebanhos amostrados foram positivos. A ocorrência de HP por fases de crescimento dos suínos foi: creche (30,47%), em crescimento (31,29%), acabamento (26,18%) e abate (40,25%). Os ciclos de quantificação (Cq) variaram de 3,18-39,56 e o número de cópias de rRNA PH 16S por µL de DNA variou de 5,57 x102 a 2,23 x10¹0. O sequenciamento e a análise filogenética de cinco amostras selecionadas mostraram 100% de identidade com a cepa indiana de M. parvum e duas sequências de M. parvum do Brasil / Goiás. Este é o primeiro relato de HP em rebanhos tecnificados, na região Sudeste do Brasil, por estágios de crescimento.

Condenações de carcaça suínas devido a doenças respiratórias revisão bibliográfica / Pork carcass condemnation due to respiratory diseases bibliographic review / Condena de canales de cerdo por enfermedades respiratorias revisión bibliográfica

As doenças respiratórias são um problema significativo na produção suína e podem levar à condenação de carcaças no abate. Entre os agentes causadores dessas doenças destacam-se o Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae e a Pasteurella multocida. O Actinobacillus pleuropneumoniae é um patógeno altamente contagioso, que ocasiona hemorragia, pleuropneumonia purulenta e fibrosa. A Pleuropneumonia é amplamente distribuída e gera graves prejuízos para a suinocultura. O Mycoplasma hyopneumoniae ocasionador da pneumonia por micoplasma, doença respiratória crônica. As infecções originadas podem regular negativamente o sistema imunológico do hospedeiro e aumentar a infecção e assim a replicação de outros patógenos. A Pasteurella multocida é o agente causador de uma ampla gama de infecções levando a alto impacto econômico. Patógeno comensal e oportunista da boca, nasofaringe e trato respiratório superior. A identificação precoce e o manejo adequado desses agentes causadores de doenças respiratórias são fundamentais para minimizar a incidência de carcaças suínas. A adoção de medidas preventivas, como a vacinação e práticas de manejo adequadas, pode ajudar a prevenir a propagação dessas doenças e garantir a produção de carne suína segura e de alta qualidade para o consumo humano.(AU)

Respiratory diseases are a significant problem in pork production and can lead to condemnation of carcasses at slaughter. Among the causative agents of these diseases are Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae and Pasteurella multocida. Actinobacillus pleuropneumoniae is a highly contagious pathogen that causes hemorrhage, purulent and fibrous pleuropneumonia. Pleuropneumonia is widely distributed and causes serious damage to pig farming. Mycoplasma hyopneumoniae causes mycoplasma pneumonia, a chronic respiratory disease. Originating infections can down-regulate the host's immune system and increase infection and thus replication of other pathogens. Pasteurella multocida is the causative agent of a wide range of infections leading to high economic impact. Commensal and opportunistic pathogen of the mouth, nasopharynx and upper respiratory tract. Early identification and proper management of these agents that cause respiratory diseases are essential to minimize the incidence of swine carcasses. Adopting preventive measures, such as vaccination and proper management practices, can help prevent the spread of these diseases and ensure the production of safe, high-quality pork for human consumption.(AU)

Las enfermedades respiratorias son un problema importante en la producción porcina y pueden provocar el decomiso de las canales en el matadero. Entre los agentes causantes de estas enfermedades se encuentran Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae y Pasteurella multocida. Actinobacillus pleuropneumoniae es un patógeno altamente contagioso que causa hemorragia, pleuroneumonía purulenta y fibrosa. La pleuroneumonía está ampliamente distribuida y causa graves daños a la cría de cerdos. Mycoplasma hyopneumoniae causa neumonía por micoplasma, una enfermedad respiratoria crónica. Las infecciones que se originan pueden regular a la baja el sistema inmunitario del huésped y aumentar la infección y, por lo tanto, la replicación de otros patógenos. Pasteurella multocida es el agente causal de una amplia gama de infecciones que tienen un alto impacto económico. Patógeno comensal y oportunista de la boca, nasofaringe y tracto respiratorio superior. La identificación temprana y el manejo adecuado de estos agentes causantes de enfermedades respiratorias son fundamentales para minimizar la incidencia de las canales porcinas. La adopción de medidas preventivas, como la vacunación y prácticas de manejo adecuadas, puede ayudar a prevenir la propagación de estas enfermedades y garantizar la producción de carne de cerdo segura y de alta calidad para el consumo humano.(AU)

Genotype profiles of Actinobacillus pleuropneumoniae isolated from pigs in Vojvodina, Serbia

