Resumo
Currently, gonadotropin products (follicle stimulating hormone, FSH, and luteinizing hormone, LH) used in animal reproduction are produced by extraction and purification from abattoir-derived pituitary glands. This method, relying on animal-derived materials, carries the potential risk of hormone contamination and pathogen transmission. Additionally, chorionic gonadotropins are extracted from the blood of pregnant mares (equine chorionic gonadotropin; eCG) or the urine of pregnant women (human chorionic gonadotropin; hCG). However, recent advancements have introduced recombinant gonadotropins for assisted animal reproduction therapies. The traditional use of FSH for superovulation has limitations, including labor requirements and variability in superovulation response, affecting the success of in vivo (SOV) and in vitro (OPU/IVEP) embryo production. FSH treatment for superstimulation before OPU can promote the growth of a homogenous follicular population and the recovery of competent oocytes suitable for IVEP procedures. At present, a single injection of a preparation of long-acting bovine recombinant FSH (rFSH) produced similar superovulation responses resulting in the production of good-quality in vivo and in vitro embryos. Furthermore, the treatment with eCG at FTAI protocol has demonstrated its efficacy in promoting follicular growth, ovulation, and P/AI, mainly in heifers and anestrous cows. Currently, treatment with recombinant glycoproteins with eCG-like activity (r-eCG) have shown promising results in increasing follicular growth, ovulation, and P/AI in cows submitted to P4/E2 -based protocols. Bovine somatotropin (bST) is a naturally occurring hormone found in cows. Recombinant bovine somatotropin (rbST), produced through genetic engineering techniques, has shown potential in enhancing reproductive outcomes in ruminants. Treatment with rbST has been found to improve P/IA, increase donor embryo production, and enhance P/ET in recipients. The use of recombinant hormones allows to produce non-animal-derived products, offering several advantages in assisted reproductive technologies for ruminants. This advancement opens up new possibilities for improving reproductive efficiency and success rates in the field of animal reproduction.(AU)
Assuntos
Animais , Feminino , Indução da Ovulação/métodos , Ruminantes/embriologia , Proteínas Recombinantes/farmacologiaResumo
ABSTRACT: Streptomyces sampsonii is a kind of biocontrol bacterium with antifungal effects, and chitinase is one of the main antifungal substances. To improve and further study the structure and function of the chitinase gene of S. sampsonii, we amplified the target fragment by PCR, ligated the fragment to the expression vector pET-32a, introduced the resulting plasmid into Escherichia coli BL21 (DE3) and induced expression of the chitinase. Then, the recombinant chitinase was purified by is-labelled protein micro purification kit. A chitinase gene, Sschi61, was cloned from the genome and expressed in a prokaryote. The antifungal effect of the recombinant protein was also studied. Finally, the chitinase gene Sschi61 with a length of 1755 bp was obtained, and the expression of the 82 kDa recombinant chitinase was induced in E. coli by IPTG. The recombinant chitinase could inhibit the black spot pathogen of Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola). After the hyphae of the pathogen of black spot of Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola) were soaked with recombinant chitinase, the hyphae cells expanded, broke, and dissolved.
RESUMO: Streptomyces sampsonii é uma espécie de bactéria de biocontrole com efeitos antifúngicos, sendo a quitinase uma das principais substâncias desse tipo. Para melhorar e estudar mais a estrutura e função do gene da quitinase de S. sampsonii, amplificamos o fragmento alvo por PCR, ligamos o fragmento ao vetor de expressão pET-32a, introduzimos o plasmídeo resultante em Escherichia coli BL21 (DE3) e induzimos expressão da quitinase. Em seguida, a quitinase recombinante foi purificada pelo kit de micropurificação de proteína marcada. Um gene da quitinase, Sschi61, foi clonado do genoma e expresso em um procarioto. O efeito antifúngico da proteína recombinante também foi estudado. Finalmente, o gene da quitinase Sschi61 foi obtido, contando comprimento de 1755 pb, e a expressão da quitinase recombinante de 82 kDa foi induzida em E. coli por IPTG. A quitinase recombinante pode inibir o patógeno da mancha preta de Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola). Após as hifas do patógeno da mancha preta de Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola) serem embebidas com quitinase recombinante, as células das hifas se expandiram, quebraram e se dissolveram.
Resumo
Streptomyces sampsonii is a kind of biocontrol bacterium with antifungal effects, and chitinase is one of the main antifungal substances. To improve and further study the structure and function of the chitinase gene of S. sampsonii, we amplified the target fragment by PCR, ligated the fragment to the expression vector pET-32a, introduced the resulting plasmid into Escherichia coli BL21 (DE3) and induced expression of the chitinase. Then, the recombinant chitinase was purified by is-labelled protein micro purification kit. A chitinase gene, Sschi61, was cloned from the genome and expressed in a prokaryote. The antifungal effect of the recombinant protein was also studied. Finally, the chitinase gene Sschi61 with a length of 1755 bp was obtained, and the expression of the 82 kDa recombinant chitinase was induced in E. coli by IPTG. The recombinant chitinase could inhibit the black spot pathogen of Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola). After the hyphae of the pathogen of black spot of Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola) were soaked with recombinant chitinase, the hyphae cells expanded, broke, and dissolved.
Streptomyces sampsonii é uma espécie de bactéria de biocontrole com efeitos antifúngicos, sendo a quitinase uma das principais substâncias desse tipo. Para melhorar e estudar mais a estrutura e função do gene da quitinase de S. sampsonii, amplificamos o fragmento alvo por PCR, ligamos o fragmento ao vetor de expressão pET-32a, introduzimos o plasmídeo resultante em Escherichia coli BL21 (DE3) e induzimos expressão da quitinase. Em seguida, a quitinase recombinante foi purificada pelo kit de micropurificação de proteína marcada. Um gene da quitinase, Sschi61, foi clonado do genoma e expresso em um procarioto. O efeito antifúngico da proteína recombinante também foi estudado. Finalmente, o gene da quitinase Sschi61 foi obtido, contando comprimento de 1755 pb, e a expressão da quitinase recombinante de 82 kDa foi induzida em E. coli por IPTG. A quitinase recombinante pode inibir o patógeno da mancha preta de Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola). Após as hifas do patógeno da mancha preta de Eucommia ulmoides (Pestalotiopsis trachicarpicola) serem embebidas com quitinase recombinante, as células das hifas se expandiram, quebraram e se dissolveram.
