Perfil proteico do plasma seminal ovino e sua relação com a criopreservação nos diluentes TRIS e Água de Coco em Pó / Protein profile of ram seminal plasm and its relation relationship with cryopreservation in TRIS and Powdered Coconut Water extender

O objetivo deste trabalho foi avaliar a relação entre a concentração de proteínas no plasma seminal ovino com parâmetros de qualidade do sêmen criopreservado em diluentes TRIS e em Água de Coco em Pó (ACP102c). Um total de 12 colheitas/animal em ovinos Santa Inês (n=2) e Dorper (n=2) foram realizadas, para obtenção do plasma seminal e para criopreservação nos diluentes testados. Foi utilizado o método de Bradford para determinação da concentração de proteína. Para avaliação do sêmen fresco e criopreservado foram utilizados os testes de viabilidade por eosina-nigrosina e teste hiposmótico (HOST), além dos parâmetros de motilidade em sistema de análise de sêmen auxiliada por computador (CASA). Baseado no valor médio da concentração de proteína, os ejaculados foram agrupados em alta (AP) e baixa (BP) concentração proteica. Correlações significativamente positivas foram encontradas entre a concentração de proteína com os parâmetros motilidade progressiva (PROG) e congelabilidade (CONGEL) e negativa para deslocamento lateral de cabeça (ALH) nas amostras criopreservadas em ambos diluentes, além de correlação positiva para motilidade total (MOT) em TRIS. Sêmen de ejaculados do grupo AP criopreservados em TRIS apresentaram MOT, PROG e CONGEL significativamente superiores ao grupo BP e inferiores para ALH. Quando criopreservado em ACP102c, sêmen do grupo AP foi superior ao BP para PROG e CONGEL. Variações na qualidade do sêmen criopreservado entre ejaculados podem estar associados à concentração de proteínas do plasma seminal, e estas podem atuar na manutenção da progressividade de espermatozoides ovinos criopreservados em diluentes TRIS e ACP102c.(AU)

The objective of this study was to evaluate the relation between the protein concentration in ram seminal plasma and quality parameters of the semen cryopreserved in TRIS and Powdered Coconut Water (ACP102c) extenders. A total of 12 semen collections/animal of Santa Ines (n=2) and Dorper (n=2) rams were performed to obtain seminal plasma and semen cryopreservation in work extenders. The protein content was determined using the Bradford's method. The eosin-nigrosine and hyposmotic (HOST) viable tests and motility parameters obtained by computer assisted semen analysis were evaluated for fresh and cryopreserved semen. The ejaculates were grouped in high (AP) and low (BP) protein content, based on the mean value of protein concentration. Significantly positive correlations were found between the protein content and progressive motility (PROG), freezability (CONGEL) and negative for lateral head displacement (ALH) in the semen cryopreserved in both extenders. Therefore, positive correlation was found for total motility (MOT) in TRIS. Semen samples from AP group cryopreserved in TRIS extender were significantly better than BP group for MOT, PROG and CONGEL, and inferior for ALH. When cryopreserved in ACP102c, the AP group were better than BP group for PROG and CONGEL. Variations in the quality of cryopreserved semen from different ejaculates may be associated with the concentration of seminal plasma proteins and may act to maintain the progressiveness of ram sperm cryopreserved in TRIS and ACP102c extenders.(AU)

Perfil proteico do plasma seminal ovino e sua relação com a criopreservação nos diluentes TRIS e Água de Coco em Pó / Protein profile of ram seminal plasm and its relation relationship with cryopreservation in TRIS and Powdered Coconut Water extender

O objetivo deste trabalho foi avaliar a relação entre a concentração de proteínas no plasma seminal ovino com parâmetros de qualidade do sêmen criopreservado em diluentes TRIS e em Água de Coco em Pó (ACP102c). Um total de 12 colheitas/animal em ovinos Santa Inês (n=2) e Dorper (n=2) foram realizadas, para obtenção do plasma seminal e para criopreservação nos diluentes testados. Foi utilizado o método de Bradford para determinação da concentração de proteína. Para avaliação do sêmen fresco e criopreservado foram utilizados os testes de viabilidade por eosina-nigrosina e teste hiposmótico (HOST), além dos parâmetros de motilidade em sistema de análise de sêmen auxiliada por computador (CASA). Baseado no valor médio da concentração de proteína, os ejaculados foram agrupados em alta (AP) e baixa (BP) concentração proteica. Correlações significativamente positivas foram encontradas entre a concentração de proteína com os parâmetros motilidade progressiva (PROG) e congelabilidade (CONGEL) e negativa para deslocamento lateral de cabeça (ALH) nas amostras criopreservadas em ambos diluentes, além de correlação positiva para motilidade total (MOT) em TRIS. Sêmen de ejaculados do grupo AP criopreservados em TRIS apresentaram MOT, PROG e CONGEL significativamente superiores ao grupo BP e inferiores para ALH. Quando criopreservado em ACP102c, sêmen do grupo AP foi superior ao BP para PROG e CONGEL. Variações na qualidade do sêmen criopreservado entre ejaculados podem estar associados à concentração de proteínas do plasma seminal, e estas podem atuar na manutenção da progressividade de espermatozoides ovinos criopreservados em diluentes TRIS e ACP102c.