Background: Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae) is one of the most important bacterial respiratory pathogens. It is the only etiological agent of porcine pleuropneumonia (PPP) or it appears as a secondary bacterial infection in the swine respiratory disease complex (PRDC). In Serbia, apart from the identification of serotype 2, no tests have been performed to establish the presence of other A. pleuropneumoniae serotypes in the pig population. The aim of this study was to perform genotyping of A. pleuropneumoniae isolates originating from pig farms in Serbia by apx genes and using multiplex polymerase chain reaction (mPCR). Materials, Methods & Results: Isolates of A. pleuropneumoniae examined in this study were obtained from lungs with macroscopically visible alterations characteristic of a A. pleuropneumoniae. A total of 46 isolates were examined. They were extracted from the lung tissue samples of pig carcasses from 9 farms across different parts of Serbia. Genotyping of isolates was performed in the previously described manner. Briefly, 5 pairs of oligonucleotide primers were used for amplification of 4 different apx genes which encode synthesis of exotoxins (ApxI , ApxII , ApxIII i ApxIV) characteristic for all A. pleuropneumoniae serotypes and biovars. Amplification of appropriate genome parts was performed with a reaction chain polymerase (PCR) in multiplex (m) format using appropriate diagnostic kits to extract DNA from bacteria and perform mPCR reaction. The results of genotyping of 46 isolates of A. pleuropneumoniae indicate the existence of a large number of different serotypes of A. pleuropneumoniae on the studied farms or that different serotypes of this microorganism circulate in the pig population in Serbia. In addition to the detection of dominant serotype 2, which was established on 7 farms, of which in 4 farms it was the only detected serotype, in the examined pig population the presence of serotypes 3, 5, 6, 7 and 9 was also found. Furthermore, the presence of 2 different serotypes of A. Pleuropneumoniae was also detected on 3 farms; on the first farm serotypes 2 and 3, on the second farm serotypes 2 and 6, and on the third farm serotypes 2 and 7. Discussion: Although the research was done with a relatively small number of isolates of A. pleuropneumoniae, comparing the obtained results with the results on the presence and prevalence of appropriate serotypes from other countries, we concluded that there is significant diversity of this pathogen in the pig population in farms of Serbia. Detection of different serotypes of A. pleuropneumoniae in the pig population and the presence of several different serotypes on 1 farm was established for the very first time in Serbia. All isolates from our study can be characterized as highly virulent, considering that the clinical symptoms, pathological findings and the results of bacteriological examination indicated A. pleuropneumoniae to be the cause of animal death. Like in the neighbouring countries, the strongly pathogenic serotype 9 and the less pathogenic serotype 2 are the most frequently identified causative agents of porcine pleuropneumonia in the Autonomous Province of Vojvodina, Republic of Serbia. The necessity to establish the presence of all A. pleuropneumoniae serotypes in the pig population, and in particular to determine the presence of different serotypes on individual farms, is crucial for several reasons: making a definitive e diagnosis; development of prophylactic strategies for medicines; implementation of immunoprophylactic vaccination.

Effect of bacterial agents of porcine respiratory disease complex on productive indices and slaughter weight / Impacto de agentes bacterianos do Complexo de Doenças Respiratórias de suínos (CDRS) nos índices zootécnicos e no peso ao abate em suínos em fase de terminação

Porcine respiratory disease complex comprises the interaction of two or more infectious agents. The major bacterial agents involved were investigated in 115 finishing pigs at a farm in São Paulo State, Brazil: Actinobacillus pleuropneumoniae (serology, bacterial culture, and multiplex PCR), Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) (nested PCR), Pasteurella multocida (multiplex PCR), Haemophilus parasuis (PCR multiplex), and Streptococcus sp. (bacterial culture). Macroscopic and microscopic lung lesions were evaluated, and zootechnical indices were recorded. Mhyo occurred in 113 animals (98.3%), seventeen of which were co-infected with Streptococcus sp. The finding of emphysematous lung was associated with significantly lower final and carcass weight at slaughter. Although vaccinated against Mhyo with an inactivated immunogen, almost 100% of the animals were infected. Mhyo infection with and without Streptococcus sp. co-infection was related to lung lesions of varying degrees and lower slaughter and carcass weight.

O Complexo de Doenças Respiratórias em suínos (CDRS) compreende a interação de dois ou mais agentes infecciosos, manejo e ambiente. Os principais agentes bacterianos causadores de CDRS foram investigados em 115 suínos em fase de terminação em uma granja no Estado de São Paulo, Brasil: Actinobacillus pleuropneumoniae (sorologia por ELISA, cultivo bacteriano e PCR multiplex), Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) (nested PCR), Pasteurella multocida (PCR multiplex), Haemophilus parasuis (PCR multiplex), e Streptococcus sp (cultivo bacteriano). Foram avaliadas lesões pulmonares macroscópicas e microscópicas, e impacto nos índices zootécnicos e no aproveitamento de carcaça. Houve positividade ao Mhyo em 113 animais (98,26%), destes houve infecção associada ao Streptococcus sp ao Mhyo em 14,78% (17) animais. O pulmão enfisematoso diminuiu significativamente o peso no final da terminação e o peso da carcaça. Apesar de vacinados com imunógeno inativado contra Mhyo, quase 100% dos animais estavam infectados e as lesões mais observadas foram broncopneumonia purulenta e pleurite. A infecção de Mhyo associado ou não ao Streptococcus sp causou lesões pulmonares em diferentes graus, menor peso ao abate e da carcaça.