Assuntos
Streptomyces , Quitinases , Controle Biológico de Vetores , Células Clonais , AntifúngicosResumo
Vaccination has been used to prevent the losses associated with Bovine alphaherpesvirus 1 (BoHV-1) infection but passively acquired antibodies may compromise vaccine efficacy. Intranasal immunization (IN) of calves with modified live viral BoHV-1 vaccines has proven to overcome the acquired passive antibodies and confer adequate protection. Herein, we evaluated the safety and immunogenicity of a glycoprotein E-deleted Brazilian BoHV-1 strain (BoHV-1gEΔ) for IN immunization of calves. Ten 1-to-2 months-old calves with virus-neutralizing titers (VN) ranging from 2-64 were immunized IN with viable BoHV-1gEΔ (107.1 TCID50) and four remained as unvaccinated controls (VN titers 8-32). After IN immunization, calves presented a transient (2-6 days) mild nasal secretion and shed the vaccine virus in nasal secretions in low titers (<102.6TCID50/mL) for 4-8 days. Interestingly, the vaccinated calves did not show an increase in VN titers after vaccination. Rather, they presented a gradual reduction in serum VN antibodies in the following weeks - similarly to unvaccinated controls. Upon IN challenge with a virulent heterologous BoHV-1 strain at day 55 post-immunization (107.63TCID50), vaccinated calves shed significantly less virus from day 6 post-challenge onwards (p < 0.07) and for a shorter period of time than the controls (p < 0.0024). Importantly, both the duration and intensity of clinical signs were reduced in vaccinated animals. In addition, vaccinated calves showed an abrupt raise in VN titers post-challenge, indicating adequate immunological priming by vaccination. In summary, immunization of calves harboring passive antibodies with BoHV-1gEΔ by the IN route was able to prime the immunity to afford partial virological and clinical protection upon challenge.
A vacinação tem sido usada para prevenir perdas associadas à infecção pelo alfaherpesvírus bovino 1 (BoHV-1), embora anticorpos adquiridos passivamente possam comprometer a eficácia das vacinas. A imunização intranasal (IN) de bezerros com vacinas de BoHV-1 vivas modificadas pode contornar o obstáculo relacionado à presença de anticorpos adquiridos passivamente, conferindo proteção aos animais vacinados. Nesse contexto, avaliou-se a segurança e imunogenicidade de uma cepa brasileira de BoHV-1 com deleção no gene da glicoproteína E (BoHV-1gEΔ) na imunização IN de bezerros. Dez bezerros, de um a dois meses de idade e com títulos neutralizantes (VN) variando de 2-64, foram inoculados IN com BoHV-1gEΔ (107,1TCID50), e quatro permaneceram como controles não vacinados (títulos de VN 8-32). Após a instilação IN, os bezerros apresentaram secreção nasal transitória leve (2-6 dias) e excretaram o vírus vacinal nas secreções nasais em baixos títulos (<102,6TCID50/mL) por 4-8 dias. Interessantemente, os bezerros vacinados não apresentaram aumento nos títulos de anticorpos neutralizantes após a vacinação. Em vez disso, eles apresentaram uma redução gradual nos anticorpos neutralizantes séricos nas semanas seguintes - semelhante aos controles não vacinados. Após o desafio IN com uma cepa BoHV-1 virulenta heteróloga no dia 55 pós-imunização (107,63TCID50), os bezerros vacinados excretaram o vírus em títulos menores a partir do sexto dia pós-desafio (p < 0,07) e por um período de tempo menor do que o observado nos controles (p < 0,0024). É importante notar que tanto a duração quanto a intensidade dos sinais clínicos foram reduzidas nos animais vacinados. Além disso, os bezerros vacinados apresentaram um aumento abrupto nos títulos neutralizantes após o desafio, indicando uma imunização adequada por BoHV-1gEΔ. Em resumo, a imunização IN de bezerros com anticorpos passivos com a cepa BoHV-1gEΔ foi capaz de estimular a imunidade, proporcionando proteção virológica e clínica parciais após o desafio.
Assuntos
Animais , Bovinos , Vacinas Sintéticas , Doenças dos Bovinos/virologia , Imunização/veterinária , Vacinação/veterináriaResumo
ABSTRACT: Vaccination has been used to prevent the losses associated with Bovine alphaherpesvirus 1 (BoHV-1) infection but passively acquired antibodies may compromise vaccine efficacy. Intranasal immunization (IN) of calves with modified live viral BoHV-1 vaccines has proven to overcome the acquired passive antibodies and confer adequate protection. Herein, we evaluated the safety and immunogenicity of a glycoprotein E-deleted Brazilian BoHV-1 strain (BoHV-1gEΔ) for IN immunization of calves. Ten 1-to-2 months-old calves with virus-neutralizing titers (VN) ranging from 2-64 were immunized IN with viable BoHV-1gEΔ (107.1 TCID50) and four remained as unvaccinated controls (VN titers 8-32). After IN immunization, calves presented a transient (2-6 days) mild nasal secretion and shed the vaccine virus in nasal secretions in low titers (<102.6TCID50/mL) for 4-8 days. Interestingly, the vaccinated calves did not show an increase in VN titers after vaccination. Rather, they presented a gradual reduction in serum VN antibodies in the following weeks - similarly to unvaccinated controls. Upon IN challenge with a virulent heterologous BoHV-1 strain at day 55 post-immunization (107.63TCID50), vaccinated calves shed significantly less virus from day 6 post-challenge onwards (p < 0.07) and for a shorter period of time than the controls (p < 0.0024). Importantly, both the duration and intensity of clinical signs were reduced in vaccinated animals. In addition, vaccinated calves showed an abrupt raise in VN titers post-challenge, indicating adequate immunological priming by vaccination. In summary, immunization of calves harboring passive antibodies with BoHV-1gEΔ by the IN route was able to prime the immunity to afford partial virological and clinical protection upon challenge.
RESUMO: A vacinação tem sido usada para prevenir perdas associadas à infecção pelo alfaherpesvírus bovino 1 (BoHV-1), embora anticorpos adquiridos passivamente possam comprometer a eficácia das vacinas. A imunização intranasal (IN) de bezerros com vacinas de BoHV-1 vivas modificadas pode contornar o obstáculo relacionado à presença de anticorpos adquiridos passivamente, conferindo proteção aos animais vacinados. Nesse contexto, avaliou-se a segurança e imunogenicidade de uma cepa brasileira de BoHV-1 com deleção no gene da glicoproteína E (BoHV-1gEΔ) na imunização IN de bezerros. Dez bezerros, de um a dois meses de idade e com títulos neutralizantes (VN) variando de 2-64, foram inoculados IN com BoHV-1gEΔ (107,1TCID50), e quatro permaneceram como controles não vacinados (títulos de VN 8-32). Após a instilação IN, os bezerros apresentaram secreção nasal transitória leve (2-6 dias) e excretaram o vírus vacinal nas secreções nasais em baixos títulos (<102,6TCID50/mL) por 4-8 dias. Interessantemente, os bezerros vacinados não apresentaram aumento nos títulos de anticorpos neutralizantes após a vacinação. Em vez disso, eles apresentaram uma redução gradual nos anticorpos neutralizantes séricos nas semanas seguintes - semelhante aos controles não vacinados. Após o desafio IN com uma cepa BoHV-1 virulenta heteróloga no dia 55 pós-imunização (107,63TCID50), os bezerros vacinados excretaram o vírus em títulos menores a partir do sexto dia pós-desafio (p < 0,07) e por um período de tempo menor do que o observado nos controles (p < 0,0024). É importante notar que tanto a duração quanto a intensidade dos sinais clínicos foram reduzidas nos animais vacinados. Além disso, os bezerros vacinados apresentaram um aumento abrupto nos títulos neutralizantes após o desafio, indicando uma imunização adequada por BoHV-1gEΔ. Em resumo, a imunização IN de bezerros com anticorpos passivos com a cepa BoHV-1gEΔ foi capaz de estimular a imunidade, proporcionando proteção virológica e clínica parciais após o desafio.
