Optimization and validation of HPLC methodology for determining flavonols and flavones in vegetables / Otimização e validação de metodologia analítica para determinação de flavonóis e flavonas por CLAE em hortaliças

ABSTRACT

The objective of this investigation was to optimize the analytical methodology for determining flavonols and flavones in vegetables. The hydrolysis procedure was optimized using Central Composite Rotational Design (CCRD) to investigate the effects of HCl concentration and hydrolysis time. This step was carried out simultaneously with extraction with 50% aqueous methanol, and refluxing at 90C. A Waters liquid chromatograph, with Nova-Pak C18 column and photodiode array detector, was used. The analyzed compounds were myricetin (M), quercetin (Q), kaempferol (K), luteolin (L), and apigenin (A). The optimum conditions found for hydrolysis for each vegetable were 1.0M HCl for 6 hours for spinach and kale, 1.6M HCl for 5 hours for roquette, 1.2M HCl for 2 hours for lettuce, 1.7M HCl for 4.3 hours for parsley, and 0.8M HCL for 2.5 hours for onion. The best gradient (HPLC) for separating flavonoids from these vegetables consisted of methanolwater (acidified with 0.03% formic acid) 2080, changing to 4555 in 5 minutes, 4852 in 17 minutes, returning to 2080 in 20 minutes. The standard curves of the flavonoids had coefficients of correlation higher than 0.99. The detection limits were 0.5, 0.4, 0.5, 0.6 and 1.0g/mL for M, Q, L, K, and A, respectively.

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi otimizar a metodologia analítica para determinação de flavonóis e flavonas em hortaliças. A hidrólise foi otimizada utilizando-se Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para investigar os efeitos da concentração de HCl e do tempo de hidrólise. Essa etapa foi realizada simultaneamente com a extração por metanol aquoso 50%, em refluxo a 90ºC. Foi utilizado cromatógrafo líquido Waters com coluna Nova-Pak C18 e detector de arranjo de diodos. Os compostos estudados foram miricetina (M), quercetina (Q), kaempferol (K), luteolina (L) e apigenina (A). As condições ótimas encontradas para hidrólise de cada hortaliça foram 1,0M HCl/6 horas para espinafre e couve, 1,6M HCl/5 horas para rúcula, 1,2M HCl/2 horas para alface, 1,7M HCl/4,3 horas para salsa e 0,8M HCl/2,5 horas para cebola. O melhor gradiente para separação (CLAE) dos flavonóides das hortaliças em estudo foi constituído de metanolágua (acidificados com 0,3% de ácido fórmico) 2080, chegando a 4555 em 5 minutos, 4852 em 17 minutos e voltando a 2080 em 20 minutos. As curvas analíticas apresentaram coeficientes de correlação maiores que 0,99. Os limites de detecção foram de 0,5, 0,4, 0,5, 0,6 e 1,0g/mL, respectivamente, para M, Q, L, K e A.