Effect of bacterial agents of porcine respiratory disease complex on productive indices and slaughter weight / Impacto de agentes bacterianos do Complexo de Doenças Respiratórias de suínos (CDRS) nos índices zootécnicos e no peso ao abate em suínos em fase de terminação

Porcine respiratory disease complex comprises the interaction of two or more infectious agents. The major bacterial agents involved were investigated in 115 finishing pigs at a farm in São Paulo State, Brazil: Actinobacillus pleuropneumoniae (serology, bacterial culture, and multiplex PCR), Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) (nested PCR), Pasteurella multocida (multiplex PCR), Haemophilus parasuis (PCR multiplex), and Streptococcus sp. (bacterial culture). Macroscopic and microscopic lung lesions were evaluated, and zootechnical indices were recorded. Mhyo occurred in 113 animals (98.3%), seventeen of which were co-infected with Streptococcus sp. The finding of emphysematous lung was associated with significantly lower final and carcass weight at slaughter. Although vaccinated against Mhyo with an inactivated immunogen, almost 100% of the animals were infected. Mhyo infection with and without Streptococcus sp. co-infection was related to lung lesions of varying degrees and lower slaughter and carcass weight.(AU)

O Complexo de Doenças Respiratórias em suínos (CDRS) compreende a interação de dois ou mais agentes infecciosos, manejo e ambiente. Os principais agentes bacterianos causadores de CDRS foram investigados em 115 suínos em fase de terminação em uma granja no Estado de São Paulo, Brasil: Actinobacillus pleuropneumoniae (sorologia por ELISA, cultivo bacteriano e PCR multiplex), Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) (nested PCR), Pasteurella multocida (PCR multiplex), Haemophilus parasuis (PCR multiplex), e Streptococcus sp (cultivo bacteriano). Foram avaliadas lesões pulmonares macroscópicas e microscópicas, e impacto nos índices zootécnicos e no aproveitamento de carcaça. Houve positividade ao Mhyo em 113 animais (98,26%), destes houve infecção associada ao Streptococcus sp ao Mhyo em 14,78% (17) animais. O pulmão enfisematoso diminuiu significativamente o peso no final da terminação e o peso da carcaça. Apesar de vacinados com imunógeno inativado contra Mhyo, quase 100% dos animais estavam infectados e as lesões mais observadas foram broncopneumonia purulenta e pleurite. A infecção de Mhyo associado ou não ao Streptococcus sp causou lesões pulmonares em diferentes graus, menor peso ao abate e da carcaça.(AU)

Molecular detection of Mycoplasma suis in extensive pig production systems in the State of Maranhão, northeast Brazil / Detecção molecular de Mycoplasma suis em suínos de criações extensivas no estado do Maranhão, nordeste do Brasil

Mycoplasma suis is a bacterium that causes hemoplasmosis in pigs. This agent is capable of adhering to the surface of porcine erythrocytes, inducing structural changes on these cells. In Brazil, there are few reports about the disease, its causal agent, and the economic impact of this pathogen on pig production systems and farm sanitation. The present study aimed to investigate the occurrence of M. suis in extensive swine farms located in the counties of Itapecuru Mirim, Santa Rita and Rosario, State of Maranhão, northeast Brazil. For such purpose, 64 blood samples of pigs from these facilities were tested for M. suis using a 16S rRNA gene-based quantitative real-time PCR (qPCR); 82.3%, 65.2% and 25% of blood samples of swine from farms in the cities of Itapecuru Mirim, Santa Rita and Rosario were positive for M. suis by qPCR, respectively. This study shows, for the first time, that M. suis circulates in pig populations from the state of Maranhão, Northeast Brazil.

Mycoplasma suis é uma bactéria que causa a hemoplasmose em suínos. Este agente é capaz de se aderir à superfície dos eritrócitos de suínos, ocasionando deformações estruturais nestas células. No Brasil, poucos são os relatos acerca do parasita, da infecção e de seus impactos econômicos nas esferas produtiva e sanitária. O objetivo deste estudo foi investigar, por meio da PCR em tempo real quantitativa (qPCR) baseada no gene 16S rRNA, a ocorrência de M. suis em 64 amostras de sangue de suínos de criações extensivas dos municípios de Itapecuru Mirim, Santa Rita e Rosário, localizados no estado do Maranhão. Foram obtidos um percentual de 82,3%, 65,2% e 25% de amostras positivas na qPCR para M. suis nos municípios de Itapecuru Mirim, Santa Rita e Rosário, respectivamente. Este estudo mostra que M. suis circula entre os suínos de criações extensivas no estado do Maranhão.