Resumo
Background: The feline immunodeficiency virus (FIV) is responsible for a retroviral disease that affects domestic and wild cats worldwide, causing Feline Acquired Immunodeficiency Syndrome (FAIDS). FIV is a lentivirus from the family Retroviridae and its genome has 3 main structural genes: gag, pol and env. Phylogenetic studies have classified FIV into 7 subtypes according to the diversity among strains from the World, mainly in the env gene. Epidemiological analyses have demonstrated the high predominance of FIV-A and FIV-B. This in silico study aimed to perform a phylogenetic analysis to study FIV diversity worldwide. Materials, Methods & Results: A total of 60 whole genome sequences (WGS) and 122 FIV env gene sequences were included in 2 datasets, which were aligned using MAFFT version 7. Recombination among genomes and/or env genes was analyzed with RDP5 software. Phylogenetic analyses with both datasets were performed, after removing the recombinant sequences, by the W-IQ-TREE and constructed and edited by the FigTree. A total of 12 recombination events involving 19 WGS were detected. In addition, 27 recombination events involving 49 sequences were observed in the env gene. A high rate of recombinants was observed inter-subtypes (A/B and B/D) and intra-subtypes (A/A). All recombinants were removed from the subsequent phylogenetic analyses. Phylogenies demonstrated 6 distinct main clades, 5 from domestic cats (A, B, C, E, U) and 1 from wild cat sequences (W) in the WGS, as well as in the specific env gene analyses. Most clustered with subtype B sequences. In the WGS analysis, clade B had a prevalence of 65.9% Brazilian sequences (27/41) and 2.4% Japanese sequences (1/41). In the env gene analyses, clade B showed a prevalence of 43.8% of Brazilian sequences (32/73) and 20.5% of USA sequences (15/73). The results of both analyses also confirm the FIV-wide geographical distribution around the world. In the phylogenetic analyses carried out with WGS, sequences from China (1/41; 2.4%), Colombia (1/41; 2.4%) and the USA (1/41; 2.4%) were identified in clade A; sequence from Canada in clade C (1/41; 2.4%); sequence from Botswana belonged to clade E (1/41; 2.4%); sequences from Brazil clustered into clade U (2/41; 5% - data not yet published); and sequences belonging to the clade W were from Canada (1/41; 2.4%) and the USA (5/41; 12.3%). Specific env gene phylogenetic analyses showed sequences from Colombia (1/73; 1.4%), France (2/73; 2.7%), the Netherlands (3/73; 4.1%), Switzerland (2/73; 2.7%), USA (6/73; 8.3%), belonging to clade A; sequence from Canada belonging to clade C (1/73; 1.4%); sequences from Brazil belonging to clade U (2/73; 5% - data not yet published); and sequences belonging to clade W from the USA (6/73; 8.3%). Discussion: The results presented here demonstrate that FIV has a rapid viral evolution due to recombination and mutation events, more specifically in the env gene, which is highly variable. Currently, this retrovirus is classified into 7 subtypes (A, B, C, D, E, F and U-NZenv) according to their high genomic diversity. It also highlighted the importance of in silico sequence and phylogeny studies to demonstrate evolutionary processes. This was the first study to address the WGS FIV diversity with a phylogenetic approach.
Assuntos
Filogenia , Recombinação Genética , Retroviridae/genética , Vírus da Imunodeficiência Felina/genética , Simulação por ComputadorResumo
Background: Scorpion neurotoxins such as those that modify the mammalian voltagegated sodium ion channels (Nav) are the main responsible for scorpion envenomation. Their neutralization is crucial in the production of antivenoms against scorpion stings. Methods: In the present study, two in silico designed genes one that codes for a native neurotoxin from the venom of the Anatolian scorpion Androctonus crassicauda, named Acra 4 and another non-native toxin named consensus scorpion toxin (SccTx) obtained from the alignment of the primary structures of the most toxic neurotoxins from the Middle Eastern and North African scorpions were recombinantly expressed in E. coli Origami. Results: Following bacterial expression, the two expressed neurotoxins, hereafter named HisrAcra4 and HisrSccTx, were obtained from inclusion bodies. Both recombinant neurotoxins were obtained in multiple Cys-Cys isoforms. After refolding, the active protein fractions were identified with molecular masses of 8,947.6 and 9,989.1 Da for HisrAcra4 and HisrSccTx, respectively, which agreed with their expected theoretical masses. HisrAcra4 and HisrSccTx were used as antigens to immunize two groups of rabbits, to produce either anti-HisrAcra4 or anti-HisrSccTx serum antibodies, which in turn could recognize and neutralize neurotoxins from venoms of scorpion species from the Middle East and North Africa. The antibodies obtained from rabbits neutralized the 3LD50 of Androctonus australis, Leiurus quinquestriatus hebraeus and Buthus occitanus venoms, but they did not neutralize A. crassicauda and A. mauritanicus venoms. In addition, the anti-HisrAcra4 antibodies did not neutralize any of the five scorpion venoms tested. However, an antibody blend of anti-HisrAcra4 and anti-HisrSccTx was able to neutralize A. crassicauda and A. mauritanicus venoms. Conclusions: Two recombinant Nav neurotoxins, from different peptide families, were used as antigens to generate IgGs for neutralizing scorpion venoms of species from the Middle East and North Africa.(AU)
Assuntos
Animais , Venenos de Escorpião/enzimologia , Neurotoxinas/análise , Proteínas Recombinantes/análiseResumo
L-Asparaginase catalysing the breakdown of L-Asparagine to L-Aspartate and ammonia is an enzyme of therapeutic importance in the treatment of cancer, especially the lymphomas and leukaemia. The present study describes the recombinant production, properties and anticancer potential of enzyme from a hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi. There are two genes coding for asparaginase in the genome of this organism. A 918 bp gene encoding 305 amino acids was PCR amplified and cloned in BL21 (DE3) strain of E. coli using pET28a (+) plasmid. The production of recombinant enzyme was induced under 0.5mM IPTG, purified by selective heat denaturation and ion exchange chromatography. Purified enzyme was analyzed for kinetics, in silico structure and anticancer properties. The recombinant enzyme has shown a molecular weight of 33 kDa, specific activity of 1175 U/mg, KM value 2.05mM, optimum temperature and pH 80°C and 8 respectively. No detectable enzyme activity found when L-Glutamine was used as the substrate. In silico studies have shown that the enzyme exists as a homodimer having Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172, and Lys232 being the putative active site residues. The free energy change calculated by molecular docking studies of enzyme and substrate was found as ∆G 4.5 kJ/mole indicating the affinity of enzyme with the substrate. IC50 values of 5U/mL to 7.5U/mL were determined for FB, caco2 cells and HepG2 cells. A calculated amount of enzyme (5U/mL) exhibited 78% to 55% growth inhibition of caco2 and HepG2 cells. In conclusion, the recombinant enzyme produced and characterized in the present study offers a good candidate for the treatment of cancer. The procedures adopted in the present study can be prolonged for in vivo studies.
