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Semina Ci. agr.; 37(5, supl. 2): 3709-3718, 2016. tab, graf

Artigo em Inglês | VETINDEX | ID: vti-26423

Resumo

The current scenario of international beef trading has increased the pressure for better and faster diagnosis of bovine tuberculosis. Although traditional culture remains the gold standard method to confirm Mycobacterium bovis infection, it is exceedingly time consuming, and demands viable mycobacteria. Molecular methods overcome the flaws of the bacteriological methods with faster detection and identification. However, mycobacterial features like a complex cell wall and pathogenhost interaction make the molecular detection a challenge. Three protocols for DNA extraction (A, B and C) from bovine tissues were tested to verify the most suitable technique for routine diagnostic assessment of their specificity and sensitivity. Thirty culture-positive and thirty culture-negative granulomatous lesions were included in the trial. From each sample, three tissue suspensions at different dilutions (10-1, 10-2 and 10-3) were prepared and submitted to DNA extraction. PCR procedures targeting IS6110 were performed, employing two volumes of DNA: 5 µL of all three dilutions, and 2.5 µL of the 10-1 dilution. Protocol A was able to detect members of the M. tuberculosis complex in most samples. The sensitivity of the test decreased with increase in tissue-suspension dilution. Although Protocol A presented the highest sensitivity followed by C and B, it showed the lowest specificity, which can be due to a failure in primary isolation caused by the lack of viable organisms or incubation time. Regardless classical bacteriological methods are still recommended by OIE, after evaluating the sensitivity of DNA extraction protocols and PCR procedures, we conclude that the best strategy for M. bovis detection is to follow Protocol A on concentrated tissue suspensions.(AU)

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O atual comércio internacional de carne tem aumentado a pressão para haver um melhor e mais rápido diagnóstico de tuberculose bovina. O tradicional cultivo continua a ser o método padrão ouro para confirmar a infecção por Mycobacterium bovis, apesar de ser excessivamente demorado e necessitar de micobactérias viáveis. Métodos moleculares representam a superação de todos os defeitos dos métodos bacteriológicos com detecção e identificação mais rápidas. Entretanto, características das micobactérias, como uma complexa parede celular e a interação patógeno-hospedeiro, torna-os um desafio. Três protocolos de extração de DNA (A, B e C) foram testados em tecidos bovinos para verificar qual técnica é mais adequada para diagnóstico de rotina, avaliando sua especificidade e sensibilidade. Trinta lesões granulomatosas positivas no cultivo e 30 lesões granulomatosas negativas no cultivo foram utilizadas no experimento. A partir de cada amostra, três homogeneizados com diferentes diluições (10-1, 10-2 e 10-3) foram preparadas e submetidas à extração de DNA. A PCR para o gene alvo IS6110 foi realizada empregando-se dois volumes de DNA: um com 5 µL para todas as três diluições e outro com 2,5 µL da diluição 10-1. O Protocolo A foi capaz de detectar membros do complexo M. tuberculosis na maior parte das amostras. À medida que a diluição dos homogeneizados aumentou, a sensibilidade diminuiu. Embora o Protocolo A tenha apresentado a maior sensibilidade, seguido por C e B, este revelou a menor especificidade, que pode ser devido à insuficiência de organismos viáveis ou tempo de incubação no primo isolamento. Apesar de os métodos bacteriológicos clássicos ainda serem recomendados pela OIE, através da avaliação da sensibilidade dos protocolos de extração de DNA e dos procedimentos de PCR, concluímos que a melhor estratégia para a detecção de M. bovis é usar o Protocolo A em homogeneizados mais concentrados.(AU)

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