Molecular detection of Mycoplasma suis in extensive pig production systems in the State of Maranhão, northeast Brazil / Detecção molecular de Mycoplasma suis em suínos de criações extensivas no estado do Maranhão, nordeste do Brasil

Mycoplasma suis is a bacterium that causes hemoplasmosis in pigs. This agent is capable of adhering to the surface of porcine erythrocytes, inducing structural changes on these cells. In Brazil, there are few reports about the disease, its causal agent, and the economic impact of this pathogen on pig production systems and farm sanitation. The present study aimed to investigate the occurrence of M. suis in extensive swine farms located in the counties of Itapecuru Mirim, Santa Rita and Rosario, State of Maranhão, northeast Brazil. For such purpose, 64 blood samples of pigs from these facilities were tested for M. suis using a 16S rRNA gene-based quantitative real-time PCR (qPCR); 82.3%, 65.2% and 25% of blood samples of swine from farms in the cities of Itapecuru Mirim, Santa Rita and Rosario were positive for M. suis by qPCR, respectively. This study shows, for the first time, that M. suis circulates in pig populations from the state of Maranhão, Northeast Brazil.(AU)

Mycoplasma suis é uma bactéria que causa a hemoplasmose em suínos. Este agente é capaz de se aderir à superfície dos eritrócitos de suínos, ocasionando deformações estruturais nestas células. No Brasil, poucos são os relatos acerca do parasita, da infecção e de seus impactos econômicos nas esferas produtiva e sanitária. O objetivo deste estudo foi investigar, por meio da PCR em tempo real quantitativa (qPCR) baseada no gene 16S rRNA, a ocorrência de M. suis em 64 amostras de sangue de suínos de criações extensivas dos municípios de Itapecuru Mirim, Santa Rita e Rosário, localizados no estado do Maranhão. Foram obtidos um percentual de 82,3%, 65,2% e 25% de amostras positivas na qPCR para M. suis nos municípios de Itapecuru Mirim, Santa Rita e Rosário, respectivamente. Este estudo mostra que M. suis circula entre os suínos de criações extensivas no estado do Maranhão.(AU)

Anatomopathological pneumonic aspects associated with highly pathogenic Pasteurella multocida in finishing pigs / Aspectos pneumônicos anatomo-patológicos associados a Pasteurella multocida de alta patogenicidade em suínos de terminação

The bacterium Pasteurella multocida is a frequent cause of porcine respiratory disease complex in finishing pigs. Historically, the bacterium is recognized as an opportunistic agent, causing secondary bacterial pneumonia in pigs. Several Brazilian reports have suggested the ability of P. multocida to cause primary pulmonary infection that leads to the death of finishing pigs prior to slaughter. The aim of this study was to evaluate anatomopathological pulmonary findings associated with P. multocida infection that were obtained from animals with clinical respiratory disease and from animals at slaughter. Twenty-five lung samples from 14 herds of finishing pigs with acute clinical respiratory disease and 19 lungs collected at slaughter from a different set of 14 herds were studied. In all lung samples, bacterial isolation was performed, and only samples with pure P. multocida growth were included in the study. Gross and histopathological lesions were evaluated, as well as Influenza A, porcine circovirus type 2 (PCV2) and Mycoplasma hyopneumoniae co-infections. Pleuritis and pericarditis were more often observed in clinical samples (P<0.05). Moreover, there was a numerical trend indicating that pericarditis, lymphadenomegaly and cavity exudates were more often present in clinical samples. Thirteen lung samples were negative to M. hyopneumoniae, Influenza A and PCV2 by immunohistochemistry (IHC), with only P. multocida identified. In these cases, gross lesions such as pleuritis, pericarditis and lymphadenomegaly were always present, and no histologic lesions indicative of other agents such as Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis or Haemophilus parasuis were observed. These findings suggest the ability of some P. multocida isolates to cause primary respiratory and systemic infection. However, in this study, it was not possible to determine specific virulence markers to explain these findings.

A bactéria Pasteurella multocida é causa frequente do Complexo de Doenças Respiratórias dos suínos em animais de terminação. Historicamente, a bactéria é reconhecida como agente oportunista, causando pneumonia bacteriana secundária. Diversos relatos brasileiros sugerem a habilidade da P. multocida de causar infecção pulmonar primária que leva a mortalidade de animais de terminação antes do abate. O objetivo deste estudo foi avaliar achados anatomopatológicos pulmonares associados com infecção por P. multocida, obtidas de animais acometidos clinicamente por doença respiratória e de animais ao abate. Avaliou-se 25 amostras de pulmão de 14 rebanhos obtidas de animais de terminação com sinais clínicos de doença respiratória aguda, e 19 pulmões coletados ao abate de 14 rebanhos diferentes. Em todos os pulmões, realizou-se isolamento bacteriano, e apenas amostras com crescimento puro de P. multocida foram incluídas no trabalho. Avaliou-se as lesões macro e microscopicamente, assim como co-infecções por Influenza A, Circovirus suíno tipo 2 (PCV2) e Mycoplasma hyopneumoniae. Pleurite e pericardite foram mais frequentemente observadas em amostras clinicas (P<0,05). Ainda, houve tendência numérica indicando a ocorrência de linfadenomegalia e exsudação cavitária, mais presentes em amostras clínicas. Treze amostras de pulmão foram negativas para M. hyopneumoniae, Influenza A e PCV2 por imunoistoquímica (IHQ), com identificação de apenas P. multocida. Nestes casos, lesões macroscópicas como pleurite, pericardite e linfadenomegalia foram sempre presentes, sem lesões histológicas indicativas de outros agentes como Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis ou Haemophilus parasuis. Estes achados sugerem a habilidade de alguns isolados de P. multocida de causarem quadro respiratório primário e infecção sistêmica. No entanto, neste estudo, não foi possível determinar marcadores de virulência específicos para justificar tais achados.