The objective of this study was to evaluate the relation between the protein concentration in ram seminal plasma and quality parameters of the semen cryopreserved in TRIS and Powdered Coconut Water (ACP102c) extenders. A total of 12 semen collections/animal of Santa Ines (n=2) and Dorper (n=2) rams were performed to obtain seminal plasma and semen cryopreservation in work extenders. The protein content was determined using the Bradford's method. The eosin-nigrosine and hyposmotic (HOST) viable tests and motility parameters obtained by computer assisted semen analysis were evaluated for fresh and cryopreserved semen. The ejaculates were grouped in high (AP) and low (BP) protein content, based on the mean value of protein concentration. Significantly positive correlations were found between the protein content and progressive motility (PROG), freezability (CONGEL) and negative for lateral head displacement (ALH) in the semen cryopreserved in both extenders. Therefore, positive correlation was found for total motility (MOT) in TRIS. Semen samples from AP group cryopreserved in TRIS extender were significantly better than BP group for MOT, PROG and CONGEL, and inferior for ALH. When cryopreserved in ACP102c, the AP group were better than BP group for PROG and CONGEL. Variations in the quality of cryopreserved semen from different ejaculates may be associated with the concentration of seminal plasma proteins and may act to maintain the progressiveness of ram sperm cryopreserved in TRIS and ACP102c extenders.

Capacidade antioxidante da quercetina na qualidade seminal de bovinos

Avanços na área da reprodução animal estão ocorrendo frequentemente. Sendo assim, os profissionais desta área otimizam as biotecnologias reprodutivas utilizando sêmen geralmente congelado, principalmente da espécie bovina. Entretanto, sabe-se que a criopreservação é um procedimento que pode ser prejudicial para as células espermáticas, tendo como uma das causas o estresse oxidativo. Sendo assim, muitos autores têm se dedicado a estudar o efeito da adição de antioxidantes nos diluidores seminais das diversas espécies, tendo como objetivo inibir e/ou reduzir os danos causados pelas espécies reativas de oxigênio. A quercetina é um dos antioxidantes que demonstrou redução dos danos espermáticos e aumento significativo da motilidade e da capacidade de interação entre espermatozoide-oócito. Portanto, o objetivo desse trabalho foi utilizar a quercetina como antioxidante no sêmen bovino, buscando melhorias na qualidade espermática em sêmen congelado. Para isso, foram realizados cinco grupos: controle, 5g, 10g, 15g e 20g/mL de quercetina em amostras seminais. Após isso, foram realizados vários testes de avaliação pós descongelação, tais como avaliação espermática pelo método CASA, formação de radicais superóxidos pelo teste nitroblue-tetrazólio e análise de microscopia eletrônica de varredura.

Advances in animal breeding are occurring frequently. And then, professionals in this area optimize reproductive biotechnology using generally frozen semen, mainly in the bovine specie. However, it is known that cryopreservation is a procedure that can be harmful to sperm cells, with one of the causes of oxidative stress. Thus, many authors have studied the effect of the addition of antioxidants on the seminal diluents of several species, aiming to inhibit and / or reduce the damage caused by reactive oxygen species. Quercetin is one of the antioxidants that demonstrates reduction of sperm damage and significant increase of motility and interaction capacity between spermatozoa-oocyte. Therefore, the objective of this experiment was to use quercetin as an antioxidant in bovine semen, seeking improvements in sperm quality in frozen semen. For this, 5 groups were performed: control, 5, 10g, 15g and 20g/mL of quercetin in different seminal samples. After that, several post-thaw evaluation tests were performed, such as spermatic evaluation by the CASA method, formation of superoxide radicals by the nitroblue-tetrazolium test and analysis of scanning electron microscopy.

