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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-1971

Resumo

O desenvolvimento embrionário depende da adequada interação nucleo-citoplasmática, o que é influenciado pelo tipo de célula doadora e pela qualidade do oócito receptor na clonagem, assim como por características dos espermatozóides e oócitos na fecundação in vitro (FIV). O primeiro estudo foi constituído de dois experimentos. O primeiro experimento avaliou o tipo de célula doadora de núcleo (células fibroblásticas - FIB vs. células mesenquimais derivadas de adipócitos - ADMSC), com diferentes citoplastos receptores (suíno ? reconstruído com dois hemi-citoplasto suínos; mosaico ? reconstruído com um citoplasto suíno e um citoplasto bovino; bovino ? reconstruído com dois hemi-citoplastos bovinos), no desenvolvimento de embriões suínos, clonados por transferência nuclear de células somáticas (TNCS). Os cultivos celulares foram estabelecidos a partir de dois suínos de raças ameaçadas de extinção (casco de mula e moura), sendo os embriões reconstruídos por clonagem manual e cultivados in vitro por 7 dias, em meio PZM-3. Os grupos mosaico e bovino apresentaram produção embrionária menor que o grupo suíno (5,5; 1,9 e 18,0%, respectivamente). O grupo ADMSC-mosaico do animal moura apresentou produção embrionária intermediaria em relação ao controle e ao bovino, e superior ao grupo FIB-mosaico do mesmo animal. A porcentagem de blastômeros fragmentados em embriões clivados e mórulas foi superior nos grupos mosaico e bovino, em relação ao grupo suíno. A dinâmica de fusão, observada conforme a migração mitocondrial entre os citoplastos, foi diferente em função do citoplasto empregado. No segundo experimento foi investigado o efeito do inibidor de desacetilases ?Scriptaid? no desenvolvimento embrionário in vitro dos grupos suíno, mosaico e bovino, utilizando-se células fibroblastos do animal moura. Os embriões reconstruídos foram expostos a 500 nM de Scriptaid por 12 h, iniciando a partir da ativação, sendo então cultivados em PZM-3 por 7 dias. A taxa de produção de blastocistos do grupo controle (9,2 vs. 17,3%) e mosaico (1,0 vs. 9,2%) aumentou com o uso de Scriptaid (p < 0,05), enquanto a proporção de fragmentos em mórulas reduziu no grupo mosaico (9,8 vs. 2,8%) (p < 0,05). No entanto, o uso de Scriptaid não aumentou a produção embrionária no grupo bovino. No segundo estudo, constituído de três experimentos, avaliou-se a influência de distintas qualidades de gametas na produção embrionária por FIV, em bovinos. Nos experimentos 1 e 3, foram avaliadas as taxas de produção embrionária no sétimo dia de cultivo. No experimento 2, dois touros de comprovada eficiência na produção embrionária in vivtro, foram utilizados na FIV de oócitos de qualidade boa e ruim. O touro 1 não mostrou diferença na produção embrionária com oócitos de qualidade boa (19,8%) ou ruim (12,7%). O touro 2 apresentou maior produção embrionária com oócitos bons (25,7%) do que com oócitos ruins (9,2%). No experimento 2, a capacidade penetrante dos dois touros foi avaliada em oócitos de qualidade ruim através da técnica de injeção espermática sub-zonal. A taxa de penetração, observada 3 h apos a injeção, foi menor no touro 1 (34,0%) em comparação ao touro 2 (44,3%) (p < 0,05). No experimento 3, o sêmen de ambos touros foi usado para injeção intra-citplasmática de espermatozóides com oócitos de viii ambas qualidades. Não foi observado nenhum efeito de touro ou oócito na produção embrionária. Os resultados permitem concluir que o uso de moduladores

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The adequate embryo development depends on proper nuclear-cytoplasmic interactions in the embryo. Such interactions are influenced by the donor cell type and quality of recipient oocyte on cloning, as well as by the characteristics of the sperm and the oocyte on in vitro fertilization (IVF). The first study (two experiments) investigated the effect of donor cell type (fibroblastic-like cells - FIB vs. adipocyte-derived mesenchymal stem cells - ADMSC), and host cytoplast (porcine â reconstructed with 2 hemi-porcine cytoplasts; mosaic â reconstructed with one-hemi-porcine and one hemi-bovine cytoplast; bovine â reconstructed using 2 hemi-bovine cytoplasts), on development of porcine somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryos. Somatic cell cultures were established from two animals of endangered pig breeds (Mule-foot and Moura) and embryos were reconstructed by hand-made cloning and cultured for 7 days in PZM-3 medium. Mosaic and bovine groups produced lower blastocyst rates than porcine (5.5, 1.9 and 18.0%, respectively). The group ADMSC-mosaic from Moura animal showed an intermediate embryo development on porcine and bovine groups, which is higher than the FIB-mosaic group of the same animal. The percentage of fragmented blastomeres in cleaved embryos and morulas from the mosaic and bovine groups were higher than the porcine. The dynamic of fusion was different according the group of cytoplasm, as observed through mitochondria staining. In the second study (three experiments), we investigated the effect of the histones de-acethylase inhibitor âScriptaidâ on the in vitro development of the three groups of SCNT reconstructed embryos. Reconstructed embryos were exposed to 500 nM of Scriptaid for 12 h starting just after activation, being then cultured in PZM-3 for 7 days. The blastocyst rates in the porcine (9.2 vs. 17.3%) and mosaic (1.0 vs. 9.2%) groups were increased by Scriptaid treatment (p < 0.05), and the proportion of fragmented morulas was reduced in mosaic (p < 0.05). However, Scriptaid treatment did not increase embryo development in the bovine group. In the second study (three experiments) the influence of distinct oocyte and spermatozoa qualities in their interaction in embryo IVP by IVF was evaluate. On experiment 1 and 3 the blastocyst rates were evaluated (day 7). On experiment 2, two bulls were used for IVF with good or poor oocytes. Bull A did not show difference according the oocyte quality: good (19.8%) and poor (12.7%). Bull B showed higher blastocyst rates in good quality (25.7%) than poor quality oocytes (9.2%). On experiment 2, sperm penetrating capacity was evaluated for both bulls in oocytes of low quality, by sub-zonal sperm injection. The penetration rate observed 3h after the injection from bull A (34.0%) was lower than for bull B (44.3%) (p < 0.05). On experiment 3, both bulls were used for ICSI of good or low quality oocytes and no bull or oocyte quality effect has affected blastocyst rates. In conclusion, the use of reprogramming modulators such as Scriptaid, and alternative technologies such as ICSI are adequate to provide, at least under particular conditions, an increase in embryo development

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