Anatomopathological pneumonic aspects associated with highly pathogenic Pasteurella multocida in finishing pigs / Aspectos pneumônicos anatomo-patológicos associados a Pasteurella multocida de alta patogenicidade em suínos de terminação

The bacterium Pasteurella multocida is a frequent cause of porcine respiratory disease complex in finishing pigs. Historically, the bacterium is recognized as an opportunistic agent, causing secondary bacterial pneumonia in pigs. Several Brazilian reports have suggested the ability of P. multocida to cause primary pulmonary infection that leads to the death of finishing pigs prior to slaughter. The aim of this study was to evaluate anatomopathological pulmonary findings associated with P. multocida infection that were obtained from animals with clinical respiratory disease and from animals at slaughter. Twenty-five lung samples from 14 herds of finishing pigs with acute clinical respiratory disease and 19 lungs collected at slaughter from a different set of 14 herds were studied. In all lung samples, bacterial isolation was performed, and only samples with pure P. multocida growth were included in the study. Gross and histopathological lesions were evaluated, as well as Influenza A, porcine circovirus type 2 (PCV2) and Mycoplasma hyopneumoniae co-infections. Pleuritis and pericarditis were more often observed in clinical samples (P<0.05). Moreover, there was a numerical trend indicating that pericarditis, lymphadenomegaly and cavity exudates were more often present in clinical samples. Thirteen lung samples were negative to M. hyopneumoniae, Influenza A and PCV2 by immunohistochemistry (IHC), with only P. multocida identified. In these cases, gross lesions such as pleuritis, pericarditis and lymphadenomegaly were always present, and no histologic lesions indicative of other agents such as Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis or Haemophilus parasuis were observed. These findings suggest the ability of some P. multocida isolates to cause primary respiratory and systemic infection. However, in this study, it was not possible to determine specific virulence markers to explain these findings.(AU)

A bactéria Pasteurella multocida é causa frequente do Complexo de Doenças Respiratórias dos suínos em animais de terminação. Historicamente, a bactéria é reconhecida como agente oportunista, causando pneumonia bacteriana secundária. Diversos relatos brasileiros sugerem a habilidade da P. multocida de causar infecção pulmonar primária que leva a mortalidade de animais de terminação antes do abate. O objetivo deste estudo foi avaliar achados anatomopatológicos pulmonares associados com infecção por P. multocida, obtidas de animais acometidos clinicamente por doença respiratória e de animais ao abate. Avaliou-se 25 amostras de pulmão de 14 rebanhos obtidas de animais de terminação com sinais clínicos de doença respiratória aguda, e 19 pulmões coletados ao abate de 14 rebanhos diferentes. Em todos os pulmões, realizou-se isolamento bacteriano, e apenas amostras com crescimento puro de P. multocida foram incluídas no trabalho. Avaliou-se as lesões macro e microscopicamente, assim como co-infecções por Influenza A, Circovirus suíno tipo 2 (PCV2) e Mycoplasma hyopneumoniae. Pleurite e pericardite foram mais frequentemente observadas em amostras clinicas (P<0,05). Ainda, houve tendência numérica indicando a ocorrência de linfadenomegalia e exsudação cavitária, mais presentes em amostras clínicas. Treze amostras de pulmão foram negativas para M. hyopneumoniae, Influenza A e PCV2 por imunoistoquímica (IHQ), com identificação de apenas P. multocida. Nestes casos, lesões macroscópicas como pleurite, pericardite e linfadenomegalia foram sempre presentes, sem lesões histológicas indicativas de outros agentes como Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis ou Haemophilus parasuis. Estes achados sugerem a habilidade de alguns isolados de P. multocida de causarem quadro respiratório primário e infecção sistêmica. No entanto, neste estudo, não foi possível determinar marcadores de virulência específicos para justificar tais achados.(AU)

Detecção direta de Actinobacillus pleuropneumoniae em órgãos de suídeos do estado de São Paulo pela técnica de reação em cadeia pela polimerase (nested-PCR) / Direct detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in suidae organs in São Paulo state, Brazil, by polymerase chain reaction (nested-PCR)