A L-asparaginase, que catalisa a degradação da L-asparagina em L-aspartato e amônia, é uma enzima de importância terapêutica no tratamento do câncer, especialmente dos linfomas e da leucemia. O presente estudo descreve a produção recombinante, propriedades e potencial anticancerígeno da enzima de Pyrococcus abyssi, um archaeon hipertermofílico. Existem dois genes que codificam para a asparaginase no genoma desse organismo. Um gene de 918 bp, que codifica 305 aminoácidos, foi amplificado por PCR e clonado na cepa BL21 (DE3) de E. coli usando o plasmídeo pET28a (+). A produção da enzima recombinante foi induzida sob 0,5mM de IPTG, purificada por desnaturação seletiva por calor e cromatografia de troca iônica. A enzima purificada foi analisada quanto à cinética, estrutura in silico e propriedades anticancerígenas. A enzima recombinante apresentou peso molecular de 33 kDa, atividade específica de 1.175 U / mg, valor de KM 2,05 mM, temperatura ótima de 80º C e pH 8. Nenhuma atividade enzimática detectável foi encontrada quando a L-glutamina foi usada como substrato. Estudos in silico mostraram que a enzima existe como um homodímero, com Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172 e Lys232 sendo os resíduos do local ativo putativo. A mudança de energia livre calculada por estudos de docking molecular da enzima e do substrato foi encontrada como ∆G 4,5 kJ / mol, indicando a afinidade da enzima com o substrato. Valores de IC50 de 5U / mL a 7,5U / mL foram determinados para células FB, células caco2 e células HepG2. Uma quantidade de enzima (5U / mL) apresentou inibição de crescimento de 78% a 55% das células caco2 e HepG2, respectivamente. Em conclusão, a enzima recombinante produzida e caracterizada no presente estudo é uma boa possibilidade para o tratamento do câncer. Os procedimentos adotados na presente pesquisa podem ser aplicados para estudos in vivo.
Assuntos
Humanos , Asparaginase/biossíntese , Asparaginase/farmacologia , Pyrococcus abyssi/enzimologia , Antineoplásicos/farmacologia , Especificidade por Substrato , Estabilidade Enzimática , Proteínas Recombinantes/biossíntese , Proteínas Recombinantes/farmacologia , Células CACO-2 , Escherichia coli/genética , Simulação de Acoplamento Molecular , Concentração de Íons de HidrogênioResumo
Abstract L-Asparaginase catalysing the breakdown of L-Asparagine to L-Aspartate and ammonia is an enzyme of therapeutic importance in the treatment of cancer, especially the lymphomas and leukaemia. The present study describes the recombinant production, properties and anticancer potential of enzyme from a hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi. There are two genes coding for asparaginase in the genome of this organism. A 918 bp gene encoding 305 amino acids was PCR amplified and cloned in BL21 (DE3) strain of E. coli using pET28a (+) plasmid. The production of recombinant enzyme was induced under 0.5mM IPTG, purified by selective heat denaturation and ion exchange chromatography. Purified enzyme was analyzed for kinetics, in silico structure and anticancer properties. The recombinant enzyme has shown a molecular weight of 33 kDa, specific activity of 1175 U/mg, KM value 2.05mM, optimum temperature and pH 80°C and 8 respectively. No detectable enzyme activity found when L-Glutamine was used as the substrate. In silico studies have shown that the enzyme exists as a homodimer having Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172, and Lys232 being the putative active site residues. The free energy change calculated by molecular docking studies of enzyme and substrate was found as G 4.5 kJ/mole indicating the affinity of enzyme with the substrate. IC50 values of 5U/mL to 7.5U/mL were determined for FB, caco2 cells and HepG2 cells. A calculated amount of enzyme (5U/mL) exhibited 78% to 55% growth inhibition of caco2 and HepG2 cells. In conclusion, the recombinant enzyme produced and characterized in the present study offers a good candidate for the treatment of cancer. The procedures adopted in the present study can be prolonged for in vivo studies.
Resumo A L-asparaginase, que catalisa a degradação da L-asparagina em L-aspartato e amônia, é uma enzima de importância terapêutica no tratamento do câncer, especialmente dos linfomas e da leucemia. O presente estudo descreve a produção recombinante, propriedades e potencial anticancerígeno da enzima de Pyrococcus abyssi, um archaeon hipertermofílico. Existem dois genes que codificam para a asparaginase no genoma desse organismo. Um gene de 918 bp, que codifica 305 aminoácidos, foi amplificado por PCR e clonado na cepa BL21 (DE3) de E. coli usando o plasmídeo pET28a (+). A produção da enzima recombinante foi induzida sob 0,5mM de IPTG, purificada por desnaturação seletiva por calor e cromatografia de troca iônica. A enzima purificada foi analisada quanto à cinética, estrutura in silico e propriedades anticancerígenas. A enzima recombinante apresentou peso molecular de 33 kDa, atividade específica de 1.175 U / mg, valor de KM 2,05 mM, temperatura ótima de 80º C e pH 8. Nenhuma atividade enzimática detectável foi encontrada quando a L-glutamina foi usada como substrato. Estudos in silico mostraram que a enzima existe como um homodímero, com Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172 e Lys232 sendo os resíduos do local ativo putativo. A mudança de energia livre calculada por estudos de docking molecular da enzima e do substrato foi encontrada como G 4,5 kJ / mol, indicando a afinidade da enzima com o substrato. Valores de IC50 de 5U / mL a 7,5U / mL foram determinados para células FB, células caco2 e células HepG2. Uma quantidade de enzima (5U / mL) apresentou inibição de crescimento de 78% a 55% das células caco2 e HepG2, respectivamente. Em conclusão, a enzima recombinante produzida e caracterizada no presente estudo é uma boa possibilidade para o tratamento do câncer. Os procedimentos adotados na presente pesquisa podem ser aplicados para estudos in vivo.