Arginina na dieta de reprodutores de Rhamdia quelen

Informações sobre a nutrição de reprodutores são fundamentais para que haja uma boa performance reprodutiva, e maior qualidade na produção de gametas e prole, entretanto esse tipo de estudo ainda não é realiado em grande quantidade. Com base nisso este trabalho teve como objetivo investigar o efeito da arginina na nutrição de reprodutores de Rhamdia quelen. Para isso 800 juvenis da espécie foram alimentados durante cinco meses com dietas que continham diferentes níveis de arginina (1,37; 1,67; 1,97; 2,27 e 2,57%). Após este período reprodutores de cada tratamento foram selecionados e induzidos hormonalmente (2.5 mg.kg-1 Extrato Hipofisário de Carpa para machos e 5.5 mg.kg-1 para fêmea), após 240 horas-grau foi realizada a coleta de sêmen e ovócitos. No sêmen foi avaliado: volume, pH, concentração, motilidade e velocidade espermática, normalidade, e foi aferido o diâmetro do ovócitos. As gônadas, fígado e gordura visceral de ambos os sexos foram removidas e pesadas para cálculo dos índices somáticos, e foi realizada a fertilização, incubação e após a abertura da boca as larvas foram transferidas para caixas de plástico onde foi realizada a larvicultura durante 10 dias. Foi realizada quantificação de: vitelogenina no plasma sanguíneo de fêmeas e de óxido nítrico nas gônadas de machos e fêmeas. Verificamos que a suplementação com 2,27% de arginina influenciou a produção seminal, tanto em volume quanto em concentração, ao mesmo tempo que promoveu a produção de ovócitos com maior diâmetro, que consequentemente gerou larvas mais resistentes. Além disso houve maior produção de óxido nítrico nas gônadas. Concluímos com estes resultados, apesar de iniciais, que a arginina tem um importante papel nos gametas e que mais estudos devem ser executados para uma melhor compreensão da função e ação na fisiologia reprodutiva.

Information about broodstock nutrition are essential for a good reproductive performance, and higher quality in gamete and offspring production, however this type of study is still not performed in large quantity. With the objective of assessing the effect of arginine on the reproduction of Rhamdia quelen females, 800 fish were fed for five months with diets containing 1.37, 1.67, 1.97, 2.27 and 2.57% arginine for seven months. After this period the fish of each treatment were selected and received hormonal induction (2.5 mg.kg-1 carp pituitary extract for males and 5.5 mg.kg-1 for females), after 240 termal units accumulated the semen and oocytes were collected. The semen were collected and analysed: volum, pH, concentration, velocity, motility and normality, and the diameter of oocytes. The gonad, liver, visceral fat of both sexes were collected to somatic analysis. The fertilization, incubation and after the larvae open the mouth were transfered to plastic box were the larviculture was carried for 10 days. Were analysed the production of vitellogenin in bood plasm of female and nitric oxide on gonad of males and females. We observed that the addition of 2.27% arginine influenced the seminal production, both in volum and concentration, at the same time that it promoted the oocyte production ith bigger diameter, that consequently generated more resistant larvae. The addition of 2.27% arginine to the diet of R. quelen females favored reproductive parameters, which suggests that arginine increases the nitric oxide production, and consequently raises reproductive efficiency. In addition also promoted the higher nitri oide production. We concluded that these results, although initials, that the arginine present an important role in the gametes and that more studies should be performed for a better understanding of the function and action in the reproductive physiology

O estudo proteômico e o seu potencial de avaliação da fertilidade em machos de diferentes espécies domésticas / The proteomic approach and its potential for fertility assessment in males of different domestic species

A abordagem proteômica permite identificar componentes proteicos, celulares e secreções. Desta forma, constitui uma ferramenta viável para o estudo das potenciais funções de proteínas e para a busca por marcadores proteicos de fenótipos específicos e/ou processos fisiológicos. Este trabalho teve por objetivo fazer uma revisão sobre esse tema e sua importância na biotecnologia do sêmen de machos domésticos. A composição da membrana espermática e do plasma seminal é de grande interesse, em virtude da sua influência nos eventos de fusão oócito-espermatozoide, fertilização e subsequente desenvolvimento embrionário. Diversos trabalhos vêm demonstrando o potencial da proteômica ligada à reprodução animal, a qual auxilia na identificação de marcadores de fertilidade ou de ejaculados aptos à congelação.(AU)

The proteomic approach allows the identification of proteins from tissues, cells and secretion. Thus, this tool is useful for the study of potential protein functions and search for markers of specific phenotypes and/or physiological events. This study aimed to review on the subject and its importance in semen biotechnology of several species. The composition of the sperm membrane and seminal plasma is of great interest because of its influence on sperm-oocyte fusion, fertilization and subsequent embryonic development. Several studies have demonstrated the potential of proteomics related to animal breeding, assisting in identifying markers for fertility or able to ejaculate process of freezing / thawing in males of several species.(AU)

Estresse oxidativo seminal em cães: Estudo da susceptibilidade dos espermatozoides e possíveis terapias durante a criopreservação