A pleuropneumonia suína, causada pelo Actinobacillus pleuropneumoniae, é uma importante doença respiratória, responsável por prejuízos e queda de produtividade nas criações. Este trabalho teve como objetivo determinar a ocorrência de A. pleuropneumoniae em amostras de campo, mediante a adaptação e emprego de uma técnica de nested-PCR dirigida ao gene Apx IV. Definiu-se a sensibilidade analítica das técnicas de PCR e nested-PCR utilizando a amostra padrão A. pleuropneumoniae sorotipo III, em concentrações de DNA variando entre 30 µg/mL a 0,01 ng/ mL. Um total de trinta e sete amostras de campo encaminhadas ao Instituto Biológico entre 1995 a 2007 foram analisadas pelas técnicas de PCR e nested-PCR. A avaliação da sensibilidade analítica revelou que a PCR possui capacidade de gerar sinal a partir de 2 ng/mL de DNA extraído e a nested-PCR a partir de 0,4 ng/mL. Uma vez que a nested-PCR apresentou sensibilidade analítica cinco vezes maior se comparada à PCR para detecção de A. pleuropneumoniae em amostra padrão, o seu emprego pode minimizar a ocorrência de resultados tipo "falso-negativo". Dentre as amostras testadas, dez foram positivas à nested-PCR, sendo observada a ocorrência de A. pleuropneumoniae em nove diferentes animais, um deles javali. A presente técnica de nested-PCR pode ser utilizada para detecção direta de A. pleuropneumoniae em amostras de campo, mesmo após congelamento da amostra por longos períodos e sem necessidade de isolamento bacteriano prévio.

Porcine pleuropneumonia, caused by Actinobacillus pleuropneumoniae, is an important respiratory disease, responsible for economic losses and reduced productivity. The aim of this study was to determine occurrence of A. pleuropneumoniae in field samples, using an adapted nested-PCR reaction targeting the Apx IV gene. Different DNA concentrations (from 30 µg/mL to 0.01 ng/mL) of A. pleuropneumoniae serotype III reference strain were used to determine the level of sensitivity of first generation and nested-PCR reactions. Thirty-seven field samples sent to Instituto Biológico from 1995 to 2007 were tested by PCR and nested-PCR. Determination of the level of sensitivity showed that PCR could amplify to 2 ng/mL of extracted DNA and nested-PCR to 0.4 ng/mL. Since the nested reaction exhibited a level of sensitivity 5 times greater than the PCR reaction to detect a reference strain, using nested-PCR could minimize the occurrence of false-negative results. Among tested samples, 10 of them were nested-PCR positive, showing occurrence of A. pleuropneumoniae in 9 different animals (including one wild boar). This nested-PCR reaction can be used for direct detection of A. pleuropneumoniae in field samples, even after frozen storage for long periods, without the need for previous bacterial isolation.

DETECÇÃO DIRETA DE ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE EM ÓRGÃOS DE SUÍDEOS DO ESTADO DE SÃO PAULO PELA TÉCNICA DE REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (NESTED-PCR)

ABSTRACT Porcine pleuropneumonia, caused by Actinobacillus pleuropneumoniae, is an important respiratory disease, responsible for economic losses and reduced productivity. The aim of this study was to determine occurrence of A. pleuropneumoniae in field samples, using an adapted nested-PCR reaction targeting the Apx IV gene. Different DNA concentrations (from 30 µg/mL to 0.01 ng/mL) of A. pleuropneumoniae serotype III reference strain were used to determine the level of sensitivity of first generation and nested-PCR reactions. Thirty-seven field samples sent to Instituto Biológico from 1995 to 2007 were tested by PCR and nested-PCR. Determination of the level of sensitivity showed that PCR could amplify to 2 ng/mL of extracted DNA and nested-PCR to 0.4 ng/mL. Since the nested reaction exhibited a level of sensitivity 5 times greater than the PCR reaction to detect a reference strain, using nested-PCR could minimize the occurrence of false-negative results. Among tested samples, 10 of them were nested-PCR positive, showing occurrence of A. pleuropneumoniae in 9 different animals (including one wild boar). This nested-PCR reaction can be used for direct detection of A. pleuropneumoniae in field samples, even after frozen storage for long periods, without the need for previous bacterial isolation.

RESUMO A pleuropneumonia suína, causada pelo Actinobacillus pleuropneumoniae, é uma importante doença respiratória, responsável por prejuízos e queda de produtividade nas criações. Este trabalho teve como objetivo determinar a ocorrência de A. pleuropneumoniae em amostras de campo, mediante a adaptação e emprego de uma técnica de nested-PCR dirigida ao gene Apx IV. Definiu-se a sensibilidade analítica das técnicas de PCR e nested-PCR utilizando a amostra padrão A. pleuropneumoniae sorotipo III, em concentrações de DNA variando entre 30 µg/mL a 0,01 ng/ mL. Um total de trinta e sete amostras de campo encaminhadas ao Instituto Biológico entre 1995 a 2007 foram analisadas pelas técnicas de PCR e nested-PCR. A avaliação da sensibilidade analítica revelou que a PCR possui capacidade de gerar sinal a partir de 2 ng/mL de DNA extraído e a nested-PCR a partir de 0,4 ng/mL. Uma vez que a nested-PCR apresentou sensibilidade analítica cinco vezes maior se comparada à PCR para detecção de A. pleuropneumoniae em amostra padrão, o seu emprego pode minimizar a ocorrência de resultados tipo falso-negativo. Dentre as amostras testadas, dez foram positivas à nested-PCR, sendo observada a ocorrência de A. pleuropneumoniae em nove diferentes animais, um deles javali. A presente técnica de nested-PCR pode ser utilizada para detecção direta de A. pleuropneumoniae em amostras de campo, mesmo após congelamento da amostra por longos períodos e sem necessidade de isolamento bacteriano prévio.