Resumo
A infecção por parvovírus de ganso (GPV) é uma doença infecciosa altamente patogênica em gansinhos e patinhos de Muscovy. Para detectar o antígeno GPV, desenvolvemos um novo ensaio imunoenzimático (ELISA) sanduíche usando um anticorpo de domínio único de cadeia pesada específico contra a proteína GPV NS1 como anticorpo de detecção. Os limites de detecção da proteína GST-NS1 e do título do vírus da cepa GPV H1 foram 5 ng/mL e 102,9 TCID50/mL, respectivamente. O ELISA sanduíche foi específico para GPV sem reatividade cruzada com outros vírus comuns de ganso, incluindo vírus Tembusu, circovírus de ganso, adenovírus de aves, vírus Newcastle ou vírus H9 da gripe aviária. Um total de 118 amostras de swab cloacal foram usadas para detectar o antígeno GPV usando o ELISA sanduíche e reação em cadeia da polimerase com uma taxa de coincidência de 91,5%. A sensibilidade e especificidade do ELISA sanduíche foram de 91,6% e 91,4%, respectivamente. Esses resultados sugerem que este ELISA sanduíche pode ser aplicado para detectar GPV.
Assuntos
Animais , Proteínas Recombinantes/análise , Parvovirus/isolamento & purificação , Gansos/virologia , Ensaio de Imunoadsorção Enzimática/veterinária , Reação em Cadeia da Polimerase/veterináriaResumo
The objective of this study was to investigate the effects of recombinant adiponectin on chicken liver cells. The full-length chicken adiponectin gene was amplified by PCR and cloned into the vector pET-32a, followed by the transformation of the vector into Escherichia coli BL21. SDS-PAGE was used to detect and analyze the purity of the expressed recombinant protein. Induction was performed with 1 mM IPTG at 30 °C for 3 h, and the recombinant thioredoxinadiponectin fusion protein was purified using Ni-NTA affinity chromatography. Chicken adiponectin was successfully expressed and purified in a bacterial system. In addition, the chicken recombinant adiponectin demonstrated that it ameliorates palmitic acid- and oleic acid-induced adipogenesis, in which an increase in ß-oxidation and a decrease in lipogenesis-related genes may be involved. In summary, chicken recombinant adiponectin enhances fatty acid metabolism in LMH cells.(AU)
Assuntos
Animais , Galinhas/metabolismo , Adiponectina/efeitos adversos , Ácidos Graxos/análise , Ácido Palmítico/efeitos adversos , Ácido Oleico/efeitos adversosResumo
Background: Juvenile panhypopituitarism is an endocrinopathy that affects young dogs and must be differentiated from other causes of height disorders, as one could have a deficiency of one or more adenohypophysis hormones, besides growth hormone. Diagnosis consists of excluding endocrine and non-endocrine causes. Treatment requires administration of heterologous porcine growth hormone or progestins, as well as supplementing other hormones that are deficient in the circulation. The prognosis for these patients tends to be unfavorable and they have a shorter life expectancy. The present case aimed to report the therapeutic challenges in a dog diagnosed with juvenile panhypopituitarism. Case: This study presents the case of a 6-month-old crossbred Labrador/Brazilian Fila dog, not neutered, 6.7 kg of body weight (body condition score 5/9), with a growth disorder and persistence of the puppy coat, when compared to other members of the same litter. During inspection, it was possible to observe an undersized dog and soft puppy coat, besides no bone irregularities or joint tenderness was noted. The other physical examination parameters were within the normal range for the species. No changes in complete blood count and only increases in urea, cholesterol and alkaline phosphatase activity were observed. Thyroid and abdominal ultrasound (US) examination did not reveal any remarkable changes. After serum dosage of insulin-like growth factor, thyroxine, thyrostimulating hormone, and cortisol, the patient was diagnosed with juvenile panhypopituitarism and underwent therapy with medroxyprogesterone and thyroid hormone supplementation. Monitoring was instituted at intervals of 3, 6, and 12 weeks, and currently every 3 or 4 months and the IGF-1 values normalized after 6 months with. After 8 months of therapy, the patient had good body growth and bone mineralization compared to the time of diagnosis. However, skeletal development was completed only 12 months after hormone replacement, accompanied by the presence of vertebral osteophytes and coxofemoral osteoarticular alterations. Considering chronic use of progestins, ovariosalpingohysterectomy (OSH) was recommended, but for personal reasons, the owners chose to do not submit her to surgery. After 18 months of treatment, the dog starts to exhibit prostration, selective appetite, and increased abdominal volume. After imaging exam, she was forwarded for OSH, due to consistent findings of pyometra. Subsequently, even the supervision of possible comorbidities involved in the chronic use of progestins was maintained at half-yearly intervals, the bitch returned to the service with skin thickening, increased limb volume, and macroglossia after 60 months of therapy. At this point IGF-1 values were higher when compared to the previous measurements and the application of medroxyprogesterone was suspended. Its supplementation was reintroduced only after 8 months when IGF-1 was significantly reduced. To date, the patient is close to 6 years of age and with a good quality of life. Discussion: The greatest therapeutic challenge for these patients involves dealing with the adverse effects of progestins, mainly related to reproductive disorders and alopecia at the application site, as well as maintaining adequate hormone replacement in order to avoid hypersomatotropism. Although longevity is lower in these individuals, the patient in this report has achieved 6 years of age and has had an excellent quality of life so far.
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Animais , Cães , Glândula Tireoide/diagnóstico por imagem , Hormônio do Crescimento/uso terapêutico , Nanismo Hipofisário/veterinária , Hipopituitarismo/veterinária , Medroxiprogesterona/administração & dosagem , Adeno-Hipófise/anormalidades , Doenças do Sistema Endócrino/veterináriaResumo
Elevadas taxas de descarte de vacas leiteiras relacionadas a baixos índices reprodutivos são observadas nos rebanhos comerciais. A utilização terapêutica de hormônios no intuito de induzir a lactação em animais hígidos é uma realidade. As doses hormonais utilizadas são elevadas e há a necessidade de experimentos que comprovem a possibilidade de redução. Nesse contexto, o objetivo desse projeto piloto foi reduzir as doses hormonais em vacas leiteiras submetidas a um protocolo de indução de lactação de 0,71mg/kg de peso vivo (PV) de benzoato de estradiol para 0,005mg/kg PV. Quatro vacas leiteiras receberam tratamento hormonal por 18 dias e iniciaram a lactação induzida após esse período. As vacas apresentaram produção de 32±4,3kg no pico lactacional induzido. A resposta lactacional das vacas foi considerada satisfatória e motivadora para experimentação de maior escala. Entretanto, são necessários estudos futuros que comprovem cientificamente o que foi encontrado nesse projeto piloto.
