Mild-acid hydrolysis of a native polysulfated fraction from Acanthophora muscoides generates sulfated oligosaccharides displaying in vitro thrombin generation inhibition / Hidrólise ácida branda de uma fração polissulfatada de Acanthophora muscoides gera oligossacarídeos sulfatados mostrando inibição de geração de trombina in vitro

ABSTRACT

Acanthophora muscoides (Rhodophyta) has three polysulfated fractions    (Am-1, Am-2 and Am-3). Am-2 displayed anti-inflammation and serpin-independent anticoagulation; however, no effect of oligomers on thrombin-generation (TG) assay has been demonstrated. This study employed mild-acid hydrolysis to obtain low-molecular-size derivatives from Am-2 and compared in vitro inhibitory effects between intact Am-2 and its hydrolysates on a TG assay. The enzymatic extract was fractionated by DEAE-cellulose that revealed Am-2 eluted with 0.75-M NaCl containing sulfate (23%), hexoses (51%) and devoid of proteins, and indicating, by one-dimension nuclear magnetic resonance, structure of galactan similar to that of extract. The depolymerization with HCl (0.02 or 0.04-M, 60C) for different times progressively reduced the charge density and the molecular-size of Am-2 based on electrophoreses in agarose and polyacrylamide gels, respectively, where at higher acid concentration and critical time up to 5 h yielded fragment of   10-kDa similar to that of unfractionated heparin (UHEP). Regarding the TG assay, intact Am-2 inhibited concentration-dependent the intrinsic pathway, whereas its hydrolysates abolished it like UHEP, when in 60-fold diluted human plasma using chromogenic method by a continuous system. The results reveal an alternative approach for producing oligosaccharides(AU)

RESUMO

A rodofícea A. muscoides possui três frações polissulfatadas (-1, -2 e Am-3). Am-2 mostrou efeito anti-inflamação e anticoagulação independente de serpina. Entretanto, não se demonstrou efeito de oligômeros sobre ensaio de geração de trombina (GT). Este estudo empregou hidrólise ácida branda para obter derivados de tamanho molecular baixo de Am-2 e os efeitos inibitórios in vitro entre Am-2 intacta e hidrolisados comparados sobre um ensaio de GT. O extrato polissacarídico, fracionado por DEAE-celulose, revelou Am-2 eluída com NaCl-0,75M contendo sulfato (23%), hexoses (51%) e destituída de proteínas. E, ainda, por ressonância magnética nuclear-unidimensional, indicando galactana semelhante a do extrato. A depolimerização com HCl (0,02 ou 0,04-M; 60C) reduziu, progressivamente durante tempos diferentes, a densidade de carga e o tamanho molecular de Am-2 baseada nas eletroforeses em géis de agarose e de poliacrilamida, respectivamente, em que, concentração ácida elevada e tempo crítico de até 5h renderam fragmento de 14-kDa semelhante ao da heparina não fracionada (HEPNF). Já no ensaio de GT, Am-2 intacta, quando em plasma humano diluído 60 vezes, usando método cromogênico por meio de sistema contínuo, quem inibiu a via intrínseca dependente de concentração, ao passo que seus hidrolisados aboliram como HEPNF, exceto fragmento análogo (inibição 92,87%). Os resultados revelam(AU)