Clonagem do cDNA e sequenciamento parcial do gene que codifica a enzima glutamato desidrogenase hepática de ovino / Cloning of the cDNA and partial sequencing of the gene that codifi es the sheep hepatic enzyme glutamate dehydrogenase

RESUMO

A enzima mitocondrial glutamato desidrogenase (GDH EC 1.4.1.2) catalisa a desaminação reversível do L-glutamato para 2-oxoglutarato (α-cetoglutarato) usando o NAD+ e NADP+ como coenzimas. É uma das mais importantes enzimas hepáticas encontradas em hepatócitos de bovinos, ovinos e caprinos. Infecções por Fasciola spp., intoxicação grave aguda por toxinas de plantas, tais como Xanthium spp. e Senecio spp. e intoxicação por cobre resultam na liberação dessa enzima no sangue. O aumento da GDH indica danos ou necrose hepática em bovinos e ovinos. Esta é a enzima de escolha para avaliar a função hepática dos ruminantes. No presente trabalho o cDNA que codifica a enzima GDH do hepatócito de ovino foi sintetizado por meio de RT-PCR utilizando mRNA extraído do fígado de ovino. Parte da região de codificação do cDNA da GDH de ovino foi amplificada por PCR usando oligonucleotídeos iniciadores sintetizados a partir do alinhamento de sequências de ORFs de Ovis aries, Bos taurus, Homo sapiens, Rattus norvegicus e Mus musculus disponíveis em banco de dados. O cDNA foi clonado no vetor pGEM® -T Easy (Promega) e inserido em células cálcio-competentes de Escherichia coli DH10B através de choque térmico. O DNA plasmidial foi purificado e após o sequenciamento a presença de um inserto de 1292 pb foi confirmado. O alinhamento da sequência deduzida de aminoácidos com outras espécies revelou alta homologia entre as GDH.

ABSTRACT

The mitochondrial enzyme Glutamate Dehydrogenase (GDH EC 1.4.1.2) catalyzes the reversible deamination of the L-glutamate for 2-oxoglutarate (α-ketoglutarate) using NAD+ and NADP+ as coenzymes. It is one of the most important liver enzymes found in hepatocytes of cattle, sheep and goats. Infections by Fasciola spp., severe acute intoxication by toxins of plants such as Xanthium spp. and Senecio spp. as well as intoxication by copper result in the release of this enzyme in blood. The increase of the GDH indicates damage or hepatic necrosis in cattle and sheep. This is an enzyme of choice to evaluate the function of the ruminants. In the present study the cDNA, that codifies the GDH enzyme of the hepatocyte of sheep, was synthesized by means of RT-PCR making use of mRNA extracted from the liver of sheep. Part of the region where the cDNA of the GDH of the ovine is codified was amplified by PCR from primers synthesized through the comparison of the aligned sequences of Ovis aries, Bos taurus, Homo sapiens, Rattus norvegicus and Mus musculus available in the database. The cDNA was cloned in the vector pGEM®-T Easy (Promega) and inserted in Escherichia coli DH10B calcium competent cells by heat shock procedure. The plasmid DNA was purified and after sequencing, the presence of 1292 pb was confirmed. The alignment of the sequence deduced of amino acid with other species revealed high homology among the GDHs.