High culling rates of dairy cows related to low reproductive indices are found in commercial herds. The therapeutic use of hormones to induce lactation in healthy animals is a reality. The hormonal doses used are high and there is a need for experiments to prove the possibility of reduction. In this context, this study aimed to reduce the hormonal doses in dairy cows submitted to a lactation induction protocol from 0.71mg/kg of body weight (BW) of estradiol benzoate to 0.005mg/kg BW. Four dairy cows received hormone treatment for 18 days and started the induced lactation after this period. The cows had a production of 32±4.3kg at the induced lactational peak. The lactational response of the cows was considered satisfactory and motivating for larger scale experimentation. However, further studies are needed to scientifically prove what was observed in this pilot project.
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Animais , Feminino , Bovinos , Progesterona/administração & dosagem , Lactação/efeitos dos fármacos , Hormônio do Crescimento/administração & dosagem , Estradiol/administração & dosagemResumo
L-Asparaginase catalysing the breakdown of L-Asparagine to L-Aspartate and ammonia is an enzyme of therapeutic importance in the treatment of cancer, especially the lymphomas and leukaemia. The present study describes the recombinant production, properties and anticancer potential of enzyme from a hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi. There are two genes coding for asparaginase in the genome of this organism. A 918 bp gene encoding 305 amino acids was PCR amplified and cloned in BL21 (DE3) strain of E. coli using pET28a (+) plasmid. The production of recombinant enzyme was induced under 0.5mM IPTG, purified by selective heat denaturation and ion exchange chromatography. Purified enzyme was analyzed for kinetics, in silico structure and anticancer properties. The recombinant enzyme has shown a molecular weight of 33 kDa, specific activity of 1175 U/mg, KM value 2.05mM, optimum temperature and pH 80°C and 8 respectively. No detectable enzyme activity found when L-Glutamine was used as the substrate. In silico studies have shown that the enzyme exists as a homodimer having Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172, and Lys232 being the putative active site residues. The free energy change calculated by molecular docking studies of enzyme and substrate was found as ∆G 4.5 kJ/mole indicating the affinity of enzyme with the substrate. IC50 values of 5U/mL to 7.5U/mL were determined for FB, caco2 cells and HepG2 cells. A calculated amount of enzyme (5U/mL) exhibited 78% to 55% growth inhibition of caco2 and HepG2 cells. In conclusion, the recombinant enzyme produced and characterized in the present study offers a good candidate for the treatment of cancer. The procedures adopted in the present study can be prolonged for in vivo studies.
A L-asparaginase, que catalisa a degradação da L-asparagina em L-aspartato e amônia, é uma enzima de importância terapêutica no tratamento do câncer, especialmente dos linfomas e da leucemia. O presente estudo descreve a produção recombinante, propriedades e potencial anticancerígeno da enzima de Pyrococcus abyssi, um archaeon hipertermofílico. Existem dois genes que codificam para a asparaginase no genoma desse organismo. Um gene de 918 bp, que codifica 305 aminoácidos, foi amplificado por PCR e clonado na cepa BL21 (DE3) de E. coli usando o plasmídeo pET28a (+). A produção da enzima recombinante foi induzida sob 0,5mM de IPTG, purificada por desnaturação seletiva por calor e cromatografia de troca iônica. A enzima purificada foi analisada quanto à cinética, estrutura in silico e propriedades anticancerígenas. A enzima recombinante apresentou peso molecular de 33 kDa, atividade específica de 1.175 U / mg, valor de KM 2,05 mM, temperatura ótima de 80º C e pH 8. Nenhuma atividade enzimática detectável foi encontrada quando a L-glutamina foi usada como substrato. Estudos in silico mostraram que a enzima existe como um homodímero, com Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172 e Lys232 sendo os resíduos do local ativo putativo. A mudança de energia livre calculada por estudos de docking molecular da enzima e do substrato foi encontrada como ∆G 4,5 kJ / mol, indicando a afinidade da enzima com o substrato. Valores de IC50 de 5U / mL a 7,5U / mL foram determinados para células FB, células caco2 e células HepG2. Uma quantidade de enzima (5U / mL) apresentou inibição de crescimento de 78% a 55% das células caco2 e HepG2, respectivamente. Em conclusão, a enzima recombinante produzida e caracterizada no presente estudo é uma boa possibilidade para o tratamento do câncer. Os procedimentos adotados na presente pesquisa podem ser aplicados para estudos in vivo.
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Anticarcinógenos/análise , Asparaginase/genética , Leucemia/tratamento farmacológico , Linfoma/tratamento farmacológico , Pyrococcus abyssi/enzimologiaResumo
L-Asparaginase catalysing the breakdown of L-Asparagine to L-Aspartate and ammonia is an enzyme of therapeutic importance in the treatment of cancer, especially the lymphomas and leukaemia. The present study describes the recombinant production, properties and anticancer potential of enzyme from a hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi. There are two genes coding for asparaginase in the genome of this organism. A 918 bp gene encoding 305 amino acids was PCR amplified and cloned in BL21 (DE3) strain of E. coli using pET28a (+) plasmid. The production of recombinant enzyme was induced under 0.5mM IPTG, purified by selective heat denaturation and ion exchange chromatography. Purified enzyme was analyzed for kinetics, in silico structure and anticancer properties. The recombinant enzyme has shown a molecular weight of 33 kDa, specific activity of 1175 U/mg, KM value 2.05mM, optimum temperature and pH 80°C and 8 respectively. No detectable enzyme activity found when L-Glutamine was used as the substrate. In silico studies have shown that the enzyme exists as a homodimer having Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172, and Lys232 being the putative active site residues. The free energy change calculated by molecular docking studies of enzyme and substrate was found as ∆G 4.5 kJ/mole indicating the affinity of enzyme with the substrate. IC50 values of 5U/mL to 7.5U/mL were determined for FB, caco2 cells and HepG2 cells. A calculated amount of enzyme (5U/mL) exhibited 78% to 55% growth inhibition of caco2 and HepG2 cells. In conclusion, the recombinant enzyme produced and characterized in the present study offers a good candidate for the treatment of cancer. The procedures adopted in the present study can be prolonged for in vivo studies.(AU)