Resumo: O desequilíbrio entre a capacidade antioxidante e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), também conhecido como estresse oxidativo (EO), pode ser extremamente prejudicial aos espermatozoides. Essa célula é altamente susceptível ao EO devido ao seu citoplasma reduzido e consequente limitação na reserva antioxidante citoplasmática. Além disso, os espermatozoides exibem em sua membrana uma grande quantidade de ácidos graxos polinsaturados (PUFAs), facilmente oxidadas e vulneráveis a peroxidação lipídica. Por outro lado, esses ácidos graxos, conferem fluidez a membrana plasmática, desempenhando um importante papel nos processos de fertilização além de proteger os espermatozoides durante a criopreservação. Com base nessas afirmações, o tratamento com ácidos graxos polinsaturados durante a criopreservação parece ser uma terapia interessante. No entanto, parece plausível associar essa terapia com um tratamento antioxidante para prevenir a exacerbada peroxidação lipídica. Portanto, o objetivo deste estudo foi associar o tratamento antioxidante com suplementação de PUFA, o ácido docosaexaenoico (DHA), ao diluidor para a criopreservação de sêmen canino. Para isso, foram desenvolvidos dois experimentos visando a melhora da qualidade do sêmen criopreservado, utilizando-se em ambos, o sêmen de oito cães saudáveis e sexualmente maduros e avaliações das amostras para motilidade, membrana plasmática e integridade acrossomica, integridade do DNA, atividade e função mitocondrial e susceptibilidade da peroxidação lipídica. No primeiro estudo avaliou-se a susceptibilidade espermática a diferentes desafios de indução oxidativa (ânion superóxido [O2-], peróxido de hidrogênio [H2O2], radical hidroxil [OH-]e malondialdeído [MDA]) na presença ou ausência de plasma seminal (PS). Sêmen com PS teve função mitocondrial preservada contra EROs. No entanto, na ausência de PS, H2O2 reduziu o potencial da membrana mitocondrial. Além do mais, independentemente do PS, H2O2 foi deletério para a cinética espermática e para as membranas plasmática/acrossomal, e OH- reduziu a atividade mitocondrial e aumentou a fragmentação do DNA. No entanto, amostras com PS foram mais resistentes para a peroxidação lipídica. O segundo estudo foi feito testando o DHA em três concentrações diferentes, para isso foi dividido em quatro grupos: controle, 1M, 5M e 10M DHA. Foram adicionados ao diluidor de sêmen, congelados, descongelados e analisados. Foram constatadas diferenças significativas entre o grupo controle e 1M, com este último apresentando menores valores para motilidade progressiva e espermatozoides rápidos; o grupo 5M obteve maiores valores de espermatozoides lentos e menores para espermatozoides estáticos e; o grupo 10M maiores valores para espermatozoides estáticos. Desta forma, selecionamos a concentração de 5M DHA para associar com os antioxidantes catalase e vitamina E no diluidor (que combatem o radical OH- e o H2O2, respectivamente), baseando-se no primeiro estudo. Foram adicionados ao diluidor de sêmen e divididos em quatro grupos (todos contendo 5m DHA): controle, vitamina E, catalase e vitamina E mais catalase. As amostras foram congelados, descongelados e avaliadas. Os resultados mostraram que 5M DHA mais vitamina E teve efeitos benéficos nas características cinéticas espermáticas, como velocidade média de percurso (VAP), velocidade linear (VSL), motilidade, motilidade progressiva e espermatozoides rápidos; enquanto a suplementação de 5M DHA mais catalase (300U/mL) não mostrou o efeito benéfico potencializado esperado, indicando que esse antioxidante parece ter toxicidade para o espermatozoide na concentração utilizada em nosso experimento. Finalmente, 5M DHA associado a vitamina E (0,6mM) mais catalase (300U/mL), não aumentou a qualidade da cinética e estrutura espermáticas, mas melhorou a resistência ao estresse oxidativo.

