Influence of the incubation conditions on culture media to optimize primary isolation of Mycobacterium bovis / Influência das condições de incubação nos meios de cultura para otimizar o primo isolamento de Mycobacterium bovis

ABSTRACT

The isolation of Mycobacterium bovis is critical to a surveillance system for bovine tuberculosis based on detection of lesions in abattoirs. Thus, four solid culture media and three incubation conditions were investigated to elucidate which combination overcomes the others by assessing growth, time to the first appearance of colonies and their number. Ninety-seven samples of granulomatous lesions were submitted to the decontamination procedure by 1-hexadecylpyridinium chloride at 0.75% w/v, and inoculated on two egg-based media, Stonebrinks (ST) and Lõwenstein-Jensens with sodium pyruvate (LJp), and two agar-based media, tuberculosis blood agar (B83) and Middlebrook 7H11 medium (7H11). Each medium was incubated at 37°C for 90 days in three incubation conditions in air, in air containing 10% carbon dioxide (CO2), and in air in slopes closed with burned hydrophobic cotton and subsequently plugged with a cork to create a microaerophilic atmosphere. The colonies appeared faster and in higher number when incubated in air containing 10% CO2 (p < 0.01), independent of media. B83 showed a faster growth and detected more isolates at 30 days of incubation, when compared to ST (0.0178), LJp (p < 0.0001) and 7H11 (p < 0.0001), though there was no difference between B83, ST and LJp at 60 and 90 days of incubation. 7H11 presented the lowest number of isolates (p < 0.0001) and a longer period for the appearance of the first colony (p < 0.001). According to our findings, the concomitant use of ST and B83 media incubated in air containing 10% CO2 increases the isolation of M. bovis in a shorter period of time, which improves bovine tuberculosis diagnosis.(AU)

RESUMO

O isolamento do Mycobacterium bovis é fundamental para um sistema de vigilância para tuberculose bovina baseado na detecção de lesões em abatedouro. Assim, quatro meios de cultura sólidos e três condições de incubação foram investigados para elucidar qual combinação supera as outras através da avaliação de crescimento, tempo para o aparecimento da primeira colônia e número de colônias. Noventa e sete amostras de lesões granulomatosas foram submetidas ao processo de descontaminação por cloreto de 1-hexadecilpiridínio a 0,75%, e inoculadas em dois meios a base de ovo, Stonebrink (ST) e Lõwenstein-Jensen com piruvato de sódio (LJp), e dois meios a base de ágar, ágar sangue tuberculose (B83) e Middlebrook 7H11 (7H11). Cada meio foi incubado a 37°C por 90 dias, em três condições de incubação em atmosfera normal, em atmosfera com acréscimo de 10% de dióxido de carbono (CO2), e em atmosfera normal em tubos fechados com algodão hidrófobo queimado e subsequentemente fechado com rolha para criar uma atmosfera microaerófila. As colônias apareceram mais rapidamente e em maior número quando incubadas em atmosfera com 10% de CO2 (p < 0,01), independente dos meios. As micobactérias cresceram em maior abundância e mais rapidamente no meio B83 aos 30 dias de incubação, comparado a ST (0,0178), LJp (p < 0,0001) e 7H11 (p < 0,0001), apesar de não ter havido diferença entre B83, ST e LJp aos 60 e 90 dias de incubação. 7H11 exibiu o número mais baixo de isolados (p < 0,0001) e um período mais longo para o aparecimento da primeira colônia (p < 0,001). De acordo com nossos resultados, o uso concomitante dos meios ST e B83, incubados em atmosfera com acréscimo de 10% de CO2, aumenta a proporção de isolados e o número de UFC de M. bovis, além de abreviar o tempo para aparecimento das primeiras colônias, melhorando o diagnóstico direto de tuberculose.(AU)