A L-asparaginase, que catalisa a degradação da L-asparagina em L-aspartato e amônia, é uma enzima de importância terapêutica no tratamento do câncer, especialmente dos linfomas e da leucemia. O presente estudo descreve a produção recombinante, propriedades e potencial anticancerígeno da enzima de Pyrococcus abyssi, um archaeon hipertermofílico. Existem dois genes que codificam para a asparaginase no genoma desse organismo. Um gene de 918 bp, que codifica 305 aminoácidos, foi amplificado por PCR e clonado na cepa BL21 (DE3) de E. coli usando o plasmídeo pET28a (+). A produção da enzima recombinante foi induzida sob 0,5mM de IPTG, purificada por desnaturação seletiva por calor e cromatografia de troca iônica. A enzima purificada foi analisada quanto à cinética, estrutura in silico e propriedades anticancerígenas. A enzima recombinante apresentou peso molecular de 33 kDa, atividade específica de 1.175 U / mg, valor de KM 2,05 mM, temperatura ótima de 80º C e pH 8. Nenhuma atividade enzimática detectável foi encontrada quando a L-glutamina foi usada como substrato. Estudos in silico mostraram que a enzima existe como um homodímero, com Arg11, Ala87, Thr110, His112, Gln142, Leu172 e Lys232 sendo os resíduos do local ativo putativo. A mudança de energia livre calculada por estudos de docking molecular da enzima e do substrato foi encontrada como ∆G 4,5 kJ / mol, indicando a afinidade da enzima com o substrato. Valores de IC50 de 5U / mL a 7,5U / mL foram determinados para células FB, células caco2 e células HepG2. Uma quantidade de enzima (5U / mL) apresentou inibição de crescimento de 78% a 55% das células caco2 e HepG2, respectivamente. Em conclusão, a enzima recombinante produzida e caracterizada no presente estudo é uma boa possibilidade para o tratamento do câncer. Os procedimentos adotados na presente pesquisa podem ser aplicados para estudos in vivo.(AU)
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Linfoma/tratamento farmacológico , Leucemia/tratamento farmacológico , Pyrococcus abyssi/enzimologia , Anticarcinógenos/análise , Asparaginase/genéticaResumo
Abstract Alpha amylase, catalyzing the hydrolysis of starch is a ubiquitous enzyme with tremendous industrial applications. A 1698 bp gene coding for 565 amino acid amylase was PCR amplified from Geobacillus thermodenitrificans DSM-465, cloned in pET21a (+) plasmid, expressed in BL21 (DE3) strain of E. coli and characterized. The recombinant enzyme exhibited molecular weight of 63 kDa, optimum pH 8, optimum temperature 70°C, and KM value of 157.7µM. On pilot scale, the purified enzyme efficiently removed up to 95% starch from the cotton fabric indicating its desizing ability at high temperature. 3D model of enzyme built by Raptor-X and validated by Ramachandran plot appeared as a monomer having 31% -helices, 15% -sheets, and 52% loops. Docking studies have shown the best binding affinity of enzyme with amylopectin (G -10.59). According to our results, Asp 232, Glu274, Arg448, Glu385, Asp34, Asn276, and Arg175 constitute the potential active site of enzyme.
Resumo A alfa-amilase, que catalisa a hidrólise do amido, é uma enzima ubíqua com imensas aplicações industriais. Um gene de 1698 pb que codifica a amilase de 565 aminoácidos foi amplificado por PCR, a partir de Geobacillus thermodenitrificans DSM-465, clonado no plasmídeo pET21a (+), expresso na cepa BL21 (DE3) de E. coli e caracterizado. A enzima recombinante exibiu peso molecular de 63 kDa, pH ótimo igual a 8, temperatura ótima de 70° C e valor KM de 157,7 µM. Em escala piloto, a enzima purificada removeu com eficiência até 95% de amido do tecido de algodão, indicando sua capacidade de desengomagem em alta temperatura. O modelo 3D da enzima construída por Raptor-X e validada por Ramachandran plot apareceu como um monômero com 31% de hélices alfa, 15% de folhas beta e 52% de loops. Os estudos de docking mostraram melhor afinidade de ligação da enzima com amilopectina (G: - 10,59). De acordo com nossos resultados, Asp 232, Glu274, Arg448, Glu385, Asp34, Asn276 e Arg175 constituem o sítio ativo potencial da enzima.
Resumo
The effectiveness of vectored recombinant vaccines to control infectious laryngotracheitis (ILT) in chickens from a region (State of Minas Gerais, Brazil) with ~10 million layers was evaluated under field conditions from 2014-2018. During this period, only recombinant turkey herpesvirus (rHVT) or fowl poxvirus (rFPV) vaccines that express antigens of infectious laryngotracheitis virus (Gallid herpesvirus-1; GaHV-1) were used. Layer chickens (n=1,283), from eight different egg-producing companies, were individually sampled and examined (active surveillance), and in instances when government poultry health veterinarians were notified due to respiratory disease (passive surveillance). Clinical, macroscopic, and histopathology examinations were performed to diagnose ILT as well as molecular techniques for the detection and characterization of the GaHV-1 DNA from the trachea and trigeminal ganglia (TG). The layer hens sampled and examined belonged to flocks and farms that used different vaccination protocols (non-vaccinated, single dose vaccination, and prime/ boost vaccination). This is the first long-term field study of the effectiveness of ILT vectored vaccines in a high-density multiple age layer hen region. Using various diagnostic methods, the occurrence of GaHV-1 infection and ILT clinical disease in layer hens vaccinated with vectored recombinant vaccines in one quarantined region of Brazil were investigated. The number of ILTV positive chickens by PCR and ILT clinical disease cases was lower in farms when all chickens were vaccinated with at least one vaccine. However, the difference in the detection rates of GaHV-1 infection was significant only when compared farms with prime/ boost and farms using single dose of HTV-LT.
A efetividade das vacinas recombinantes vetorizadas para o controle da laringotraqueíte infecciosa (LTI) nas aves de uma região (Minas Gerais, Brasil) com aproximadamente 10 milhões de poedeiras foi avaliada em condições de campo, no período de 2014 a 2018. Durante este período, somente as vacinas recombinantes "turkey herpesvirus" (rHVT) ou "fowl poxvirus" (rFPV), que expressam antígenos do vírus da laringotraqueíte (Gallid herpesvirus-1; GaHV-1) foram utilizadas. Galinhas poedeiras (n=1.283), de oito diferentes granjas produtoras de ovos, foram individualmente amostradas e examinadas por monitoramento ativo e, na ocorrência de notificação de doença respiratória aos veterinários do serviço oficial, por monitoramento passivo. Exames clínicos, macroscópicos e histopatológicos foram realizados para o diagnóstico de LTI, bem como técnicas moleculares para a detecção e caracterização do DNA de GaHV-1 da traqueia e gânglio trigêmeo. As galinhas poedeiras pertenciam a lotes e granjas que usavam diferentes protocolos de vacinação (não vacinadas, uma dose ou tipo de vacina e duas doses ou tipos de vacina). Este é o primeiro longo estudo a campo sobre a efetividade das vacinas vetorizadas em uma região com população elevada de poedeiras de múltiplas idades. Utilizando vários métodos de diagnóstico, a ocorrência da infecção por GaHV-1 e a LTI clínica em poedeiras de uma região interditada do Brasil foi investigada. O número de galinhas positivas para o vírus GaHV-1 e para casos clínicos de LTI nas granjas foi menor quando todas as aves estavam vacinadas com, pelo menos, um tipo ou dose de vacina. Entretanto, a diferença na taxa de detecção da infecção por GaHV-1 foi significativa somente quando a comparação foi realizada entre granjas com aves vacinadas com duas doses e aves de granjas vacinadas com uma única dose de HVT-LT.