Abstract: The imbalance between the antioxidant capacity and the production of reactive oxygen species (ROS), also known as oxidative stress (EO), can be extremely harmful to mammalian sperm. This cell is highly susceptible to EO due to its reduced cytoplasm and consequent limitation on the enzymatic antioxidant reserve. In addition, sperm exhibit a large amount of polyunsaturated fatty acids (PUFAs), which confer fluidity to the plasm membrane, playing an important role in the fertilization processes. Also, PUFAs are known to protect the sperm during the cryopreservation process. However, PUFAs are easily oxidized and vulnerable to lipid peroxidation. Based on these statements, treatment with polyunsaturated fatty acids during cryopreservation seems to be an interesting therapy. However, it seems plausible to associate this therapy with an antioxidant treatment to prevent exacerbated lipid peroxidation. Therefore, the objective of this study was to associate the antioxidant treatment with docosaexaenoic acid (DHA) supplementation to the cryopreservation extender of canine semen. Towards this aim, two experiments were developed aiming to improve the quality of cryopreserved semen. For both experiments, semen samples of eight healthy and sexually mature dogs were collected. Post-thaw semen evaluations consisted of motility, plasma and acrosome membrane integrity, DNA status, mitochondrial activity and function, and susceptibility of lipid peroxidation. In the first study, we aimed to assess which ROS is the most deleterious for canine semen in the absence of seminal plasma (condition required for the cryopreservation). This was performed in order to define the ideal antioxidant for semen cryopreservation. Therefore, semen samples were incubated with different oxidative induction challenges (superoxide anion [O2-], hydrogen peroxide [H2O2], hydroxyl radical [OH-] and malondialdehyde [MDA]) in the presence or absence of seminal plasma (PS). Semen with PS had a mitochondrial function preserved against ROS. However, in the absence of PS, H2O2 reduced the potential of the mitochondrial membrane. Moreover, regardless of the PS, H2O2 was deleterious for the sperm kinetics and for the plasmatic/acrossomal membranes, and OH- reduced mitochondrial activity and increased DNA fragmentation. However, PS samples were more resistant to lipid peroxidation. The second study was performed by testing DHA in three different concentrations. Ejaculates were divided into four groups: control, 1M, 5M and 10M DHA added to the semen extender. Samples were cryopreserved, thawed and analyzed. Significant differences were found between the control group and 1M, with the latter presenting lower values for progressive motility and rapid spermatozoa; the 5M group showed higher values of slow and lower percentage of static sperm; the group 10M presented higher values for static sperm. Therefore, we selected the concentration of 5M DHA to associate with the antioxidants catalase and vitamin E in the extender (specific for OH- and the H2O2, respectively), based on the first study. Antioxidants were added to the semen extender and divided into four groups (all containing 5M DHA): control, vitamin E, catalase and vitamin E plus catalase. Samples were cryopreserved, thawed and evaluated. The results showed that 5M of DHA plus vitamin E (0,6mM) had beneficial effects on the sperm kinetic characteristics, such as mean route velocity (VAP), linear velocity (VSL), motility, progressive motility and percentage of rapid sperm. On the other hand, 5M of DHA associated with vitamin E (0,6mM) plus catalase (300u/ML), did not increase the quality of the kinetics and spermatic structure, but improved the resistance to oxidative stress.

O estudo proteômico e o seu potencial de avaliação da fertilidade em machos de diferentes espécies domésticas / The proteomic approach and its potential for fertility assessment in males of different domestic species

A abordagem proteômica permite identificar componentes proteicos, celulares e secreções. Desta forma, constitui uma ferramenta viável para o estudo das potenciais funções de proteínas e para a busca por marcadores proteicos de fenótipos específicos e/ou processos fisiológicos. Este trabalho teve por objetivo fazer uma revisão sobre esse tema e sua importância na biotecnologia do sêmen de machos domésticos. A composição da membrana espermática e do plasma seminal é de grande interesse, em virtude da sua influência nos eventos de fusão oócito-espermatozoide, fertilização e subsequente desenvolvimento embrionário. Diversos trabalhos vêm demonstrando o potencial da proteômica ligada à reprodução animal, a qual auxilia na identificação de marcadores de fertilidade ou de ejaculados aptos à congelação.

The proteomic approach allows the identification of proteins from tissues, cells and secretion. Thus, this tool is useful for the study of potential protein functions and search for markers of specific phenotypes and/or physiological events. This study aimed to review on the subject and its importance in semen biotechnology of several species. The composition of the sperm membrane and seminal plasma is of great interest because of its influence on sperm-oocyte fusion, fertilization and subsequent embryonic development. Several studies have demonstrated the potential of proteomics related to animal breeding, assisting in identifying markers for fertility or able to ejaculate process of freezing / thawing in males of several species.

ADIÇÃO DA CICLODEXTRINA CARREGADA COM COLESTEROL DURANTE A CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN CANINO

