Isolamento, caracterização e avaliação da patogenicidade de Pythium spp. de ecossistemas de água doce no estado do Rio Grande do Sul e influência da temperatura na zoosporogênese de Pythium insidiosum

Pythium insidiosum é o agente etiológico da pitiose, uma doença grave e emergente que acomete os mamíferos. Seu ciclo biológico ocorre em ambientes aquáticos dando origem a zoósporos infectantes. O presente estudo objetivou isolar e caracterizar espécies de Pythium que habitam ambientes aquáticos no Rio Grande do Sul, Brasil; avaliar a patogenicidade das espécies isoladas empregando coelhos como modelo experimental; bem como verificar a influência de diferentes temperaturas sobre a zoosporogênese in vitro de P. insidiosum. Foram coletadas 186 amostras de água de ambientes aquáticos em 13 municípios das regiões Sul, Central e Oeste do Rio Grande do Sul, com o objetivo de isolar e caracterizar espécies de Pythium e avaliar a sua patogenicidade empregando coelhos como modelo experimental. Em 11,8% (n=22) das águas coletadas foram isoladas diferentes espécies de Pythium incluindo: P. insidiosum (n=01), P. catenulatum (n=03), P. pachycaule voucher (n=01), P. rhizo-oryzae (n=03), P. torulosum (n=04) e Pythium spp. (n=10). Zoósporos desses micro-organismos foram produzidos in vitro e inoculados por via subcutânea em coelhos, os quais foram avaliados durante 45 dias. Dentre os oomicetos testados, apenas P. insidiosum evidenciou patogenicidade, causando pitiose no modelo experimental, evidenciando que, em nossas condições, apenas esta espécie de Pythium é patógena para mamíferos. Para verificar a influência de diferentes temperaturas sobre a zoosporogênese in vitro de P. insidiosum, isolados brasileiros de P. insidiosum (n=26) foram submetidos à zoosporogênese e incubados nas temperaturas de 5,15, 20 e 37. Fragmentos de grama foram avaliados em microscopia ótica nas primeiras 4, 8 e 24 horas de incubação (1a etapa do experimento). Após, todos os isolados foram incubados a 37 (grupo controle) e avaliados nos mesmos períodos (2a etapa do experimento). Avaliou-se o desenvolvimento de hifas, presença de vesículas, zoosporângios e zoósporos. A 5 observou-se apenas presença de hifas curtas nas bordas dos fragmentos de grama. Em 15, as hifas apresentavam-se em desenvolvimento ou longas e dois isolados produziram zoósporos. Quando os isolados foram submetidos a 20/4horas verificou-se a presença de hifas longas e miceliais, vesículas, zoosporângios e zoósporos, o que se manteve nos demais períodos avaliados. Os isolados que anteriormente estavam a 5 e 15, e posteriormente foram transferidos para 37, evidenciaram hifas em desenvolvimento e longas com presença de vesículas, zoosporângios e zoósporos em 4 horas de incubação, sendo essas características mantidas nos demais períodos avaliados. Os isolados mantidos a 37 na 1a etapa do experimento apresentaram zoosporogênese evidente nas primeiras 4 horas de avaliação. Evidencia-se que em temperaturas baixas (5 e 15) a viabilidade de P. insidiosum é mantida. No entanto, quando este oomiceto é submetido a temperaturas mais elevadas (20 e 37) a zoosporogênese com a liberação de zoósporos é induzida em um período curto de tempo.

Pythium insidiosum is the agent etiological da pythiosis, a serious and emerging disease affecting mammals. Its biological cycle occurs in aquatic environments giving rise to infectious zoospores. The present study aimed to isolate and characterize Pythium species which in habit aquatic environments in Rio Grande do Sul State, Brazil; evaluate isolated the species pathogenicity by using rabbits as an experimental model; as well as verify the influence of different temperatures on in vitro P. Insidiosum zoosporogenisis.A total of 186 water samples from aquatic environments were collected from 13 municipalities in Southern, Central and Western areas of Rio Grande do Sul State for the purpose of isolating and characterizing Pythium species and evaluating their pathogenicity using rabbits as an experimental model. Different Pythium species were isolated In 11.8% (n = 22) of the collected samples, including P. insidiosum (n = 01), P. catenulatum (n = 03), P. pachycaule voucher (n = 01), P. Rhizo-oryzae (n = 03), P. torulosum (n = 04) and Pythium spp. (n = 10). Zoospores of these microorganisms were produced in vitro and inoculated subcutaneously into rabbits, which were evaluated for 45 days. Of all oomycetes tested, only P. insidiosum showed pathogenicity, causing pythiosis in the experimental model, thus evidencing that, under the analyzed conditions, only this Phythium species is pathogenic to mammals.In order to verify the influence of different temperatures on in vitro P. Insidiosum zoosporogenesis, Brazilian P. insidiosum isolates (n = 26) were submitted to zoosporogenesis and incubated at 5, 15, 20 and 37. Grass fragments were evaluated under optical microscopy at the first 4, 8 and 24 hours of incubation (1st stage of the experiment). Afterwards, all isolates were incubated at 37 and evaluated at the same periods of time (2nd stage of the experiment). The development of hyphae, and the presence of vesicles, zoosporangia and zoospores were evaluated. At 5 only the presence of short hyphae at the edges of grass fragments was observed. In 15, hyphae were developing or elongated, and two isolates produced zoospores. When the isolates were submitted to 20/4 hours, the presence of long and mycelial hyphae, vesicles, zoosporangia and zoospores was observed, which was also the case at the remaining periods of time evaluated. Isolates which had been previously at 5 and 15 and later transferred to 37 evidenced developing and long hyphae with presence of vesicles, zoosporangia and zoospores within 4 hours of incubation; these characteristics were maintained at the other evaluated times.Isolates maintained at 37 in the 1 st stage of the experiment showed evident zoosporogenesis in the first 4 hours of evaluation. It was evidenced that at low temperatures (5 and 15), P. insidiosum viability was maintained. However, when this oomycete was subjected to higher temperatures (20 and 37) zoosporogenes is with the release of zoospores was induced in a short period of time.