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Animais , Vacinas Virais/análise , Galinhas/virologia , Análise de Sequência/veterinária , Herpesvirus Galináceo 1/isolamento & purificação , Reação em Cadeia da Polimerase/veterináriaResumo
ErpY-like protein (LIC11966) is an antigen from Leptospira spp., which is possibly involved in the infection process and, consequently, can be a promising solution for the development of new diagnostic tests and vaccines. Here, the presence of the erpY-like gene was evaluated in several Leptospira serovars by polymerase chain reaction (PCR), and the ErpY-like recombinant protein was produced and characterized in terms of antigenicity and immunogenicity in vivo. The erpY-like gene was detected by PCR in all Leptospira pathogenic serovars tested (n = 8) and was absent in the saprophytic ones. The rErpY-like protein was recognized by antibodies present in the sera of humans and animals (swine and canine) naturally infected, suggesting ErpY-like expression during natural infection. The rErpY-like protein used to immunize mice with Freund's adjuvant stimulated a mixed Th1/Th2 response, an important protective immunity against leptospirosis.(AU)
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Leptospira/imunologia , Antígenos de Bactérias/genética , Análise de Sequência de Proteína/métodosResumo
The aim of this study was to produce high yield of a local bacterial alkaline protease in the yeast system because the scientific involvement of microorganisms in enzyme production is still not given enough attention in Saudi Arabia. Soil samples were collected from the rhizosphere of some desert plants in Saudi Arabia. Ninety-three alkaline protease producing bacterial isolates were recovered on skimmed-milk agar at pH 9.4 and 45°C for 48 hr. Isolate D9 obtained from the rhizosphere of Heliotropium digynum at Dhahran City was the most potent isolate in respect to enzyme productivity (184.6 U/ml). The full gene of alkaline protease was amplified and showed the expected size (1300 bp). Restriction enzymes analysis also verified the integrity of the PCR product. The sequence of the protease gene revealed an open reading frame of 1329 nt correspond to the full length of the protease gene of isolate D9 encoding a 443 aa protein. After ligation of the amplified gene by the TA cloning method, digestion with appropriate restriction enzymes confirmed the integrity of the cloned gene. The insert was prepared by two PCRs that were conducted with a pair of primers specifically designed for this purpose. The digested and purified cloning vector pRS426/GAL1p-207-Glu-MS was ligated with the insert then transformed into various strains of Saccharomyces cerevisiae via the electroporation method. Maximum protease expression was done by recombinant OS303 in galactose containing media (145.5 U/ml) with an approximately 2-fold increase when compared with the wild OS303 strain., this may be due to ability to activate gal operon.
O objetivo deste estudo foi produzir alto rendimento de uma protease alcalina bacteriana local no sistema de leveduras, já que o envolvimento científico de microrganismos na produção de enzimas ainda não recebe atenção suficiente na Arábia Saudita. Amostras de solo foram coletadas da rizosfera de algumas plantas do deserto na Arábia Saudita. Noventa e três isolados bacterianos produtores de protease alcalina foram recuperados em ágar de leite desnatado a pH 9,4 e 45°C por 48 horas. O isolado D9 obtido da rizosfera de Heliotropium digynum na cidade de Dhahran foi o mais potente em relação à produtividade da enzima (184,6 U/ml). O gene completo da protease alcalina foi amplificado e apresentou o tamanho esperado (1300 pb). A análise de enzimas de restrição também verificou a integridade do produto de PCR. A sequência do gene da protease revelou uma fase de leitura aberta de 1329 nt, correspondendo ao comprimento total do gene da protease do isolado D9 que codifica uma proteína 443 aa. Após a ligação do gene amplificado pelo método de clonagem TA, a digestão com enzimas de restrição apropriadas confirmou a integridade do gene clonado. A inserção foi preparada por dois PCRs que foram conduzidos com um par de primers projetados especificamente para esta finalidade. O vetor de clonagem digerido e purificado pRS426/GAL1p-207-Glu-MS foi ligado com a inserção e então transformado em várias cepas de Saccharomyces cerevisiae por meio do método de eletroporação. A expressão máxima da protease foi feita por OS303 recombinante em meio contendo galactose (145,5 U/ml) com um aumento de aproximadamente duas vezes quando comparado com a cepa OS303 selvagem, e isso pode ser por causa da capacidade de ativar o operon gal.
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Animais , Peptídeo Hidrolases , Saccharomyces cerevisiae , Leveduras , Ativadores de Enzimas , Enzimas/biossíntese , RizosferaResumo
Alpha amylase, catalyzing the hydrolysis of starch is a ubiquitous enzyme with tremendous industrial applications. A 1698 bp gene coding for 565 amino acid amylase was PCR amplified from Geobacillus thermodenitrificans DSM-465, cloned in pET21a (+) plasmid, expressed in BL21 (DE3) strain of E. coli and characterized. The recombinant enzyme exhibited molecular weight of 63 kDa, optimum pH 8, optimum temperature 70°C, and KM value of 157.7µM. On pilot scale, the purified enzyme efficiently removed up to 95% starch from the cotton fabric indicating its desizing ability at high temperature. 3D model of enzyme built by Raptor-X and validated by Ramachandran plot appeared as a monomer having 31% α-helices, 15% β-sheets, and 52% loops. Docking studies have shown the best binding affinity of enzyme with amylopectin (∆G -10.59). According to our results, Asp 232, Glu274, Arg448, Glu385, Asp34, Asn276, and Arg175 constitute the potential active site of enzyme.
A alfa-amilase, que catalisa a hidrólise do amido, é uma enzima ubíqua com imensas aplicações industriais. Um gene de 1698 pb que codifica a amilase de 565 aminoácidos foi amplificado por PCR, a partir de Geobacillus thermodenitrificans DSM-465, clonado no plasmídeo pET21a (+), expresso na cepa BL21 (DE3) de E. coli e caracterizado. A enzima recombinante exibiu peso molecular de 63 kDa, pH ótimo igual a 8, temperatura ótima de 70° C e valor KM de 157,7 µM. Em escala piloto, a enzima purificada removeu com eficiência até 95% de amido do tecido de algodão, indicando sua capacidade de desengomagem em alta temperatura. O modelo 3D da enzima construída por Raptor-X e validada por Ramachandran plot apareceu como um monômero com 31% de hélices alfa, 15% de folhas beta e 52% de loops. Os estudos de docking mostraram melhor afinidade de ligação da enzima com amilopectina (∆G: - 10,59). De acordo com nossos resultados, Asp 232, Glu274, Arg448, Glu385, Asp34, Asn276 e Arg175 constituem o sítio ativo potencial da enzima.