Production of outer membrane vesicles (OMV) in batch cultivation of Neisseria meningitidis serogroup B

ABSTRACT

Meningococcal disease is an important cause of death and morbidity throughout the world. Nearly 330,000 cases and 35,000 deaths occur yearly. Neisseria meningitidis, serogroup B strain N.44/89, is prevalent in Brazil. Its outer membrane vesicles (OMV) with iron regulated proteins (IRP) are released to the culture medium and are used as antigen for vaccine production. In order to have knowledge about the kinetic parameters, especially the final OMV concentration values, 20-h batch cultivations were carried out in Catlin medium with iron restriction. Process conditions comprised 7 L bioreactor, 36ºC, 0.5 atm, overlay air flowrate of 1 L/min, agitation varying from 250 rpm to 850 rpm and dissolved oxygen control set at 10% of saturation condition. Biomass was determined by optical density at 540 nm and dry weight. Glycerol, lactate, pH and dissolved oxygen were measured from samples taken during cultivation. Outer membrane vesicle (OMV) concentration was determined by Lowry's method after ultracentrifugation. IRP presence was verified by SDS-PAGE. Highest biomass value, corresponding to the highest initial lactate concentration (7.84 g/L) was achieved at the 9th hour process time corresponding to 1.0 g/L dry biomass and 2.3 optical density at 540 nm. Lactate consumption was directly related to cell growth (yield factor 0.24 g dry biomass / g lactate). Glycerol concentration in the medium did not change significantly during the process. OMV concentration reached the highest value of 80 mg/L at end cultivation time. The obtained results suggest that lactate is a main limiting growth factor and the maximum amount of antigen is obtained during stationary growth and cell death phases.

RESUMO

A doença meningocócica é uma causa importante de morte a nível mundial. Aproximadamente 330.000 casos e 35.000 mortes ocorrem anualmente. A cepa N.44/89 do sorogrupo B de Neisseria meningitidis é prevalente no Brasil. Suas vesículas de membrana externa (OMV - "outer membrane vesicles"), com proteínas reguladoras de ferro (IRP - "iron regulated proteins") liberadas no meio de cultura, são empregadas como antígeno para a produção da vacina. A fim ter o conhecimento sobre os parâmetros cinéticos, especialmente os valores finais da concentração de OMV, cultivos batelada de 20 hs foram realizados no meio de Catlin com limitação do ferro. As condições de processo compreenderam biorreator de 7 litros, 36ºC, 0,5 atm, vazão de ar de 1 L/min, agitação variando entre 250 a 850 rpm, controle do oxigênio dissolvido em 10% da condição de saturação. A biomassa foi determinada pela densidade ótica em 540 nm e peso seco. Glicerol, lactato, pH e oxigênio dissolvido foram medidos das amostras retiradas durante o cultivo. A concentração de OMV foi determinada pelo método de Lowry após ultracentrifugação. A presença de IRP foi verificada por SDS-PAGE. O valor mais elevado de biomassa, correspondendo à concentração inicial mais elevada de lactato (7,84 g/L) foi obtido no tempo de processo de 9 horas, o qual corresponde a biomassa seca de 1,0 g/L e a densidade ótica de 2,3 em 540 nm. O consumo de lactato. foi relacionado diretamente ao crescimento celular (fator de conversão de 0,24 biomassa por lactato g/g). A concentração do glicerol no meio não se alterou significativamente ao longo do processo. A concentração de OMV alcançou o valor mais elevado de 80 mg/L no tempo final de cultivo. Os resultados obtidos sugerem que o lactato é o principal fator limitante do crescimento e o máximo do antígeno é obtido durante a fase estacionária de crescimento e de morte celular.