O processo de criopreservação do sêmen canino provoca redução na fertilidade comparada ao sêmen fresco e resfriado, devido à formação de cristais de gelos oriundos das variações de temperatura lesionando as células espermáticas. Durante o processo de criopreservação do sêmen, as membranas espermáticas passam por modificações que ocorrem pela desestabilização da bicamada lipídica, devido às várias mudanças de fase e reorganização estrutural da membrana plasmática dos espermatozoides, com grande efluxo de colesterol a partir da membrana celular espermática, causando uma capacitação espermática prematura. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da adição de ciclodextrina carregada com colesterol (CCC) durante criopreservação de sêmen canino sobre os aspectos físicos, morfológicos e integridade da membrana plasmática. Foram utilizados 10 ejaculados de um cão da raça Buldogue Inglês com sete anos de idade pesando 32 Kg. Cada ejaculado foi dividido em 3 alíquotas de 360 milhões de espermatozoides: grupo controle, grupo 2 mg de CCC e grupo 5 mg de CCC para 120 milhões de espermatozoides, as amostras permanecerem em banho-maria por 15 minutos, a 37°C. Após a incubação, foi feita a diluição do ejaculado com diluente de refrigeração 1:3, centrifugação à 700 g por 10 minutos, ressuspensão do pellet de espermatozoides com diluente crioprotetor, envase de palhetas de 0,25 ml com 60 milhões de espermatozoides em cada e em seguida foram refrigeradas a 5°C por 2 horas e criopreservadas em nitrogênio líquido. As palhetas foram descongeladas em banho-maria a 37°C durante um minuto, para análise posterior dos aspectos físicos e morfológicos e teste hiposmótico, e coloração supravital. Foram observadas diferenças entre os grupos na motilidade retilínea progressiva do sêmen congelado/descongelado, sendo o grupo de 5 mg de CCC inferior aos demais (p<0,05), e nos percentuais de espermatozoides íntegros no teste supravital, o grupo de 2 mg de CCC superior aos outros (p<0,05). Conclui-se que a adição da CCC influencia a qualidade do sêmen canino congelado/descongelado, em que o grupo de 2 mg de CCC por 120 milhões de espermatozoides melhora a qualidade seminal e o grupo de 5mg de CCC por 120 milhões de espermatozoides influenciou negativamente a qualidade seminal.

Dog semen cryopreservation causes a reduction in fertility compared to fresh and cooled semen, due to the formation of ice crystals arising from temperature variations, damaging the sperm cells. During the semen cryopreservation process, sperm membranes undergo changes due to the destabilization of the lipid bilayer due to the various phase changes and structural reorganization of the sperm plasma membrane, with a large efflux of cholesterol from the sperm cell membrane, causing premature sperm capacitation. The objective of this work is to evaluate the effect of the addition of Cholesterol-Loaded Cyclodextrin (CLC) during cryopreservation of canine semen on the physical and morphological aspects and plasma membrane integrity. One English Bulldog male with 32 kg and 7 years old was used. Ten ejaculates were used for cryopreservation. Ejaculate was divided into 3 aliquots of 360 million spermatic cells: a control group that received no addition of CLC, 2mg of CLC and 5mg of CLC for 120 million spermatozoa, after the three groups incubated for 15 minutes at 37 ° C. After incubation, the ejaculate was diluted with a 1: 3 diluent, centrifuged at 700g for 10 minutes, resuspended from the spermatozoa pellet with cryoprotective diluent, armazened on 0,25 ml straws with 60 million spermatozoa and after refrigeration at 5 ° C for 2 hours were cryopreserved in liquid nitrogen. Straws were thawed at 37 ° C for one minute. After semen aspects, hyposmotic test, and Supravital staining were measurement. Differences were observed between treatments in progressive rectilinear motility of frozen / thawed semen, with a treatment of 5 mg lower than the others (p <0,05), and in percentages of intact spermatozoa in the Supravital test, with a treatment of 2 mg higher to the others (p <0.05). It was concluded that CCC treatment influences the quality of frozen / thawed canine semen, where the treatment of 2mg CCC per 120 million sperm improved seminal quality and 5mg CCC per 120 million spermatozoa negatively influenced seminal quality of frozen / thawed canine spermatozoa.

CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS E FUNCIONAIS DE ESPERMATOZOIDES BOVINOS RECUPERADOS DO EPIDÍDIMO

A utilização de espermatozoides do epidídimo (EP) em técnicas de reprodução assistida tem um papel importante na multiplicação e armazenamento de material genético. Entretanto, melhor conhecimento sobre o comportamento fisiológico destes espermatozoides é necessário para otimizar a sua utilização. Objetivou-se avaliar a viabilidade, resistência e longevidade de EP de sete touros da raça Gir, durante e após a criopreservação, usando os espermatozoides do ejaculado (EJ) como controle. O ejaculado foi coletado através de eletroestimulação, posteriormente os animais foram castrados e os espermatozoides da cauda do epidídimo foram coletados pelo método de extravasamento. Primeiramente, verificou-se a resistência dos EJ e EP diante à criopreservação, as células foram avaliadas logo após a recuperação, após quatro horas de refrigeração e após o descongelamento. Em uma segundo etapa, foi avaliada a longevidade após a criopreservação. Foram utilizados três grupos de espermatozoides do EJ, do EP e um grupo em que EP foram incubados com plasma seminal (EPP). Após o descongelamento amostras dos três grupos foram incubadas por zero, três, seis e 24 horas. Em cada momento foi avaliada a motilidade total e progressiva, integridade de membrana plasmática, integridade acrossomal, morfologia espermática capacitação. Finalmente foi avaliada a capacidade dos espermatozoides do epidídimo de se ligarem às células da tuba uterina (CTU). Para isso foram utilizados os grupos EJ, EP e EPP, foram co-incubados, com CTU por zero, três, seis e 24 horas. Devido ao resultado obtido, um segundo teste foi realizado utilizando testículos de quatro touros, coletados em abatedouro. Um testículo de cada animal foi utilizado para o grupo de EP criopreservado (EP-C) e o outro para o grupo de EP fresco (EP-F). Os dados foram analisados usando procedimento GLIMMIX do programa SAS (P0,05). Os EP apresentaram características de qualidade semelhantes aos do EJ frescos e após a criopreservação (P>0,05). Entretanto, foram mais resistentes à refrigeração do que os do EJ, apresentado maior MT (79,8±4,5 e 56,8±5,6), maior MP (46,1±3,5 e 29,2±3,2) e maior porcentagem de acrossoma íntegro (68,7±5,8 e 48,5±6,1). Após o descongelamento, e 6h de incubação os grupos EP e EPP comparados com o EJ apresentaram maior porcentagem de membrana plasmática íntegra (29±4,3, 28,2±4,2 e 16,4±3,4), maior porcentagem de espermatozoides com acrossoma intacto (31,6±3,8, 31,6±3,8 e 19,9±3,2) e maior porcentagem de espermatozoides não capacitados (81±3,5, 80,9±3,5 e 70,3±3,7). O número de espermatozoides ligados após a co-incubação das CTU com EJ, EP ou EPP não diferiu (P>0,05) em nenhum grupo, a análise dentro de cada grupo mostrou que ambos apresentaram queda gradativa no número de espermatozoides ligados às CTU, sendo que o menor número foi observado às 24 h para todos os grupos. No segundo teste de ligação, o grupo EP-F apresentou maior numero de células ligadas aos 30 min (130,9±21,2) e às 24 horas (131,7±21,2) de incubação do que o grupo EP-C aos 30 min (88±21,2) e 24 h (20,4±21,2). Pode-se concluir que EP são mais resistentes à refrigeração dos que os do EJ, apresentam maior longevidade e características de capacitação tardia, quando comparados ao EJ. Além disso, os EP se ligam às CTU da mesma forma que os EJ, no entanto a criopreservação pode afetar esta ligação.

The use of epididymal sperm (ES) in assisted reproductive technologies is an important tool form multiplication and conservation of genetic material. However, a better understanding of several aspects of those sperm physiology is needed to optimize its use. The aim of this study was to evaluate the strength, the post thawed viability, longevity and sperm characteristics behavior of ES from 7 Gir bulls, during and after cryopreservation, using ejaculated sperm (EJ) as a control. After ejaculated sperm was collected the testis were removed and sperm from the cauda epididymis were recovered First we evaluate the resistance of ES and EJ to cryopreservation, sperm were evaluated just after recovering, after 4 h of cooling and after freezing. Then, we evaluate the post thawing longevity by examining the sperm after different periods of incubation. Three groups were used ES, EJ, and a third group, in which ES was incubated with seminal plasm for 10 min after thawed (ESS). After thawing, samples from the 3 groups were incubated for 0, 3, 6 e 24 h. In each moment they were evaluated for total motility and progressive motility, plasm membrane integrity. acrosome integrity, morphology and capacitation. Finally, we evaluated the ability of ES, EJ and ESS to bind to oviduct epithelium cells (OEC), Samples from EJ, EP e EPP groups were co-incubated with OEC for 0, 3, 6 e 24 h. Due to the results obtained, another test had to be done to evaluated if the cryopreservation process was affecting ES binding. To do that we used testis form 4 bulls collected at slaughter house. From each animal one testis was used for the fresh sperm (ES-F) and the other for the frozen sperm (EP-C). Data analysis was performed using GLIMMIX from SAS (P0.05). Fresh and cryopreserved ES presented all quality parameters similar (P>0.05) to the EJ However, after cooling at 4°C, ES showed to be more resistance to cold than the EJ presenting greater TM (79.8±4.5 and 56.8±5.6), greater PM (46.1±3.5 and 29.2±3.2) and higher percentage of cells with intact acrosome (68.7±5.8 and 48.5±6.1) than EJ. After thawed at 6 h of incubation ES and ESS compared to EJ had a higher percentage of intact membranes (29±4.3, 28.2±4.2 and 16.4±3.4), higher percentage of cells with intact acrosome (31.6±3.8 31.6±3.8 and 19.9±3.2) and higher percentage of non-capacitated sperm (81±3.5, 80.9±3.5 and 70.3±3.7). The number of bounded sperm after co-incubation with OEC was similar (P>0.05) for EJ, ES and ESS groups. The analysis within the group showed that all had a decreased on the number of bounded sperm, with the lowest number of bounded sperm found at 24 h of incubation. In the second biding test the group EF had a higher number of bounded sperm at 30 min (130.9±21.2) and at 24 h (131.7±21.2) of incubation than the EC (30 min=88±21.2 and 24 h=20.4±21.2). It can be concluded that ES are more resistant to cooling than the EJ, presenting a greater longevity and a delay on capacitation process than the EJ. In addition, ES binds to OEC similarly to EJ; however cryopreservation can affect that binding.