Otimização da técnica da PCR para a detecção de Actinobacillus pleuropneumoniae

The use of molecular methods based on PCR is important in Actinobacillus pleuropneumoniae detection, being able to identify the infection before the establishment of the disease in the herd. These methods have larger sensitivity when compared with traditional methods of bacteriological isolation, but they can suffer influence of substances that reduce the specificity of the test and resulting in inespecific amplifications. In order to reduce inespecific amplifications, observed when applied the PCR technique for the gene cpx in tonsil's tissue samples, the optimization was performed, in which different annealing temperatures were analyzed and introduced, in the technique, an antibody that binds to the enzyme Taq DNA Polimerase, increasing its specificity. In parallel, an experiment was performed in order to verify the inhibiting effect of the tonsil's tissue on the PCR results. For that, portions of tonsil from animals negative to the A. pleuropneumoniae were artificially contaminated with the reference sample of the sorotype 5B. The addition antibody for the enzyme Taq DNA Polimerase and the increase of the primers anneling temperature to 57°C reduced the inespecific amplifications. The results obtained in the experiment demonstrated a possible inhibiting effect of the tonsil's tissue in the PCR amplifications. Besides, amplifications depend on at least 675 UFC present in the aliquot of samples that will be used in PCR (equivalent to 1.35 x 10(5) UFC mL-1), therefore, samples tissue's fragments in initial infections and/or with few cells can result in false-negative.

A utilização de métodos moleculares baseados em PCR é fundamental na detecção do Actinobacillus pleuropneumoniae, sendo capaz de identificar a infecção antes do estabelecimento da doença no rebanho. Estes métodos apresentam maior sensibilidade quando comparados com métodos tradicionais de isolamento bacteriano, mas podem sofrer influência de substâncias que reduzem a especificidade do teste e proporcionam o aparecimento de amplificações inespecíficas. No intuito de reduzir as amplificações inespecíficas, observadas quando aplicada a PCR para o gene cpx em amostras de tecido tonsilar, procedeu-se a otimização da técnica, na qual foram analisados o efeito do pré-cultivo bacteriano e as diferentes temperaturas de anelamento dos iniciadores e foi introduzido, no protocolo, um anticorpo que se liga na enzima Taq DNA Polimerase, aumentando a especificidade do teste. Paralelamente, foi realizado um experimento para verificar o efeito inibidor do tecido tonsilar sobre os resultados da PCR. Para isso, porções de tonsila de animais negativos para A. pleuropneumoniae foram contaminadas artificialmente com a amostra referência do sorotipo 5B. A adição do anticorpo para a enzima Taq DNA Polimerase e o aumento da temperatura de anelamento dos iniciadores para 57°C diminuiu o aparecimento de amplificações inespecíficas. Os resultados obtidos no experimento demonstraram que o tecido tonsilar possui efeito inibidor nas amplificações da PCR. Além disso, a amplificação depende de, no mínimo, 675 UFC presentes na alíquota da amostra usada na PCR (equivalente a 1,35 x 10(5) UFC mL-1), assim, amostras de fragmentos de tecido de infecções iniciais e/ou com poucas células podem apresentar resultados falsos negativos.

Otimização da técnica da PCR para a detecção de Actinobacillus pleuropneumoniae

The use of molecular methods based on PCR is important in Actinobacillus pleuropneumoniae detection, being able to identify the infection before the establishment of the disease in the herd. These methods have larger sensitivity when compared with traditional methods of bacteriological isolation, but they can suffer influence of substances that reduce the specificity of the test and resulting in inespecific amplifications. In order to reduce inespecific amplifications, observed when applied the PCR technique for the gene cpx in tonsil's tissue samples, the optimization was performed, in which different annealing temperatures were analyzed and introduced, in the technique, an antibody that binds to the enzyme Taq DNA Polimerase, increasing its specificity. In parallel, an experiment was performed in order to verify the inhibiting effect of the tonsil's tissue on the PCR results. For that, portions of tonsil from animals negative to the A. pleuropneumoniae were artificially contaminated with the reference sample of the sorotype 5B. The addition antibody for the enzyme Taq DNA Polimerase and the increase of the primers anneling temperature to 57°C reduced the inespecific amplifications. The results obtained in the experiment demonstrated a possible inhibiting effect of the tonsil's tissue in the PCR amplifications. Besides, amplifications depend on at least 675 UFC present in the aliquot of samples that will be used in PCR (equivalent to 1.35 x 10(5) UFC mL-1), therefore, samples tissue's fragments in initial infections and/or with few cells can result in false-negative.