Aspectos clínicos, morfológicos e imuno-histoquímicos da pitiose gastrintestinal canina / Clinical Aspects, contouring and immunohistochemistry of pythiosis gastrintestinal diseases of dogs

Através de um estudo retrospectivo dos casos de biópsias e necropsias de cães recebidos no Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Santa Maria, constatou-se a ocorrência de dois casos confirmados e de quatro casos suspeitos de pitiose gastrintestinal canina. Os dois casos diagnosticados e publicados tiveram a etiologia confirmada através da cultura e indução de zoosporogênese ou por nested-PCR. Neste estudo utilizou-se a técnica de imuno-histoquímica com anticorpo policlonal anti-Pythium insidiosum para confirmação da etiologia dos quatro casos suspeitos. A epidemiologia, sinais clínicos, lesões macroscópicas e microscópicas, características histoquímicas e imuno-histoquímicas e diagnósticos diferenciais são relatados e discutidos.(AU)

Four suspect and two confirmed cases of gastrointestinal pythiosis were found in a retrospective study of biopsy and necropsy cases of dogs received in the Laboratório de Patologia Veterinária at the Universidade Federal de Santa Maria. The two diagnosed and published cases have had the etiology confirmed by culture and zoosporogenesis induction or by nested-PCR. On this study, the etiologic diagnosis of four suspect cases was confirmed by immunohistochemistry using anti-Pythium insidiosum policlonal antibody. Epidemiology, clinical signs, gross and microscopic lesions, histochemistry, immunohistochemistry, and differential diagnoses are reported and discussed.(AU)

Zoosporogênese in vitro entre isolados do oomiceto Pythium insidiosum / In vitro zoosporogenesis among oomycetes Pythium insidiosum isolates

Pythium insidiosum é um oomiceto aquático, responsável pela etiologia da pitiose, uma enfermidade crônica, observada freqüentemente em eqüinos. A produção de zoósporos móveis por este microrganismo se constitui no fator determinante da ocorrência da enfermidade. Este estudo avaliou a zoosporogênese e quantificou a produção de zoósporos de 32 amostras de Pythium insidiosum isoladas de eqüinos naturalmente infectados. Pythium insidiosum foi cultivado em meio Corn Meal Agar acrescido de fragmentos de grama, durante 5 dias, a 37ºC. Posteriormente, os fragmentos de grama parasitados foram incubados em Meio de Indução a 37ºC, por 24 horas. Observou-se que 16 amostras (50 por cento) produziram 20.000 zoósporos mL-1, 12 isolados (37,5 por cento) produziram acima de 20.000 zoósporos mL-1, enquanto quatro amostras (12,5 por cento) produziram menos de 20.000 zoósporos mL-1. O período de maior produção de zoósporos foi entre 6 e 8 horas de incubação. O protocolo utilizado na indução da zoosporogênese mostrou-se eficiente e representa uma importante ferramenta, tanto para a identificação do Pythium insidiosum, como para a obtenção de zoósporos em quantidades suficientes para a inoculação em animais experimentais e aplicação no desenvolvimento de testes de suscetibilidade.(AU)

Pythium insidiosum is an aquatic oomycete and the etiology of a chronic disease called pythiosis, commonly found in the skin of horses. The production of mobile zoospores by this microorganism is the determinant factor of this disease. This study evaluated the zoosporogenesis and quantification of zoospores in 32 samples of Pythium insidiosum isolated from horses with pythiosis. The assay used culture of the Pythium insidiosum in Corn Meal Agar plus grass blades for 5 days at 37ºC. The grass blades were incubated in Induction Medium at 37ºC for 24 hours. The findings showed 16 samples (50 percent) yielded 20,000 zoospores mL-1, 12 (37.5 percent) samples yielded over 20,000 zoospores mL-1 and 4 samples (12.5 percent) yielded less than 20,000 zoospores mL-1. The zoospores production was higher between 6 and 8 hours of incubation. The protocol used in the zoosporogenesis induction was efficient and represents an important tool for Pythium insidiosum identification and the attainment of zoospores in adequate amounts for inoculation in experimental animals and application in the development of susceptibility tests.(AU)