Efeito do estresse e da suplementação com vitamina E sobre parâmetros seminais, peroxidação lipídica de componentes seminais e atividade das enzimas antioxidantes presentes no plasma seminal de cães / Effect of stress and oral supplementation with vitamin E on seminal parameteres, lipidic oxidation of seminal components and antioxidants enzymes activies in the seminal plasm in dogs

O presente trabalho visou avaliar se, em cães, o estresse provoca efeitos deletérios sobre os parâmetros seminais e a composição do plasma seminal. Além disso, avaliou-se os efeitos da suplementação oral com vitamina E em animais estressados. Utilizaram-se 18 cães machos da raça rotweiller, com idade média de 4 anos. O tratamento foi inteiramente casualizado com esquema fatorial 2x2 (com e sem estresse X com e sem vitamina E). Os animais dos grupos suplementados com vitamina E receberam 500 mg de -tocoferol/animal/dia. O estresse foi induzido, sete dias após o início da suplementação com vitamina E através da aplicação intramuscular de 0,01mg/kg de dexametasona, durante 7 dias consecutivos. O estresse foi caracterizado através do cortisol sérico, consumo alimentar, escore corporal e peso vivo. Foram feitas duas colheitas semanais de sêmen através de manipulação digital e uma coleta semanal se sangue. Os parâmetros utilizados para avaliar os efeitos do tratamento foram: volume, densidade e pH do ejaculado, motilidade, vigor, concentração e morfologia espermáticos, integridade da membrana espermática (teste de expansão hipo-osmótico, coloração fluorescente IP/DCF, coloração tripla, coloração acrossomal simples e viabilidade espermática), proteínas totais, grau de peroxidação lipídica (concentração de TBARS), concentração de catalase, superóxido dismutase, glutationa peroxidase no plasma seminal e nível de testosterona plasmática. Observou-se um efeito do estresse sobre o volume do ejaculado, pH do ejaculado, TBARS e porcentagem de células mortas com acrossoma reagido (classe 4 da coloração simples). A vitamina E atuou sobre a porcentagem de defeitos maiores, TBARS, a porcentagem de células com membrana acrossomal íntegra e sobre a viabilidade espermática. O efeito conjunto da vitamina E e do estresse foi observado sobre a motilidade, vigor e concentração espermáticos, a porcentagem de defeitos maiores, porcentagem de células íntegras pelo teste hipo-osmótico e através de sondas fluorescentes IP/DFC. Com base nos resultados obtidos neste experimento concluiu-se que o estresse influencia de maneira negativa a célula espermática e a composição do plasma e a suplementação oral com vitamina E modifica estes efeitos

The present study aimed to evaluate if the stress in dogs may have deleterious effects on the sperm quality and on the composition of the seminal plasma. IN addition, the effect of supplementation with vitamin E on stressed dogs was also evaluated. Eighteen male adult rotweiller dogs were randomly allocated in a 2X2 factorial treatment design (stress and no stress X vitamin E supplementation and no supplementation). Animals of the supplemented group received 500 mg of -tocopherol/animal/day. The stress was induced 7 days after the beginning of the vitamin supplementation using dexamethasone (0.01 mg/kg intramuscular for 7 consecutive days). Stress was characterized through the measurement of plasmatic cortisol, food intake, body score and weight. Semen collections were performed twice a week through digital manipulation and blood collections were performed weekly. Semen parameters used to evaluate the effect of the treatments were: ejaculate volume, density and pH, sperm motility, vigor, concentration and morphology, sperm membrane integrity (hypo-osmotic swelling test - HOST, fluorescent probe IP/DCF, triple stain, simple acrosome stain and sperm viability), total protein concentration, lipid peroxidation rate (TBARS), enzymatic activity of the antioxidants catalase, superoxide dismutase, glutatione peroxidase in the seminal plasma and plasmatic testosterone concentration. The stress influenced the ejaculate volume and pH, TBARS and percentage of dead cells with reacted acrosome (class 4 of the simple stain). Vitamin E had na effect on the percentage of sperm major defects, TBARS, percentage of cells with intact acrosome and sperm viability. The effect of vitamin E and stress was observed on sperm motility, vigor and concentration, percentage of major sperm defects, percentage of intact membrane cells evaluated through the HOST and through the fluorescent probe IP/DFC. Results obtained indicated that the stress has a deleterious effect on the spermatic cell and that the composition of the seminal plasma and the oral vitamin E supplementation may modify this effects