A utilização de métodos moleculares baseados em PCR é fundamental na detecção do Actinobacillus pleuropneumoniae, sendo capaz de identificar a infecção antes do estabelecimento da doença no rebanho. Estes métodos apresentam maior sensibilidade quando comparados com métodos tradicionais de isolamento bacteriano, mas podem sofrer influência de substâncias que reduzem a especificidade do teste e proporcionam o aparecimento de amplificações inespecíficas. No intuito de reduzir as amplificações inespecíficas, observadas quando aplicada a PCR para o gene cpx em amostras de tecido tonsilar, procedeu-se a otimização da técnica, na qual foram analisados o efeito do pré-cultivo bacteriano e as diferentes temperaturas de anelamento dos iniciadores e foi introduzido, no protocolo, um anticorpo que se liga na enzima Taq DNA Polimerase, aumentando a especificidade do teste. Paralelamente, foi realizado um experimento para verificar o efeito inibidor do tecido tonsilar sobre os resultados da PCR. Para isso, porções de tonsila de animais negativos para A. pleuropneumoniae foram contaminadas artificialmente com a amostra referência do sorotipo 5B. A adição do anticorpo para a enzima Taq DNA Polimerase e o aumento da temperatura de anelamento dos iniciadores para 57°C diminuiu o aparecimento de amplificações inespecíficas. Os resultados obtidos no experimento demonstraram que o tecido tonsilar possui efeito inibidor nas amplificações da PCR. Além disso, a amplificação depende de, no mínimo, 675 UFC presentes na alíquota da amostra usada na PCR (equivalente a 1,35 x 10(5) UFC mL-1), assim, amostras de fragmentos de tecido de infecções iniciais e/ou com poucas células podem apresentar resultados falsos negativos.

Aspectos recentes da patogênese e diagnóstico da pleuropneumonia suína

Porcine pleuropneumonia is a highly contagious disease caused by the bacterium Actinobacillus pleuropneumoniae, a pathogen responsible for substantial losses worldwide to the pig industry. The disease is characterized by fibrinous pleuritis with hemorrhagic and necrotic lesions in the lungs, and pleural adhesions. Specific and precise methods for the identification of this pathogen are still required. In the present article we review the pathogenesis, as the traditional and the recently developed molecular methods employed for the identification and characterization of A. pleuropneumoniae.

A pleuropneumonia suína, causada por Actinobacillus pleuropneumoniae, é uma doença caracterizada pela apresentação fibrino-hemorrágica com pleurite adesiva. A enfermidade está presente em todos os países produtores de suínos, sendo responsável por prejuízos econômicos elevados. No Brasil e no mundo, diversos grupos vêm conduzindo estudos na busca por um melhor entendimento da doença e de sua epidemiologia. Avanços importantes foram obtidos, entre os quais a caracterização dos fatores de virulência, implicados na apresentação clínica da enfermidade; e a aplicação de novos métodos de diagnóstico. A difusão das técnicas de biologia molecular como ferramenta diagnóstica em Medicina Veterinária tem contribuindo para a identificação de Actinobacillus pleuropneumoniae. Nesta revisão, são abordados os aspectos mais recentes sobre a patogênese e o diagnóstico deste importante patógeno.

Aspectos recentes da patogênese e diagnóstico da pleuropneumonia suína

Porcine pleuropneumonia is a highly contagious disease caused by the bacterium Actinobacillus pleuropneumoniae, a pathogen responsible for substantial losses worldwide to the pig industry. The disease is characterized by fibrinous pleuritis with hemorrhagic and necrotic lesions in the lungs, and pleural adhesions. Specific and precise methods for the identification of this pathogen are still required. In the present article we review the pathogenesis, as the traditional and the recently developed molecular methods employed for the identification and characterization of A. pleuropneumoniae.

A pleuropneumonia suína, causada por Actinobacillus pleuropneumoniae, é uma doença caracterizada pela apresentação fibrino-hemorrágica com pleurite adesiva. A enfermidade está presente em todos os países produtores de suínos, sendo responsável por prejuízos econômicos elevados. No Brasil e no mundo, diversos grupos vêm conduzindo estudos na busca por um melhor entendimento da doença e de sua epidemiologia. Avanços importantes foram obtidos, entre os quais a caracterização dos fatores de virulência, implicados na apresentação clínica da enfermidade; e a aplicação de novos métodos de diagnóstico. A difusão das técnicas de biologia molecular como ferramenta diagnóstica em Medicina Veterinária tem contribuindo para a identificação de Actinobacillus pleuropneumoniae. Nesta revisão, são abordados os aspectos mais recentes sobre a patogênese e o diagnóstico deste importante patógeno.